Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59465

⸱

17 czerwca 2019

 ,  , 
1Department of Experimental Medical Sciences and Lund Stem Cell Center, BMC, Lund University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu generowanie bezpośrednio przeprogramowanych interneuronów in vivo, przy użyciu systemu wirusowego opartego na AAV w mózgu i reportera GFP sterowanego przez synapsynę FLEX, który pozwala na identyfikację komórek i dalszą analizę in vivo.

Streszczenie

Przekształcanie komórek glejowych w mózgu w funkcjonalne i specyficzne dla podtypów neurony in vivo stanowi krok naprzód w kierunku rozwoju alternatywnych terapii wymiany komórek, jednocześnie tworząc narzędzia do badania losu komórek in situ. Do tej pory możliwe było uzyskanie neuronów poprzez przeprogramowanie in vivo, ale dokładny fenotyp tych neuronów lub sposób ich dojrzewania nie został szczegółowo przeanalizowany. W tym protokole opisujemy bardziej efektywną konwersję i specyficzną dla komórki identyfikację neuronów przeprogramowanych in vivo, przy użyciu systemu wektorów wirusowych opartego na AAV. Udostępniamy również protokół oceny funkcjonalnej dojrzewania neuronalnego przeprogramowanych komórek. Poprzez wstrzykiwanie wektorów przerzucania (FLEX), zawierających geny reporterowe przeprogramowujące i napędzane przez synapsynę do określonych typów komórek w mózgu, które służą jako cel przeprogramowania komórek. Technika ta pozwala na łatwą identyfikację nowo przeprogramowanych neuronów. Wyniki pokazują, że uzyskane przeprogramowane neurony dojrzewają funkcjonalnie w czasie, odbierają kontakty synaptyczne i wykazują właściwości elektrofizjologiczne różnych typów interneuronów. Wykorzystując czynniki transkrypcyjne Ascl1, Lmx1a i Nurr1, większość przeprogramowanych komórek ma właściwości szybko rosnących interneuronów zawierających parwalbuminę.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest skuteczne przekształcenie komórek glejowych w mózgu in vivo w funkcjonalne i specyficzne dla podtypów neurony, takie jak interneurony wykazujące ekspresję parwalbuminy. Jest to krok naprzód w kierunku opracowania alternatywnej terapii zastępczej w chorobach mózgu bez konieczności stosowania egzogennego źródła komórek. Tworzy również narzędzie do badania przełączników losu komórek in situ.

Mózg ma ograniczoną zdolność do generowania nowych neuronów. Dlatego w chorobach neurologicznych istnieje zapotrzebowanie na egzogenne źródła komórek do naprawy mózgu. W tym celu różne źródła komórek zostały poddane intensywnym badaniom na przestrzeni lat, w tym komórki z tkanki pierwotnej, komórki pochodzące z komórek macierzystych i komórki przeprogramowane1,2,3. Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek mózgowych na neurony jest nowym podejściem, które może zapewnić atrakcyjną metodę naprawy mózgu, ponieważ wykorzystuje własne komórki pacjenta do generowania nowych neuronów w mózgu. Do tej pory kilka raportów wykazało przeprogramowanie in vivo poprzez dostarczanie wektorów wirusowych w mózgu4,5,6,78,9 w różnych obszarach mózgu, takich jak kora, rdzeń kręgowy, prążkowie i śródmózgowie5,10,11, a także w nienaruszonym i uszkodzonym mózgu5,8,11,12. Uzyskano zarówno neurony hamujące, jak i pobudzające4,8, ale dokładny fenotyp lub funkcjonalność tych komórek nie została jeszcze szczegółowo przeanalizowana.

W tym protokole opisujemy bardziej efektywne przeprogramowanie i specyficzną dla komórki identyfikację neuronów przeprogramowanych in vivo. Udostępniamy protokół oceny funkcjonalnej dojrzewania neuronów i charakterystyki fenotypu w oparciu o funkcjonalność i cechy immunohistochemiczne.

Użyliśmy indukowanego przez Cre wektora AAV i reportera GFP, aby zidentyfikować przeprogramowane neurony in vivo. Ten wybór wektorów wirusowych ma tę zaletę, że infekuje zarówno dzielące się, jak i niedzielące się komórki mózgu, zwiększając liczbę komórek docelowych, jako alternatywa dla stosowania retrovirus7,8. Specyficzny dla neuronów reporter FLEX (GFP) napędzany synapsyną umożliwił nam specyficzne wykrycie nowo wygenerowanych neuronów. W poprzednich badaniach do przeprogramowania in vivo wykorzystano promotory specyficzne dla podtypu7,9, które również umożliwiają ekspresję genów przeprogramowujących i reporterów w określonych typach komórek. Metoda ta wymaga jednak dalszej identyfikacji przeprogramowanych neuronów poprzez pośmiertną analizę koekspresji markerów reporterowych i neuronalnych. Użycie reportera specyficznego dla neuronu, takiego jak ten opisany w niniejszym dokumencie, pozwala na bezpośrednią identyfikację. Stanowi to bezpośredni dowód udanej konwersji i umożliwia identyfikację żywych komórek, która jest wymagana do elektrofizjologii z klamrą krosową.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej (2010/63/UE) i zatwierdzone przez komisję etyczną ds. wykorzystania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie w Lund i Szwedzkim Departamencie Rolnictwa (Jordbruksverket). Myszy są trzymane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.

