Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Ogólnym celem tej metody jest skuteczne przekształcenie komórek glejowych w mózgu in vivo w funkcjonalne i specyficzne dla podtypów neurony, takie jak interneurony wykazujące ekspresję parwalbuminy. Jest to krok naprzód w kierunku opracowania alternatywnej terapii zastępczej w chorobach mózgu bez konieczności stosowania egzogennego źródła komórek. Tworzy również narzędzie do badania przełączników losu komórek in situ.

Mózg ma ograniczoną zdolność do generowania nowych neuronów. Dlatego w chorobach neurologicznych istnieje zapotrzebowanie na egzogenne źródła komórek do naprawy mózgu. W tym celu różne źródła komórek zostały poddane intensywnym badaniom na przestrzeni lat, w tym komórki z tkanki pierwotnej, komórki pochodzące z komórek macierzystych i komórki przeprogramowane^1,2,3. Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek mózgowych na neurony jest nowym podejściem, które może zapewnić atrakcyjną metodę naprawy mózgu, ponieważ wykorzystuje własne komórki pacjenta do generowania nowych neuronów w mózgu. Do tej pory kilka raportów wykazało przeprogramowanie in vivo poprzez dostarczanie wektorów wirusowych w mózgu^4,5,6,78,9 w różnych obszarach mózgu, takich jak kora, rdzeń kręgowy, prążkowie i śródmózgowie5^,10,11, a także w nienaruszonym i uszkodzonym mózgu^5,8,11,12. Uzyskano zarówno neurony hamujące, jak i pobudzające^4,8, ale dokładny fenotyp lub funkcjonalność tych komórek nie została jeszcze szczegółowo przeanalizowana.

W tym protokole opisujemy bardziej efektywne przeprogramowanie i specyficzną dla komórki identyfikację neuronów przeprogramowanych in vivo. Udostępniamy protokół oceny funkcjonalnej dojrzewania neuronów i charakterystyki fenotypu w oparciu o funkcjonalność i cechy immunohistochemiczne.

Użyliśmy indukowanego przez Cre wektora AAV i reportera GFP, aby zidentyfikować przeprogramowane neurony in vivo. Ten wybór wektorów wirusowych ma tę zaletę, że infekuje zarówno dzielące się, jak i niedzielące się komórki mózgu, zwiększając liczbę komórek docelowych, jako alternatywa dla stosowania retrovirus^7,8. Specyficzny dla neuronów reporter FLEX (GFP) napędzany synapsyną umożliwił nam specyficzne wykrycie nowo wygenerowanych neuronów. W poprzednich badaniach do przeprogramowania in vivo wykorzystano promotory specyficzne dla podtypu^7,9, które również umożliwiają ekspresję genów przeprogramowujących i reporterów w określonych typach komórek. Metoda ta wymaga jednak dalszej identyfikacji przeprogramowanych neuronów poprzez pośmiertną analizę koekspresji markerów reporterowych i neuronalnych. Użycie reportera specyficznego dla neuronu, takiego jak ten opisany w niniejszym dokumencie, pozwala na bezpośrednią identyfikację. Stanowi to bezpośredni dowód udanej konwersji i umożliwia identyfikację żywych komórek, która jest wymagana do elektrofizjologii z klamrą krosową.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej (2010/63/UE) i zatwierdzone przez komisję etyczną ds. wykorzystania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie w Lund i Szwedzkim Departamencie Rolnictwa (Jordbruksverket). Myszy są trzymane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.

