Przedstawiamy protokół kolorymetrycznego testu aktywności syntazy cytrynianu do ilościowego oznaczania nienaruszonej masy mitochondrialnej w homogenatach tkanek Drosophila.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test kolorymetryczny aktywności syntazy cytrynianu u Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria odgrywają najważniejszą rolę w metabolizmie komórkowym, wytwarzając ATP poprzez fosforylację oksydacyjną i regulując różnorodne procesy fizjologiczne. Dysfunkcja mitochondriów jest główną przyczyną wielu chorób metabolicznych i neurodegeneracyjnych. Nienaruszone mitochondria mają kluczowe znaczenie dla ich prawidłowego funkcjonowania. Enzym syntaza cytrynianu jest zlokalizowany w macierzy mitochondrialnej, a zatem może być stosowany jako ilościowy marker enzymatyczny nienaruszonej masy mitochondrialnej. Biorąc pod uwagę, że wiele cząsteczek i szlaków, które pełnią ważne funkcje w mitochondriach, jest wysoce konserwatywnych między ludźmi a Drosophila, oraz że w Drosophila dostępny jest szereg potężnych narzędzi genetycznych, Drosophila służy jako dobry system modelowy do badania funkcji mitochondriów. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiego i prostego pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w homogenacie tkankowym od dorosłych much bez izolowania mitochondriów. Protokół ten nadaje się również do pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w larwach, hodowanych komórkach i tkankach ssaków.
Wprowadzenie
Mitochondria są najbardziej znane jako organelle wytwarzające energię w większości organizmów eukariotycznych, które wytwarzają walutę energetyczną, ATP, poprzez cykl kwasów trikarboksylowych (tj. cykl Krebsa) i fosforylację oksydacyjną. Stwierdzono również, że mitochondria odgrywają ważną rolę w wielu innych procesach fizjologicznych, takich jak regulacja apoptozy1, Ca2+ homeostaza2,3, generacja reaktywnych form utleniania (ROS)4, oraz retikulum endoplazmatyczne (ER)-odpowiedź na stres5. Dysfunkcja mitochondriów może wpływać na każdy narząd w ciele w każdym wieku i jest główną przyczyną chorób metabolicznych, związanych ze starzeniem się6 i neurodegeneracyjnych7. Nienaruszone mitochondria są mechanistycznie związane z funkcją mitochondriów. Tak więc właściwa kwantyfikacja nienaruszonej masy mitochondrialnej jest bardzo ważna dla oceny funkcji mitochondriów8. Syntaza cytrynianu, enzym ograniczający szybkość w pierwszym etapie cyklu kwasów trikarboksylowych9, jest zlokalizowana w macierzy mitochondrialnej w komórkach eukariotycznych, a zatem może być stosowana jako ilościowy marker obecności nienaruszonej masy mitochondrialnej9,10. Aktywność syntazy cytrynianu może być również stosowana jako czynnik normalizujący dla nienaruszonych białek mitochondrialnych11,12.
Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, jest doskonałym modelowym systemem do badania funkcji mitochondriów, ponieważ wiele cząsteczek i szlaków, które odgrywają kluczową rolę w mitochondriach, jest ewolucyjnie zachowanych od Drosophila do człowieka13,14,15. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiej i prostej metody pomiaru aktywności syntazy cytrynianu za pomocą testu kolorymetrycznego w homogenatach tkanek Drosophila16 w formacie płytki 96-dołkowej. W teście aktywności syntazy cytrynianu syntaza cytrynianu w homogenacie tkankowym Drosophila katalizuje reakcję szczawiooctanu z acetylokoenzymem A (acetylo-CoA) w celu wytworzenia cytrynianu CoA-SH i H+. CoA-SH następnie reaguje z 5,5'-ditiobis-(kwasem 2-nitrobenzoesowym) (DTNB), tworząc barwny produkt, 2-nitro-5-tiobenzoesan (TNB), który można łatwo zmierzyć spektrofotometrycznie przy 412 nm. Aktywność syntazy cytrynianu może być odzwierciedlona w szybkości produkcji koloru.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Kolorymetryczny pomiar aktywności syntazy cytrynianowej u D. melanogaster16
- Zebrać dziesięć dorosłych much dla każdej próbki. Zebrać co najmniej trzy powtórzenia próbek dla każdego genotypu.
- Przygotuj 500 µL lodowatego buforu do ekstrakcji zawierającego 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA oraz 0,1% triton X-10 w probówce 1,5 ml dla każdej próbki.
- Uśpić dorosłe muchy za pomocą CO22 na podkładce do anestezji i wyizoluj pożądane tkanki. Aby wyizolować klatki piersiowe dorosłych much, należy na przykład unieruchomić klatki piersiowe much pęsetą, a następnie oddzielić odwłoki much, przecinając je wzdłuż granicy klatki piersiowej i odwłoka za pomocą nożyczek. Klatki piersiowe much należy zebrać do oznaczenia aktywności syntazy cytrynianowej w mięśniach.
