Linie komórkowe Drosophila są ważnymi odczynnikami zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych. Ten artykuł zawiera protokoły rozmrażania, subhodowli i kriokonserwacji powszechnie stosowanych linii komórkowych Drosophila, aby pomóc naukowcom w włączeniu tych odczynników do ich badań.
Artykuł metodologiczny
Rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecnie istnieje ponad 160 różnych linii komórkowych Drosophila dystrybuowanych przez Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Oczekuje się, że dzięki inżynierii genomu liczba nowych linii komórkowych wzrośnie. DGRC ma na celu zapoznanie naukowców z wykorzystaniem linii komórkowych Drosophila jako narzędzia eksperymentalnego uzupełniającego i napędzającego ich program badawczy. Podano procedury pracy z różnymi liniami komórkowymi Drosophila o różnych cechach, w tym protokoły rozmrażania, hodowli i kriokonserwacji linii komórkowych. Co ważne, publikacja ta przedstawia najlepsze praktyki wymagane do pracy z liniami komórkowymi Drosophila w celu zminimalizowania ryzyka zanieczyszczeń mikroorganizmami przypadkowymi lub innymi liniami komórkowymi. Naukowcy, którzy zapoznają się z tymi procedurami, będą mogli zagłębić się w wiele zastosowań wykorzystujących komórki hodowane przez Drosophila, w tym biochemię, biologię komórki i genomikę funkcjonalną.
Wprowadzenie
Wykorzystanie komórek hodowanych przez Drosophila uzupełnia analizę genetyczną much in vivo i służy jako podstawowe narzędzie do rozwiązywania wielu podstawowych pytań biologicznych1,2,3. Linie komórkowe Drosophila oferują unikalne, jednorodne populacje komórek pochodzących z różnych źródeł tkankowych o różnym pochodzeniu genetycznym. Linie komórkowe nadają się do wielu zastosowań, w tym do transgenicznej ekspresji genów, genomiki, transkryptomiki, proteomiki, metabolomiki, wysokoprzepustowych badań przesiewowych interferencji RNA (RNAi), biologii komórki i mikroskopii. Co ważne, zastosowanie hodowli komórek Drosophila ułatwia scharakteryzowanie natychmiastowych reakcji czasowych na znane bodźce. Co więcej, hodowla komórek Drosophila jest podatna na edycję genomu CRISPR-Cas9, dzięki czemu stosunkowo łatwo jest tworzyć nowe linie komórkowe z określonymi modyfikacjami genomu4,5,6,7.
Centrum Zasobów Genomiki Drosophila (DGRC) służy jako repozytorium i centrum dystrybucji dla linii komórkowych Drosophila. Jednym z celów DGRC jest pomoc członkom społeczności naukowej w korzystaniu z zasobów hodowli komórek Drosophila. W artykule przedstawiono podstawowe protokoły postępowania z liniami komórkowymi Drosophila. Uzupełnia istniejące zasoby, aby pomóc naukowcom oswoić się z hodowlami komórek Drosophila i osiągnąć pewien poziom niezależności w swoich eksperymentach1,2,8,9,10.
Najczęściej używanymi liniami komórkowymi Drosophila są: Linie Schneidera11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginal disc and central nervous system (CNS) lines13,14, Milner laboratory imaginal disc lines15, dorosłe linie komórkowe jajników16,17, oraz linie Ras18 (Tabela 1). Linie Schneidera i Kc167 są ogólnymi, uniwersalnymi liniami komórkowymi do stosowania w biochemii, rekombinowanej ekspresji genów transgenicznych i odwrotnych badaniach genetycznych. Linie laboratoryjne Mitsubishi/Miyake (ML) wywodzą się albo z dysków wyobrażonych larw, albo z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i były przydatne w badaniach związanych z neurowydzielaniem, regulacją transkrypcji i przetwarzaniem RNA. Linie dysków Milnera (CME) były ważne dla badania transdukcji sygnału. Linie komórkowe fGS/OSS pochodzące ze zmutowanych dorosłych jajników pozostają ważnymi odczynnikami do badania wpływu niekodującej biologii małego RNA na utrzymanie i różnicowanie komórek rozrodczych17,19. Wreszcie, linie Ras są wyjątkowe, ponieważ są to linie komórkowe pochodzące z zarodków ektopowo wyrażających onkogen Ras. Mają one sygnaturę transkrypcyjną komórek prekursorowych mięśni i wyrażają aktywną maszynerię piRNA20. Ostatnie artykuły przeglądowe i rozdziały książek omawiają zastosowania tych popularnych linii komórkowych z większą ilością szczegółów2,3,9.
Wszystkie te linie komórkowe mogą być subhodowane i zamrażane. Istnieją niewielkie, ale ważne wymagania dotyczące tego, jak każda linia komórkowa jest utrzymywana i przygotowywana do krioprezerwacji. Na przykład odrębne linie komórkowe wymagają różnych pożywek i suplementów (Tabela 1). Linie różnią się również właściwościami przylegania do powierzchni, morfologią (Rysunek 1 i Rysunek 2), genotypem i czasem podwojenia (Tabela 2). Przedstawiamy podstawowe protokoły i podkreślamy unikalne różnice w obsłudze różnych szeroko stosowanych linii komórkowych Drosophila.
Protokół
1. Rozmrażanie i rewitalizowanie zamrożonych linii komórkowych Drosophila
- Wysterylizuj kaptur, przecierając powierzchnię roboczą 70% etanolem. Dozować 5 ml odpowiedniej pożywki (Tabela 1) do kolby T o średnicy25 cm (T-25).