1. Wektory wirusowe

  1. Klonowanie wektorów AAV
    1. Aby utworzyć indukowane przez Cre wektory AAV5, należy wstawić cDNA dla GFP, Ascl1, Lmx1a i NR4A2 (Nurr1) w odwrotnej orientacji otoczonej dwiema parami heterotypowych, antyrównoległych sekwencji LoxP z przerzuceniem (FLEX) (Tabela materiałów). Do insercji cDNA należy użyć szkieletu, takiego jak pAAV-Cba-FLEX lub o podobnej strukturze, zawierającego sekwencje FLEX i promotor beta aktyny kurczaka (CBA).
    2. Wstaw każdy pojedynczy cDNA (np. Ascl1) do szkieletu za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i enzymów restrykcyjnych. Ekspresja GFP pod kontrolą promotora synapsyny i Ascl1, Lmx1a, Nurr1 pod kontrolą wszechobecnie wyrażanego promotora CBA.
      nuta: Upewnij się, że masz DNA wolne od endotoksyn za pomocą specjalnych zestawów do izolacji plazmidowego DNA bez endotoksyn.
    3. Przed użyciem należy przeprowadzić sekwencjonowanie i analizę ograniczeń na konstrukcjach, aby sprawdzić powodzenie etapu klonowania.
  2. Produkcja wektorów wirusowych AAV5
    ostrożność: Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego podczas obchodzenia się z wirusem związanym z adenowirusem (AAV). W Szwecji AAV stosowany w tym protokole wymaga poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
    1. Komórki HEK293T nasiennej ze standardowymi pożywkami hodowlanymi (DMEM + Glutamax + 10% FBS + penicylina (100 U/ml) streptomycyna (100 μg / ml), patrz tabela materiałów) w kolbach T175 o gęstości 3 x 106 komórek na kolbę. Weź pod uwagę 5 kolb na partię AAV i zaplanuj 6 partii na raz.
    2. Gdy komórki osiągną 50-70% zbieżności, przygotuj następującą mieszankę do transfekcji (na 175 cm2 kolbę).
      1. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać równomolowe ilości plazmidu wektorowego i plazmidu pomocniczego serii pDG (pDP5, pDP6), o łącznej ilości 72 μg na kolbę o długości 175cm2.
      2. Dodać bufor Tris-EDTA (bufor TE, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) do końcowej objętości 144 μL.
      3. Dodaj ultraczystą wodę, aby całkowita objętość wynosiła 1296 μl i wymieszaj.
      4. Dodać 144 μl 2,5 M CaCl2 i wymieszać. Dodać 1,92 μl buforowanej soli fizjologicznej HEPES (HBS) (1,5 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 50 mM HEPES) do roztworu DNA i natychmiast wymieszać przez wirowanie.
      5. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) dokładnie przez 60 sekund. Przenieść roztwór do 28 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i wymieszać.
    3. Zastąp pożywkę w kolbach pożywką do hodowli komórkowych zawierającą mieszaninę transfekcji.
    4. Trzy dni po transfekcji zebrać komórki, wylewając pożywkę z kolb do jednorazowego pojemnika na odpady i dodać 5 ml buforu do zbioru (EDTA dodany do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, patrz Tabela materiałów, DPBS do końcowego stężenia 5 mM) do stężenia 5 mM) do stężenia 5 mM) do każdej kolby, aby umożliwić oderwanie komórek.
    5. Wlać roztwór komórkowy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać kolejne 4 ml DPBS do każdej kolby, aby przepłukać pozostałe komórki i połączyć je z roztworem z pierwszej komórki. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Po odwirowaniu usunąć supernatant i rozpuścić granulki w 15 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2) przez wirowanie.
    7. Zamrozić je w kąpieli CO2 lodowo-etanolowej na 15 minut i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić zebrany lizat komórkowy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Oczyszczanie wektorów wirusowych AAV5
    1. Przeprowadzić oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradionym iodixanolu13 i użyć ultrawirówek uszczelniających z wirowaniem przy 350 000 x g przez 1 godzinę i 45 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 18G i włóż około 2 mm poniżej granicy fazy 40/60% ze skosem skierowanym do góry, aby wyekstrahować fazę zawierającą AAV. Pamiętaj, aby zatrzymać się przed dotarciem do pasma białkowego po ekstrakcji 5-6 ml.
    3. Ekstrakty gradientowe należy przechowywać w szklanych butelkach sterylizowanych w autoklawie w temperaturze 4 °C. Należy unikać przechowywania dłużej niż przez noc.
    4. Rozcieńczyć ekstrakt gradientowy jodiksanolu 3-krotnie, powoli pipetując w 12 ml buforu do elucji jodiksanolu (IE) (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 15 mM NaCl) podczas wirowania.
    5. Oczyścić i skoncentrować rozcieńczony gradient jodiksanolu przez filtr anionowymienny. Przepychaj go powoli z prędkością nie większą niż 1 kropla/s. Powoli przepchnij 3 ml buforu IE przez filtr, aby go umyć.
    6. Eluować do odśrodkowego zespołu filtrującego z 1-2 ml buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM NaCl). Dodać DPBS do urządzenia do końcowej objętości 4 ml. Wirować przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej do momentu, gdy w filtrze pozostanie mniej niż 0,5 ml. Usuń płyn z dna probówki, napełnij 4 ml DPBS i ponownie odwiruj. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Upewnij się, że objętość skoncentrowanego wektora na filtrze wynosi około 200 μl po ostatnim etapie wirowania.
    7. Usuń skoncentrowany wektor o objętości 200 μl za pomocą pipety i przepchnij koncentrat przez filtr 0,22 μm w celu jego wysterylizowania. Porcja 200 μLinto szklana fiolka 9 mm z blokowaną wkładką (tabela materiałów).
      nuta: Zapasy wektorów AAV5 można przechowywać w zamrażarkach w temperaturze -80 °C w celu długiego przechowywania lub w temperaturze 4 °C, jeśli zostaną zużyte w ciągu 2 tygodni.
  4. Oznaczanie miana wektora wirusa AAV5
    1. Oznaczyć miano AAV5 za pomocą standardowej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) ze starterami dla sekwencji powtórzeń odwróconego terminala (ITR) i sondy 5'FAM / 3'BHQ1 dla sekwencji ITR (tabela materiałów). Należy użyć krzywej wzorcowej uzyskanej ze znanymi ilościami ITR zawierającymi plazmid. Każdy wektor AAV powinien mieć zakres 1E+14 – 1E+15 kopii genomu na mililitr, jeśli do określenia miana stosuje się sekwencję ITR.
      nuta: Udana produkcja wirusa AAV5 daje zapasy o mianach w minimalnym zakresie 3E+13 – 7E+13 jednostek/ml.

