Artykuł metodologiczny

Pomiar specyficznych wskaźników błędnej translacji prątków za pomocą systemów reporterowych wzmocnienia funkcji

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59453

⸱

26 kwietnia 2019

 ,  ,  , 
1Centre for Global Health and Infectious Diseases, Collaborative Innovation Centre for the Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Tsinghua University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule prezentujemy dwie uzupełniające się metody pomiaru konkretnych wskaźników błędów translacyjnych i błędnych tłumaczeń w modelowym Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, przy użyciu systemów reporterowych wzmocnienia funkcji. Metody te mogą być stosowane do pomiaru dokładnych poziomów błędów w przypadku niskiej przepustowości lub względnych wskaźników błędów w warunkach o wyższej przepustowości.

Streszczenie

Translacja genów na białka jest podatna na błędy. Chociaż średni wskaźnik błędu translacyjnego w systemach modelowych szacuje się na 1/10 000 na kodon, rzeczywiste poziomy błędów różnią się znacznie, w zależności od gatunku, środowiska i badanych kodonów. Wcześniej wykazaliśmy, że prątki wykorzystują dwuetapowy szlak do wytwarzania aminoacylowanych tRNA glutaminy i asparaginy, co jest szczególnie związane ze stosunkowo wysokimi wskaźnikami błędów ze względu na modulację wskaźników błędnej translacji przez niezbędny składnik szlaku, amidotransferazę GatCAB. Zmodyfikowaliśmy wcześniej stosowany system podwójnej lucyferazy Renilla-Firefly, który był używany do pomiaru wskaźników błędnej translacji u Escherichia coli do stosowania u prątków w celu pomiaru określonych wskaźników błędnej translacji glutaminianu w kodonach glutaminy i asparaginianu w kodonach asparaginy. Chociaż ten system raportowania był odpowiedni do dokładnego szacowania określonych poziomów błędów, brak czułości i wymagania dotyczące nadmiernych etapów manipulacji sprawiły, że nie nadawał się do zastosowań o dużej przepustowości. W związku z tym opracowaliśmy drugi system reporterowy wzmocnienia funkcji, wykorzystujący lucyferazy Nluc i białko zielonej fluorescencji (GFP), który jest bardziej podatny na ustawienia średnio/wysokoprzepustowe. Użyliśmy tego systemu do zidentyfikowania kasumamicyny jako małej cząsteczki, która może zmniejszyć błędną translację prątków. Chociaż raporty, które tutaj opisujemy, zostały użyte do pomiaru określonych typów błędnej translacji prątków, mogą być one modyfikowane w celu pomiaru innych typów błędnych tłumaczeń w wielu systemach modelowych.

Wprowadzenie

Przepływ informacji w biologii molekularnej wymaga tłumaczenia informacji genetycznej na funkcjonalne białka. Podobnie jak w przypadku wszystkich systemów biologicznych, translacja genów również wiąże się z mierzalnymi błędami. Szacunki poziomu błędu w translacji są zwykle podawane jako około 1/10 000 na kodon (sprawdzone przez Ribas de Pouplana et al.1). Jednak poziomy błędów są bardzo zróżnicowane, od mniej niż 10-5 do więcej niż 0,05/codon1,2,3,4,5. Szeroki zakres poziomów błędów, obejmujący ponad trzy rzędy wielkości, wynika z faktu, że błędy mogą wynikać z wielu etapów ścieżki translacji: ze stochastycznych, mutacyjnych lub wywołanych stresem błędów w aminoacylacji6,7,8,9,10, fizjologiczna misacylacja asparaginylowych i glutaminylowych tRNA5, lub błędy dekodowania rybosomalnego2,3,11. Wymiernie wysoki poziom błędów, wynoszący ponad 0,01/kodon, sugerował, że błędy translacyjne mogą pełnić funkcje fizjologiczne1,12 i że błędne tłumaczenie może być zależne od kontekstu13.

