Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej

DOI:

10.3791/59471

⸱

9 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest prezentowany przy użyciu technik biologii syntetycznej do syntezy zestawu biosensorów bakteryjnych do analizy pozostałości po postrzałach oraz do testowania działania urządzeń pod kątem ich zamierzonego zastosowania za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicRoboCop to biosensor, który został zaprojektowany do unikalnego zastosowania w chemii sądowej. MicRoboCop to system składający się z trzech urządzeń, które używane razem mogą wskazywać na obecność pozostałości po postrzałach (GSR) poprzez wytwarzanie sygnału fluorescencyjnego w obecności trzech kluczowych analitów (antymonu, ołowiu i organicznych składników GSR). Protokół opisuje syntezę bioczujników z wykorzystaniem Escherichia coli (E. coli) oraz metody chemii analitycznej stosowane do oceny selektywności i czułości czujników. Demonstracja działania systemu polega na wykorzystaniu GSR pobranego z wnętrza zużytej łuski naboju. Po przygotowaniu biosensory mogą być przechowywane do czasu, gdy będą potrzebne i mogą być używane jako test dla tych kluczowych analitów. Pozytywna odpowiedź wszystkich trzech analitów zapewnia przypuszczalnie pozytywny wynik testu na obecność GSR, podczas gdy każde pojedyncze urządzenie ma aplikacje do wykrywania analitów w innych próbkach (np. detektor zanieczyszczenia ołowiem w wodzie pitnej). Głównym ograniczeniem systemu jest czas potrzebny na sygnał pozytywny; Przyszłe prace mogą obejmować badanie różnych organizmów w celu optymalizacji czasu reakcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biosensor to dowolne urządzenie analityczne, które wykorzystuje składniki biologiczne (takie jak białka, kwasy nukleinowe lub całe organizmy), które wywołują odpowiedź, która może być wykorzystana do wykrycia substancji chemicznej lub analitu. Na przykład przemysł wydobywczy węgla używał bioczujnika przez większą część XX wieku do wykrywania obecności toksycznych gazów kopalnianych: kanarek w kopalni węgla1. Reakcja organizmu biologicznego (kanarka) (śmierć lub niepokój) na analit chemiczny (tlenek węgla) była obserwowana przez górników w celu ochrony pracowników. W bardziej nowoczesnym i wyrafinowanym przykładzie bakterie mogą być zmieniane za pomocą technik biologii syntetycznej, aby reagować na obecność określonego analitu chemicznego poprzez wykazywanie określonej odpowiedzi, takiej jak ekspresja białka fluorescencyjnego.

Biologia syntetyczna to szeroki termin, który odnosi się do budowy urządzeń i systemów biologicznych, które nie istnieją naturalnie, lub do przeprojektowania istniejących systemów biologicznych dla określonego celu2. Biologia syntetyczna różni się od inżynierii genetycznej standardową metodologią i istnieniem znormalizowanych części (standardowych elementów genetycznych biologii syntetycznej), które można wykorzystać do syntezy urządzeń i systemów. Część jest wprowadzana do genomu urządzenia, organizmu, takiego jak bakteria, w celu wyrażenia pewnej cechy, która będzie służyć jako wskaźnik funkcji. Na przykład w wielu urządzeniach syntetycznych ekspresja białka fluorescencyjnego jest wprowadzana do organizmu jednokomórkowego jako białko reporterowe. W system można łączyć wiele urządzeń. Genomy mikroorganizmów, takich jak bakterie, są łatwe do manipulowania w ten sposób. W ciągu ostatniej dekady w literaturze opisano liczne przykłady bioczujników specyficznych dla szerokiej gamy analitów chemicznych3,4.

W tej pracy system MicRoboCop jest przedstawiony jako przykład biosensora zaprojektowanego przy użyciu technik biologii syntetycznej z nowatorskimi zastosowaniami w kryminalistyce i chemii środowiskowej. MicRoboCop to system trzech oddzielnych urządzeń, które po połączeniu pozwolą Escherichia coli na ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) w obecności pozostałości po postrzałach (GSR), które zostały pobrane z rąk lub powierzchni człowieka. Każde z trzech urządzeń reaguje na określony analit chemiczny, o którym wiadomo, że jest składnikiem GSR5. Trzy anality, na które reaguje system, to I. 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) i związki pokrewne, II. ołowiu (w postaci jonów ołowiu) oraz III. antymon (również w postaci jonów).