2. Wstrzykiwanie czynników przeprogramowujących do mózgu

  1. Ustawienie zwierząt, stereotaktyczne rozmieszczenie i wiercenie
    nuta: Protokół ten koncentruje się na wykorzystaniu Ascl1, Lmx1a i Nurr1 (ALN) do przeprogramowania gleju NG2 na interneurony. Z naszego doświadczenia wynika, że interneurony o podobnym fenotypie można uzyskać przy użyciu innych kombinacji czynników11.
    1. Przed zabiegiem chirurgicznym należy przygotować mieszankę wirusową zawierającą wektory Cba-FLEX-Ascl1, Cba-FLEX-Lmx1a, Cba-FLEX-Nurr1 i wektor reporterowy Syn-FLEX-GFP. Dodać każdy z zapasów przygotowanych w sekcji 1 do końcowej mieszanki, tak aby końcowy roztwór wirusowy zawierał 5% każdego z czynników przeprogramowujących (Ascl1, Lmx1a i Nurr1) i 10% konstruktu reporterowego (5% A, 5% L, 5% N i 10% GFP).
      nuta: Mieszaniny wektorów AAV5 mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C i przechowywane do wykorzystania w przyszłości in vivo.
    2. Znieczulić mysz za pomocą 2% izofluranu w mieszaninie powietrza i podtlenku azotu (N2O) w stosunku 4:1. Monitoruj oddech zwierzęcia, obserwując ruchy przepony. Podczas zabiegu należy utrzymać znieczulenie za pomocą 1–1,5% izofluranu.
      nuta: Opisany tutaj model myszy składa się ze szczepu myszy, który specyficznie wyraża Cre w gleju NG2. Przeprogramowanie in vivo można osiągnąć przy użyciu różnych szczepów myszy, które wyrażają Cre w innych populacjach komórek glejowych (np. astrocyty14).
    3. Gdy zwierzę jest całkowicie znieczulone (np. całkowite rozluźnienie mięśni i brak reakcji na uszczypnięcie w opuszkę stopy), ogol obszar wokół miejsca nacięcia i przyprowadź zwierzę do klatki stereotaktycznej.
    4. Aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji, przymocuj poduszkę grzewczą do podstawy ramy stereotaktycznej. Umieść mysz na czystym, suchym ręczniku papierowym.
    5. Ostrożnie umieść głowę myszy w nausznikach. W przypadku prawidłowego umieszczenia nie należy obserwować bocznego ruchu głowy. Ustaw lewą listwę douszną na 4 mm przed rozpoczęciem umieszczania myszy w ramce stereotaktycznej.
    6. Zamocuj listwę zębatą na miejscu, a następnie dokręć listwę nosową. Upewnij się, że głowa nie porusza się w żadnym wymiarze i jest skierowana prosto przed siebie (linia środkowa jest prostopadła do płaszczyzny nauszników). Zastosuj maść okulistyczną w celu ochrony oczu.
    7. Przed rozpoczęciem zabiegu należy podać odpowiednie środki przeciwbólowe (np. 0,05 mg/kg buprenorfiny podawane podskórnie).
    8. Oczyść miejsce nacięcia bawełnianą gazą lub chusteczką nasączoną 70% EtOH, nie zbliżając się do okolic oczu.
      nuta: Do domózgowego wstrzykiwania wirusa stosuje się strzykawkę o pojemności 5 lub 10 μl przystosowaną do ciągniętej szklanej kapilary. Szklane kapilary są pobierane za pomocą ściągacza do mikropipet, w wyniku czego powstaje kapilara z bardzo cienką końcówką, co zminimalizuje inwazyjność zabiegu. Aby zaadaptować kapilarnę do strzykawki, należy użyć kawałka gumowej rurki nad połączeniem między igłą strzykawki a szklaną kapilarną i stopić ją za pomocą źródła ciepła (np. zapalniczki). Szczelne połączenie między tymi dwoma częściami zapewni, że podczas wstrzykiwania nie dojdzie do wycieków płynu. Przed rozpoczęciem operacji należy to sprawdzić, napełniając strzykawkę solą fizjologiczną i wypychając płyn ze strzykawki.
    9. Wykonaj nacięcie około 0,5-0,8 cm wzdłuż linii środkowej głowy. Przeciąć zarówno warstwę skórną, jak i podskórną za pomocą skalpela.
    10. Poszerz płaty skóry po obu stronach nacięcia. Oczyść nacięcie z krwi i zeskrob warstwy podskórne patyczkiem kosmetycznym.
    11. Przesuń ramię M/L-D/V ramy stereotaktycznej na miejsce (nad zwierzęciem) i zabezpiecz je.
      nuta: Ramka stereotaktyczna umożliwia regulację strzykawki wzdłuż osi Przednio/Tylnej (A/P, Y), Przyśrodkowej/Bocznej (M/L, oś X) oraz Grzbietowej/Brzusznej (oś D/V, Z).
    12. Przesunąć strzykawkę wzdłuż różnych osi ramy stereotaktycznej, aby końcówka szklanej kapilary znalazła się tuż nad bregmą (punktem połączenia, w którym spotykają się różne płytki czaszki).
    13. Upewnij się, że końcówka kapilarna jest idealnie prosta zarówno w płaszczyźnie A/P, jak i M/L. W przypadku niejednoznacznej bregmy należy wziąć średnią ze szwów bocznych i środkowych.
    14. Gdy końcówka kapilary zostanie prawidłowo umieszczona nad bregmą, zresetuj wartości M/L i A/P do 0,0 na cyfrowym liczniku współrzędnych.
    15. Aby upewnić się, że głowa zwierzęcia znajduje się w idealnie płaskiej pozycji, użyj cyfrowego licznika współrzędnych do zmierzenia wartości współrzędnych D/V, gdy ramię A/P znajduje się na poziomie +2,0 i -2,0 (M/L = 0,0), a także gdy ramię M/L znajduje się na poziomie +2,0 i -2,0 (A/P = 0,0). Dostosuj odpowiednio wysokość listwy zębatej i nauszników.
    16. Przesunąć strzykawkę do żądanych współrzędnych w celu wstrzyknięcia wektorów wirusowych w prążkowiu (A/P = +1,0; M/L = -2,0, w stosunku do bregmy).
    17. Lekko unieść strzykawkę i patrząc na miejsce wstrzyknięcia przez mikroskop, wywiercić otwór za pomocą wiertła dentystycznego we współrzędnych wstrzyknięcia. Rozpocznij wiercenie na miejscu, pracując okrężnie i delikatnie.
      nuta: Nie wywieraj zbyt dużego nacisku w dół, ponieważ wiertło powinno być wystarczająco ostre, aby przejść przez kość bez dodatkowej siły. Unikaj długiego, długotrwałego wiercenia, ponieważ powoduje to wytwarzanie ciepła.
    18. Pod koniec wiercenia należy sprawdzić, czy opona twarda pozostała nienaruszona i wystawiona do wstrzyknięcia.
  2. Przygotowanie konfiguracji strzykawki
    1. Umieść kawałek bawełnianej gazy na otwartym nacięciu i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.
    2. Po przepłukaniu należy pobrać pęcherzyk powietrza o objętości 1–2 μl, a następnie 1 μl roztworu zawierającego wektory wirusowe, unikając niezamierzonych pęcherzyków. Upewnij się, że roztwór wirusowy można łatwo uwidocznić poniżej pęcherzyka powietrza podczas wstrzykiwania.
  3. Wstrzyknięcie wirusa
    1. Usunąć bawełnianą gazę znad miejsca nacięcia i opuścić strzykawkę za pomocą ramienia D/V ramy stereotaktycznej. W miarę zbliżania się do powierzchni czaszki uważnie spójrz przez mikroskop i zmierz poziom D/V opony twardej - powinna się lekko wybrzuszyć pod delikatnym naciskiem.
    2. Dotykając opony twardej końcówką kapilary, ustaw współrzędną D/V na 0,0.
    3. Opuścić strzykawkę, powoli przesuwając się do żądanej głębokości (D/V = -2,7, w stosunku do opony twardej). Upewnij się, że trajektoria jest wolna od fragmentów kości, tak aby nie zaobserwowano zgięcia igły/kapilary.
      nuta: Przedstawione współrzędne odnoszą się do wstrzyknięcia czynników przeprogramowujących do prążkowia myszy NG2-Cre. Można użyć współrzędnych odpowiadających innym obszarom mózgu. Zawsze najpierw testuj współrzędne do wstrzyknięcia za pomocą barwnika (np. błękitu trypanowego), kolorowego zastrzyku kulki lub reporterowego wektora wirusowego przed wstrzyknięciem czynników przeprogramowujących do mózgu nowego szczepu myszy. W przypadku wstrzyknięcia błękitu trypanowego, zwierzęta muszą zostać uśmiercone natychmiast po operacji, a mózg wycięty. Świeże mózgi można wyciąć za pomocą mikrotomu, podczas gdy są zamrożone, a miejsce wstrzyknięcia można określić na podstawie wizualizacji położenia barwnika w mózgu. Jeśli współrzędne testuje się za pomocą kolorowych kulek, możliwe jest określenie miejsca wstrzyknięcia na perfundowanych i pociętych mózgach tydzień po wstrzyknięciu. Alternatywnie można zastosować wstrzyknięcie wektora wirusowego przenoszącego gen reporterowy, a miejsce wstrzyknięcia określić w perfundowanych naciętych mózgach.
    4. Wstrzyknąć 1 μl roztworu wirusa z szybkością 0,4 μl/min. Po wstrzyknięciu całej objętości należy odczekać 2 minuty dyfuzji przed pobraniem strzykawki.
    5. Po dyfuzji powoli wycofaj strzykawkę, aż końcówka naczynia włosowatego całkowicie wystanie z mózgu.
    6. Umieść kawałek bawełnianej gazy na ranie i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.
    7. Przesuń ramię M/L-D/V ramy stereotaktycznej poza obszar roboczy.
  4. Zamykanie ran i zabiegi pooperacyjne
    1. Ostrożnie zszyć nacięcie za pomocą nici do szycia.
      nuta: Wszystkie nici do szycia stosowane u zwierząt, którym wstrzyknięto zastrzyki, należy umieścić w kubku/fiolce zawierającej przeciwwirusowy roztwór detergentu. To samo rozwiązanie stosuje się do czyszczenia wszystkich powierzchni otaczających obszar operacyjny, które miały kontakt z materiałami chirurgicznymi. Wszystkie narzędzia chirurgiczne są dokładnie myte i sterylizowane w autoklawie pod koniec każdego dnia operacji.
    2. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je w stacji pooperacyjnej, która obejmuje czystą, podgrzewaną klatkę, dostęp do jedzenia i wody oraz miejsce, w którym zwierzę pozostaje do momentu pełnego wybudzenia. W tym okresie należy uważnie obserwować zwierzę, aż do odzyskania przytomności.
    3. Nie należy trzymać operowanych zwierząt ze zwierzętami nieoperowanymi, dopóki te pierwsze nie wyzdrowieją w pełni po operacji.
    4. Codziennie nadzoruj operowane zwierzęta. W zależności od zastosowanych szwów, upewnij się, że zostały one usunięte w razie potrzeby. Wszystkim zwierzętom podawano Bupenorphinum (Temgesic w dawce 1 ml/kg) podskórnie jako opiekę pooperacyjną.
      nuta: W przypadku pracy przy użyciu tej samej strzykawki przez dwa kolejne dni, przepłukać ją wodą, a następnie etanolem 70% i ponownie wodą. Pozostawić strzykawkę wypełnioną wodą na noc, aby umożliwić rozpuszczenie wszelkich ewentualnych pozostałości.