My i inni wykazaliśmy, że naturalnie występujące błędy w translacji genów mogą być adaptacyjne, szczególnie podczas stresu środowiskowego1,5,12,14,15,16,17,18. U prątków błędy generowane przez dwuetapowy pośredni szlak aminoacylacji glutaminy/asparaginy tRNA19,20 skutkują znacznie zwiększoną tolerancją na antybiotyk przeciwgruźliczy pierwszego rzutu ryfampicynę5. Dlatego spekulowaliśmy, że zmniejszenie błędnej translacji prątków za pomocą małej cząsteczki może nasilać zabijanie przez ryfampicynę. Przebadaliśmy i zidentyfikowaliśmy naturalnie występującą aminoglikozyd kasugamycynę jako związek, który może zmniejszyć błędną translację prątków, nasilić zabijanie prątków za pośrednictwem ryfampicyny zarówno in vitro, jak i in vivo21 i ograniczyć pojawienie się oporności na ryfampicynę21, który zagraża globalnej kontroli gruźlicy22 — najbardziej śmiercionośnego patogenu na świecie.

Aby badać błędy tłumaczeniowe, należy zastosować metody pomiaru błędnego tłumaczenia. Istnieje wiele metod, które zostały opracowane do pomiaru błędów w tłumaczeniu, z których każda ma zalety i wady. Krótko mówiąc, metody oparte na precyzyjnej spektrometrii mas mają kilka zalet, z których najważniejszą jest to, że dzięki nowszym algorytmom wykrywania wielu typów błędów translacyjnych można przeprowadzić stosunkowo bezstronny pomiar błędnego tłumaczenia18. Jednak spektrometria mas nie jest zbyt odpowiednia do pomiaru zdarzeń błędnej translacji deamidacji - dokładnie tego rodzaju błędnej translacji, która występuje w prątkach z powodu podatnego na błędy pośredniego szlaku aminoacylacji tRNA. Dzieje się tak z powodu nieenzymatycznej deamidacji o wysokiej częstotliwości, która zachodzi podczas przetwarzania próbek do spektrometrii mas23, co skutkuje niezwykle wysokim sygnałem tła. W związku z tym, jeśli chodzi o wykrywanie błędów w tej ścieżce, genetyczne reportery wzmocnienia funkcji oferują wyraźne korzyści. W szczególności odpowiednie reportery wzmocnienia funkcji mogą mieć bardzo niskie współczynniki tła, co pozwala na pomiar bardzo niskich wskaźników błędów11.