1. Wektory wirusowe

1. Klonowanie wektorów AAV
   1. Aby utworzyć indukowane przez Cre wektory AAV5, należy wstawić cDNA dla GFP, Ascl1, Lmx1a i NR4A2 (Nurr1) w odwrotnej orientacji otoczonej dwiema parami heterotypowych, antyrównoległych sekwencji LoxP z przerzuceniem (FLEX) (Tabela materiałów). Do insercji cDNA należy użyć szkieletu, takiego jak pAAV-Cba-FLEX lub o podobnej strukturze, zawierającego sekwencje FLEX i promotor beta aktyny kurczaka (CBA).
   2. Wstaw każdy pojedynczy cDNA (np. Ascl1) do szkieletu za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i enzymów restrykcyjnych. Ekspresja GFP pod kontrolą promotora synapsyny i Ascl1, Lmx1a, Nurr1 pod kontrolą wszechobecnie wyrażanego promotora CBA.
      nuta: Upewnij się, że masz DNA wolne od endotoksyn za pomocą specjalnych zestawów do izolacji plazmidowego DNA bez endotoksyn.
   3. Przed użyciem należy przeprowadzić sekwencjonowanie i analizę ograniczeń na konstrukcjach, aby sprawdzić powodzenie etapu klonowania.
2. Produkcja wektorów wirusowych AAV5
   ostrożność: Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego podczas obchodzenia się z wirusem związanym z adenowirusem (AAV). W Szwecji AAV stosowany w tym protokole wymaga poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
   1. Komórki HEK293T nasiennej ze standardowymi pożywkami hodowlanymi (DMEM + Glutamax + 10% FBS + penicylina (100 U/ml) streptomycyna (100 μg / ml), patrz tabela materiałów) w kolbach T175 o gęstości 3 x 10⁶ komórek na kolbę. Weź pod uwagę 5 kolb na partię AAV i zaplanuj 6 partii na raz.
   2. Gdy komórki osiągną 50-70% zbieżności, przygotuj następującą mieszankę do transfekcji (na 175 cm² kolbę).
      1. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać równomolowe ilości plazmidu wektorowego i plazmidu pomocniczego serii pDG (pDP5, pDP6), o łącznej ilości 72 μg na kolbę o długości 175^cm2.
      2. Dodać bufor Tris-EDTA (bufor TE, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) do końcowej objętości 144 μL.
      3. Dodaj ultraczystą wodę, aby całkowita objętość wynosiła 1296 μl i wymieszaj.
      4. Dodać 144 μl 2,5 M CaCl₂ i wymieszać. Dodać 1,92 μl buforowanej soli fizjologicznej HEPES (HBS) (1,5 mM Na₂HPO₄, 140 mM NaCl, 50 mM HEPES) do roztworu DNA i natychmiast wymieszać przez wirowanie.
      5. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) dokładnie przez 60 sekund. Przenieść roztwór do 28 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i wymieszać.
   3. Zastąp pożywkę w kolbach pożywką do hodowli komórkowych zawierającą mieszaninę transfekcji.
   4. Trzy dni po transfekcji zebrać komórki, wylewając pożywkę z kolb do jednorazowego pojemnika na odpady i dodać 5 ml buforu do zbioru (EDTA dodany do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, patrz Tabela materiałów, DPBS do końcowego stężenia 5 mM) do stężenia 5 mM) do stężenia 5 mM) do każdej kolby, aby umożliwić oderwanie komórek.
   5. Wlać roztwór komórkowy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać kolejne 4 ml DPBS do każdej kolby, aby przepłukać pozostałe komórki i połączyć je z roztworem z pierwszej komórki. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Po odwirowaniu usunąć supernatant i rozpuścić granulki w 15 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂) przez wirowanie.
   7. Zamrozić je w kąpieli CO₂ lodowo-etanolowej na 15 minut i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić zebrany lizat komórkowy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Oczyszczanie wektorów wirusowych AAV5
   1. Przeprowadzić oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradionym iodixanolu¹³ i użyć ultrawirówek uszczelniających z wirowaniem przy 350 000 x g przez 1 godzinę i 45 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 18G i włóż około 2 mm poniżej granicy fazy 40/60% ze skosem skierowanym do góry, aby wyekstrahować fazę zawierającą AAV. Pamiętaj, aby zatrzymać się przed dotarciem do pasma białkowego po ekstrakcji 5-6 ml.
   3. Ekstrakty gradientowe należy przechowywać w szklanych butelkach sterylizowanych w autoklawie w temperaturze 4 °C. Należy unikać przechowywania dłużej niż przez noc.
   4. Rozcieńczyć ekstrakt gradientowy jodiksanolu 3-krotnie, powoli pipetując w 12 ml buforu do elucji jodiksanolu (IE) (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 15 mM NaCl) podczas wirowania.
   5. Oczyścić i skoncentrować rozcieńczony gradient jodiksanolu przez filtr anionowymienny. Przepychaj go powoli z prędkością nie większą niż 1 kropla/s. Powoli przepchnij 3 ml buforu IE przez filtr, aby go umyć.
   6. Eluować do odśrodkowego zespołu filtrującego z 1-2 ml buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM NaCl). Dodać DPBS do urządzenia do końcowej objętości 4 ml. Wirować przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej do momentu, gdy w filtrze pozostanie mniej niż 0,5 ml. Usuń płyn z dna probówki, napełnij 4 ml DPBS i ponownie odwiruj. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Upewnij się, że objętość skoncentrowanego wektora na filtrze wynosi około 200 μl po ostatnim etapie wirowania.
   7. Usuń skoncentrowany wektor o objętości 200 μl za pomocą pipety i przepchnij koncentrat przez filtr 0,22 μm w celu jego wysterylizowania. Porcja 200 μLinto szklana fiolka 9 mm z blokowaną wkładką (tabela materiałów).
      nuta: Zapasy wektorów AAV5 można przechowywać w zamrażarkach w temperaturze -80 °C w celu długiego przechowywania lub w temperaturze 4 °C, jeśli zostaną zużyte w ciągu 2 tygodni.
4. Oznaczanie miana wektora wirusa AAV5
   1. Oznaczyć miano AAV5 za pomocą standardowej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) ze starterami dla sekwencji powtórzeń odwróconego terminala (ITR) i sondy 5'FAM / 3'BHQ1 dla sekwencji ITR (tabela materiałów). Należy użyć krzywej wzorcowej uzyskanej ze znanymi ilościami ITR zawierającymi plazmid. Każdy wektor AAV powinien mieć zakres 1E⁺¹⁴ – 1E⁺¹⁵ kopii genomu na mililitr, jeśli do określenia miana stosuje się sekwencję ITR.
      nuta: Udana produkcja wirusa AAV5 daje zapasy o mianach w minimalnym zakresie 3E⁺¹³ – 7E⁺¹³ jednostek/ml.