- Usunąć kriofial/ampułkę z płynuN2 lub suchego lodu. Przetrzyj kriowial 70% etanolem, ostrożnie poluzuj i rozszczelnij ampułkę.
- Za pomocą pipety Pasteura pobrać 1 ml pożywki o temperaturze pokojowej (RT) z kolby T-25. Powoli dodawaj pożywkę do kriowialu i delikatnie mieszaj, aby rozmrozić zamrożone komórki, upewniając się, że zawiesina komórek nie przeleje się.
- Przenieść całą objętość zawiesiny rozmrożonych komórek z ampułki do kolby T-25. Powtórz tę czynność, aby upewnić się, że zawiesina komórek została całkowicie przeniesiona.
- Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 25 °C, pozwalając komórkom osiąść i przylegać przez co najmniej 2 godziny. Zbadać komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek osiadła na powierzchni wzrostu. Delikatnie usuń stare podłoże i zastąp je 5 ml świeżym. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze.
- Następnego dnia delikatnie usuń stare podłoże i zastąp je 5 ml świeżym. Przywróć kulturę do inkubatora.
2. Rozmrażanie i rewitalizacja zamrożonych linii komórkowych Drosophila (alternatywnie)
- W sterylnym kapturze rozmrozić komórki, ponownie zawieszając zamrożone osady z 1 ml pożywki RT. Przenieść całą rozmrożoną zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Osadzać komórki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżej pożywki.
- Przenieść całą objętość zawiesiny komórkowej do kolby T-25 i inkubować kulturę w temperaturze 25 °C.
- 1 do 2 godzin później zbadaj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek osiadła na rosnącej powierzchni. Następnego dnia zastąp starą pożywkę 5 ml świeżej pożywki i włóż kulturę z powrotem do inkubatora.
3. Hodowla komórek póładherentnych hodowanych na 100 mm płytkach hodowlanych
- Wysterylizuj kaptur, wycierając go 70% etanolem. Do kaptura należy włożyć sterylne materiały do subkulturacji, w tym butelki z pożywką, pipety, przyrząd do pipet i płytki hodowlane.
- Zbadaj morfologię i zbieg kultury pod mikroskopem. Szukaj wyraźnych oznak skażenia mikroorganizmami w kulturze. Określ, czy komórki są gotowe do pasażu, w oparciu o charakterystykę hodowli: gęstość komórek i czas podwojenia, w tym ostatni raz, kiedy były subhodowane.
- Jeśli kultura wydaje się wysoce zlewająca (Rysunek 1), określ gęstość komórek. W sterylnym kapturze usuń komórki z powierzchni wzrostu, odpipetowując do 10 ml pożywki z płytki i dozując ją na komórki. Powtórz kilka razy, uważając, aby nie tworzyć piany, aż powierzchnia do uprawy stanie się czysta. Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika cząstek (sekcja 5, Rysunek 3). Subkultura komórek, jeśli gęstość komórek wynosi od 5 x 106 do 1 x 107 komórek/ml.
nuta: Nie należy subkulturować linii komórkowych Drosophila do gęstości komórek poniżej 1 x 106 komórek/ml. - Rozcieńczyć zawiesinę komórkową odpowiednio, używając odpowiedniej pożywki, do końcowego stężenia wysiewu co najmniej 1 x 106 komórek/ml.
- W przypadku rutynowego pasażowania i konserwacji należy dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do wcześniej określonej objętości pożywki na nowej płytce hodowlanej, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek wysiewu.
- W celu zwiększenia skali hodowli należy przenieść całą zawiesinę komórek do dużej kolby. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do pożądanej gęstości komórek odpowiednią objętością pożywki. Rozprowadzić równe objętości rozcieńczonej zawiesiny komórkowej na nowe płytki. Ta metoda minimalizuje różnice w gęstości komórek między płytkami.
- Przykryj i oznacz płytki inicjałami operatora, datą, stosunkiem podziału, gęstością komórek wysiewu, identyfikatorem linii komórkowej, pożywką, numerem pasażu i wszelkimi dodatkami pożywki, takimi jak antybiotyki.
- Umieść płytki w plastikowym pojemniku i włóż pudełko z powrotem do inkubatora.
UWAGA: W tabeli 3 wymieniono naczynia hodowlane powszechnie używane do hodowli linii komórkowych Drosophila i związane z nimi objętości robocze.
4. Przemieszczanie przylegających komórek hodowanych na 100 mm płytkach hodowlanych
- Przenieść całe podłoże z płytki do nowej sterylnej kolby. Zapisz nośnik.
- Opłucz komórki, powoli dodając do płytki 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie obracaj, aby upewnić się, że roztwór trypsyny pokrywa całą powierzchnię wzrostu. Wyrzuć roztwór trypsyny.
- Delikatnie dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C między 3-10 minutami, monitorując widoczne oznaki odklejania się warstwy komórkowej i zsuwania się z powierzchni wzrostu.
- Dodaj 9 ml zapisanej pożywki do płytki, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Wymieszaj zawiesinę komórkową, aby zdysocjować grudki komórek. Gdy wszystkie komórki zostaną usunięte, powierzchnia do uprawy będzie czysta.
nuta: Stosowanie enzymów trawiennych, takich jak trypsyna, pomaga w przechodzeniu silnie przylegających linii komórkowych. Trypsyna jest mieszaniną proteaz często pochodzących z trzustki świni i jest dostępna w handlu w różnych stopniach czystości.