Ponieważ przeprowadzanie eksperymentów z patogennymi Mycobacterium tuberculosis wymaga specjalistycznych urządzeń i dodatkowych środków ostrożności, przeprowadzamy większość eksperymentów na niepatogennym prątku M. smegmatis — i wykazaliśmy wcześniej, że wyniki między tymi dwoma gatunkami są zasadniczo porównywalne5,21. Aby zmierzyć wskaźniki błędnej translacji u prątków generowanych przez pośredni szlak aminoacylacji tRNA, zmodyfikowaliśmy system podwójnej lucyferazy Renilla-Firefly, który został wcześniej opracowany do pomiaru błędów dekodowania rybosomów w E. coli11 do stosowania w prątkach. Dokonaliśmy trzech konkretnych modyfikacji: oryginalny reporter nie wyrażał się efektywnie w prątkach, a zatem sekwencja była zoptymalizowana pod kątem kodonów, a C-końcowe trzy aminokwasy lucyferazy świetlika, seryna-lizyna-leucyna, która została opisana jako sygnał przemytu w niektórych systemach24, została zmodyfikowana na isoleucine-alaninę-walinę25. Oryginalny reporter miał krytyczną resztę lizyny w lucyferazy świetlika, która została zmutowana. Zamiast tego zmutowaliśmy krytycznie konserwatywną resztę asparaginianu (D120) lub glutaminianu (E144) w lucyferazy Renilla odpowiednio do asparaginy i glutaminy25 (Figura 1). Reporter poddano subklonowaniu do episomalnego plazmidu indukowanego tetracykliną plazmidu pUV-tetOR (patrz tabela materiałów). Reporterzy wzmocnienia funkcji mutują krytycznie zachowane reszty funkcjonalne w enzymach/białkach fluorescencyjnych, co czyni je niefunkcjonalnymi11,26. Błędy translacyjne (lub teoretycznie transkrypcyjne), które syntetyzują funkcjonalny wariant białka, skutkowałyby mierzalną aktywnością enzymu w podzbiorze translowanych białek. Aby skorygować zmienność obfitości białka, zmutowany reporter ulega koekspresji z funkcjonalnym białkiem, które działa jako punkt odniesienia i pozwala na dokładne ilościowe określenie przyrostu funkcji11. Podczas gdy reporter podwójnej lucyferazy Renilla-Firefly pozwolił na dokładny pomiar określonych wskaźników błędnych translacji prątków5,25 (Rysunek 2 i sekcja 1 protokołu), szybko zdaliśmy sobie sprawę, że nie nadaje się do średnio/wysokoprzepustowych badań przesiewowych cząsteczek, które zmieniłyby szybkość błędnej translacji. Wynika to głównie z dwóch powodów, a mianowicie: a) względny brak siły działania lucyferazy Renilla oznaczał, że do pomiaru wskaźników błędnej translacji wymagany był co najmniej 1 ml hodowli / próbki prątków, oraz b) wymóg lizy komórek przed pomiarem aktywności enzymatycznej wymagał nadmiernej ręcznej obsługi: komórki prątkowe mają grubą i wielowarstwową ścianę komórkową i otoczkę, która jest stosunkowo odporna na lizę. W związku z tym staraliśmy się opracować nowy system reporterowy ze wzmocnieniem funkcji, który mógłby być stosowany przy małych objętościach (np. w systemie płytek 96-dołkowych) i nie wymagał lizy komórek do pomiarów. Użyliśmy bardzo silnej lucyferazy Nluc i zidentyfikowaliśmy krytyczną resztę asparaginianu, która po zmutowaniu do asparaginy spowodowała utratę funkcji o 2 logarytmy (ryc. 1). Co więcej, mały rozmiar Nluca pozwolił mu na posiadanie N-końcowego znacznika sygnału wydzielania - z antygenu 85A, głównego antygenu wydzielanego w mycobacteria27 - który pozwoliłby Nlucowi być wydzielanym do supernatantu hodowli i obejść wymóg lizy komórek. Białko wzorcowe, GFP, uległo ekspresji z tego samego promotora co zmutowany Nluc, ale ze zintegrowanego wektora (patrz Tabela Materiałów) i mogło być mierzone w nienaruszonych komórkach21 (Figura 3). Pomimo tych zalet, reporter Nluc/GFP (sekcja 2 protokołu) ma również wady: stosunkowo niewielkie zmniejszenie aktywności Nluc (100-krotnie) z mutacją D140N nie pozwoliłoby na pomiar wyjątkowo niskich wskaźników błędnych tłumaczeń, co czyni reportera bardziej odpowiednim jako narzędzie przesiewowe niż do dokładnych pomiarów błędu translacyjnego. Co więcej, Nluc nie ma krytycznych reszt glutaminianu; W związku z tym można było zmierzyć jedynie poziomy błędu w stosunku do asparaginianu. Ogólne zasady opisane w tej pracy powinny pozwolić badaczom na korzystanie z tych raportów, tak jak to zrobiliśmy, lub modyfikowanie raportów w zależności od potrzeb w celu dokładnego i/lub łatwego pomiaru innych konkretnych wskaźników błędów translacyjnych w wybranym przez nich systemie modelowym.

Protokół

1. Reporter dualnej lucyferazy Renilla-Firefly

UWAGA: Wizualna reprezentacja tej metody przedstawiona jest na Rysunku 2.