2. Wstrzykiwanie czynników przeprogramowujących do mózgu

1. Ustawienie zwierząt, stereotaktyczne rozmieszczenie i wiercenie
   nuta: Protokół ten koncentruje się na wykorzystaniu Ascl1, Lmx1a i Nurr1 (ALN) do przeprogramowania gleju NG2 na interneurony. Z naszego doświadczenia wynika, że interneurony o podobnym fenotypie można uzyskać przy użyciu innych kombinacji czynników¹¹.
   1. Przed zabiegiem chirurgicznym należy przygotować mieszankę wirusową zawierającą wektory Cba-FLEX-Ascl1, Cba-FLEX-Lmx1a, Cba-FLEX-Nurr1 i wektor reporterowy Syn-FLEX-GFP. Dodać każdy z zapasów przygotowanych w sekcji 1 do końcowej mieszanki, tak aby końcowy roztwór wirusowy zawierał 5% każdego z czynników przeprogramowujących (Ascl1, Lmx1a i Nurr1) i 10% konstruktu reporterowego (5% A, 5% L, 5% N i 10% GFP).
      nuta: Mieszaniny wektorów AAV5 mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C i przechowywane do wykorzystania w przyszłości in vivo.
   2. Znieczulić mysz za pomocą 2% izofluranu w mieszaninie powietrza i podtlenku azotu (_N2O) w stosunku 4:1. Monitoruj oddech zwierzęcia, obserwując ruchy przepony. Podczas zabiegu należy utrzymać znieczulenie za pomocą 1–1,5% izofluranu.
      nuta: Opisany tutaj model myszy składa się ze szczepu myszy, który specyficznie wyraża Cre w gleju NG2. Przeprogramowanie in vivo można osiągnąć przy użyciu różnych szczepów myszy, które wyrażają Cre w innych populacjach komórek glejowych (np. astrocyty¹⁴).
   3. Gdy zwierzę jest całkowicie znieczulone (np. całkowite rozluźnienie mięśni i brak reakcji na uszczypnięcie w opuszkę stopy), ogol obszar wokół miejsca nacięcia i przyprowadź zwierzę do klatki stereotaktycznej.
   4. Aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji, przymocuj poduszkę grzewczą do podstawy ramy stereotaktycznej. Umieść mysz na czystym, suchym ręczniku papierowym.
   5. Ostrożnie umieść głowę myszy w nausznikach. W przypadku prawidłowego umieszczenia nie należy obserwować bocznego ruchu głowy. Ustaw lewą listwę douszną na 4 mm przed rozpoczęciem umieszczania myszy w ramce stereotaktycznej.
   6. Zamocuj listwę zębatą na miejscu, a następnie dokręć listwę nosową. Upewnij się, że głowa nie porusza się w żadnym wymiarze i jest skierowana prosto przed siebie (linia środkowa jest prostopadła do płaszczyzny nauszników). Zastosuj maść okulistyczną w celu ochrony oczu.
   7. Przed rozpoczęciem zabiegu należy podać odpowiednie środki przeciwbólowe (np. 0,05 mg/kg buprenorfiny podawane podskórnie).
   8. Oczyść miejsce nacięcia bawełnianą gazą lub chusteczką nasączoną 70% EtOH, nie zbliżając się do okolic oczu.
      nuta: Do domózgowego wstrzykiwania wirusa stosuje się strzykawkę o pojemności 5 lub 10 μl przystosowaną do ciągniętej szklanej kapilary. Szklane kapilary są pobierane za pomocą ściągacza do mikropipet, w wyniku czego powstaje kapilara z bardzo cienką końcówką, co zminimalizuje inwazyjność zabiegu. Aby zaadaptować kapilarnę do strzykawki, należy użyć kawałka gumowej rurki nad połączeniem między igłą strzykawki a szklaną kapilarną i stopić ją za pomocą źródła ciepła (np. zapalniczki). Szczelne połączenie między tymi dwoma częściami zapewni, że podczas wstrzykiwania nie dojdzie do wycieków płynu. Przed rozpoczęciem operacji należy to sprawdzić, napełniając strzykawkę solą fizjologiczną i wypychając płyn ze strzykawki.
   9. Wykonaj nacięcie około 0,5-0,8 cm wzdłuż linii środkowej głowy. Przeciąć zarówno warstwę skórną, jak i podskórną za pomocą skalpela.
   10. Poszerz płaty skóry po obu stronach nacięcia. Oczyść nacięcie z krwi i zeskrob warstwy podskórne patyczkiem kosmetycznym.
   11. Przesuń ramię M/L-D/V ramy stereotaktycznej na miejsce (nad zwierzęciem) i zabezpiecz je.
       nuta: Ramka stereotaktyczna umożliwia regulację strzykawki wzdłuż osi Przednio/Tylnej (A/P, Y), Przyśrodkowej/Bocznej (M/L, oś X) oraz Grzbietowej/Brzusznej (oś D/V, Z).
   12. Przesunąć strzykawkę wzdłuż różnych osi ramy stereotaktycznej, aby końcówka szklanej kapilary znalazła się tuż nad bregmą (punktem połączenia, w którym spotykają się różne płytki czaszki).
   13. Upewnij się, że końcówka kapilarna jest idealnie prosta zarówno w płaszczyźnie A/P, jak i M/L. W przypadku niejednoznacznej bregmy należy wziąć średnią ze szwów bocznych i środkowych.
   14. Gdy końcówka kapilary zostanie prawidłowo umieszczona nad bregmą, zresetuj wartości M/L i A/P do 0,0 na cyfrowym liczniku współrzędnych.
   15. Aby upewnić się, że głowa zwierzęcia znajduje się w idealnie płaskiej pozycji, użyj cyfrowego licznika współrzędnych do zmierzenia wartości współrzędnych D/V, gdy ramię A/P znajduje się na poziomie +2,0 i -2,0 (M/L = 0,0), a także gdy ramię M/L znajduje się na poziomie +2,0 i -2,0 (A/P = 0,0). Dostosuj odpowiednio wysokość listwy zębatej i nauszników.