5. Ręczne liczenie komórek za pomocą suwaka do liczenia komórek Neubauera
- Przygotuj szkiełko hemocytometryczne i szkiełko nakrywkowe, przecierając powierzchnię 70% alkoholem.
- Wymieszaj zawiesinę komórek i dozuj 15 μl zawiesiny komórek do rowkowanej krawędzi hemocytometru (Rysunek 3A), aby wypełnić pierwszą komorę hemocytometru. Napełnij drugą komorę hemocytometru. Zawiesina komórek zostanie wciągnięta do komory zliczającej przez działanie kapilarne.
- Używając obiektywu mikroskopowego 10x, policz komórki w obszarze 1 mm2 w środku siatki ograniczonej równoległymi liniami (Rysunek 3C, D). Aby uniknąć zduplikowanego zliczania, należy policzyć komórki, które nakładają się na górną i lewą granicę, ale nie komórki, które przecinają prawą i dolną granicę kwadratów o wielkości 200μm2. Policz od 100 do 200 komórek. Powtórz liczenie z drugą komorą.
- Oblicz średnią z dwóch zliczeń i określ gęstość komórek zgodnie z następującym wzorem: Gęstość komórek (komórki/ml) = średnia liczba komórek (n1 + n2/2) x 104,
nuta: Żywotność komórek jest wyrażona jako procent żywotnych komórek w stosunku do wszystkich komórek. Aby określić żywotność komórek, wymieszaj zawiesinę komórek z równą objętością roztworu błękitu trypanowego (0,4%) przed ręcznym lub automatycznym liczeniem komórek. Żywe komórki nie przyjmą barwnika, podczas gdy martwe komórki zostaną zabarwione na niebiesko.
6. Kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila
- Sprawdź kulturę pod kątem zdrowej morfologii, wzrostu i braku zanieczyszczeń. Zbieraj kultury od środkowej do późnej fazy wzrostu (krok 3.3 lub sekcja 4). W przypadku wielu linii komórkowych Drosophila jest to w przybliżeniu od 4 x 106 komórek/ml do 8 x 106 komórek/ml.
- Przenieść całą zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w objętości pożywki do zamrażania (Tabela 4), co spowoduje uzyskanie końcowej gęstości komórek co najmniej 4 x 107 komórek/ml.
- Dodawać kroplami odpowiednią ilość krioprotektantu dimetylosulfotlenku (DMSO) do zawiesiny komórkowej tak, aby końcowe stężenie DMSO wynosiło 10%. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową.
- Ostrożnie dozować 0,5 ml zawiesiny komórkowej do porcji wstępnie znakowanych kriowialiów (~2 x 107 komórek/fiolkę). Umieść ampułki w pojemniku do zamrażania wypełnionym izopropanolem (Rysunek 4A). Przenieść pojemnik do zamrażania do zamrażarki o temperaturze -80 °C na noc, aby temperatura kriowiali powoli spadała (-1 °C/min) do temperatury zamrażarki.
- Wyjmij zamrożone kriowiale i szybko przymocuj je do trzciny (Rysunek 4B). Włóż laski zawierające kriowiale do kanistra (Rysunek 4C). Alternatywnie, umieść zamrożone kriowiale w wstępnie schłodzonym pudełku do zamrażania (Rysunek 4D). Przechowywać zamrożone kriowiale w fazie ciekłej zamrażarek N2 ( Rysunek 4E,F).
nuta: W przypadku stosowania pożywek zamrażających zawierających DMSO, opóźnienie do 30 minut w temperaturze pokojowej nie jest szkodliwe dla komórek.
Wyniki
Ważne jest, aby zamrożone komórki Drosophila rozmrażać szybko i hodować je przy gęstości komórek, która przywróci kulturę do fazy wzrostu. Jeśli przestrzegane są procedury krio konserwacji i rozmrażania, gęstość komórek w kolbie T-25 będzie wynosić co najmniej 4 x 106 cells/mL. Od jednej do dwóch godzin po rozmrożeniu większość linii komórkowych Drosophila zacznie przylegać do powierzchni wzrostu. W przypadku, gdy większość komórek nie przylgnie do powierzchni wzrostu w ciągu dwóch godzin od rozmrożenia, zaleca się inkubację komórek przez noc przed wymianą pożywki.
Celem subkulturowania jest utrzymanie komórek w zdrowej, wykładniczej fazie logarytmicznej krzywej wzrostu. Kryteria subkulturowania zależą od widocznego braku zanieczyszczeń mikroorganizmami, gęstości komórek oraz potrzeby ustalenia regularnego harmonogramu utrzymania hodowli. Przed zamrażaniem ważne jest, aby najpierw ocenić stan zdrowia komórek i stwierdzić brak przypadkowych zanieczyszczeń. Większość zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych można łatwo wykryć za pomocą zwykłej kontroli wizualnej. Zanieczyszczone hodowle można zidentyfikować po wzroście mętności pożywki. Pod mikroskopem zanieczyszczenia mogą występować w postaci pałeczek bakteryjnych, gronkowców, pączkujących komórek drożdży lub nitkowatych strzępek grzybni. Inne źródła zanieczyszczeń, takie jak niecytopatyczne mycoplasma, nie mogą być wykryte wizualnie i mogą być rutynowo badane za pomocą testów opartych na PCR21.