  1. Zaszczepić szczepy reporterowe prątków z -80 °C roztwór z 2 ml pożywki 7H9. Dual-lucyferaza typu dzikiego, a także zmutowana Renilla (reporterowe) szczepy, których należy użyć, aby umożliwić obliczenie szybkości błędnej translacji (patrz krok 1.7). Inkubować z wytrząsaniem przy 37 °C przez 1 do 2 dni do momentu osiągnięcia OD600 osiąga fazę stacjonarną (OD > 3).
  2. Aliquotować i rozcieńczyć do odpowiedniej gęstości optycznej (OD)60 nm około 0,1–0,5. W typowych eksperymentach należy wykorzystać trzy niezależne hodowle biologiczne. Do końcowego stężenia 50 ng/ml dodaje się anhydrotetracyklinę (ATC), analog tetracykliny będący induktorem ekspresji reportera (sterowanej przez promotor indukowalny tetracykliną).
  3. Pomiar wpływu kasugamycyny na stopień błędnej translacji21, dodać różne dawki kasugamicyny do hodowli (patrz Rysunek 4 (dla wskazanych dawek) w tym samym czasie (w testowanych dawkach kasugamicyna nie wykazuje aktywności przeciwdrobnoustrojowej). Należy pamiętać, że istotne jest uwzględnienie co najmniej jednej kontroli nieindukowanej dla każdego reportera. Inkubować indukowane kultury przez 4–6 h w 37 °C z mieszaniem.
  4. Przenieść kultury bakteryjne do probówki o pojemności 2 ml i odwirować przy 320 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu odwirowania bakterii. Odrzucić nadsącz.
  5. Rozbij bakterie poprzez dodanie 40 μL 1x buforu do lizy pasywnej (załączonego do zestawu do badania dualnej lucyferazy), który został rozcieńczony (1:1) w wodzie dwukrotnie destylowanej. Przenieść resuspendowany lizat bakteryjny do białej płytki 96-dołkowej (jedna próbka na dołek) i inkubować z wstrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 20 min.
    UWAGA: Nie należy zbyt długo inkubować bakterii w buforze lizującym (powyżej 30 min).
  6. Dodaj 80 μL podłoża dla lucyferazy świetlika do każdej studni, wstrząsnąć przez 15 s i zmierzyć luminescencję za pomocą luminometru przy czasie całkowania 10 ms. Aby uniknąć błędów pipetowania, należy użyć automatycznego injektora lub pipety wielokanałowej.
  7. Dodać 80 μL z Renilla do każdej studzienki substrat, wstrząsać przez 15 s, a następnie zmierzyć luminescencję za pomocą luminometru, stosując czas całkowania 1 00 ms.
  8. Odejmij luminescencję tła – zmierzoną przy użyciu typu dzikiego M. smegmatis (t.j. niezawierający reporterów) lub lizat z nieindukowanym reporterem – z wartości zmierzonych. Skorygowane wartości należy wykorzystać do obliczenia wskaźników błędnych translacji dla każdego stanu, stosując następujące równanie11,25, gdzie DN odnosi się do aktywności w zmutowanym szczepie reporterowym:
    Wzór na stopień błędnej translacji, \( \text{Stopień błędnej translacji} = \frac{\left( \frac{\text{Renilla}}{\text{Firefly}} \right)^{DN}}{\left( \frac{\text{Renilla}}{\text{Firefly}} \right)^{WT}} \), równanie.

2. Reporter Nluc/GFP

UWAGA: Wizualna prezentacja tej metody przedstawiona jest na Ryc. 3.

  1. Zaszczep szczep reporterowy bakterii z zapasu przechowywanego w -80 °C w 2 mL pożywki 7H9. Inkubuj z wytrząsaniem w 37 °C przez 1 do 2 dni, aż OD60 osiągnie fazę stacjonarną (OD >3).
  2. Przeszczep kulturę do 50 mL pożywki 7H9 i hoduj do momentu, gdy OD60 osiągnie późną fazę stacjonarną (>4).
  3. Przed rozdzieleniem bakterii do płytki 96-dołkowej, dodaj ATC do końcowego stężenia 50 ng/mL i dokładnie wymieszaj. Indukcja kultury zbiorczej zapewnia, że wszystkie dołki zawierają taką samą ilość induktora i że indukcja reportera jest zsynchronizowana. Rozdziel bakterie do przezroczystej płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem, dozując 10 μL objętości do każdego dołka.
  4. W celu przesiewania małych cząsteczek wpływających na tempo błędnych translacji, dodaj związek w wskazanym stężeniu do wybranych dołków. Na potrzeby niniejszego protokołu jako przykład wykorzystaj kasugamicynę (w dawkach wskazanych na Rysunku 5). Dodaj różne dawki kasugamicyny do wybranych dołków (każda grupa eksperymentalna powinna zawierać co najmniej dwa powtórzenia biologiczne).
  5. Wstrząsaj i indukuj próbki w 37 °C przez 16-20 h.
    UWAGA: Należy zabezpieczyć płytkę folią. Ponadto wszystkie dołki brzegowe muszą zostać wypełnione co najmniej 20 μL sterylnej wody, aby ograniczyć parowanie z dołków testowych.
  6. Pobierz 80 μL z każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej i przenieś próbki do czarnej płytki 96-dołkowej (co maksymalizuje pomiar sygnału fluorescencji). Zmierz sygnał GFP za pomocą luminometru, przyjmując czas całkowania 20 ms.
  7. Po pomiarze sygnału GFP odwiruj płytkę przy 3 20 x g przez 10 min. Przenieś 50 μL supernatantu do białej płytki 96-dołkowej (co maksymalizuje pomiar sygnału luminescencji), dodaj 50 μL substratu Nluc do każdego dołka, dokładnie wymieszaj i zmierz luminescencję za pomocą luminometru, przyjmując czas całkowania 1 00 ms.
  8. Wyznacz stosunek Nluc/GFP, dzieląc skorygowane wartości luminescencji Nluc przez fluorescencję GFP: miara ta (w jednostkach dowolnych) jest wzglomym pomiarem błędnej translacji asparaginy zamiast asparaginianu.

