Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowany heterotopowy model płata kostno-skórnego kończyn tylnych u szczura do translacyjnych badań nad allotransplantacją unaczynionych kompozytów

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59458

⸱

26 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Christine M. Kleinert Institute for Hand and Microsurgery, 2Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 3Kentucky Spinal Cord Injury Research Center, University of Louisville, 4Department of Physiology, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

Unaczyniony kompozytowy przeszczep allogeniczny oferuje korzyści zmieniające życie biorcom przeszczepów, ale biologiczne przyczyny odrzucenia przeszczepu i waskulopatii pozostają słabo poznane. Przedstawiony tutaj model chirurgiczny gryzoni oferuje powtarzalny, klinicznie istotny model przeszczepu, umożliwiając naukowcom ocenę zdarzeń odrzucenia przeszczepu i potencjalnych strategii terapeutycznych zapobiegających ich wystąpieniu.

Streszczenie

Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA) to stosunkowo nowa dziedzina w chirurgii rekonstrukcyjnej. Osiągnięcia kliniczne w VCA u ludzi obejmują przeszczepy dłoni i twarzy, a ostatnio także przeszczepy ścian jamy brzusznej, macicy i układu moczowo-płciowego. Wyniki funkcjonalne przekroczyły początkowe oczekiwania, a większość biorców cieszy się poprawą jakości życia. Jednak w miarę gromadzenia się doświadczenia klinicznego należy zająć się przewlekłym odrzuceniem i powikłaniami związanymi z immunosupresją. W wielu przypadkach, w których przeszczepy nie powiodły się, patologią przyczynową była waskulopatia niedokrwienna. Biologiczne mechanizmy ostrego i przewlekłego odrzucenia związanego z VCA, zwłaszcza waskulopatii niedokrwiennej, są ważnymi obszarami badań. Jednak ze względu na bardzo małą liczbę pacjentów z VCA, ocena proponowanych mechanizmów jest lepiej uwzględniona w modelu eksperymentalnym. Wiele grup wykorzystało modele zwierzęce, aby odpowiedzieć na niektóre z istotnych nierozwiązanych pytań dotyczących odrzucenia VCA i waskulopatii. W literaturze opisano kilka projektów modeli obejmujących różne gatunki. W tym miejscu przedstawiamy powtarzalny model heterotopowego płata kostno-mięśniowo-skórnego kończyny tylnej VCA u szczura, który można wykorzystać do translacyjnych badań VCA. Model ten pozwala na seryjną ocenę przeszczepu, w tym biopsje i różne metody obrazowania, przy zachowaniu niskiego poziomu zachorowalności.

Wprowadzenie

Chirurgia rekonstrukcyjna w przypadku katastrofalnej utraty tkanki spowodowanej amputacją, urazami spowodowanymi wybuchem, nowotworami złośliwymi i wadami wrodzonymi są ograniczone przez dostępność tkanek od pacjenta i dodatkową chorobę spowodowaną w miejscu dawczym. W niektórych przypadkach, takich jak ofiary oparzeń lub osoby po amputacji czworobocznej, żywa tkanka do rekonstrukcji nie jest dostępna od pacjenta. W 1964 roku w Ekwadorze przeprowadzono pierwszy nowoczesny przeszczep ręki. Chociaż był to sukces techniczny, dostępna w tamtym czasie immunosupresja była niewystarczająca, aby zapobiec odrzuceniu, a przeszczep został utracony w czasie krótszym niż 3 tygodnie1. W latach 1998 i 1999 pierwsze przeszczepy ręki w nowoczesnej erze immunosupresji przeprowadzono w Lyonie we Francji2 i Louisville, Kentucky, USA3. Po raz pierwszy chirurdzy rekonstrukcyjni mogli zastąpić podobne podobnym. Przeszczep twarzy został po raz pierwszy wykonany w 2005 roku4, a obecnie rutynowo wykonuje się szereg innych przeszczepów VCA, takich jak ściana brzucha5, przeszczepy macicy i układu moczowo-płciowego6.