Stopień konfluencji linii komórkowej można określić wizualnie (Rysunek 1). Szybko rosnące linie komórkowe osiągają konfluencję wcześnie i wymagają regularnego pasażowania. Takie linie są podkulturowane nawet dwa razy w tygodniu. Z kolei komórki wolno rosnące są pasażowane co najmniej raz na dwa tygodnie lub rzadziej. Należy jednak co tydzień dostarczać komórkom świeżą pożywkę. Zapobiega to wyczerpaniu składników odżywczych w medium i rozcieńcza produkty odpadowe metabolizmu komórkowego. Linie komórkowe pochodzące z różnych tkanek różnią się morfologią (Rysunek 2), właściwościami adhezyjnymi, wymaganiami dotyczącymi pożywek (Tabela 1) oraz czasem podwojenia liczby komórek (Tabela 2). W Tabeli 5, Tabeli 6, Tabeli 7 oraz Tabeli 8 przedstawiono przepisy na różne pożywki do hodowli komórek Drosophila.
Liczenie komórek zapewnia dokładne zagęszczenie wysiewu oraz przewidywalną rutynę podczas pasażowania. W eksperymentach ilościowych liczenie komórek jest niezbędne. Komórki liczy się za pomocą hemocytometru (Rysunek 3A) lub automatycznego licznika cząstek (Rysunek 3B). W przypadku korzystania z licznika automatycznego należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Ręczne liczenie komórek przy użyciu hemocytometru jest ekonomiczne i łatwe. Liczy się komórki znajdujące się w środkowych polach siatki Neubauera, a następnie oblicza gęstość komórek; na przykład dla n = 214 komórek gęstość komórek wynosi 2.14 x 106 cells/mL (Rysunek 3D).
Suspensję komórkową z dwóch płytek 100 mm, z których każda zawiera 10 mL suspensji komórkowej o zagęszczeniu 4 x 106 komórek/mL, zbiera się i resuspendsuje w 2 mL medium do zamrażania, aby uzyskać gęstość 4 x 107 komórek/mL. Każda zamrożona krioprobówka zawierająca 0,5 mL suspensji komórkowej zawiera 2 x 107 komórek. Po rozmrożeniu zgodnie z sekcją 1 protokołu pozwoli to na uzyskanie hodowli o zagęszczeniu 4 x 106 komórek/mL.
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy trzech różnych linii komórkowych Drosophila przy różnym stopniu konfluencji i gęstości komórek. (A) Kultura S2-DGRC przy gęstości 1 x 106 cells/mL. (A') Kultura S2-DGRC przy gęstości 4.5 x 106 cells/mL. (B) Kultura ML-BG2-c2 przy gęstości 2 x 106 cells/mL. (B') Kultura ML-BG2-c2 przy gęstości 8 x 106 cells/mL, w której komórki piętrzą się i agregują w formie ognisk. (C) Kultura OSS przy gęstości 1 x 106 cells/mL. (C') Kultura OSS przy gęstości 4 x 106 cells/mL. Komórki w zawiesinie nie znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy ośmiu odrębnych linii komórkowych Drosophila. (A) Okrągłe komórki S2-DGRC pochodzące z zarodka. (B) Okrągłe komórki Kc167 pochodzące z zarodka. (C) Okrągłe komórki ML-BG2-c2 pochodzące z OUN larwy. (D) Okrągłe, wrzecionowate komórki ML-BG3-c2 pochodzące z larwy. (E) CME L1, linia komórkowa pochodząca z tarczek imaginarnych nogi larwy, jest mniejsza i posiada morfologię okrągłą/wrzecionowatą. (F) OSS, linia komórkowa pochodząca z jajników osobników dorosłych, wykazuje morfologię wrzecionowatą. (G) Wrzecionowata linia komórkowa RasV12 wykazująca ekspresję aktywnego białka Ras. (H) RasV12; wtsRNAi (WRR1), linia komórkowa wykazująca ekspresję aktywnego białka Ras oraz dwuniciowego RNA celującego w supresor nowotworowy warts (wts), wykazuje cechy nabłonkowe. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Gęstość komórek można określić ręcznie za pomocą hemocytometru lub automatycznie, korzystając z automatycznego licznika cząstek. (A) Hemocytometr z dwiema komorami. (B) Automatyczny licznik komórek wyświetlający wynik liczenia. (C) Udoskonalona siatka licząca Neubauera oglądana pod obiektywem 10x. Należy zliczyć komórki znajdujące się w obrębie centralnej siatki o objętości 0.1 mm3 (czerwony przerywany kwadrat). (D) Centralna siatka hemocytometru wypełniona komórkami do liczenia. Pasek skali = 1 mm (C); 0.2 mm (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Sprzęt do kriokonserwacji. (A) Pojemnik do mrożenia, w którym ampułki są przechowywane w pozycji pionowej w celu powolnego mrożenia. (B) Metalowy kaniule do trzymania zamrożonych ampułek. (C) Kanister do przechowywania kaniuli. (D) Plastikowy pojemnik do mrożenia (krioboks). (E) Kanister zawierający wiele kaniuli, umieszczony w zbiorniku do przechowywania ciekłego N2. (F) Zbiornik do przechowywania ciekłego N2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