Wyniki

Schematyczny rysunek przedstawiający ogólny zarys dwóch systemów reporterowych wykorzystanych w tej pracy znajduje się na Rysunku 1. Przegląd sekcji 1 protokołu przedstawiono na Rysunku 2, a przegląd sekcji 2 na Rysunku 3. Wpływ kasugamycyny na błędy translacji u prątków, zmierzony za pomocą systemu reporterowego Renilla-Firefly, przedstawiono na Rysunku 4. Aby wykazać swoistość działania kasugamycyny, reporter wyeksponowano również w szczepie M. smegmatis z delecją genu ksgA (∆ksgA). KsgA jest dimetylotransferazą rRNA, a szczepy z delecją ksgA wykazują względną odporność na kasugamycynę. Wpływ kasugamycyny na błędy translacji zmierzono również przy użyciu reportera Nluc/GFP, co przedstawiono na Rysunku 5.

Schematy testu dualnej lucyferazy; geny fuzji Renilla-Firefly pod promotorem Ptet; analiza białek.
Rysunek 1Schemat ilustrujący dwa systemy reporterowe typu gain-of-function. (A) The RenillaSystem reporterowy Firefly składa się z dwóch enzymów lucyferazowych ekspresowanych jako białko fuzyjne pod kontrolą promotora indukowanego tetracykliną. Ekspresja enzymu podwójnego typu dzikiego skutkuje wysoką mierzalną aktywnością obu Renilla or lucyferazy świetlikowe (góra). Mutacja krytycznego reszty asparaginianowej, D120, w Renilla asparagina sprawia, że Renilla enzym (D120N) jest nieaktywny, lecz lucyferaza świetlikowa pozostaje aktywna. Błędna translacja asparaginy na asparaginian (w tym przypadku z fizjologicznie błędnie acylowanego Asp-tRNA)Asn tRNA5,21) prowadzi do niewielkiej proporcji przetłumaczonych Renilla białka zyskują aktywność, którą można zmierzyć. Porównanie RenillaAktywność lucyferazy Firefly zmutowanego reportera w porównaniu z enzymem podwójnym typu dzikiego pozwala na obliczenie częstotliwości błędnej translacji asparaginianu na kwas asparaginowy.B) System reporterowy Nluc/GFP działa na podobnej zasadzie. Zmutowany gen Nluc (D140N) posiada N-końcowy sygnał sekrecyjny pochodzący z antygenu 85A, głównego wydzielanego białka prątków. Oba nluc i gfp geny są wyrażane z identycznych promotorów indukowalnych tetracykliną, co umożliwia wykorzystanie GFP jako punktu odniesienia dla względnej ekspresji. Należy zwrócić uwagę na brak szczepu kontrolnego Nluc typu dzikiego: reporter ten jest wykorzystywany głównie w badaniach przesiewowych, w których pomiary względnych wskaźników błędnej translacji są wystarczające dla wstępnego etapu przesiewu. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu hodowli kultur plazmidowych M. smegmatis z układem pomiaru sygnału do analizy szybkości mistranslacji.
Rysunek 2Schemat pomiaru szybkości błędnych translacji przy użyciu Renilla-Reporter lucycyklazy Firefly (sekcja 1 protokołu). Świeże hodowle M. smegmatishoduje się komórki przekształcone plazmidem wykazującym ekspresję podwójnych reporterów lucyferazy. Indukuje się ekspresję reporterów, a następnie testuje badane związki lub warunki. Po 4–6 godzinach ekspresji reporterów hodowle są wirowane w celu odsączenia osadu i poddawane lizie, a następnie lizaty są testowane pod kątem aktywności podwójnej lucyferazy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji genów M. smegmatis z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych; pomiar sygnałów GFP i Nluc; obliczenie stosunku.
Rycina 3Schemat pomiaru stopnia błędnej translacji reportera Nluc-GFP (sekcja 2 protokołu). Świeża hodowla M. smegmatishodowlę, przekształconą reporterami Nluc i GFP, namnaża się do objętości wystarczającej dla wszystkich testowanych płytek (zakładając ok. 10 ml na płytkę 96-dołkową). Bezpośrednio przed przeniesieniem kultury bakteryjnej do poszczególnych dołków indukuje się ekspresję reporterów poprzez dodanie ATC do całej kultury. Dołki inkubuje się przez noc w warunkach wstrząsania. Aby zmierzyć względne tempo błędnej translacji, kultury przenosi się na czarną płytkę (w celu zwiększenia czułości detekcji fluorescencji), mierzy fluorescencję GFP, a następnie wirowkuje płytki w celu osadzenia bakterii. Nadsącz przenosi się na białą płytkę w celu pomiaru aktywności Nluc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wpływ kasugamycyny na aktywność Renilla; wykres słupkowy; szczep dziki vs mutanty ΔksgA; analiza zależności dawka-odpowiedź.