3. Zapisy elektrofizjologiczne

  1. Przygotowanie plastrów tkanek do elektrofizjologii
    ostrożność: Dobrze wykonane przygotowanie tkanek jest niezbędne do uzyskania dobrych zapisów elektrofizjologicznych. Starannie przygotuj pomieszczenie i umieść narzędzia do perfuzji i preparacji na lodzie.
    1. Przygotuj lodowaty i natleniony (95%O2 i 5% CO2) roztwór Krebsa do perfuzji, rozwarstwienia i cięcia (przygotuj go tego samego dnia z 10x bulionu, rozcieńczając roztwór podstawowy w ultraczystej wodzie i dodającNaHCO3 i glukozę). Składnikami roztworu Krebsa w mM (po rozcieńczeniu do 1x) są: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4·H2O, 1,3 MgCl2·6H2O i 2,4 CaCl2·6H2O, 22 NaHCO3, 10 glukoza. Doprowadzić pH roztworu do 7,4.
    2. Wykonaj kalibrację (Vibracheck) wibratomu za pomocą nowej żyletki.
    3. Uruchomić blok chłodzący wibratomu (lub napełnić otaczającą komorę lodem), a następnie napełnić komorę tnącą roztworem Krebsa do natlenienia 95 %O2 i 5 % CO2 co najmniej 30 minut przed użyciem.
    4. Połóż szalkę Petriego na lodzie i napełnij ją natleniznym roztworem Krebsa. Umieść ostrze, nożyczki i płytkę montażową na lodzie.
      ostrożność: Przynieś klatkę zawierającą mysz do pomieszczenia co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem procedury aklimatyzacji. Stres ma negatywny wpływ na stan wycinków tkanki mózgowej.
    5. Znieczul końcowo mysz, wstrzykując przedawkowanie pentobarbitalu i pozwól zwierzęciu zasnąć. Gdy odruch mrugania zniknie, a zwierzę nie reaguje na bodźce bólowe, przekrwij zwierzę przezsercowo lodowatym roztworem Krebsa przez 2-3 minuty (z szybkością 10-20 ml / min).
    6. Szybko, ale ostrożnie, wypreparuj mózg i umieść go do góry nogami na szalce Petriego, która jest umieszczona na lodzie (zawierającej roztwór Krebsa).
      nuta: Aby porównać funkcjonalne dojrzewanie przeprogramowanych neuronów, należy poświęcić zwierzęta do nagrań w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu wirusa. Oceń właściwości wypalania różnych podtypów neuronów na podstawie istniejącej literatury15 .
    7. Wykonaj nacięcie koronalne wzdłuż środkowej części móżdżku i przyklej tę stronę do płyty montażowej (również lodowato-zimnej) w celu wycięcia wibratomem.
    8. Ostrożnie zanurz sklejony mózg w komorze buforowej w wibratomie.
      ostrożność: Uważaj, aby nie dotknąć żyletki dla własnego bezpieczeństwa i aby ostrze pozostało skalibrowane.
    9. Cięcie od najbardziej rostralnej części mózgu w dół do poziomu prążkowia z dużą prędkością. Następnie przetnij prążkowie koronalnie pod kątem 275 μm z małą prędkością (0,10 mm/s).
    10. Po każdym cięciu ostrożnie usunąć niewstrzykniętą stronę prążkowia (np. za pomocą zgiętej igły) i przenieść wstrzykniętą stronę do innej fiolki w łaźni wodnej, zawierającej dolną siatkę (natleniony Krebs w temperaturze pokojowej) umieszczoną w łaźni wodnej. Utrzymuj to na RT, aż wszystkie sekcje zostaną wycięte.
    11. Powoli zwiększaj temperaturę łaźni wodnej do 37 °C i pozostaw ją na 30 minut. Następnie wyłącz grzałkę i pozwól ostygnąć do RT.
      UWAGA: W tym momencie możesz wstrzymać nagrywanie, aż rozpoczniesz nagrywanie. Odcinki trwają 4-6 godzin.
  2. Nagrania z użyciem clampów krosowych dla całych komórek
    1. Przenieść pierwszy wycinek tkanki do komory rejestracyjnej zanurzonej w ciągłym strumieniu roztworu Krebsa. Zamontuj sekcję za pomocą lekkich ciężarów i zanurz obiektyw.
    2. Zidentyfikuj obszar prążkowia w mikroskopie i poszukaj neuronów GFP-dodatnich (przeprogramowanych). Wybierz neuron, który ma rozległą morfologię i nie jest pokryty wiązkami włókien lub naczyniami krwionośnymi.
    3. Przygotować pipety ze szkła borokrzemianowego (3–7 MΩ) do łatania i napełnić następującym roztworem wewnątrzkomórkowym (w mM): 122,5 glukonian potasu, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3Na3GTP i 8 NaCl, dostosowany do pH 7,3 za pomocą KOH.
    4. W celu wypełnienia biocytyną dodaj 1 mg soli biocytyny do 1 ml roztworu wewnętrznego i zawiruj.
      ostrożność: Upewnij się, że przefiltrowałeś roztwór wewnętrzny za pomocą biocytyny, ponieważ w przeciwnym razie może to zatkać elektrodę.
    5. Przymocuj szklaną pipetę do elektrody rejestrującej i zanurz ją w roztworze. Dokładnie sprawdź rezystancję elektrody. Następnie powoli zbliż się pipetą do ogniwa, utrzymując lekkie nadciśnienie w elektrodzie, aby uniknąć zatkania końcówki.
      ostrożność: Uważaj, aby śledzić swoją komórkę podczas schodzenia do elektrody i nie wybielać fluorescencji w ogniwie (tj. wyłączaj lampę fluorescencyjną, gdy jej nie potrzebujesz).
    6. Ostrożnie opłucz otaczającą tkankę za pomocą nadciśnienia elektrody i zbliż się do ogniwa z elektrodą. Umieść elektrodę bezpośrednio na górze ogniwa i opuść, aż elektroda dotknie membrany. Wykonaj uszczelnienie Giga-Ω między elektrodą a błoną komórkową i za pomocą impulsów podciśnienia rozerwij membranę, aby utworzyć łatkę na całe komórki.
      ostrożność: Przeprogramowane neurony są wrażliwe. Zachowaj ostrożność podczas łatania i nie wywieraj zbyt dużego podciśnienia podczas docierania do uszczelki Giga-Ω lub otwierania błony komórkowej. Ponadto łatanie na zwierzętach, które są starsze, wymaga praktyki i cierpliwości, ponieważ ich tkanka łączna jest grubsza i trudniej jest uwidocznić neurony.
    7. Sprawdź spoczynkowe potencjały membranowe natychmiast po włamaniu w trybie cęgów prądowych i zapisz je do analizy.
    8. W cęgach prądowych utrzymuj ogniwo w zakresie od -60 mV do -80 mV i wstrzykuj prądy 500 ms od -20 pA do +90 pA, z przyrostami 10 pA w celu indukcji potencjałów czynnościowych.
    9. Przenieść do cęgów napięciowych i zmierzyć wewnętrzne prądy sodowe i opóźnione prostownikujące prądy potasowe w krokach depolaryzacji 10 mV.
      nuta: Zapisy cęgów napięciowych są lepiej oceniane przy użyciu innego rozwiązania wewnętrznego, składającego się z substancji chemicznych, które bardziej efektywnie zaciskają membranę. Jednak w przypadku przeprogramowanych neuronów liczba komórek, z których można nagrywać, jest niewielka, a liczba odcinków tkanek z tymi neuronami jest ograniczona. W związku z tym zaletą jest nagrywanie zarówno w cęgach prądowych, jak i napięciowych z tego samego ogniwa.
    10. W trybie cęgowym napięcia rejestruj spontaniczną aktywność postsynaptyczną przy -70 mV. Rozróżnij hamujące zdarzenia postsynaptyczne przy potencjale błonowym 0 mV od zdarzeń pobudzających przy -70 mV.
    11. Po osiągnięciu stabilnej linii podstawowej, dodać Pitrotoksynę, antagonistę receptora GABAA, do roztworu Krebsa, który wpływa do komory rejestrującej, w celu ekstrakcji zdarzeń pobudzających (dodać podstawowy roztwór pikrotoksyny do końcowego stężenia 50 mM w oddzielnej strzykawce buforowej, która jest podłączona do perfuzji w komorze. Podłącz odpływ buforu z komory do worka próżniowego w celu bezpiecznej utylizacji).
    12. Po 20 minutach dodać CNQX (20 mM), antagonistę AMPA, do roztworu Krebsa, który przepływa do komory rejestrującej, w celu zablokowania zdarzeń hamujących (stosując tę samą procedurę, co w przypadku pikrotoksyny). Pozostaw na kolejne 20 minut, a następnie zmyj roztworem Krebsa. Usuń wycinek tkanki z komory.
    13. Po zakończeniu nagrań należy przeprowadzić analizę offline spontanicznych pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC) i hamujących prądów postsynaptycznych (IPSC) przy użyciu detekcji zdarzeń progowych (>5 pA) w programie do analizy.
    14. Podczas całego nagrania komórka będzie powoli wypełniana wewnętrznym roztworem zawierającym biocytynę. Przytrzymaj plaster przez co najmniej 20 minut przed powolnym wyjęciem elektrody w celu całkowitego wypełnienia ogniwa.
      ostrożność: Należy uważać, aby w elektrodzie nie wystąpiło nadciśnienie, które mogłoby zniszczyć późniejszą analizę morfologiczną komórek.
    15. W celu uwidocznienia biocytyny należy umieścić wycinek tkanki w 4% paraformaldehydzie (PFA) na noc w temperaturze 4 °C. Przepłukać skrawek w 0,02 M buforze fosforanu potasu (KPBS) z 0,1% trytonem. Następnie barwnik na streptawidynę-Cy3 (1: 600 w KPBS-T, 2 h), w celu identyfikacji komórki wypełnionej biocytyną i morfologicznej wizualizacji przeprogramowanego neuronu.
      nuta: Wypełnienie biocytyną może być wykorzystywane do analizy morfologicznej i ilustracji neuronów z łatkami.