GSR składa się z wielu różnych substancji chemicznych, ale trzy zwykle używane do identyfikacji pozostałości jako GSR to bar, ołów i antymon5. Standardowym testem dowodowym do identyfikacji GSR jest użycie skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) z fluorescencją rentgenowską z dyspersją energii (EDX)5. SEM-EDX pozwala analitykom zidentyfikować unikalną morfologię i podstawowe składniki GSR. Obecnie dostępnych jest kilka powszechnie stosowanych binarnych testów przypuszczalnych. Jeden z niedawno opublikowanych testów wykorzystuje spektroskopię ruchliwości jonów (IMS), która jest specjalistycznym sprzętem, który może nie być dostępny w wielu laboratoriach6. Istnieje również kilka kolorowych testów "punktowych", które mogą być używane, chociaż są one zwykle używane do określania odległości lub identyfikacji GSR na po kulach i ranach5. Ponadto w literaturze poświęcono nieco mniej uwagi testom elektrochemicznym dla GSR, które wykorzystują analizę woltamperometryczną, która ma tę zaletę, że potencjalnie można ją przenosić w terenie, lub woltamperometrii anodowej strippingu, która jest niezwykle czułą metodą dla pierwiastków metalowych7. W literaturze bardzo niewiele jest wzmianek o biosensorach zaprojektowanych specjalnie do wykrywania GSR, chociaż niektóre biosensory do innych zastosowań kryminalistycznych zostały opublikowane8.

Elementy biologiczne dla każdego urządzenia w systemie MicRoboCop oraz budowa plazmidu są zilustrowane na rysunku 1. Zakrzywiona strzałka na rysunku 1b reprezentuje region promotora, który jest aktywowany w obecności analitu, owal jest rybosomalnym miejscem wiązania, które umożliwia translację białka reporterowego, szare pole oznaczone RFP to gen, który wyraża czerwone białko fluorescencyjne, a czerwony ośmiokąt to miejsce zakończenia transkrypcji. Wszystkie trzy urządzenia będą używane razem jako system do wykrywania GSR. Każde urządzenie z określonym promotorem (SbRFP, PbRFP i TNT-RFP) zostanie inkubowane z badaną próbką i zmierzona zostanie fluorescencja RFP. Zapytanie ofertowe zostanie wyrażone tylko wtedy, gdy obecny jest odpowiedni analit chemiczny, który aktywuje region promotora. Zaprojektowano trzy urządzenia, które reagują na niektóre substancje chemiczne obecne w GSR, które zostały przedstawione w niniejszej pracy.

Promotory używane w trzech urządzeniach MicRoboCop to promotor wrażliwy na arsen i antymon, SbRFP9,10, promotor wrażliwy na leady, PbRFP11,12 oraz promotor wrażliwy na TNT, TNT-RFP13. Ponieważ wyszukiwanie w literaturze nie wykazało żadnego promotora zaprojektowanego do reagowania na bar, zamiast niego wybrano promotor TNT, ponieważ promotor ten jest wrażliwy na szereg strukturalnie pokrewnych związków (w szczególności 2,4-dinitrotoluenu i dinitrobenzenu), o których wiadomo, że są częścią związków organicznych pozostawionych w GSR. Promotor ten został z powodzeniem wykorzystany do wykrywania niewielkich ilości trotylu i 2,4-dinitrotoluenu (2,4-DNT) w zakopanych minach lądowych13. Używając trzech urządzeń razem jako systemu, pozytywny wynik testu na GSR spowoduje fluorescencję we wszystkich trzech urządzeniach. Sygnał fluorescencyjny w jednym lub dwóch urządzeniach będzie wskazywał na inne środowiskowe źródło analitu (analitów) lub w przypadku promotora TNT, aktywację przez związek, który nie jest związkiem organicznym pozostawionym w GSR. Dzięki zastosowaniu wszystkich trzech urządzeń razem, możliwość uzyskania wyników fałszywie dodatnich ze względu na źródła środowiskowe jest zminimalizowana. Amunicja bezołowiowa, która zyskuje na popularności, nadal stanowi tylko około 5% sprzedaży amunicji w Stanach Zjednoczonych; W związku z tym możliwe mogą być wyniki fałszywie ujemne z powodu braku ołowiu, ale nadal istnieje użyteczność czujnika, który wykorzystuje ołów jako znacznik dla GSR14. Oprócz tego konkretnego zastosowania kryminalistycznego, każde urządzenie może być używane oddzielnie do wykrywania zanieczyszczeń środowiska.