| Linia komórkowa | Pożywki | Przyleganie | Trypsyna |
| Linie Schneidera | M3 + BPYE + 10% płodowa surowica cielęca (FCS), pH 6,6 | Półprzylepne | Nie |
| (S2R+, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4)11 | |||
| pożywka Schneidera+ + 10% FCS | |||
| linie Kc (Kc167, Kc7E10)21,22 | M3 + BPYE + 5% FCS, pH 6,6 | Półprzylepne | Nie |
| Hyclone-CCM3, pH 6,2 | |||
| Linie tarczek imaginalnych i OUN (linie ML)13,14 | M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6,6 | Półprzylepny | Nie |
| 10 µg/mL insulina | |||
| linie tarczek imaginalnych Milnera (linie CME)15 | M3 + 2% FCS | Półprzylegający | Nie |
| 5 µg/mL insulina | |||
| 2,5% ekstraktu z muchy | |||
| fGS/OSS16 | M3 + 10% FCS, pH 6,8 | Adherentne | * |
| 10 µg/mL insulina | |||
| 1 mg/ml C5H8KNO4 | |||
| 0,5 mg/ml KHCO33 | |||
| 0,6 mg/mL glutationu | |||
| 10% ekstrakt z muchy | |||
| RasV12 linie18 | M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6,6 | Przylegający | Tak |
Tabela 1: Właściwości i wymagania dotyczące pożywek dla różnych linii komórkowych Drosophila. Różne izolaty póładherentnych linii Schneidera, w tym S2R+, S2-Drosophila RNAi Screening Center (DRSC), S2-Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) oraz Sg4, to powszechnie stosowane linie komórkowe, które proliferują intensywnie w pożywce M3 + ekstrakt drożdżowy Bactopetone (BPYE) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Alternatywnie, zamiast M3+BPYE często stosuje się pożywkę Schneidera (pH 6,7-6,8). Linie Kc proliferują w pożywce M3 + BPYE (5% FCS) lub bezsurowiczej pożywce CCM3. Linie ML z tarcz wyobraźnych i ośrodkowego układu nerwowego (CNS) wymagają suplementacji insuliną w celu proliferacji. Linie Milnera z tarcz wyobraźnych wymagają suplementacji zarówno insuliną, jak i ekstraktem z muchy. Adherentne linie komórkowe fGS/OSS do wzrostu wymagają insuliny, wyższego stężenia ekstraktu z muchy oraz glutationu. Adherentne linie RasV12 dobrze rosną w pożywce M3 + BPYE (10% FCS). Trypsyny używa się do odrywania adherentnych linii komórkowych od powierzchni hodowlanej.
| Linia komórkowa (Nr katalogowy) | Genotyp | Czas podwojenia (h)* | Źródło tkanki |
| S2R+ (150) | OreR | 39 | Późne embriony |
| S2-DGRC (6) | OreR | 23 | Późne embriony |
| S2-DRSC (181) | OreR | 46 | Późne embriony |
| Kc167 (1) | e/se | 22 | zarodki w wieku 6–12 h |
| ML-BG2-c2 (53) | y v f mal | 48 | 3rd układ nerwowy larwy w danym stadium rozwojowym |
| ML-BG3-c2 (68) | y v f mal | 104 | 3rd układ nerwowy larwy w stadium rozwojowym |
| ML-DmD8 (92) | y v f mal | 66 | 3Badań i rozwoju płytka skrzydłowa larwy w stadium rozwojowym |
| CME W1 Cl.8+ (151) | OreR | 46 | 3B&R imaginalny krążek skrzydłowy larwy w stadium instaru |
| CME L1 (156) | OreR | 47 | 3rd przężlak kończyny larwalnej stadium instar |
| OSS (190) | bamD86 | 45 | Osoba dorosła bam mutacyjne jajniki |
| RasV12 linie | UAS-GFP; P(UAS-Ras85D.V12)/ P(Act5C-GAL4)17bFO1 | 41−65 | Zarodek |
Tabela 2: Genotyp, czas podwojenia i źródła tkanek szeroko stosowanych linii komórkowych Drosophila. Przedstawiono genotyp tkanki, źródło oraz czas podwojenia populacji powszechnie używanych linii komórkowych. Czas podwojenia oparto na wzroście w zalecanych pożywkach w temperaturze 25 °C.
| Naczynie hodowlane | Objętość pożywki (ml) |
| 12,5 cm2 kolba T | 2.5 |
| 25 cm2 kolba T | 5 |
| 75 cm2 kolba T | 15 |
| płytka 35 mm | 1 |
| szalka 60 mm | 4 |
| szalka 100 mm | 10 |
| płyta 384-dołkowa* | 0,04/do analizatora (do studzienki) |
| płytka 96-dołkowa* | 0,1/do dołka |
| płytka 48-dołkowa* | 0,3/do dołka |
| płytka 24-dołkowa* | 0,5/do studzienki |
| płytka 12-dołkowa | 1,0/dołek |
| płytka 6-dołkowa | 2,0/do dołka |
Tabela 3: Naczynia hodowlane i zalecane objętości pożywki. Do hodowli komórek Drosophila dostępne są naczynia hodowlane o różnych rozmiarach. Dla każdego naczynia zalecane są odpowiednie objętości pożywki (mL). Płytki wielodołkowe zawierające mniej niż 0,5 mL zawiesiny komórkowej należy uszczelnić folią parafinową, aby ograniczyć ubytek pożywki wskutek odparowania.
| Objętość | |
| M3 + BPYE, pH 6,6 | 70 mL |
| Inaktywowana termicznie FCS | 20 mL |
| DMSO filtrowany sterylnie* | 10 mL |
Tabela 4: Receptura na przygotowanie 100 mL medium do zamrażania (M3 + BPYE, 20% FCS, 10% DMSO). Przygotowywać media do zamrażania w miarę potrzeb i unikać długotrwałego przechowywania mediów zawierających DMSO.