4. Immunohistochemia, stereologia i kwantyfikacja

UWAGA: Poświęć określoną grupę myszy do immunohistochemii, ponieważ skrawki tkanek używane do elektrofizjologii nie są optymalne dla immunohistochemii.

  1. Znieczulij myszy wstrzyknięciem dożylnego przedawkowania pentobarbitalu i dosiądź zwierzę do perfuzji.
  2. Perfuzję przezsercową myszy najpierw roztworem soli fizjologicznej w celu usunięcia krwi, a następnie lodowatym 4% PFA.
  3. Wypreparuj mózgi i pofix przez co najmniej 12 godzin w 4% PFA.
  4. Umieść mózgi w 25% roztworze sacharozy (w celu krioprotekcji) na około 12 godzin
    nuta: Mózgi są gotowe do cięcia, gdy zanurzą się w 25% roztworze sacharozy, co wskazuje, że sacharoza przeniknęła do całego mózgu myszy.
  5. Wykonaj nacięcie koronalne w poprzek móżdżku, użyj płaskiej, najbardziej ogonowej części mózgu, aby umieścić mózg na mikrotomie i przymocuj go na miejscu za pomocą optymalnego związku o temperaturze cięcia (OCT).
  6. Pokrój mózg na plastry koronalne o grubości 35 μm i podziel mózg na kolejne serie umieszczone w fiolkach lub studzienkach zawierających 0,02 M KPBS.
  7. Przetwarzaj skrawki do immunohistochemii przy użyciu przeciwciał przeciwko GFP i markerom interneuronowym, takim jak GAD65/67, PV, Chat (acetylotransferaza choliny) i NPY (neuropeptyd Y), zgodnie ze standardowymi protokołami16, 17.
    nuta: Plastry mózgu można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C w roztworze niezamarzającym przez długi czas.
  8. Po zakończeniu barwienia zamontuj sekcje na szklanym szkiełku podstawowym i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym, używając roztworu montażowego, aby zamocować go na miejscu. Pozostaw szkiełka nakryte do wyschnięcia na noc.
    nuta: W naszych badaniach całe mózgi są cięte w seriach 1:8 (tj. każda fiolka zawierająca sekcje będzie zawierała jedną ósmą mózgu myszy 11).
  9. Przeanalizuj skrawki za pomocą odwróconej mikroskopu fluorescencyjnego i/lub konfokalnego.
    ostrożność: Mikroskopia fluorescencyjna jest przydatna do ogólnego przeglądu wyników i przechwytywania obrazów w celu obliczenia wydajności przeprogramowania. W celu bardziej szczegółowej analizy tożsamości fenotypowej poprzez obserwację komórek podwójnie dodatnich należy zastosować obrazowanie konfokalne.
  10. Aby określić ilościowo różne markery wyrażane w neuronach GFP+ w prążkowiu, policz liczbę komórek podwójnie dodatnich w stosunku do całkowitej liczby komórek GFP+ (tj. Przeprogramowanych neuronów), w co najmniej dwóch polach każdego odcinka prążkowia.
  11. Aby określić przybliżoną ekstrapolowaną całkowitą liczbę przeprogramowanych neuronów na mózg, policz neurony GFP+ obecne w prążkowiu jednej z wcześniej przeciętych serii mózgowych, a następnie pomnóż przez całkowitą liczbę serii.
    nuta: Różne metody kwantyfikacji mogą być stosowane do wyrażania wydajności przeprogramowywania, liczby przeprogramowanych neuronów na zwierzę i odsetka neuronów, które wyrażają określone markery fenotypowe. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz poprzednią publikację11.
  12. Przeanalizuj różnice między warunkami za pomocą Graph Pad Prism lub podobnego.
    nuta: W celu obliczenia wydajności wstrzyknęliśmy myszom NG2-Cre wektory konwersji ALN zależne od CRE i reporter GFP. Aby oszacować wydajność konwersji, wstrzyknęliśmy również zwierzętom GFP zależny od Cre pod wszechobecnym promotorem CBA, uzyskując GFP+ dla wszystkich docelowych komórek. Korzystając z tego porównania, oszacowaliśmy, że 66,81% ± 38,38% docelowych komórek przekształca się w neurony. W celu walidacji ekspresji każdego z genów można przeprowadzić komplementarne podwójne barwienie immunofluorescencyjne dla GFP/Ascl1, GFP/Lmx1a i GFP/Nurr1. Ponadto sekwencjonowanie genomu, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, może ujawnić obecność każdego z genów w przeprogramowanych komórkach.