Przedstawione protokoły obejmują techniki biologii syntetycznej użyte do stworzenia urządzeń (bakterie czujników) oraz techniki analityczne do sprawdzania funkcji urządzeń i analizy uzyskanych sygnałów fluorescencyjnych. Protokół obejmuje również zbieranie dowodów kryminalistycznych w postaci ręcznego wycierania w celu pobrania GSR z rąk podejrzanego lub wymazu w celu pobrania GSR z powierzchni. Wyniki z czujnika ołowiu przedstawiono jako przykładowe wyniki, wraz z demonstracją pozytywnego wyniku testu na obecność GSR przy użyciu zużytej łuski naboju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przedstawiono syntezę E. coli wyrażającą RFP.

1. Przygotowanie plazmidowego DNA z E. coli

  1. Rozmrozić E. coli zawierającą plazmid z genem RFP i genem oporności na ampicylinę i wyhodować E. coli na płytkach agarowych Luria Bulth (LB) zawierających 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Na przykład użyj plazmidu J10060 z rejestru standardowych części biologicznych używanych w biologii syntetycznej (patrz tabela materiałów). Plazmid J10060 zawiera gen RFP (białko czerwonej fluorescencji) pod kontrolą regionu promotora pBad i gen oporności na ampicylinę. Alternatywnie, przekształcić E. coli (patrz krok 3.2) za pomocą plazmidu przed wzrostem na płytkach agarowych LB.
  2. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem miniprep (patrz tabela materiałów), aby wyizolować DNA z 1 ml kultury E. coli, która zawiera plazmid J10060. Celem poniższego protokołu jest usunięcie promotora pBad i zastąpienie go pożądanym promotorem dla urządzenia.
  3. Po miniprzygotowaniu plazmidu przechowuj DNA w zamrażarce, aż będzie gotowe do strawienia.

2. Trawienie enzymatyczne restrykcyjne

  1. Przygotuj następującą reakcję w probówce mikrowirówkowej do mineralizacji EcoRI i NheI: 10 μl plazmidowego DNA J10060 (wyizolowanego w kroku 1), 8 μl wody i po 1 μl enzymów EcoRI i NheI wstępnie zmieszanych z 1 μl buforu (patrz tabela materiałów).
  2. W przypadku DNA promotora należy przeprowadzić następującą reakcję w probówce mikrowirówkowej do trawienia EcoRI i NheI: 10 μl wyżarzonych sekwencji DNA promotora (8 μl wody i po 1 μl enzymów EcoRI i NheI wstępnie zmieszanych z 1 μl buforu.
    1. W przypadku Sb-, Pb- lub TNT-RFP (patrz tabela materiałów) rozpuścić oligonukleotydy w buforze (30 mM HEPES, pH 7,5; 100 mM octanu potasu), inkubować w równych stężeniach molowych, ogrzewać do 94 °C przez 2 minuty i stopniowo schładzać do temperatury pokojowej).
  3. Wymieszać próbki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety ustawionej na 10 μl.
  4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Podgrzewać inaktywację enzymów w temperaturze 80 °C przez 5 minut.
  6. Przechowuj strawione DNA w zamrażarce, aż będzie gotowe do następnego kroku.

3. Podwiązanie i transformacja

  1. Ligacji
    1. Używając plazmidu i promotora DNA, które zostały podwójnie strawione za pomocą EcoRI i NheI w kroku 2, umieść mieszaninę reakcyjną pokazaną w tabeli 1 w probówce mikrowirówki na lodzie; dodaj ligazę DNA T4 na końcu.
      UWAGA: Tabela 1 przedstawia ligację przy użyciu wektora o stosunku molowym 1:3 do wstawienia dla wskazanych rozmiarów DNA.
    2. Delikatnie wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko odwirować.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    4. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 min.
  2. przekształcenie
    1. Rozmrozić probówkę z 20 μl komórek E. coli kompetentnych DH5-alfa na lodzie, aż znikną ostatnie kryształki lodu.
    2. Dodać 5 μl plazmidowego DNA do mieszaniny komórek. Ostrożnie przesuń probówkę 4-5 razy, aby wymieszać komórki i DNA.
    3. Umieść mieszaninę na lodzie na 2 minuty.
    4. Szok termiczny dokładnie o temperaturze 42 °C przez dokładnie 30 s. Nie mieszać.
    5. Ułóż na lodzie na 2 min. Nie mieszać.
    6. Odpipetować 380 μl SOC o temperaturze pokojowej do mieszaniny. Natychmiast rozprowadzić na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    7. Sprawdź płytki w ciągu 24 godzin pod kątem wzrostu.
    8. Uszczelnij płytki folią uszczelniającą i przechowuj w lodówce, aż będą gotowe do następnego kroku.