| Pożywka M3 + BPYE | Ilość |
| Shields and Sang’s M323 | 1 butelka |
| KHCO3 | 0.5 g |
| Ekstrakt drożdżowy Select | 1.0 g |
| Bactopeptone | 2.5 g |
| Sterylna woda oczyszczona | 1000 mL |
Tabela 5: Skład pożywki do kultur tkankowych M3 + BPYE w ilości 1 L. Dostosować pH do wartości 6,6. Sterylizować poprzez przepuszczenie pożywki przez filtr 0,22 µm.
| Podstawowe pożywka M3 dla linii komórkowej fGS/OSS | Ilość |
| Shields and Sang M3 | 1 butelka |
| KHCO3 | 0.5 g |
| C5H8KNO4 | 1.0 g |
| Sterylna woda oczyszczona | 1,000 mL |
Tabela 6: Skład 1 L podstawowej pożywki fGS/OSS M3. Dostosować pH do 6,8. Sterylizować poprzez przepuszczenie pożywki przez filtr 0,22 µm.
| Hyclone-CCM3 | Ilość |
| proszek CCM3 | 28.6 g |
| NaHCO3 | 0.35 g |
| 10 N NaOH | 2.5 mL |
| CaCl2 | 0.5 g |
| Sterylna woda oczyszczona | 1,000 mL |
Tabela 7: Skład 1 L pożywki do hodowli tkankowej Hyclone-CCM3. Dostosować pH do 6.2. Sterylizować poprzez przefiltrowanie pożywki przez filtr 0.22 µm.
| M3 + BPYE + 10% FCS | podłoże do linii CNS i dysk Miyake | podłoże do linii komórkowych Milner disc | kompletna pożywka fGS/OSS | |
| M3 + BPYE, pH 6,6 | 90 mL | 90 mL | - | - |
| Inaktywowana termicznie FCS* | 10 ml | 10 ml | 2 mL | 10 mL |
| Insulina (10 mg/ml) | - | 100 µL | 50 µL | 100 µL |
| Ekstrakt z muchy | - | - | 2,5 ml | 10 mL |
| Glutation (60 mg/ml) | - | - | 1 mL | |
| M3, pH 6,6 | - | - | 97,5 mL | - |
| fGS/OSS M3, pH 6,8 | - | - | 79 ml |
Tabela 8: Przepis na przygotowanie 100 mL różnych powszechnie stosowanych pożywek do hodowli komórek Drosophila. Inkubować FCS w temperaturze 56 °C przez 1 h i wstrząsać co pięć minut w celu termicznej inaktywacji białek dopełniacza.
Dyskusja
Hodowle komórek Drosophila są podstawowymi odczynnikami do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na komórkach. Ich zastosowanie uzupełnia również badania genetyczne in vivo, zapewniając jednorodną populację komórek nadających się do biochemii, szybkiego testowania konstruktów transgenicznych przed wstrzyknięciem do much, biologii komórki, mikroskopii, a ostatnio manipulacji genetycznych komórek somatycznych poprzez edycję genomu 1,2,3,8,9,10.
Żywotność i regeneracja zamrożonych komórek Drosophila jest wrażliwa na drastyczne wahania nawet w niskich temperaturach. DGRC przechowuje zamrożone linie komórkowe w fazie ciekłej N2 (-196 °C) i transportuje je w suchym lodzie (-78,5 °C). Zamrożonych ampułek, które były transportowane w suchym lodzie, nie należy przenosić z powrotem do cieczyN2 lub zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. Zamiast tego zamrożone komórki powinny zostać rozmrożone, ponownie zasiane w wysokiej gęstości komórek tak szybko, jak to możliwe po przybyciu (sekcja 1 protokołu) i hodowane zgodnie z ich przeznaczeniem (sekcja 3 protokołu). Jeśli linie komórkowe nie zostaną natychmiast wykorzystane do eksperymentów, linie komórkowe powinny zostać poddane krioprezerwacji (sekcja 6 protokołu) do czasu, aż będą gotowe do użycia.
Niektóre linie komórkowe, takie jak linie ML-BG2-c2 i Ras, potrzebują kilku dni, aby dojść do siebie po skutkach ożywienia ze stanu kriokonserwacji. Znaczna ilość szczątków komórkowych towarzyszy tym liniom komórkowym w ciągu pierwszych kilku dni po rozmrożeniu. Pozostawione w spokoju komórki zregenerują się i będą się namnażać. Wiele linii komórkowych Drosophila w DGRC zostało przystosowanych do wzrostu w pożywkach opartych na M322. W przypadku linii komórkowych, które powoli regenerują się po skutkach rozmrażania, przydatne może być użycie kondycjonowanych pożywek. Kondycjonowane pożywki prawdopodobnie zawierają czynniki wzrostu wydzielane przez komórki do pożywki, które mogą sprzyjać regeneracji i proliferacji komórek po rozmrożeniu.
Linie komórkowe na ogół podążają za stereotypową krzywą wzrostu składającą się z fazy opóźnienia, fazy wykładniczej, fazy plateau i fazy degradacji. Wiele linii komórkowych Drosophila namnaża się w logarytmicznej fazie wzrostu, gdy są hodowane w gęstości między 1 x 106 a 1 x 107 komórek/ml w temperaturze 25 °C. Istotne jest, aby linie komórkowe były pasażowane w taki sposób, aby zawsze znajdowały się w fazie wzrostu wykładniczego.