Rysunek 4Reprezentatywny wynik zastosowania Renilla-Reporter lucycyzowy Firefly służący do pomiaru szybkości błędnej translacji w obecności kasugamycyny w różnych szczepach. częstość błędnych translacji asparaginianu zamiast asparaginy w (A) szczep dziki M. smegmatis oraz (B) szczep z delecją ksgA (∆ksgA) po podaniu kasugamycyny (ksg), zmierzone za pomocą Renilla-Podwójny reporter Firefly. Hodowle poddano działaniu kasugamycyny w zaznaczonych dawkach (w mikrogramach/mililitr) przez 6 h przed lizą komórek i pomiarami. Skorygowane stosunki Ren/FF (osie y) wskazują na tempo błędnej translacji asparaginy na asparaginian. Delecja ksgA skutkuje to wyższym bazowym wskaźnikiem błędnych translacji, który wykazuje większą odporność na modulację kasugamycyną. Słupki wskazują wartości średnie, a błędy oznaczają odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy wpływu kasugamicyny na ekspresję Nluc/GFP; wyniki badania zależnego od dawki.
Rycina 5Reprezentatywny wynik z użyciem reportera Nluc-GFP do pomiaru szybkości błędnej translacji w obecności kasugamycyny. Względne wskaźniki błędnego wbudowania asparaginianu zamiast asparaginy w typie dzikim M. smegmatis mierzone za pomocą reportera Nluc/GFP po nocnej (16 h) inkubacji z kasugamycyną (ksg). Słupki przedstawiają wartości średnie, a słupki błędów odchylenie standardowe. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół może być dostosowany do pomiaru wskaźników błędnych translacji w wielu różnych organizmach. Istnieje szereg kwestii, o których należy pamiętać podczas dostosowywania protokołu do innych systemów. W pierwszej kolejności należy wziąć pod uwagę cel pomiaru. Do dokładnego pomiaru wskaźników błędnych tłumaczeń przy użyciu reporterów wzmocnienia funkcji potrzebny jest (a) solidny test odczytu (np. funkcja enzymatyczna [w tym przypadku aktywność lucyferazy] o szerokim zakresie liniowym). Należy również zwrócić uwagę na (b) mutację powodującą utratę funkcji w krytycznej reszcie białka reporterowego, która powoduje bardzo znaczącą utratę funkcji, poniżej oczekiwanego wskaźnika błędnej translacji. Na przykład, jeśli oczekiwany wskaźnik błędnej translacji, który ma być zmierzony, wynosi około 10-3 / kodon, mutacja utraty funkcji musi być większa niż 1000-krotnie; W przeciwnym razie dolny zakres zdarzeń błędnego tłumaczenia nie będzie wykrywany z czułością. Wreszcie, do dokładnego pomiaru wskaźników błędnych translacji przy użyciu reporterów wzmocnienia funkcji, (c) potrzebny jest solidny reporter porównawczy - w tym przypadku lucyferazy świetlika dla sekcji 1 protokołu. Idealnie byłoby, gdyby reporter wzorcowy był połączony ze zmutowanym reporterem enzymatycznym, gwarantując (pod każdym względem), że oba są wyrażone w proporcjach równomolowych. Odczyt wzorcowy (i główny reporter) powinien być odporny na zakłócenia w narażonych środowiskach. Na przykład fluorescencja GFP typu dzikiego jest wysoce podatna na zakłócenia spowodowane zmianami pH28, co czyni ją nieodpowiednią jako punkt odniesienia do pomiaru wskaźników błędnej translacji w fagocytozowanych prątkach w makrofagach, które znajdują się w fagosomy o pH poniżej 729. Z drugiej strony, w przypadku zastosowań takich jak badania przesiewowe małych cząsteczek, najważniejszymi kwestiami dotyczącymi badania przesiewowego pierwotnego będą odtwarzalność pomiarów (tj. precyzja, a nie dokładność), minimalizacja ręcznej obsługi i małe objętości hodowli. Dokładne pomiary wskaźników błędnych tłumaczeń są mniej ważne i mogą być wykonywane jako testy wtórne. Na koniec należy zauważyć, że reporterzy opisani w tym protokole, w oparciu o funkcję enzymatyczną enzymów lucyferazy, będą mierzyć tylko średnie wskaźniki błędnej translacji populacji bakterii, ale nie mogą dostarczyć informacji o zmienności heterogeniczności pojedynczej komórki we wskaźnikach błędnej translacji. Biorąc pod uwagę znaczenie zmienności pojedynczej komórki w fenotypach adaptacyjnych 30,31,32, opracowano fluorescencyjne reportery do pomiaru zdarzeń błędnej translacji 12,33, w tym do pomiaru błędnej translacji u prątków 5.