UWAGA: Na tym etapie należy określić masę świeżą tkanki, jeśli jest ona wykorzystywana do normalizacji aktywności syntazy cytrynianowej. - Przenieś 10 odwłoków dorosłych much do 100 µL buforu ekstrakcyjnego schłodzonego do temperatury 0°C i homogenizuj za pomocą tłuczka na lodzie. Aby próbki pozostały schłodzone, homogenizuj je przez 5–10 s na lodzie, następnie pozostaw na lodzie na 5 s i powtarzaj tę czynność, aż wszystkie tkanki w probówce zostaną całkowicie zhomogenizowane.
UWAGA: Proszkę zaklejonej probówki, a następnie sprawdzić homogenaty, aby upewnić się, że nie zawierają one skrzepów i że tkanki w probówce zostały całkowicie zhomogenizowane. Wszystkie etapy obróbki próbek należy przeprowadzać w warunkach chłodzenia na lodzie. - Pobierz 10 µL każdą zhomogenizowanych próbek do nowej probówki w celu oznaczenia zawartości białka. Próbki przeznaczone do pomiaru białka należy przechowywać na lodzie.
UWAGA: Próbki białek można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy. Stężenia białek służą jako wewnętrzny parametr do normalizacji aktywności syntazy cytrynianowej. - Dodaj 400 µL lodowatego buforu ekstrakcyjnego do każdej pozostałej próbki, tak aby uzyskać całkowitą objętość wynoszącą 500 µLWymieszać dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół co najmniej 5 razy, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Do każdej reakcji dodać 1 µL rozcieńczonego lizatu komórkowego do 150 µL świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetylu CoA, 1 mM kwasu szczawiowego). Wymieszać dokładnie i niezwłocznie, delikatnie pipetując, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Pomiar absorbancji przeprowadzać przy 412 nm co 10–30 s przez 4 min w 25 °C przy użyciu czytnika płytek umożliwiającego pomiar absorbancji przy 412 nm w odstępach czasowych wynoszących co najmniej 10 s.
UWAGA: Przed pipetowaniem innego odczynnika należy zmienić końcówkę i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza w dołkach. Niecałkowite wymieszanie odczynników może prowadzić do zmienności pomiarów. Analizę aktywności syntazy cytrynianowej należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej niezwłocznie po pobraniu próbek, ponieważ analiza ta służy do ilościowego oznaczenia nienaruszonej masy mitochondriów. Bufor reakcyjny należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i nie należy go przechowywać. - Nanieś dane jako gęstość optyczną (OD) lub absorbancję (abs) (oś Y) w funkcji czasu (w minutach) (oś X). Następnie oblicz nachylenie dla liniowego fragmentu krzywej, w którym szybkość reakcji jest
Podziel uzyskaną wartość przez stężenie białka w próbce, aby znormalizować aktywność syntazy cytrynianowej. Aktywność syntazy cytrynianowej oblicza się według wzoru
UWAGA: Stężenie białka w próbce można zmierzyć za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia przykład krzywych kinetycznych wchłaniania OD przy 412 nm w czasie, uzyskanych za pomocą kolorymetrycznego testu aktywności cytrynianowej syntezy w homogenatach tkanki tułowia Drosophila o różnych genotypach. Wiadomo, że PGC-1α jest głównym regulatorem biogenezy mitochondriów. PGC-1α jest funkcjonalnie zachowany między Drosophila a człowiekiem. Drosophila RNF34 (dRNF34) jest ligazą ubiquitynową typu E3 dla D...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badania metaboliczne z wykorzystaniem Drosophila jako modelu muszą uwzględniać tło genetyczne, dietę i utrzymanie stada muszek18. Aby uniknąć wpływu różnych środowisk genetycznych na pomiar aktywności syntazy cytrynianu, różne szczepy Drosophila powinny być krzyżowane wstecznie ze szczepem kontrolnym przez 10 pokoleń. Tło genetyczne wszystkich szczepów Drosophila użytych w naszych eksperymentach to w1118, więc użyliśmy w1118 jako k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31401013 i 31471010), Komisji Nauki i Technologii Gminy Szanghaj, Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (19ZR1446400).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (zasada TRIZMA)) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetylo-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Kwas ditio-bis-nitrobenzoesowy (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| szczawiooctan | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Tłuczek do pelletu | Sangon | F619072 | |
| Silnik do peletów | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Czytnik płytek | BioTek | Eon | |
| Zestaw do oznaczania białka BCA | Beyotime | P0010S | |
| Nożyczki | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Bibliografia
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