4. PCR kolonii

  1. Dodać do probówki do PCR (ustawić 4 probówki reakcyjne) mieszaniny reakcyjne pokazane w tabeli 2.
  2. Delikatnie wymieszaj reakcje, pipetując w górę i w dół.
  3. Za pomocą żółtej końcówki pipety zeskrob kolonię (lub bardzo mały obszar) przekształconej E. coli. Przenieś przeciągnięcie tej E. coli na nową płytkę LB/ampicyliny/agaru, która została odcięta, a następnie włóż końcówkę pipety do probówki do PCR. Potrząśnij końcówką pipety, aby wymieszać E. coli z mieszanką PCR. Powtórz jeszcze trzy razy, aby uzyskać dodatkowe kolonie. Przenieś probówki PCR do maszyny do PCR i rozpocznij termocykl za pomocą programu pokazanego w Tabeli 3.
  4. Przeprowadź elektroforezę żelową przy użyciu 2% żelu agarozowego w TAE, aby określić, które kolonie mają najlepszą ligację do plazmidu i wyhodować te kolonie na nowej płytce.
  5. Przechowuj płytki w lodówce, aż będą gotowe do testowania. Przygotuj płynną kulturę w bulionie Luria z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny do testów chemicznych.

5. Sekwencjonowanie DNA

  1. Do każdej próbki dodaj 5 μl plazmidu, 4 μl startera sekwencjonującego i 3 μl wody dejonizowanej.
  2. Umieść tę mieszaninę w probówce i wyślij ją do sekwencjonowania DNA (patrz Tabela materiałów).
  3. Analizuj dane sekwencji DNA, aby porównać oczekiwane i obserwowane sekwencje DNA za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji DNA, aby upewnić się, że nie ma mutacji i że geny zostały prawidłowo wstawione.
    UWAGA: Wykorzystanie E. coli jako czujnika chemicznego przedstawiono poniżej.

6. Przygotowanie kultur E. coli

  1. Przygotować LB ze 100 μg/ml ampicyliny do płynnych kultur.
  2. Przygotować płynne kultury bakterii czujnika, bakterii kontroli pozytywnej* i bakterii kontroli negatywnej**.
    UWAGA: *Bakterie kontroli pozytywnej: E. coli zawierająca plazmid z genem RFP pod kontrolą konstytutywnego promotora; W pracy wykorzystano plazmid E1010 z rejestru standardowych części biologicznych stosowanych w biologii syntetycznej (patrz tabela materiałów).
    **Bakterie kontroli ujemnej: E. coli zawierające plazmid z genem RFP pod kontrolą innego promotora, takiego jak promotor pBad (plazmid J10060 z rejestru standardowych części biologicznych stosowanych w biologii syntetycznej (patrz tabela materiałów)) lub plazmid, który nie ma genu RFP.
  3. Umieścić kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 220 obr./min przez minimum 8 godzin, a maksymalnie przez 18 godzin. Mętny bulion wskazuje na rozwój bakterii.

7. Miareczkowanie E. coli w celu sprawdzenia działania urządzenia

UWAGA: Po miareczkowaniu czujników w celu sprawdzenia ich działania, ten krok nie musi być powtarzany. Kontrola pozytywna w postaci dodania ołowiu, antymonu i 2,4-DNT lub 1,3-dinitrobenzenu (1,3-DNB) może sprawdzić działanie urządzeń dla każdego zastosowania bez konieczności pełnego miareczkowania.