Wyniki

Iniekcja wektorów AAV jest wykorzystywana do skutecznego przeprogramowania резидентnych komórek glejowych NG2 w neurony w prążkowiu myszy NG2-Cre (Rysunek 1A). Aby specyficznie celować w glej NG2, wektory FLEX z genami przeprogramowującymi/reporterowymi są wstawiane w kierunku antysensownym i flankowane przez dwie pary antyrównoległych, heterotypowych miejsc loxP (Rysunek 1B). Każdy z trzech genów przeprogramowujących (Ascl1, Lmx1a i Nurr1) znajduje się pod kontrolą wszechobecnego promotora cba na oddzielnych wektorach. Aby upewnić się, że ekspresja GFP jest ograniczona do przeprogramowanych neuronów pochodzących z komórki wykazującej ekspresję Cre, GFP umieszczono pod kontrolą swoistego dla neuronów promotora synapsyny (również w wektorze FLEX).

Zastosowanie kombinacji konstruktów reprogramujących i reporterowych umożliwia generowanie neuronów GFP-dodatnich w prążkowiu myszy (Rysunek 1C,C’). Użycie konstruktu reporterowego bez obecności genów reprogramujących nie prowadzi do powstania neuronów GFP-dodatnich (Rysunek 1D).

Przeprogramowane neurony wypełnione biocytyną są widoczne po pośmiertnym barwieniu immunologicznym (Rysunek 2A). W przypadku udanej konwersji powinna wystąpić rozbudowana morfologia neuronalna. Rejestracje elektrofizjologiczne przeprogramowanych neuronów wykazują obecność funkcjonalnych połączeń postsynaptycznych z pomiarami aktywności spontanicznej (Rysunek 2B,C). Można je zablokować za pomocą jonotropowego blokera GABAergicznego lub glutaminergicznego (Pikrotoksyna lub CNQX), co sugeruje zarówno pobudzające, jak i hamujące wejścia synaptyczne do przeprogramowanych neuronów. Występowanie aktywności spontanicznej wzrasta wraz z czasem po wstrzyknięciu wirusa (Rysunek 2D), co wskazuje na stopniowe dojrzewanie.

Potencjały czynnościowe indukowane prądem występują w funkcjonalnych neuronach. Liczba potencjałów czynnościowych wzrasta w czasie po konwersji (Rysunek 2E). Wskazuje to na dalsze dojrzewanie funkcji neuronalnych. W niedojrzałym neuronie prąd nie wywoła żadnych lub wywoła bardzo mało potencjałów czynnościowych (Rysunek 2F).

Wzorce wyładowań neuronu są specyficzne dla typu komórki, ponieważ zależą one od czynników takich jak morfologia komórek i ekspresja kanałów15. Zarejestrowane wzorce w neuronach przeprogramowanych in vivo można podzielić na grupy i porównać z wzorcami endogennych podtypów neuronalnych, np. szybko wyładowujących interneuronów (Typ Komórki B, Rysunek 3B) lub innych typów komórek (Rysunek 3A,C,D). Obserwowane różnice elektrofizjologiczne można potwierdzić poprzez obecność specyficznych markerów podtypu i koekspresję z GFP (Rysunek 3E-H). Łącznie dane te wskazują, że przeprogramowane neurony obecne w prążkowiu wykazują właściwości różnych typów interneuronów, takich jak interneurony wykazujące ekspresję Parwalbuminy, ChAt oraz NPY, a także tożsamość średnioskolistych neuronów prążkowia (DARPP32+) (Rysunek 3E-H).

Schemat procesu iniekcji AAV w reprogramowaniu genów; model myszy NG2-Cre; fluorescencja GFP.
Rysunek 1: Reprogramowanie in vivo rezydentnej glei NG2 w neurony. (A) Schematyczne przedstawienie zależnego od wirusa AAV przeprogramowania in vivo glejowych komórek NG2 w prążkowiu. (B) Schematyczne przedstawienie konstruktów AAV5 FLEX wykorzystanych do reprogramowania in vivo, w których ekspresja genów jest regulowana przez ekspresję Cre w komórkach docelowych. (C i C’) Neurony przeprogramowane in vivo, powstałe w wyniku wstrzyknięcia Syn-GFP + ALN do prążkowia. (D) Brak przeprogramowanych neuronów w przypadku braku czynników przeprogramowujących w koktajlu wirusowym i wstrzyknięcia in vivo wyłącznie konstruktu reporterowego. Paski skali = 100 μm (C),25 μm (C'), 25 μm (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aktywność neuronalna, rejestracje synaptyczne, wykresy kołowe; elektrofizjologia, analiza funkcji synaptycznych.
Rycina 2: Neurony przeprogramowane in vivo są funkcjonalne i wykazują dojrzewanie w czasie. (A) Przeprogramowany neuron wypełniony biocytyną wykazuje dojrzałą morfologię neuronalną, w tym kolce dendrytyczne. Ślady pokazują (B) aktywność hamująca (GABAergiczna), która jest blokowana przez pikrotoksynę, antagonistę receptorów GABAA antagonista receptora i (C) aktywność pobudzająca, która zostaje zablokowana przez CNQX, antagonista receptorów AMPA. (DLiczba neuronów z aktywnością postsynaptyczną zwiększa się w czasie.ENeurony poddane rejestracji metodą patch-clamp wykazują powtarzalne wyładowania już w 5. tygodniu po wstrzyknięciu (w.p.i.) i nadal wykazują je w 8. oraz 12. tygodniu po wstrzyknięciu (F) Potencjał czynnościowy indukowany prądem oraz aktywność postsynaptyczna niedojrzałego neuronu, wykazująca mniej zdarzeń synaptycznych i mniej potencjałów czynnościowych w porównaniu do B i D. Pasek skali = 25 μm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza elektrofizjologiczna typów komórek neuronów i ekspresji GFP; wykres danych i fluorescencja.
Rycina 3: Neurony przeprogramowane in vivo wykazują właściwości immunohistochemiczne i elektrofizjologiczne charakterystyczne dla interneuronów prążkowia. (A-DWzorce wyładowań neuronów przeprogramowanych in vivo mogą być różnych typów:A) Typ A jest podobny do endogennego średniego neuronu kolczastego (DARPP32+); (B) podobnie jak interneurony szybko wyładowujące (PV+); (C) podobne do neuronów niskoprogowych (LTS) z wyraźnym ugięciem potencjału (NPY+); (D) neurony wyładowujące z silną hiperpolaryzacją następczą (Chat+). (E-H) Obrazy konfokalne wykazujące kolokalizację GFP i markerów interneuronów PV (E), ChAT (F), NPY (G), oraz marker neuronów projekcyjnych DARPP32 (H). Wszystkie paski skali = 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo można osiągnąć przy użyciu wektorów AAV FLEX w szczepach myszy z ekspresją Cre. Należy zauważyć, że zaobserwowano różnice między szczepami myszy pod względem skuteczności przeprogramowywania. W przypadku przeprogramowania in vivo prążkowia, linia myszy NG2-Cre okazała się bardziej wydajna w porównaniu z innymi szczepami. Przed rozpoczęciem stosowania nowego szczepu zwierzęcego ważne jest, aby zapoznać się z wytycznymi dostawcy myszy dotyczącymi ekspresji Cre w czasie, ponieważ wiek zwierząt często wpływa na specyficzność ekspresji tego białka. W naszych badaniach zwierzęta w wieku powyżej 12 tygodni nie były wykorzystywane do przeprogramowania in vivo, ponieważ istniało ryzyko ekspresji Cre w komórkach innych niż glej NG2. Zaleca się stałą obecność i monitorowanie zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto wyłącznie konstrukt Synapsin-FLEX-GFP. Pozwala to na monitorowanie zwierząt pod kątem komórek GFP-dodatnich, które nie powinny być obecne, jeśli nie stosuje się genów przeprogramowujących (ALN).