Zbieżność kultury, wyrażona w procentach, opisuje powierzchnię wzrostu pokrytą przez komórki. Zbieg komórek dla linii komórkowej zależy od jej kształtu i wielkości komórki. Odrębne linie komórkowe mają różną morfologię i właściwości przylegania. W rezultacie, różne linie komórkowe w przybliżeniu podobnej konfluencji mogą mieć znacznie różną gęstość komórek (ryc. 1). Zbieg kultur może nie być idealnym wskaźnikiem pasażowania kultur komórkowych Drosophila, ponieważ linie komórkowe Drosophila nadal się namnażają, gromadząc się jedna na drugiej jako ogniska lub w zawiesinie, nawet po pokryciu powierzchni wzrostu (ryc. 1). Jednak użytkownicy doświadczeni z określonymi liniami komórkowymi mogą często używać konfluencji jako szybkiego wizualnego przewodnika po tym, kiedy należy przeprowadzić subkulturę.
Chociaż możliwe jest hodowanie linii Drosophila w temperaturze otoczenia w temperaturze pokojowej w zakresie 19-25 °C, nie jest to zalecane, ponieważ wahania temperatury otoczenia mogą wpływać na tempo proliferacji. Zaleca się stosowanie dedykowanego inkubatora o temperaturze 25 °C. Inkubator do hodowli komórek Drosophila nie musi ułatwiać wymiany gazowej CO2 , ponieważ pożywki do hodowli komórkowych Drosophila nie wykorzystują CO2 do buforowania. Wilgotność wewnątrz inkubatora do hodowli linii komórkowych jest ważnym czynnikiem, którego nie należy przeoczyć podczas hodowli komórek na płytkach. W zależności od rodzaju inkubatora i środowiska pracy może być konieczne umieszczenie w nim zlewki ze sterylną wodą. Aby zminimalizować parowanie pożywki, należy używać zamkniętej kolby T lub przechowywać płytki hodowlane w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku wewnątrz inkubatora.
Ważne jest, aby opracować harmonogram subhodowli linii komórkowych Drosophila . Aby oszacować tempo wzrostu i monitorować spójność, wygodnie jest subkulturować w równych proporcjach geometrycznych (stosunek podziału 1:2, 1:4, 1:8). Na przykład 10 ml zlewającej się płytki komórek Kc167 o wymiarach 8 x 106 komórek/ml można podzielić w stosunku 1:8, aby uzyskać gęstość wysiewu 1 x 106 komórek/ml (1,25 ml zawiesiny komórkowej rozcieńczonej w 8,75 ml świeżej pożywki). Oczekuje się, że w ciągu 72 godzin kultury Kc167 rozmnożą się do gęstości 8 x 106 komórek/ml, biorąc pod uwagę czas podwojenia wynoszący 24 godziny. W związku z tym współczynnik podziału jest określany tak, aby ułatwić wygodną rutynę subhodowli do dwóch razy w tygodniu, zapewniając, że komórki są zawsze hodowane w ich wykładniczej fazie wzrostu. Pozwala to na regularny harmonogram subkulturacji komórek, dzięki czemu czas do zbiegu nie jest ani za krótki, ani za długi. Jeśli czas do konfluencji jest zbyt krótki, komórki są hodowane przy niższej gęstości komórek (wyższy współczynnik podziału). Podobnie, jeśli czas do osiągnięcia konfluencji jest zbyt długi, komórki są hodowane w subkulturze przy większej gęstości komórek (niższy współczynnik podziału). Ważne jest, aby pamiętać, że większość linii komórkowych Drosophila jest bardzo wrażliwa na niską gęstość komórek (<1 x 105 komórek/ml), w której komórki prawie się nie namnażają i mogą ostatecznie umrzeć.
Linie komórkowe Drosophila różnią się charakterystyką wzrostu i morfologią. W rezultacie, linie komórkowe o różnych właściwościach mogą wymagać innego traktowania. Większość linii komórkowych Drosophila jest częściowo przylegająca. Przy mniejszej gęstości komórek silniej przylegają do powierzchni wzrostu, a gdy kultura staje się zlewana, komórki stają się mniej przylegające i łatwo się odłączają. Ta stopniowa zmiana przylegania komórek ułatwia łatwą hodowlę najczęściej stosowanych linii komórkowych Drosophila (linie Schneidera, Kc, dysk imaginalny i linie OUN), ponieważ pozwala operatorowi po prostu dozować pożywkę na monowarstwę komórki, aby usunąć je z powierzchni wzrostu, gdy hodowla jest gęsta. W przypadku linii, które przylegają do powierzchni, takich jak żeńska osłonka somatyczna macierzysta/jajnikowa (fGS/OSS) i linie Ras, konieczne jest inkubowanie komórek w trypsynie przez krótki czas, aby pomóc w oderwaniu komórek od powierzchni wzrostu.
Dodatki do pożywek dla większości linii komórkowych Drosophila obejmują płodową surowicę cielęcą (FCS). Insulina i ekstrakt z dorosłej muchy (FEX) są wymagane dla niektórych określonych linii. FEX zawiera niezdefiniowane składniki niezbędne do wzrostu określonych linii krążka międzykręgowego larwalnego i linii komórkowych dorosłego jajnika. DGRC przygotowuje i udostępnia dorosłe FEX pochodzące od 1-tygodniowych much Oregon-R-modENCODE (RRID: BDSC_25211) w podwielokrotnościach 2,5 ml i 10 ml. DGRC udostępnia również instrukcje dotyczące przygotowania FEX na małą skalę na swojej stronie internetowej . Przygotowanie FEX jest jednak czasochłonne i wymaga dużej ilości dorosłych much.
Kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila oszczędza czas i odczynniki do konserwacji linii komórkowych, które nie są w bezpośrednim użyciu. Kriokonserwację uzyskuje się poprzez powolne zamrażanie komórek (-1 °C/min) do -80 °C w pożywce zawierającej DMSO, środek krioprotekcyjny. Powolny etap chłodzenia ma kluczowe znaczenie dla udanej kriokonserwacji. W zamrażarce o temperaturze -80 °C ampułka komórek jest schładzana z prędkością -1 °C/min po umieszczeniu w pojemniku do zamrażania wypełnionym izopropanolem. Począwszy od temperatury otoczenia 25 °C, potrzeba do 2 godzin, aby temperatura w ampułkach osiągnęła -80 °C. Zaleca się pozostawienie ampułek do zamrożenia na noc.
Zamrożone ampułki muszą być następnie szybko przeniesione do ciekłej fazy azotu w celu przedłużonego przechowywania. W temperaturze otoczenia kriowial szybko się nagrzeje do około 10 °C/min, a żywotność będzie zagrożona przy temperaturze powyżej -50 °C23. Aby transfer był szybki, należy obchodzić się z ampułkami w małych partiach, aby zminimalizować narażenie na temperaturę otoczenia. Alternatywnie, umieścić zamrożone kriowiale na suchym lodzie, przygotowując się do ich przeniesienia do cieczy N2. Jeżeli ciekły azot nie jest dostępny, komórki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, przy czym istnieje ryzyko znacznego pogorszenia stanu w miarę upływu czasu.
Gęstość komórek ma kluczowe znaczenie dla udanej kriokonserwacji i późniejszego odrodzenia linii komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, nowe linie komórkowe powinny być zamrażane, aby stworzyć początkowe zamrożenie (1-3 ampułki), gdy tylko nadmiar komórek stanie się dostępny. Po stabilnej hodowli linii komórkowej należy utworzyć zamrożony zapas 10-20 ampułek. Stado to jest następnie rozmrażane w celu sprawdzenia jego regeneracji i żywotności po zamrożeniu, po czym rozmnaża się je w celach doświadczalnych lub w celu wymiany stada, gdy liczba zamrożonych ampułek spadnie poniżej pięciu. Wreszcie, ważne jest, aby potwierdzić, że rozmrożone komórki zachowują cechy swojego stada rodzicielskiego, ponieważ wiadomo, że linie komórkowe ewoluują 3,24.
Podsumowując, w tym artykule przedstawiono podstawy pracy z hodowlami komórek Drosophila , dostarczając podstawowych informacji na temat różnych linii, najlepszych praktyk i protokołów audiowizualnych dotyczących podstawowej obsługi linii komórkowych Drosophila . Ten dostępny zasób ma na celu bezproblemowe ułatwienie wprowadzenia do pracy z hodowanymi komórkami Drosophila i uzupełnienie istniejących przewodników szkoleniowych w każdym laboratorium badawczym.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy National Institutes of Health (Nagroda NIH P40OD010949) oraz społeczności naukowej za wykorzystanie różnych zasobów DNA/wektorów/komórek D. melanogaster nadzorowanych przez DGRC.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytki do hodowli tkankowych 100 mm Corning | 430167 | Termos | |
| 25 cm2 Kolba T | Corning | 430168 | |
| Zbiornik do przechowywania ciekłego azotu 35HC | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | |
| Automatyczny licznik komórek | BIO-RAD | TC20 | Liczenie |
| Bactopepton | BD BioSciences | 211677 | Dodatki do pożywki |
| Szkiełka do liczenia | BIO-RAD | 145-0011 | Liczenie |
| Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Kriokonserwacja |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Zamrażarka do krioprezerwacji |
| Nalgene | 5029-0909 | Pojemnik | |
| do zamrażania | Fisher Scientific | 15-350-50 | do krioprezerwacji |
| Fisher Scientific | #0267110 | Liczenie | |
| ludzkiej insuliny | Millipore Sigma | I9278 | Dodatki do pożywki |
| Hyclone CCM3 Media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Średni |
| hyklon Płodowa surowica bydlęca | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Dodatki podłoża |
| Kwas L-glutaminowy sól potasowa monohydrat | Millipore Sigma | G1149 | Średnie dodatki |
| L-Glutation zredukowany | Millipore Sigma | G6013 | Dodatki do pożywki |
| Wodorowęglan potasu | Millipore Sigma | 237205 | Dodatki |
| do podłoża Select Ekstrakt drożdżowy | Millipore | Sigma Y1000 | Medium dodatki |
| Shields i Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
| Trpsin-EDTA (0,05 %), czerwień fenolowa | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Kultura |
| Trypanu Niebieskiego (0,4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Liczenie |
Bibliografia
- Baum, B., Cherbas, L. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Dahmann, C. 420, Humana Press. Ch. 25 391-424 (2008).
- Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
- Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339(2018).
- Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
- Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9(2015).
- Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
- Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
- Echalier, G. Drosophila Cells in Culture. , Academic Press. (1997).
- Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. Drosophila cells in culture. 2nd edition. , Elsevier. (2017).
- Cherbas, L., Cherbas, P. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 10, 2nd, Oxford University Press. 319-346 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
- Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
- Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
- Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
- Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
- Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142(2008).
- Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
- Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161(1977).
- Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , Wiley Blackwell. (2016).
- Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70(2014).
Przedruki i uprawnienia