W przeciwieństwie do przeszczepu narządów stałych, większość technik VCA wiąże się z obecnością wysoce antygenowej skóry dawcy. Doświadczenie kliniczne wykazało, że ostre odrzucenie skóry jest stosunkowo łatwe do opanowania, ale może przyczyniać się do chronicznego odrzucania leżących poniżej tkanek i naczyń, które nie reagują dobrze na leczenie7. Dysfunkcja naczyń krwionośnych związana z odpowiedzią alloimmunologiczną jest bardziej złowieszczą przeszkodą dla pola VCA7. Makrowaskulopatie prowadzą do deficytów perfuzji, opóźnionego gojenia i stanów prozapalnych. Zarówno zlewająca się agresywna waskulopatia dużych naczyń, jak i ogniskowy przerost błony wewnętrznej występują u biorców przeszczepu dłoni7. Ponadto mikrowaskulopatie prawdopodobnie również przyczyniają się do powikłań VCA, a nawet mogą prowadzić do odrzucenia. Chociaż zarówno czynniki immunologiczne, jak i nieimmunologiczne prawdopodobnie odgrywają rolę w unaczynieniu biorców przeszczepu dłoni, specyficzne mechanizmy sprzyjające dysfunkcji dystalnych naczyń w VCA nie są znane, szczególnie w kontekście przewlekłego odrzucenia o niskim stopniu złośliwości. Te pytania bez odpowiedzi wymagają opracowania zwierzęcego modelu VCA, który pozwoli na seryjną ocenę przeszczepu podczas klinicznego przebiegu odrzucania/podtrzymywania VCA i waskulopatii. Taki model zapewni wgląd w odrzucenie i waskulopatię w obliczu immunosupresji, prowokacji infekcyjnej i/lub innego pooperacyjnego urazu8,9.

Prezentowany tutaj jest allogeniczny szczur VCA heterotopowy model płata kostno-skórnego kończyny tylnej. Opierając się na wcześniej opublikowanych modelach VCA, procedura ta jest technicznie łatwa do wykonania, powtarzalna w dużej liczbie i wykazuje minimalną zachorowalność i dyskomfort dla zwierzęcia biorcy. Model ten został zaprojektowany, aby umożliwić kliniczną i histopatologiczną ocenę akceptacji i odrzucenia VCA oraz daje możliwość oceny podstawowych mechanizmów immunologicznych i nieimmunologicznych zaangażowanych w odrzucenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie operacje na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Louisville (protokół 18198 zatwierdzony przez IACUC) oraz Przewodnik National Institutes of Health (NIH) dotyczący opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych10. Czteromiesięczny samiec rasy brązowo-norweskiej (RT1. An) i 4-miesięczny piesek Lewis (RT1. Al) szczury były wykorzystywane odpowiednio jako dawca i biorca VCA.