Aby zidentyfikować nowo przeprogramowane neurony, niezwykle ważna jest metoda identyfikacji specyficzna dla neuronów, taka jak ta opisana w tym protokole. Pozwala to na właściwą identyfikację i odróżnienie przeprogramowanych neuronów od endogennych komórek otaczających, co ma szczególne znaczenie w przypadku przeprogramowania w regionie homotopowym.

Ważne jest również, aby celować w odpowiednią strukturę do wstrzyknięcia wirusa. Dlatego chirurgia stereotaktyczna do wstrzykiwania wirusa jest ważna i należy do niej podchodzić z dokładnością, zwłaszcza gdy celuje się w mniejsze struktury mózgu.

Wcześniej wykazaliśmy11 , że nie jest wiarygodne przewidywanie wyniku przeprogramowania in vivo na podstawie eksperymentów z przeprogramowaniem in vitro przy użyciu tych samych czynników przeprogramowania. W związku z tym wszystkie czynniki będące przedmiotem zainteresowania muszą zostać przetestowane in vivo. W naszych rękach wiele różnych kombinacji czynników daje ten sam podtyp neuronów (tj. interneurony11 in vivo), pomimo faktu, że geny te są zaangażowane w rozwój innych neuronów.

Zacisk łatki na całe komórki dla przeprogramowanych neuronów jest delikatną techniką, a przetwarzanie tkanek jest ważne dla dobrego wyniku. Perfuzja z lodowatym roztworem Krebsa poprawia jakość tkanek. Również neurony z łatami muszą być traktowane ostrożnie. Nawet jeśli dojrzewanie i tożsamość fenotypową przeprogramowanych neuronów można w pewnym stopniu ocenić za pomocą klamry krosowej całej komórki, komórki te nie są w pełni porównywalne z ich endogennymi odpowiednikami. Dodatkowe rodzaje analiz, takie jak sekwencjonowanie genomu (np. sekwencjonowanie RNA), powinny być stosowane w celu dalszego potwierdzenia przeprogramowanej tożsamości komórki.