Biorąc pod uwagę wymagania dotyczące pomiaru błędnej translacji, należy zauważyć, że reporterzy genetycznego przyrostu funkcji, tacy jak opisani w niniejszym protokole, mogą mierzyć tylko jeden rodzaj błędnego tłumaczenia (tj. jedno podstawienie aminokwasu dla jednego kodonu) na reporter. W związku z tym do pomiaru różnych zdarzeń związanych z błędami w tłumaczeniu potrzebnych jest wielu sprawozdawców. Na przykład do pomiaru błędnej translacji przez błędy dekodowania rybosomów prawie pokrewnych kodonów przez lizylo-tRNA w jednej pozycji, potrzeba co najmniej 16 reporterów 2,3,11. Wysoce precyzyjna spektrometria mas i bioinformatyka pozwalają na potencjalną identyfikację wielu różnych typów zdarzeń związanych z błędnym tłumaczeniemjednocześnie 18; Jednak te metody wiążą się również z zastrzeżeniami. Ogólnie rzecz biorąc, są one mniej dokładne niż raporty dotyczące wzmocnienia funkcji. Ponadto, jak wspomniano wcześniej, są one mniej odpowiednie do wykrywania niektórych rodzajów błędnej translacji, a mianowicie tych, które można powiązać z deamidacją nieenzymatyczną23. Wreszcie, spektrometria mas nie nadaje się jako odczyt do badań przesiewowych o średniej lub wysokiej przepustowości.