1. Pobieranie alloprzeszczepu dawcy

  1. Uspokaj zwierzę dawcy za pomocą odparowanego izofluranu podawanego przez komorę.
  2. Ogolić obszar dawczy przeszczepu (kończyna tylna), a także okolice pachwiny i brzucha. Następnie potraktuj kremem do depilacji, aby zmniejszyć ilość meszku pozostawionego przez maszynkę do strzyżenia.
  3. Głęboko znieczulić zwierzęta dawcy za pomocą dootrzewnowej (IP) ketaminy (60 mg/kg)/ksylazyny (15 mg/kg)/acepromazyny (2 mg/kg). Podawać dawkę początkową 0,2 ml/100 g masy ciała i dodatkowe dawki 0,2 ml co godzinę. Dla wygody można wykonać ten krok przed krokiem 2.
  4. Stale monitoruj zwierzęta pod narkozą pod kątem oddychania, temperatury ciała i głębokości znieczulenia, korzystając z testu odruchu odruchu odsuwania szczypania palców u stóp.
  5. Przed zabiegiem należy podać 30 j. roztworu heparyny podskórnie (SC) w okolicę karku, aby zapobiec zakrzepom.
  6. Noś maskę, nakrycie głowy, jednorazowy fartuch izolacyjny i jednorazowe rękawiczki.
  7. Umieść zwierzę dawcy na wznak na poduszce grzewczej. Stwórz sterylne pole operacyjne poprzez przygotowanie, szorowanie i udrapowanie obszaru operacyjnego, w tym zarówno brzusznej, jak i grzbietowej części nogi. Załóż sterylne rękawiczki.
  8. Wykonaj 3 cm nacięcie skóry we wklęsłości pachwiny za pomocą ostrza skalpela #15 i odbij bocznie pachwinową poduszeczkę tłuszczową za pomocą nożyczek do tęczówki.
  9. Odsłoń wspólne naczynia udowe i umieść druciany haczyk z elastyczną opaską, aby cofnąć mięśnie brzucha.
  10. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego (40x) należy wyciąć szypułkę proksymalnie od pojawienia się wspólnych naczyń udowych pod więzadłem pachwinowym i dystalnie do zbiegu naczyń podkolanowych do przeszczepu.
  11. Za pomocą mikroklipsów i bipolarnych kleszczyków jubilerskich podwiązaj i podziel duże gałęzie tętnicze i żylne, takie jak boczne naczynia udowe obwodowe, powierzchowne naczynia nadbrzusza ogonowego, tętnica odpiszczelowa i proksymalne ogonowe naczynia udowe, aby zmobilizować główne naczynia udowe. Kauteryzuj wszelkie małe gałęzie za pomocą cienkich kleszczy bipolarnych.
  12. Wykonaj nacięcie skóry od środka poprzedniej skóry przeciętej wzdłuż brzusznej strony kończyny tylnej, do okolicy kostki, za pomocą nożyczek do tęczówki.
  13. Przetnij mięsień gracilis, a także inne mięśnie przywodzicieli pod nim, w pionie, aby odsłonić i podwiązać przyśrodkowe proksymalne naczynia kolanowe, głęboko rozgałęzione małe naczynia i nerw kulszowy.
    nuta: W tym momencie, na osobnym stole operacyjnym, drugi chirurg powinien zaintubować i znieczulić (2,5%-3% izofluranu) zwierzę biorcze; Dzięki temu chirurdzy mogą przygotować miejsce operacji biorcy na czas do wszczepienia przeszczepu i zminimalizować czas niedokrwienia przeszczepu.
  14. Na zwierzęciu dawcy wykonaj obwodowe nacięcia skóry na poziomie kolana i kostki. Odłącz kolano i kostkę, usuń obce mięśnie i tkanki, a następnie wykonaj pionowe nacięcie skóry po grzbietowej stronie kończyny tylnej, aby uwolnić przeszczep. W tym miejscu przeszczep (złożony z kości strzałkowej i piszczelowej, pokryty powiązanymi mięśniami i wyspą skórną odżywianą przez jego perforatory) jest połączony tylko szypułką.
  15. Umieść małe zaciski jak najbardziej proksymalnie na tętnicy i żyle udowej i przetnij szypułkę jak najprężej, w pobliżu więzadła pachwinowego.
  16. Aby wypłukać przeszczep krwi, wstrzyknąć heparynizowaną sól fizjologiczną (30 U/ml) do tętnicy udowej za pomocą kaniuli płuczącej 27 G.
    nuta: Rozszerzenie tętnicy przed płukaniem heparyną umożliwia łatwy dostęp do wprowadzenia kaniuli. Podczas płukania należy uważnie monitorować odpływ z żyły udowej. Gdy przezroczysty płyn opuści żyłę udową, zatrzymaj płukanie.
  17. Owiń wyizolowany przeszczep w ciepłą gazę nasączoną solą fizjologiczną i natychmiast przetransportuj go na stół biorcy. W tym czasie miejsce operacyjne biorcy powinno być już przygotowane do zespolenia naczyniowego.
  18. Po pobraniu przeszczepu należy natychmiast poddać szczura dawcy eutanazji za pomocą odmy opłucnowej.