   16. Przesunąć strzykawkę do żądanych współrzędnych w celu wstrzyknięcia wektorów wirusowych w prążkowiu (A/P = +1,0; M/L = -2,0, w stosunku do bregmy).
   17. Lekko unieść strzykawkę i patrząc na miejsce wstrzyknięcia przez mikroskop, wywiercić otwór za pomocą wiertła dentystycznego we współrzędnych wstrzyknięcia. Rozpocznij wiercenie na miejscu, pracując okrężnie i delikatnie.
       nuta: Nie wywieraj zbyt dużego nacisku w dół, ponieważ wiertło powinno być wystarczająco ostre, aby przejść przez kość bez dodatkowej siły. Unikaj długiego, długotrwałego wiercenia, ponieważ powoduje to wytwarzanie ciepła.
   18. Pod koniec wiercenia należy sprawdzić, czy opona twarda pozostała nienaruszona i wystawiona do wstrzyknięcia.
2. Przygotowanie konfiguracji strzykawki
   1. Umieść kawałek bawełnianej gazy na otwartym nacięciu i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.
   2. Po przepłukaniu należy pobrać pęcherzyk powietrza o objętości 1–2 μl, a następnie 1 μl roztworu zawierającego wektory wirusowe, unikając niezamierzonych pęcherzyków. Upewnij się, że roztwór wirusowy można łatwo uwidocznić poniżej pęcherzyka powietrza podczas wstrzykiwania.
3. Wstrzyknięcie wirusa
   1. Usunąć bawełnianą gazę znad miejsca nacięcia i opuścić strzykawkę za pomocą ramienia D/V ramy stereotaktycznej. W miarę zbliżania się do powierzchni czaszki uważnie spójrz przez mikroskop i zmierz poziom D/V opony twardej - powinna się lekko wybrzuszyć pod delikatnym naciskiem.
   2. Dotykając opony twardej końcówką kapilary, ustaw współrzędną D/V na 0,0.
   3. Opuścić strzykawkę, powoli przesuwając się do żądanej głębokości (D/V = -2,7, w stosunku do opony twardej). Upewnij się, że trajektoria jest wolna od fragmentów kości, tak aby nie zaobserwowano zgięcia igły/kapilary.
      nuta: Przedstawione współrzędne odnoszą się do wstrzyknięcia czynników przeprogramowujących do prążkowia myszy NG2-Cre. Można użyć współrzędnych odpowiadających innym obszarom mózgu. Zawsze najpierw testuj współrzędne do wstrzyknięcia za pomocą barwnika (np. błękitu trypanowego), kolorowego zastrzyku kulki lub reporterowego wektora wirusowego przed wstrzyknięciem czynników przeprogramowujących do mózgu nowego szczepu myszy. W przypadku wstrzyknięcia błękitu trypanowego, zwierzęta muszą zostać uśmiercone natychmiast po operacji, a mózg wycięty. Świeże mózgi można wyciąć za pomocą mikrotomu, podczas gdy są zamrożone, a miejsce wstrzyknięcia można określić na podstawie wizualizacji położenia barwnika w mózgu. Jeśli współrzędne testuje się za pomocą kolorowych kulek, możliwe jest określenie miejsca wstrzyknięcia na perfundowanych i pociętych mózgach tydzień po wstrzyknięciu. Alternatywnie można zastosować wstrzyknięcie wektora wirusowego przenoszącego gen reporterowy, a miejsce wstrzyknięcia określić w perfundowanych naciętych mózgach.
   4. Wstrzyknąć 1 μl roztworu wirusa z szybkością 0,4 μl/min. Po wstrzyknięciu całej objętości należy odczekać 2 minuty dyfuzji przed pobraniem strzykawki.
   5. Po dyfuzji powoli wycofaj strzykawkę, aż końcówka naczynia włosowatego całkowicie wystanie z mózgu.
   6. Umieść kawałek bawełnianej gazy na ranie i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.
   7. Przesuń ramię M/L-D/V ramy stereotaktycznej poza obszar roboczy.
4. Zamykanie ran i zabiegi pooperacyjne
   1. Ostrożnie zszyć nacięcie za pomocą nici do szycia.
      nuta: Wszystkie nici do szycia stosowane u zwierząt, którym wstrzyknięto zastrzyki, należy umieścić w kubku/fiolce zawierającej przeciwwirusowy roztwór detergentu. To samo rozwiązanie stosuje się do czyszczenia wszystkich powierzchni otaczających obszar operacyjny, które miały kontakt z materiałami chirurgicznymi. Wszystkie narzędzia chirurgiczne są dokładnie myte i sterylizowane w autoklawie pod koniec każdego dnia operacji.
   2. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je w stacji pooperacyjnej, która obejmuje czystą, podgrzewaną klatkę, dostęp do jedzenia i wody oraz miejsce, w którym zwierzę pozostaje do momentu pełnego wybudzenia. W tym okresie należy uważnie obserwować zwierzę, aż do odzyskania przytomności.
   3. Nie należy trzymać operowanych zwierząt ze zwierzętami nieoperowanymi, dopóki te pierwsze nie wyzdrowieją w pełni po operacji.
   4. Codziennie nadzoruj operowane zwierzęta. W zależności od zastosowanych szwów, upewnij się, że zostały one usunięte w razie potrzeby. Wszystkim zwierzętom podawano Bupenorphinum (Temgesic w dawce 1 ml/kg) podskórnie jako opiekę pooperacyjną.
      nuta: W przypadku pracy przy użyciu tej samej strzykawki przez dwa kolejne dni, przepłukać ją wodą, a następnie etanolem 70% i ponownie wodą. Pozostawić strzykawkę wypełnioną wodą na noc, aby umożliwić rozpuszczenie wszelkich ewentualnych pozostałości.