  1. Przygotować roztwór podstawowy analitu (analitów) o stężeniu 10 ppm w wodzie. Jeśli problemem jest rozpuszczalność, użyj mieszaniny wody i metanolu w proporcji 50/50.
  2. Korzystając z tabeli 4 jako przewodnika, oznacz odpowiednią liczbę sterylnych probówek hodowlanych i umieść 2 ml bulionu hodowlanego (z kroku 6 protokołu) w każdej probówce.
    UWAGA: W celu określenia ogólnego zakresu analitycznego należy wykonać co najmniej trzy różne poziomy analitu z bakteriami czujnika, jeden poziom z kontrolą ujemną i jeden poziom z kontrolą dodatnią. Powinna być również jedna tubka każdej z bakterii, która nie zawiera dodatku metalu (inny rodzaj kontroli negatywnej). Aby dokładniej określić zakres analityczny i granice wykrywalności, należy użyć większego zakresu stężeń analitu.
  3. Dodać roztwór podstawowy analitu do probówek zawierających 2 ml bulionu, jak podano w Tabeli 4, umieścić zatrzaski na probówce hodowlanej tak, aby były luźne (aby umożliwić przepływ powietrza do probówki) i przekręcić rurkę hodowlaną.
  4. Pozostawiając zatrzaski luźno na probówkach hodowlanych, umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min i temperaturze 37 °C na co najmniej 24 godziny.
  5. Wyjmij probówki z inkubatora, mocno zatrzaśnij nakrętki na probówkach i przechowuj probówki w lodówce, aż będą gotowe do analizy fluorescencyjnej.

8. Używanie E. coli jako czujnika chemicznego dla GSR

  1. Za pomocą chusteczki na bazie etanolu przeznaczonej do usuwania ołowiu (patrz Tabela materiałów) wytrzyj wszystkie powierzchnie dłoni, w tym między palcami. Użyj osobnej chusteczki do każdej ręki. Chusteczki należy przechowywać w odpowiednio oznakowanej, zamykanej torebce do czasu analizy.
  2. W przypadku powierzchni, które mają być badane: użyj chusteczki na bazie alkoholu w przypadku dużych powierzchni lub wacika zwilżonego etanolem w przypadku małych powierzchni.
    UWAGA: Aby zademonstrować reakcję czujników na GSR, wnętrze zużytej łuski naboju kalibru .40 przetarto wacikiem zwilżonym etanolem.
  3. Zakładając czyste rękawice i używając nożyczek oczyszczonych alkoholem, wytnij około 1cm2 odcinek ze środka chusteczki.
  4. Umieść odcięty kawałek chusteczki do rąk lub bawełnianego wacika bezpośrednio w probówce hodowlanej, która zawiera 2 ml bakterii czujnika, upewniając się, że jest zanurzona w bulionie.
  5. Postępuj zgodnie z powyższym opisem w krokach 7.4 – 7.5.

9. Analiza fluorescencji za pomocą przenośnego spektrometru (patrz Tabela Materiałów)

  1. Użyj miksera wirowego, aby wstrząsnąć rurkami.
  2. Przygotuj spektrometr do zbierania emisji fluorescencji na odpowiedniej długości fali dla Twojego wariantu RFP o długości fali wzbudzenia 500 nm.
  3. Użyj bulionu Luria, aby nagrać puste spektrum.
  4. Ostrożnie przenieść każdy supernatant do kuwety o małej objętości i zebrać intensywność emisji.

10. Analiza fluorescencyjna przy użyciu 96-dołkowego czytnika płytek (patrz Tabela Materiałów)

  1. Użyj miksera wirowego, aby wstrząsnąć rurkami.
  2. Przenieś 200 ml bulionu do studzienki w płytce studzienki. Zapisz, które próbki trafiły do każdego dołka płytki.
  3. Skonfiguruj fluorymetr tak, aby zbierał intensywność emisji na odpowiedniej długości fali dla wariantu zapytania ofertowego.