2. Operacja transplantacji biorcy

  1. Po indukcji sedacji za pomocą odparowanego izofluranu podawanego przez komorę, należy głęboko znieczulić zwierzę biorcy za pomocą rurki dotchawiczej sterowanej respiratorem i 2,5%-3% izofluranu.
    nuta: Na tym etapie szczur dawca jest nadal znieczulony.
  2. Stale monitoruj tętno, częstość oddechów, temperaturę ciała i głębokość znieczulenia zwierzęcia biorcy, korzystając z testu odruchu odruchu wycofania palca u nogi.
  3. Aby zapobiec odwodnieniu i hipoglikemii, należy wstrzyknąć 2 ml roztworu Ringera z mleczanami i 2,5% dekstrozy podskórnie na początku i kolejne 2 ml na końcu operacji.
  4. Ogol obszar pachwiny, a następnie potraktuj kremem do depilacji, aby zmniejszyć ilość meszków pozostawionych przez maszynki do strzyżenia.
  5. Noś maskę, nakrycie głowy, jednorazowy fartuch izolacyjny i sterylne rękawiczki.
  6. Połóż zwierzę na wznak na poduszce grzewczej. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec otarciom rogówki podczas znieczulenia. Wytwórz sterylne pole chirurgiczne, przygotowując, szorując i udrapując obszar operacyjny.
  7. Wykonaj 3 cm nacięcie skóry we wklęsłości pachwiny za pomocą ostrza skalpela #15 i odbij bocznie pachwinową poduszeczkę tłuszczową za pomocą nożyczek do tęczówki.
  8. Odsłoń wspólne naczynia udowe i umieść druciany haczyk z elastyczną opaską, aby cofnąć mięśnie brzucha.
  9. Liguj i dziel gałęzie Murphy'ego.
  10. Za pomocą nylonowych szwów przerywanych 10-0 zespolej naczynia dawcze z naczyniami biorczymi za pomocą techniki żylnej od końca do boku i techniki tętniczej od końca do końca. Stopniowo uwalniaj zaciski z tętnicy, a następnie z żyły. Monitoruj miejsca zespolenia pod kątem krwawienia i w razie potrzeby dodaj dodatkowe szwy.
  11. Wizualna ocena zespolenia naczyniowego w celu zapewnienia skutecznej reperfuzji przeszczepu.
  12. Umieść przeszczep w kieszonce pachwinowej i ustaw go do góry nogami, tak aby staw skokowy był górny, a staw kolanowy dolny.
  13. Za pomocą szwów podwijających przymocuj przeszczep do sąsiednich mięśni. Zamknij skórę za pomocą przerwanego poziomego materaca wchłanialne szwy 4-0.
  14. Usunąć zwierzę biorcy ze znieczulenia i odłączyć je od respiratora. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej w celu wsparcia termicznego.
    nuta: Całkowity czas operacji wynosi od 3 do 4 godzin, w zależności od doświadczenia chirurga i znajomości zabiegu chirurgicznego.
  15. Meloksykam (1 mg/kg) należy podawać podskórnie w celu złagodzenia bólu i obserwować do momentu, aż zwierzę w pełni wyzdrowieje i będzie w pełni mobilne.

3. Monitorowanie odbiorcy VCA

  1. Trzymaj szczury biorcę pojedynczo i monitoruj je codziennie pod kątem klinicznych objawów bólu, odwodnienia, utraty masy ciała i zmniejszonej aktywności, a także niepowodzenia chirurgicznego (przez pierwsze 48-72 godziny) lub odrzucenia. Meloksykam należy podawać podskórnie (1 mg/kg mc.) dziennie przez pierwsze 3 dni w celu złagodzenia bólu.
  2. Na podstawie punktu końcowego badania wybierz lek immunosupresyjny, który ma być podawany.