3. Zapisy elektrofizjologiczne

1. Przygotowanie plastrów tkanek do elektrofizjologii
   ostrożność: Dobrze wykonane przygotowanie tkanek jest niezbędne do uzyskania dobrych zapisów elektrofizjologicznych. Starannie przygotuj pomieszczenie i umieść narzędzia do perfuzji i preparacji na lodzie.
   1. Przygotuj lodowaty i natleniony (95%_O2 i 5% CO₂) roztwór Krebsa do perfuzji, rozwarstwienia i cięcia (przygotuj go tego samego dnia z 10x bulionu, rozcieńczając roztwór podstawowy w ultraczystej wodzie i dodając_NaHCO3 i glukozę). Składnikami roztworu Krebsa w mM (po rozcieńczeniu do 1x) są: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH₂PO₄·H₂O, 1,3 MgCl₂·6H₂O i 2,4 CaCl₂·6H₂O, 22 NaHCO₃, 10 glukoza. Doprowadzić pH roztworu do 7,4.
   2. Wykonaj kalibrację (Vibracheck) wibratomu za pomocą nowej żyletki.
   3. Uruchomić blok chłodzący wibratomu (lub napełnić otaczającą komorę lodem), a następnie napełnić komorę tnącą roztworem Krebsa do natlenienia 95 %_O2 i 5 % CO₂ co najmniej 30 minut przed użyciem.
   4. Połóż szalkę Petriego na lodzie i napełnij ją natleniznym roztworem Krebsa. Umieść ostrze, nożyczki i płytkę montażową na lodzie.
      ostrożność: Przynieś klatkę zawierającą mysz do pomieszczenia co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem procedury aklimatyzacji. Stres ma negatywny wpływ na stan wycinków tkanki mózgowej.
   5. Znieczul końcowo mysz, wstrzykując przedawkowanie pentobarbitalu i pozwól zwierzęciu zasnąć. Gdy odruch mrugania zniknie, a zwierzę nie reaguje na bodźce bólowe, przekrwij zwierzę przezsercowo lodowatym roztworem Krebsa przez 2-3 minuty (z szybkością 10-20 ml / min).
   6. Szybko, ale ostrożnie, wypreparuj mózg i umieść go do góry nogami na szalce Petriego, która jest umieszczona na lodzie (zawierającej roztwór Krebsa).
      nuta: Aby porównać funkcjonalne dojrzewanie przeprogramowanych neuronów, należy poświęcić zwierzęta do nagrań w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu wirusa. Oceń właściwości wypalania różnych podtypów neuronów na podstawie istniejącej literatury¹⁵ .
   7. Wykonaj nacięcie koronalne wzdłuż środkowej części móżdżku i przyklej tę stronę do płyty montażowej (również lodowato-zimnej) w celu wycięcia wibratomem.
   8. Ostrożnie zanurz sklejony mózg w komorze buforowej w wibratomie.
      ostrożność: Uważaj, aby nie dotknąć żyletki dla własnego bezpieczeństwa i aby ostrze pozostało skalibrowane.
   9. Cięcie od najbardziej rostralnej części mózgu w dół do poziomu prążkowia z dużą prędkością. Następnie przetnij prążkowie koronalnie pod kątem 275 μm z małą prędkością (0,10 mm/s).
   10. Po każdym cięciu ostrożnie usunąć niewstrzykniętą stronę prążkowia (np. za pomocą zgiętej igły) i przenieść wstrzykniętą stronę do innej fiolki w łaźni wodnej, zawierającej dolną siatkę (natleniony Krebs w temperaturze pokojowej) umieszczoną w łaźni wodnej. Utrzymuj to na RT, aż wszystkie sekcje zostaną wycięte.
   11. Powoli zwiększaj temperaturę łaźni wodnej do 37 °C i pozostaw ją na 30 minut. Następnie wyłącz grzałkę i pozwól ostygnąć do RT.
       UWAGA: W tym momencie możesz wstrzymać nagrywanie, aż rozpoczniesz nagrywanie. Odcinki trwają 4-6 godzin.
2. Nagrania z użyciem clampów krosowych dla całych komórek
   1. Przenieść pierwszy wycinek tkanki do komory rejestracyjnej zanurzonej w ciągłym strumieniu roztworu Krebsa. Zamontuj sekcję za pomocą lekkich ciężarów i zanurz obiektyw.
   2. Zidentyfikuj obszar prążkowia w mikroskopie i poszukaj neuronów GFP-dodatnich (przeprogramowanych). Wybierz neuron, który ma rozległą morfologię i nie jest pokryty wiązkami włókien lub naczyniami krwionośnymi.
   3. Przygotować pipety ze szkła borokrzemianowego (3–7 MΩ) do łatania i napełnić następującym roztworem wewnątrzkomórkowym (w mM): 122,5 glukonian potasu, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3_Na3GTP i 8 NaCl, dostosowany do pH 7,3 za pomocą KOH.
   4. W celu wypełnienia biocytyną dodaj 1 mg soli biocytyny do 1 ml roztworu wewnętrznego i zawiruj.
      ostrożność: Upewnij się, że przefiltrowałeś roztwór wewnętrzny za pomocą biocytyny, ponieważ w przeciwnym razie może to zatkać elektrodę.