11. Analiza danych

  1. Korzystając z sygnału uzyskanego ze wszystkich kontroli ujemnych (bakterie ujemne RFP lub bakterie czujnikowe bez dodatku analitu), oblicz średni sygnał fluorescencji dla tła.
  2. Odejmij średni sygnał tła od każdego sygnału fluorescencyjnego uzyskanego dla bakterii czujnika, aby uzyskać intensywność fluorescencji skorygowaną w tle.
  3. Oszacuj stosunek sygnału do szumu (S/N), dzieląc intensywność fluorescencji skorygowanej o tło przez średni sygnał tła. Jeśli stosunek sygnału do szumu jest większy niż 3, test jest pozytywny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Widma fluorescencji dla wariantu RFP użytego w tej pracy są pokazane na rysunku 2. Dane te pochodzą z urządzenia PbRFP, które reaguje na ołów, oraz z urządzenia TNT-RFP, które reaguje na dwa anality, 2,4-DNT i 1,3-DNB. Rysunek ten przedstawia widmo kontroli ujemnej (bez dodatku analitu) oraz widma na dwóch różnych poziomach dodanego analitu. Maksymalny sygnał fluorescencji dla zastosowanego wariantu RFP zaobserwowano przy długości fali 575 nm (długość fali wzbudzenia 500 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Doświadczenie opisane w tabeli 4 może być modyfikowane w dowolny sposób odpowiedni dla czujników, które zostały zaprojektowane. Najważniejszym aspektem czujnika chemicznego jest ocena jego czułości i swoistości. Korzystne jest zapewnienie analizy szerokiego zakresu stężeń analitu w celu określenia użytecznego zakresu analitycznego czujnika. Warto również określić maksymalny poziom analitu dla komórek. Ponieważ anality użyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować studentom z Longwood University w BIOL 324 (Genetyka) oraz studentom z CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory Problem Solving), którzy byli zaangażowani w początkowe przygotowanie i testowanie biosensorów antymonu i ołowiu. Pomysł na MicRoboCop narodził się podczas warsztatów GCAT SynBIO (lato 2014), które są finansowane przez NSF i Howard Hughes Medical Institute, a gospodarzem jest University of Maryland Baltimore County. Autorzy potwierdzają również finansowanie otrzymane z Cook-Cole College of Arts and Sciences Uniwersytetu Longwood oraz GCAT SynBio Alumni Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,3-dinitrobenzen, 97%AldrichD194255-25G
2,4-dinitrotoluen, 97%Aldrich101397-5G
AgarFisher ScientificBP1423-500
AmpicylinaFisher ScientificBP1760-5
Anmon, Referencyjny roztwór wzorcowy (1000ppm ± 1%/Certyfikowany)Fisher ScientificSA450-100Standard w rozcieńczonym HNO3
Cut Smart BufferNew England BioLabsB7204S
Duplex BufferZintegrowane technologie DNA11-01-03-00
Enzym restrykcyjny EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
Etanol, klasa HPLC, denaturowanyAcros OrganicsAC611050040Rozpuszczalniki nie muszą być klasy HPLC, ACS lub klasy odczynnikowej będą działać.
Zestawy do sekwencjonowania DNA Eurofins Genomics SimpleSeqEurofins GenomicsSimpleSeq Standardowy
starter do PCR koloniiZintegrowane technologie DNA 5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'
Podstawowy element do sekwencjonowania DNAZintegrowane technologie5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kitIBI ScientificIB47101
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426-500
Ołów, referencyjny roztwór wzorcowy (1000ppm ± 1%/Certyfikowany)Fisher ScientificSL21-100Standard w rozcieńczonym HNO3
Jednorazowe chusteczki do czyszczenia i dekonowaniaHygenall45NRCNSprzedawane w kanistrach lub pakowane pojedynczo, każda chusteczka na bazie alkoholu będzie działać.
Metanol, klasa HPLCRozpuszczalniki Fisher ScientificA452-4nie muszą być klasy HPLC, ACS lub klasy odczynnikowej będą działać.
NEB 5-alfa Kompetentne komórki E. coliNew England BioLabsC2987I
Enzym restrykcyjny NheI-HFNew England BioLabsR3131S
Woda wolna od nukleazNew England BioLabsB1500S
OneTaq 2X Master Mix ze standardowym buforemNew England BioLabsM0482S
Plazmidy z rejestru standardowych części biologicznych stosowanych w biologii syntetycznejRejestr standardowych częścihttp://parts.igem.org/Main_Page
sekwencji promotorówZintegrowane technologie DNA PromotorSb: 5'-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5'
Promotor Pb: 5'-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5'
Promotor TNT: 5' GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3'
3' CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5' (Zobacz materiał GCGTA5'
Odwrócony starter do PCR koloniiZintegrowane technologie5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'
Odwrotny starter do sekwencjonowania DNAZintegrowane technologie5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
Ligaza DNA T4Nowa Anglia BioLabsM0202S
Zestaw DNA HNO3 LeadOff biologicznych DNA DNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
  2. The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
  3. Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
  4. He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
  5. Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
  6. Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
  7. O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
  8. Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9(2016).
  9. Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
  10. Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
  11. Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
  12. Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
  13. Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
  14. Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
  15. Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
  16. Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
  17. Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie pozosta o ci wystrza uEscherichia colibiologia syntetycznaspektrometria fluorescencyjnatrawienie plazmidutransformacja koloniiinkubacja hodowlipomiar fluorescencjichemia analityczna

Powiązane artykuły