4. Histologia

  1. W znieczuleniu wziewnym izofluranem (2,5%-3%) należy pobrać seryjne biopsje skóry i mięśni znajdujących się pod nią od dawcy w pożądanych punktach czasowych. Przed uzyskaniem biopsji należy wyszorować i udrapować skórę, a następnie wykonać sterylne pole i technikę.
  2. Zamknij ranę jednym lub dwoma szwami, używając wchłanialnych szwów 4-0. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i pozwól mu dojść do siebie po znieczuleniu.
  3. Utrwal biopsyjne tkanki w oddzielnych probówkach w 10% formalinie.
  4. W końcowym punkcie czasowym i w znieczuleniu wziewnym izofluranem (2,5%-3%) należy wykonać większą biopsję skóry, która obejmuje granicę dawca/biorca. Ostrożnie zlokalizuj parę smyczy naczyń w miejscu zespoleń; Prawidłowe miejsce będzie widoczne dzięki szwom. Pobrać żądane próbki naczyń z tętnicy i/lub żyły. Utrwal wszystkie próbki osobno w 10% formalinie. Po pobraniu próbek tkanek, gdy zwierzę jest jeszcze pod narkozjozjozą, należy natychmiast poddać zwierzę eutanazji przez odmę opłucnową.
  5. Używając procesora tkanek (lub innej preferowanej techniki osadzania), każda biopsja jest osadzana w parafinie we własnym bloku. W przypadku próbek skóry należy ustawić tkankę tak, aby wszystkie warstwy naskórka i skóry właściwej były widoczne w jednym plasterku. W przypadku próbek z naczyń należy ustawić je w taki sposób, aby można było uzyskać przekroje poprzeczne.
  6. Za pomocą mikrotomu wyciąć odcinki o grubości 6 μm i nałożyć je na szkiełka do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E).
  7. Plama dla BHP przy użyciu standardowego protokołu.
  8. Uzyskaj reprezentatywne obrazy wszystkich pożądanych próbek tkanek za pomocą technik mikroskopii jasnego pola.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szczurzy model heterotopowej płata kostno-mięśniowo-skórnego kończyny tylnej VCA umożliwia długotrwałe przeżycie allograftu w warunkach immunosupresji. Model ten jest wiarygodny, powtarzalny i prosty w wykonaniu. Płat jest dobrze ukryty w okolicy pachwinowej i wiąże się z minimalną zachorowalnością oraz dyskomfortem dla zwierzęcia. Stan skóry jest klinicznym przejawem przeżycia lub odrzucenia allograftu (Rycina 1). Konstrukcja płata pozwala na ogólną obserwację kliniczną i stwarza możliwość ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowując ten model VCA, wzięto pod uwagę kilka kluczowych kwestii. Po pierwsze, ważne było, aby w przeszczepie uwzględnić nienaruszoną kość (piszczel i strzałkową), szpik kostny i skórę. Podczas gdy kliniczne przeszczepy rąk od dorosłych dawców nie przenoszą znacznych ilości aktywnie krwiotwórczego szpiku, badania nad rolą niszy szpiku kostnego są lepiej odzwierciedlone przy użyciu nienaruszonej, unaczynionej kości, a nie przeciętej kości długiej, co powoduje zwłóknienie odsłoniętego szpiku. Co więcej, zamknięta konst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia poprzez Kongresowo Kierowany Program Badań Medycznych pod numerem nagrody W81XWH-13-2-0057. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autorów i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcepromazynaHenry Schein5700850
Adventitia NożyczkiASSI 
Zacisk aproksymatora (podwójny)ASSIABB2V, ABB22V
Zacisk aproksymatora (pojedynczy)FST00398-02
Zacisk Kleszczyk do nakładaniaASSI CAF4
Nożyczki preparacyjneASSISDS18R8
igła do płukania 27 GSAI
Heparyna Spod sodu25021-400-30
IzofluranPatterson Weterynaryjny14043-704-06
Jubilerzy BipolarniASSI103000BPS03
Kleszcze jubilerskie #3FST11231-30
Ketamina HCl 100 mg/mlZoetis043-304DEA Wymagana licencja
Lactated Ringer SolutionHospira0409-7953-03
Lactany roztwór Ringera + 5% dekstrozaHospira0409-7953-09
MeloxicamHenry Schein11695-6925-2
MikrokleszczykiASSI JFAL3
Mikro uchwyt na igłyASSIB138
Prograf (takrolimus) 5 mg/mlAstellas0469-3016-01
Szew, 10-0 ProleneEthiconW2790lub 10-0 Ethilon (2830)Szew
, 4-0 Powlekany VicrylEthiconJ714D
Kleszczyki do rozszerzania naczyńASSID5AZ
KsylazynaVetOne13985-612-50
SAS15R8

Bibliografia

  1. Gilbert Fernandez, J. J., Febres-Cordero, R. G., Simpson, R. L. The Untold Story of the First Hand Transplant: Dedicated to the Memory of one of the Great Minds of the Ecuadorian Medical Community and the World. Journal of Reconstructive Microsurgery. , (2018).
  2. Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: report on first 6 months. Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
  3. Jones, J. W., Gruber, S. A., Barker, J. H., Breidenbach, W. C. Successful hand transplantation. One-year follow-up. Louisville Hand Transplant Team. The New England Journal of Medicine. 343 (7), 468-473 (2000).
  4. Devauchelle, B., et al. First human face allograft: early report. Lancet. 368 (9531), 203-209 (2006).
  5. Broyles, J. M., et al. Functional abdominal wall reconstruction using an innervated abdominal wall vascularized composite tissue allograft: a cadaveric study and review of the literature. Journal of Reconstructive Microsurgery. 31 (1), 39-44 (2015).
  6. Kollar, B., et al. Innovations in reconstructive microsurgery: Reconstructive transplantation. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 800-806 (2018).
  7. Kaufman, C. L., et al. Graft vasculopathy in clinical hand transplantation. American Journal of Transplantation. 12 (4), 1004-1016 (2012).
  8. Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
  9. Kaufman, C. L., et al. Immunobiology in VCA. Transplantation International. 29 (6), 644-654 (2016).
  10. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute for Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  11. Nazzal, J. A., Johnson, T. S., Gordon, C. R., Randolph, M. A., Lee, W. P. Heterotopic limb allotransplantation model to study skin rejection in the rat. Microsurgery. 24 (6), 448-453 (2004).
  12. Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Klapka ko czyny tylnej szczuraheterotopowy model przeszczepumikrochirurgiczne zespolenieterapia immunosupresyjnaprzewlek e odrzucanieneuropatia niedokrwiennabiopsja przeszczepuobrazowanie Dopplerat tnica udowa

Powiązane artykuły