   5. Przymocuj szklaną pipetę do elektrody rejestrującej i zanurz ją w roztworze. Dokładnie sprawdź rezystancję elektrody. Następnie powoli zbliż się pipetą do ogniwa, utrzymując lekkie nadciśnienie w elektrodzie, aby uniknąć zatkania końcówki.
      ostrożność: Uważaj, aby śledzić swoją komórkę podczas schodzenia do elektrody i nie wybielać fluorescencji w ogniwie (tj. wyłączaj lampę fluorescencyjną, gdy jej nie potrzebujesz).
   6. Ostrożnie opłucz otaczającą tkankę za pomocą nadciśnienia elektrody i zbliż się do ogniwa z elektrodą. Umieść elektrodę bezpośrednio na górze ogniwa i opuść, aż elektroda dotknie membrany. Wykonaj uszczelnienie Giga-Ω między elektrodą a błoną komórkową i za pomocą impulsów podciśnienia rozerwij membranę, aby utworzyć łatkę na całe komórki.
      ostrożność: Przeprogramowane neurony są wrażliwe. Zachowaj ostrożność podczas łatania i nie wywieraj zbyt dużego podciśnienia podczas docierania do uszczelki Giga-Ω lub otwierania błony komórkowej. Ponadto łatanie na zwierzętach, które są starsze, wymaga praktyki i cierpliwości, ponieważ ich tkanka łączna jest grubsza i trudniej jest uwidocznić neurony.
   7. Sprawdź spoczynkowe potencjały membranowe natychmiast po włamaniu w trybie cęgów prądowych i zapisz je do analizy.
   8. W cęgach prądowych utrzymuj ogniwo w zakresie od -60 mV do -80 mV i wstrzykuj prądy 500 ms od -20 pA do +90 pA, z przyrostami 10 pA w celu indukcji potencjałów czynnościowych.
   9. Przenieść do cęgów napięciowych i zmierzyć wewnętrzne prądy sodowe i opóźnione prostownikujące prądy potasowe w krokach depolaryzacji 10 mV.
      nuta: Zapisy cęgów napięciowych są lepiej oceniane przy użyciu innego rozwiązania wewnętrznego, składającego się z substancji chemicznych, które bardziej efektywnie zaciskają membranę. Jednak w przypadku przeprogramowanych neuronów liczba komórek, z których można nagrywać, jest niewielka, a liczba odcinków tkanek z tymi neuronami jest ograniczona. W związku z tym zaletą jest nagrywanie zarówno w cęgach prądowych, jak i napięciowych z tego samego ogniwa.
   10. W trybie cęgowym napięcia rejestruj spontaniczną aktywność postsynaptyczną przy -70 mV. Rozróżnij hamujące zdarzenia postsynaptyczne przy potencjale błonowym 0 mV od zdarzeń pobudzających przy -70 mV.
   11. Po osiągnięciu stabilnej linii podstawowej, dodać Pitrotoksynę, antagonistę receptora GABA_A, do roztworu Krebsa, który wpływa do komory rejestrującej, w celu ekstrakcji zdarzeń pobudzających (dodać podstawowy roztwór pikrotoksyny do końcowego stężenia 50 mM w oddzielnej strzykawce buforowej, która jest podłączona do perfuzji w komorze. Podłącz odpływ buforu z komory do worka próżniowego w celu bezpiecznej utylizacji).
   12. Po 20 minutach dodać CNQX (20 mM), antagonistę AMPA, do roztworu Krebsa, który przepływa do komory rejestrującej, w celu zablokowania zdarzeń hamujących (stosując tę samą procedurę, co w przypadku pikrotoksyny). Pozostaw na kolejne 20 minut, a następnie zmyj roztworem Krebsa. Usuń wycinek tkanki z komory.
   13. Po zakończeniu nagrań należy przeprowadzić analizę offline spontanicznych pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC) i hamujących prądów postsynaptycznych (IPSC) przy użyciu detekcji zdarzeń progowych (>5 pA) w programie do analizy.
   14. Podczas całego nagrania komórka będzie powoli wypełniana wewnętrznym roztworem zawierającym biocytynę. Przytrzymaj plaster przez co najmniej 20 minut przed powolnym wyjęciem elektrody w celu całkowitego wypełnienia ogniwa.
       ostrożność: Należy uważać, aby w elektrodzie nie wystąpiło nadciśnienie, które mogłoby zniszczyć późniejszą analizę morfologiczną komórek.
   15. W celu uwidocznienia biocytyny należy umieścić wycinek tkanki w 4% paraformaldehydzie (PFA) na noc w temperaturze 4 °C. Przepłukać skrawek w 0,02 M buforze fosforanu potasu (KPBS) z 0,1% trytonem. Następnie barwnik na streptawidynę-Cy3 (1: 600 w KPBS-T, 2 h), w celu identyfikacji komórki wypełnionej biocytyną i morfologicznej wizualizacji przeprogramowanego neuronu.
       nuta: Wypełnienie biocytyną może być wykorzystywane do analizy morfologicznej i ilustracji neuronów z łatkami.