W celu dostosowania tych raportów i protokołów do pomiaru błędnej translacji w innych systemach, dalsze rozważania obejmują solidne wyrażenie raportowania w pożądanym systemie modelowym. Początkowo próbowaliśmy użyć systemu podwójnej lucyferazy opracowanego przez Farabaugha i współpracowników w naszym systemie mykobakteryjnym bez modyfikacji, ale nie odnieśliśmy sukcesu z powodu braku ekspresji reporterowej. Szeroko zakrojone rozwiązywanie problemów wykazało, że zarówno optymalizacja kodonów, jak i niewielka modyfikacja sekwencji reporterów były wymagane, aby umożliwić solidną ekspresję25 (i patrz wyżej). Nie można wykluczyć, że podobne dostosowania reporterów byłyby wymagane do stosowania w innych systemach.

Na koniec należy wziąć pod uwagę rodzaj mierzonego zdarzenia związanego z błędem w tłumaczeniu. Na przykład, jeśli istnieje potrzeba zmierzenia odczytu kodonu stop (tłumienie nonsensu), mutacja utraty funkcji kodonu stop musi zostać wprowadzona w niekrytycznym regionie pierwotnego białka reporterowego34. W przeciwnym razie tylko określone zdarzenia tłumienia nonsensów, które odzyskują krytyczną pozostałość (a tym samym funkcję reportera) będą mierzone przez test, co potencjalnie doprowadziłoby do znacznego niedoszacowania rzeczywistych wskaźników błędnych tłumaczeń. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że błąd translacyjny może odgrywać rolę adaptacyjną w dużej liczbie organizmów 1,12,13,35. Jednak pomiar zdarzeń związanych z błędami w tłumaczeniu jest nadal ograniczony do niewielkiej, choć rosnącej liczby gatunków modelowych. Adaptacja czułych metod do pomiaru błędnego tłumaczenia może przyczynić się do dalszego pogłębienia wiedzy naukowców na temat roli błędów w tłumaczeniu w fizjologii i patologii.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Fundacji Billa i Melindy Gatesów (OPP1109789), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31570129), oraz fundusze startowe z Tsinghua University School of Medicine dla B.J. B.J. jest badaczem Wellcome Trust (207487/Z/17/Z).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Middlebrook 7H9BD Difco271310
AnhydrotetracyklinaCayman Chemical 
KasugamycinsigmaK4013
System testów reporterowych z podwójnym lucyferazypromegaE1960
Test lucyferazy Nano-GlopromegaN1120
luminometr Fluoroskan Ascent FLtermiczna
/testowa, 96 dołków, biała, płaskie dno, wysokie wiązanie, bez pokrywkiCostar3922
Płytka testowa, 96-dołkowa, płaska denna wysoka licytacja, bez pokrywkiCostar3925
96 dołkowy klaster hodowli komórkowych, płaskie dno z pokrywkąCostar3599
Niekomercyjne odczynniki (plazmidy)
pUV-TetOR-RenFFNAEpisomalny plazmid wahadłowy, który umożliwia indukowaną tetracykliną ekspresję podwójnego reportera lucyferazy typu dzikiego
pUV-TetOR-Ren-D120N-FFreporter podwójnej lucyferazy ze zmutowaną Renilla
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140NNAepisomalny plazmid wahadłowy NA z indukowaną tetracykliną, sekretną wersją zmutowanej lucyferazy Nluc
pMC1S-GFPNAZintegrowany wektor Mykobakteryjny (miejsce L5) do indukowanej tetracykliną ekspresji GFP
10009542, , , , , płytka

Bibliografia

  1. Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. Protein mistranslation: friend or foe. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).
  2. Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
  3. Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
  4. Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
  5. Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147(2016).
  6. Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
  7. Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
  8. Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
  9. Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
  10. Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
  11. Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
  12. Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
  13. Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117(2017).
  14. Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
  15. Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
  16. Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
  17. Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
  18. Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
  19. Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
  20. Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
  21. Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
  22. Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
  23. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Deamidation of human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).
  24. Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
  25. Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
  26. Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
  27. Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
  28. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166(2016).
  29. Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754(2016).
  30. Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
  31. Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
  32. Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218(2018).
  33. Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
  34. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
  35. Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza Nluc GFPprzesiew kasugamycynsystem Renilla Fireflywska niki b d w translacyjnychkodony glutaminianu i glutaminykodony asparaginianu i asparaginyszlak GatCABhodowla w po ywce 7H9
Pomiar specyficznych wskaźników błędnej translacji prątków za pomocą systemów reporterowych wzmocnienia funkcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.