Opisana w niniejszym dokumencie technika może być brana pod uwagę przy opracowywaniu przyszłych terapii, w których konieczna jest wymiana neuronów w mózgu. Chociaż przeprogramowanie in vivo jest wciąż na wczesnym etapie, a translacja na ludzi nie jest jeszcze przewidziana, technika ta może zapewnić metodę oceny funkcji genów egzogennych w mózgu i badania dojrzewania komórek in vivo.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Marcella Birtele została sfinansowana przez Program Unii Europejskiej Horyzont 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) w ramach Innowacyjnej Sieci Szkoleniowej Marie Skłodowska-Curie oraz Umowy o Grant nr 676408. Daniella Rylander Ottosson jest finansowana przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (2017-01234).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI DO KLONOWANIA AAV5 I PRZYGOTOWANIA WEKTORÓW WIRUSOWYCH
pAAV-CA-FLEXAddGene38042
Ascl1AddGene67291NM_008553.4
Lmx1aAddGene33013NM_0033652.5
Nurr1AddGene35000NM_013613.2
GFP-synAddGene30456
LoxP (FLEX) sekwencja 1GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac
gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc
accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg
acccataacttcgtataatgctatacgaa
gttatactagtcccgggaagggaagacggcgga
agaggctctaga
LoxP (FLEX) sekwencje 2tactagtataacttcgtataggatactttatac
gaagttatcattgggattctttttattttgatc
caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct
caccatcgacccataacttcgtatagcatacat
tatacgaagttatgtccctcgagaggttcgagaggtcttcgtttaaacGGTACCCTCGAC
pDP5Fabryka plazmidówPF435
Fabryka plazmidówpDP6PF436
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
FBS (płodowa surowica bydlęca)Thermo Fisher Scientific10500064
Penicylina streptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ GlutamaxThermo Fisher Scientific61965026
DPBS (Sól fizjologiczna buforu fosforanowego Dulbecco)Thermo Fisher Scientific
ogniwa HEK293Thermo Fisher Scientific85120602-1VL
KolbyBD Falcon10078780175 cm2
Tris H-CLSigma Aldrich10812846001 Dla buforu TE użyj 10 mM, pH 8,0; dla buforu do lizy użyj 50 mM, pH 8,5; dla buforu IE użyj 20 mM, pH 8,0; dla buforu elucyjnego użyj 20 mM, pH 8,0
EDTAEDTA: InvitrogenEDTA: AM9260G W przypadku buforu TE użyj 1 mM EDTA
Ultrapure water patrz System wody ultraczystej
CaCl2SigmaAldrichC50802.5 M
Dulbecco´ s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190136
NaClSigma-AldrichS3014 DLA HBS użyj 140 mM; dla buforu do lizy użyj 150 mM; dla buforu IE użyj 15 mM; dla buforu elucyjnego użyj 250 mM
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G Do lizy Bufor : 1 mM
Ultrawirówki uszczelniająceBeckman CoulterQuick-Seal®   Rurka
OptiPrep™   Gradient gęstości MediumSigma AldrichD1556-250ML
Strzykawka 10 ml igła 18GBD305064
Szklane butelki laboratoryjneVWR?
Filtr anionowymiennyLaboratorium PALLMSTG25Q6 Jednostka Acrodisc z membraną Mustang Q
Filtr odśrodkowyUrządzenie MerckZ740210-24EA Amicon Ultra-4
Zestawy do izolacji plazmidu DNA bez endotoksynThermo Fisher ScientificA33073
Na2PO4Sigma-AldrichS7907
HEPESSigma-AldrichH752315 ml
Probówka FalconThermo Fisher ScientificCorning 352196
Falconrurka Thermo Fisher ScientificCorning 352070
Szklane fiolkiNovatech30209-1232 CGGCCTCAGFGAGCGA
Podkład do przodu do sekwencji GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
Odwrotny podkład do sekwencji CACTCCCTCTCTGCGCGCTGcCGG&
acute; FAM / 3´ Sonda BHQ1Jena Bioscience
filtr 0,22 mmMerckSLGV004SLMillex-GV filtr
SPRZĘT AAV5 PRZYGOTOWANIE WEKTORÓW WIRUSOWYCH
Zamrażarka -20 ° C
Zamrażarka -80 & deg; C
Lodówka +4 ° C
AAV wirusowy pokój
System wody ultraczystejMerckMilli-Q® IQ 7000
Mieszalnik wirowyVWR444-0004
UltrawirówkaBeckman CoulterBeckman Optima LE-80K Autoklaw ultrawirówkowy
Tuttnauer2540 EL
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)BioRadC1000 Dotykowy termocykler
Ilościowy PCR (qPCR)RocheLightCycler® 480
Thermo Fisher ScientificSorvall ST16
Kąpiel wodnaThermo Fisher ScientificTSGP02
ANIMAL MODEL
NG2-Cre myszyJacksonNG2-CrexB6129, Stock #008533
ODCZYNNIKI DO WSTRZYKIWANIA CZYNNIKÓW PRZEPROGRAMOWUJĄCYCH DO MÓZGU
Water
SalineApoteket AB70%
EtanolSolveco
IsolfuraneApoteket AB Rozcieńczyć do 1% roztworu ciepłą wodą.
VirkonViroderm7511 
PentobarbitalApoteket ABP0500000 i.p. do postępowania terminalnego w dawce 60 mg/ml.
SacharozaMerckS0389-500G
Trypan BluThermo Fisher Scientific15250061
RetrobeadsLumafluorR170
BuprenorfinaApoteket AB
STRONG>SPRZĘT DO WSTRZYKIWANIA CZYNNIKÓW PRZEPROGRAMOWUJĄCYCH DO MÓZGU firmy RSG Solingen.
NożyczkiVWR233-1552firmy Biochem.
PęsetaVWR232-0007
KleszczVWR232-0120
Uchwyt na skalpelVWRRSGA106.621Numer 20.
SkalpelVWRRSGA106.200
Rama stereotaktycznaStoelting Europe51500D
Nakładki na uszy myszyStoelting Europe516485 ul
Strzykawka z wyjmowaną igłąHamilton Company65 0,75 średnica wewnętrzna i 1,5 średnica zewnętrzna.
Szklane kapilaryStoelting50811
Ściągacz do kapilar szklanychFirmaSutter P-1000
Wiertłodentystyczne Agnthos AB1464
GolarkaAgnthos ABGT420
Izofluran Komora i pompaAgnthos AB8323101Strzykawki 2 mL
MerckZ118400-30EA25G
IgłyMerckZ192414  Aldrich
Adapter myszy i noworodka szczura do stereotaktycznego ramkiStoelting51625
Poduszka grzewczaBraintree scientific, inc53800M od Covidien 2187.
Gaza bawełnianaFisher Scientific22-037-902
Rurka gumowaElfa DistrelecHFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150
Waciki bawełnianeFisher Scientific18-366-473
ODCZYNNIKI DO NAGRAŃ Z ZACISKIEM KROSOWYM DLA CAŁYCH KOMÓREK
NaClSigma-AldrichS3014
KClSigma-AldrichP9333
NaH2PO4-H2OSigma-AldrichS9638
MgCl2-6 H2OSigma-AldrichM2670
CaCl2-6 H2OSigma-AldrichC8106
MgSO4-7 H2OSigma-Aldrich230391
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
GlukozaSigma-AldrichG7021 patrz System wody ultraczystej
ultraczystaPrzygotuj 1 lub 2M.
KOHSigma-AldrichP5958-500G
K-D-glukonianSigma-AldrichG4500  Sigma
KClSigma-AldrichP9541
KOH-EGTA (kwas glikol-bis-N-tetracetynowy etilenu)Sigma-AldrichE3889  Kwas Sigma
KOH-Hepes (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy)Sigma-AldrichH7523
NaClSigma-AldrichS3014
Mg2ATPSigma-AldrichA9187
Na3GTPSigma-AldrichG8877
BiocytynaSigma-AldrichB4261
PikrotoksynaMerckP1675  Sigma
CNQXMerckC239  Sigma
Ice
SPRZĘT DO NAGRAŃ Z ZACISKIEM KROSOWYM DLA CAŁYCH KOMÓREK
pipeta ze szkła borokrzemianowegoFirma SutterB150-86-10
Ściągacz kapilar szklanychFirmaP-1000
WibratomeLeicaLeica VT1000 S
Oprogramowanie WaterBathThermo Fisher ScientificTSGP02
ClampfitUrządzenia molekularne Oprogramowanie
Multiclampmolekularne
ODCZYNNIKI DO IMMUNOHISTOCHEMII Stosować w stężeniu 4%.  UWAGA:  PFA jest silnym utrwalaczem. Unikać spożycia i kontaktu ze skórą.
Paraformaldehyd (PFA)Merck Millipore1040051000 Stosować w stężeniu 0,1%.
Triton X-100Fisher Scientific 10254640 Donkey.Stosować w stężeniu 1 : 400.
SerumMerck MilliporeS30-100ML Rozpuść proszek w wodzie Milli-Q do 1 mg/ml. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20° C,  wrażliwy na światło. Stosować w stężeniu 1 : 500.
Dichlorowodorek 4&,6-diamidyno-2′-fenyloindolu (DAPI)Sigma AldrichD9542 1: 600 w KPBS-T.
streptawidyna- Cy3Thermo Fisher Scientific4343151:5000, królik.
Anti-GAD65/67Abcam1:2000, mysz.
Anty-PVSigmaP30881:200, koza.
Anti-ChatMerkAB1431:5000, królik.
Anti-NPYImmunostar22940
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
NaClSigma-AldrichS3014
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B1:1000, kurczak.
Anti-GFPAbcamab13970
Rozwiązanie montażoweMerck10981 Medium montażowe z alkoholu poliwinylowego z DABCO®, zapobiegające blaknięciu
OCTAgar Scientific
GlycerolSigma-AldrichG9012-100ML
Woda
Roztwór przeciw zamarzaniuTissue Pro TechnologyAFS05-1000N, 1000 ml/szt.
SPRZĘT DO IMMUNOHISTOCHEMII
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SP8 ze skaningiem laserowym.
PrismGraphPad
MicrotomeLeicaSM2010R
14190094polipropylenowa powtórzeń z odwróconym terminalem końcowym (ITR) powtórzeń odwróconego terminalu końcowego (ITR) Wirówka systemowa <Woda Urządzenia destylowanaOdwrócony mikroskop fluorescencyjny Leica DMI6000 B

Bibliografia

  1. Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson's Disease: Dawn of a New Era. Cell Stem Cell. 21 (5), 569-573 (2017).
  2. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622(2014).
  3. Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. Cell-based therapy for Parkinson's disease: A journey through decades toward the light side of the Force. European Journal of Neuroscience. , (2018).
  4. Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
  5. Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord. Nature Communication. 5, 3338(2014).
  6. Liu, Y., et al. Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9336-9355 (2015).
  7. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  8. Grande, A., et al. Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain. Nature Communication. 4, 2373(2013).
  9. Niu, W., et al. In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain. Nature Cell Biology. 15 (10), 1164-1175 (2013).
  10. Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons. Molecular Therapy. 25 (4), 928-934 (2017).
  11. Pereira, M., et al. Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons. Stem Cell Reports. 9 (3), 742-751 (2017).
  12. Rivetti di Val Cervo, P., et al. Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson's disease model. Nature Biotechnology. 35 (5), 444-452 (2017).
  13. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy Methods & Clinial Development. 10, 1-7 (2018).
  14. Torper, O., et al. Generation of induced neurons via direct conversion in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 7038-7043 (2013).
  15. Kawaguchi, Y., Kubota, Y. Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex. Journal of Neurophysiology. 70 (1), 387-396 (1993).
  16. Grealish, S., et al. The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson's disease. Brain. 133 (Pt 2), 482-495 (2010).
  17. Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections. Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeprogramowanie in vivokonwersja kom rek glejowychwektory wirusowe AAVinterneurony parwalbuminowewstrzykiwanie stereotaktyczneocena elektrofizjologicznaoczyszczanie w gradiencie jodiksanolufiltr wymiany anionowejekspresja reportera GFPaktywno typu fast spiking
Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.