4. Immunohistochemia, stereologia i kwantyfikacja

UWAGA: Poświęć określoną grupę myszy do immunohistochemii, ponieważ skrawki tkanek używane do elektrofizjologii nie są optymalne dla immunohistochemii.

1. Znieczulij myszy wstrzyknięciem dożylnego przedawkowania pentobarbitalu i dosiądź zwierzę do perfuzji.
2. Perfuzję przezsercową myszy najpierw roztworem soli fizjologicznej w celu usunięcia krwi, a następnie lodowatym 4% PFA.
3. Wypreparuj mózgi i pofix przez co najmniej 12 godzin w 4% PFA.
4. Umieść mózgi w 25% roztworze sacharozy (w celu krioprotekcji) na około 12 godzin
   nuta: Mózgi są gotowe do cięcia, gdy zanurzą się w 25% roztworze sacharozy, co wskazuje, że sacharoza przeniknęła do całego mózgu myszy.
5. Wykonaj nacięcie koronalne w poprzek móżdżku, użyj płaskiej, najbardziej ogonowej części mózgu, aby umieścić mózg na mikrotomie i przymocuj go na miejscu za pomocą optymalnego związku o temperaturze cięcia (OCT).
6. Pokrój mózg na plastry koronalne o grubości 35 μm i podziel mózg na kolejne serie umieszczone w fiolkach lub studzienkach zawierających 0,02 M KPBS.
7. Przetwarzaj skrawki do immunohistochemii przy użyciu przeciwciał przeciwko GFP i markerom interneuronowym, takim jak GAD65/67, PV, Chat (acetylotransferaza choliny) i NPY (neuropeptyd Y), zgodnie ze standardowymi protokołami^{16, 17.}
   nuta: Plastry mózgu można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C w roztworze niezamarzającym przez długi czas.
8. Po zakończeniu barwienia zamontuj sekcje na szklanym szkiełku podstawowym i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym, używając roztworu montażowego, aby zamocować go na miejscu. Pozostaw szkiełka nakryte do wyschnięcia na noc.
   nuta: W naszych badaniach całe mózgi są cięte w seriach 1:8 (tj. każda fiolka zawierająca sekcje będzie zawierała jedną ósmą mózgu myszy ¹¹).
9. Przeanalizuj skrawki za pomocą odwróconej mikroskopu fluorescencyjnego i/lub konfokalnego.
   ostrożność: Mikroskopia fluorescencyjna jest przydatna do ogólnego przeglądu wyników i przechwytywania obrazów w celu obliczenia wydajności przeprogramowania. W celu bardziej szczegółowej analizy tożsamości fenotypowej poprzez obserwację komórek podwójnie dodatnich należy zastosować obrazowanie konfokalne.
10. Aby określić ilościowo różne markery wyrażane w neuronach GFP⁺ w prążkowiu, policz liczbę komórek podwójnie dodatnich w stosunku do całkowitej liczby komórek GFP⁺ (tj. Przeprogramowanych neuronów), w co najmniej dwóch polach każdego odcinka prążkowia.
11. Aby określić przybliżoną ekstrapolowaną całkowitą liczbę przeprogramowanych neuronów na mózg, policz neurony GFP⁺ obecne w prążkowiu jednej z wcześniej przeciętych serii mózgowych, a następnie pomnóż przez całkowitą liczbę serii.
    nuta: Różne metody kwantyfikacji mogą być stosowane do wyrażania wydajności przeprogramowywania, liczby przeprogramowanych neuronów na zwierzę i odsetka neuronów, które wyrażają określone markery fenotypowe. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz poprzednią publikację¹¹.
12. Przeanalizuj różnice między warunkami za pomocą Graph Pad Prism lub podobnego.
    nuta: W celu obliczenia wydajności wstrzyknęliśmy myszom NG2-Cre wektory konwersji ALN zależne od CRE i reporter GFP. Aby oszacować wydajność konwersji, wstrzyknęliśmy również zwierzętom GFP zależny od Cre pod wszechobecnym promotorem CBA, uzyskując GFP⁺ dla wszystkich docelowych komórek. Korzystając z tego porównania, oszacowaliśmy, że 66,81% ± 38,38% docelowych komórek przekształca się w neurony. W celu walidacji ekspresji każdego z genów można przeprowadzić komplementarne podwójne barwienie immunofluorescencyjne dla GFP/Ascl1, GFP/Lmx1a i GFP/Nurr1. Ponadto sekwencjonowanie genomu, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, może ujawnić obecność każdego z genów w przeprogramowanych komórkach.

Wstrzyknięcie wektorów AAV służy do skutecznego przeprogramowania rezydujących komórek glejowych NG2 w neurony w prążkowiu myszy NG2-Cre (Rysunek 1A). Aby specyficznie celować w glej NG2, wektory FLEX z genami przeprogramowującym/reporterowymi są wprowadzane w kierunku antysensownym i otoczone dwiema parami antyrównoległych, heterotypowych miejsc loxP (Figura 1B). Każdy z trzech genów przeprogramowujących (Ascl1, Lmx1a i Nurr1) jest umieszczany pod kontrolą wszechobecnego promotora cba na poszczególnych wektorach. Aby upewnić się, że ekspresja GFP jest ograniczona do przeprogramowanych neuronów pochodzących z komórki wykazującej ekspresję Cre, GFP umieszcza się pod kontrolą specyficznego dla neuronu promotora synapsyny (również w wektorze FLEX).

Użycie kombinacji konstrukcji przeprogramowujących i reporterowych pozwala na generowanie neuronów GFP-dodatnich w prążkowiu myszy (Rysunek 1C,C'). Użycie konstruktu reporterowego bez obecności genów przeprogramowujących nie daje neuronów GFP-dodatnich (Rysunek 1D).

Przeprogramowane neurony, które są wypełnione biocytyną, są widoczne po pośmiertnym barwieniu immunologicznym (Rysunek 2A). Jeśli konwersja się powiedzie, powinna istnieć rozległa morfologia neuronów. Zapisy elektrofizjologiczne przeprogramowanych neuronów wykazują obecność postsynaptycznych połączeń funkcjonalnych z miarami spontanicznej aktywności (Rysunek 2B,C). Może to być zablokowane za pomocą jonotropowego blokera GABA-ergicznego lub glutaminergicznego (pikrotoksyny lub CNQX), co sugeruje zarówno pobudzające, jak i hamujące wejście synaptyczne do przeprogramowanych neuronów. Występowanie spontanicznej aktywności zwiększa się wraz z upływem czasu po wstrzyknięciu wirusa (Ryc. 2D), co wskazuje na stopniowe dojrzewanie.

Potencjały czynnościowe indukowane prądem są obecne w funkcjonalnych neuronach. Potencjał czynnościowy zwiększa się w czasie po konwersji (Rysunek 2E). To dodatkowo wskazuje na dojrzewanie funkcji neuronalnych. W niedojrzałym neuronie prąd indukuje albo żaden, albo bardzo mało potencjałów czynnościowych (Rysunek 2F).

Wzorce wypalania neuronu są specyficzne dla typu komórki, ponieważ zależą od takich czynników, jak morfologia komórek i ekspresja kanału15. Zarejestrowane wzorce w neuronach przeprogramowanych in vivo można podzielić na grupy i porównać z endogennymi podtypami neuronów, np. szybko rosnącymi interneuronami (typ komórki B, Rysunek 3B) lub inne typy komórek ( Rysunek 3A, C, D). Obserwowane różnice elektrofizjologiczne można potwierdzić obecnością specyficznych markerów podtypu i koekspresją z GFP (Figura 3E-H). Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że przeprogramowane neurony obecne w prążkowiu mają właściwości różnych typów interneuronów, takich jak interneurony wyrażające parwalbuminę, ChAt i NPY, a także tożsamość neuronu kolczastego środkowego prążkowia (DARPP32+) (Ryc. 3E-H).

Ryc. 1: Przeprogramowanie in vivo rezydującego gleju NG2 na neurony. (A) Schematyczne przedstawienie reprogramowania in vivo prążkowia NG2 za pośrednictwem wirusa AAV. (B) Schematyczne przedstawienie konstruktów AAV5 FLEX stosowanych do przeprogramowania in vivo, w którym ekspresja genów jest regulowana przez ekspresję Cre w docelowych komórkach. (C i C') Przeprogramowane neurony in vivo, powstałe w wyniku wstrzyknięcia Syn-GFP + ALN do prążkowia. (D) Brak przeprogramowanych neuronów, gdy do koktajlu wirusowego nie dodaje się żadnych czynników przeprogramowujących, a in vivo wstrzykuje się tylko konstrukt reporterowy. Podziałka = 100 μm (C), 25 μm (C'), 25 μm (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: Przeprogramowane neurony in vivo są funkcjonalne i wykazują dojrzewanie w czasie. (A) Przeprogramowany neuron wypełniony biocytyną, wykazuje dojrzałą morfologię neuronów, w tym kolce dendrytyczne. Ślady pokazują (B) hamującą (GABAergiczną) aktywność, która jest blokowana przez pikrotoksynę, antagonistę receptora GABAA i (C) aktywność pobudzającą, która jest blokowana przez CNQX, antagonistę receptora AMPA. (D) Liczba neuronów o aktywności postsynaptycznej wzrasta z czasem. (E) Połatane neurony wykazują powtarzalne odpalanie już po 5 tygodniach od wstrzyknięcia (w.p.i.) i nadal pokazują to po 8 i 12 w.p.i. (F) Potencjał czynnościowy indukowany prądem i aktywność postsynaptyczna niedojrzałego neuronu, wykazujący niewiele zdarzeń synaptycznych i niewiele potencjałów czynnościowych w porównaniu do B i D. Pasek skali = 25 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Przeprogramowane neurony in vivo wykazują właściwości immunohistochemiczne i elektrofizjologiczne interneuronów prążkowia. (A-D) Wzorce wypalania neuronów przeprogramowanych in vivo mogą być różnych typów: (A) Typ A jest podobny do endogennego średniego neuronu kolczastego (DARPP32+); (B) podobne do interneuronów szybko-impulsowych (PV+); (C) podobne do niskoprogowych neuronów kolczastych z wyraźnym zwisem (NPY+); (D) neurony wystrzeliwujące z dużą hiperpolaryzacją pourazową (Chat+). (E-H) Obrazy konfokalne pokazujące kolokalizację GFP i markerów interneuronowych PV (E), ChAT (F), NPY (G) i markera neuronu projekcyjnego DARPP32 (H). Wszystkie paski skali = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.