Artykuł metodologiczny

Ustalenie i charakterystyka trzech linii komórkowych PC-9 gruczolakoraka płuc opornych na afatynib opracowanych przy rosnących dawkach afatynibu

DOI:

10.3791/59473

⸱

26 czerwca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano metodę ustalania linii komórkowych oporności na afatynib z komórek PC-9 gruczolakoraka płuc i scharakteryzowano komórki oporne. Oporne komórki można wykorzystać do badania mechanizmów oporności receptora naskórkowego czynnika wzrostu na inhibitory kinazy tyrozynowej, mających zastosowanie u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabyta oporność na molekularne inhibitory docelowe jest poważnym problemem w terapii raka. Rak płuc pozostaje główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami w większości krajów. Odkrycie "onkogennych mutacji napędzających", takich jak mutacje aktywujące receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), a następnie opracowanie molekularnych leków ukierunkowanych na inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR (TKI) (gefitynib, erlotynib, afatynib, dacomitinib i ozymertynib) radykalnie zmieniło leczenie raka płuc w ostatnich dziesięcioleciach. Jednak leki te nadal nie są skuteczne u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) przenoszącym mutacje aktywujące EGFR. Po nabytej oporności ogólnoustrojowa progresja NDRP pozostaje istotną przeszkodą w leczeniu pacjentów z NDRP z mutacją EGFR. W tym miejscu przedstawiamy metodę stopniowej eskalacji dawki w celu ustalenia trzech niezależnych nabytych linii komórkowych opornych na afatynib z komórek NSCLC PC-9 zawierających mutacje aktywujące EGFR delecje par 15 zasad w eksonie 19 EGFR. Pokrótce przedstawiono metody charakterystyki trzech niezależnych linii komórkowych opornych na afatynib. Nabyte mechanizmy oporności na TKI EGFR są niejednorodne. W związku z tym należy zbadać wiele linii komórkowych z nabytą opornością na EGFR-TKI. Potrzeba od dziesięciu do dwunastu miesięcy, aby uzyskać linie komórkowe z nabytą opornością przy użyciu tego podejścia polegającego na stopniowym zwiększaniu dawki. Odkrycie nowych mechanizmów oporności nabytej przyczyni się do opracowania skuteczniejszych i bezpieczniejszych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pięć inhibitorów kinazy tyrozynowej, ukierunkowanych na receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), w tym gefitynib, erlotynib, afatynib, dacomitinib i ozymertynib jest obecnie dostępnych do leczenia pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) z mutacją EGFR. W ciągu ostatniej dekady terapie dla takich pacjentów uległy znacznemu rozwojowi wraz z odkryciem nowych potencjalnych EGFR-TKI. Wśród pacjentów z gruczolakorakiem płuc mutacje somatyczne w EGFR identyfikuje się u około 50% pacjentów z Azji i 15% pacjentów rasy kaukaskiej1. Najczęstszymi mutacjami w EGFR są mutacja punktowa L858R w delecjach EGFR egzonu 21 i 15 par zasad (bp) w eksonie EGFR 192. U pacjentów z mutacją EGFR z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, EGFR-TKI poprawiają wskaźniki odpowiedzi i wyniki kliniczne w porównaniu z poprzednim standardem chemioterapii dubletem platyny3.

Gefitynib i erlotynib były pierwszymi zatwierdzonymi inhibitorami małych cząsteczek i są ogólnie określane jako TKI EGFR pierwszej generacji. Te TKI EGFR blokują aktywność kinazy tyrozynowej, konkurując z ATP i odwracalnie wiążąc się z miejscami wiązania ATP4. Afatynib jest EGFR TKI drugiej generacji, który nieodwracalnie i kowalencyjnie wiąże się z domeną kinazy tyrozynowej EGFR i jest charakteryzowany jako pan-ludzki inhibitor rodziny EGFR 5.

Pomimo dramatycznych korzyści płynących z tych terapii u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, nabyta oporność jest nieunikniona. Najczęstszym mechanizmem oporności na TKI EGFR pierwszej i drugiej generacji jest pojawienie się mutacji T790M w eksonie EGFR 20, która jest obecna w 50-70% próbek guza6,7,8. Inne mechanizmy oporności obejmują sygnały obejściowe (do MET, IGF1R i HER2), transformację w drobnokomórkowego raka płuca oraz indukcję przejścia z nabłonka do mezenchymów, które zachodzą przedklinicznie i klinicznie9. Mechanizmy oporności na TKI EGFR są niejednorodne. Identyfikując nowe mechanizmy oporności w badaniach przedklinicznych, możliwe będzie opracowanie nowych środków terapeutycznych w celu przezwyciężenia oporności. Terapie o optymalnej sekwencji, które maksymalizują korzyści kliniczne dla pacjentów, muszą uwzględniać mechanizmy oporności i cel terapeutyczny.

Konieczne jest wybranie właściwej rodzicielskiej linii komórkowej, ponieważ jest ona podstawą wszystkich późniejszych eksperymentów. Strategie selekcji rozpoczynają się od znaczenia klinicznego; Konieczne jest, aby wybrać chemioterapię i radioterapię naiwną linię komórkową. Wcześniejsza chemioterapia i (lub) radioterapia mogą powodować zmianę szlaków oporności i zmiany ekspresji markerów oporności na leki. W tym badaniu komórki PC-9, niosące 15 delecji bp w eksonie 19 EGFR, są wykorzystywane do ustalenia nabytej oporności na afatynib. Ta linia komórkowa pochodzi od japońskiego pacjenta z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, który nie otrzymywał wcześniejszej chemioterapii i radioterapii.

Ponieważ afatynib jest podawany doustnie codziennie, ciągłe leczenie in vitro, w którym komórki są stale hodowane w obecności afatynibu, byłoby klinicznie istotne. Dawka leków stosowana w różnych etapach eksperymentu musi być zoptymalizowana dla wybranej rodzicielskiej linii komórkowej. Test cytotoksyczności może być wykorzystany do określenia odpowiedniego zakresu leków, który powinien być porównywalny z informacjami farmakokinetycznym leku.

Podczas procesu selekcji, cała populacja komórek jest utrzymywana jako pojedyncza grupa; klonowanie lub inne metody separacji nie są używane. Komórki są najpierw w sposób ciągły wystawione na działanie niskiego poziomu leku. Następnie, po tym, jak komórki przystosują się do wzrostu w obecności leku, dawka leku jest powoli zwiększana do końcowej optymalnej dawki leku10,11. Alternatywnie, impulsowe podawanie leków lub mutageneza mogą być użyte do selekcji komórek oporności, które są również wykonywane przed leczeniem farmakologicznym 12,13. Niestety, przypadki, w których oporność na leki nie rozwija się, na ogół nie są zgłaszane. Strategie selekcyjne zostały opracowane w celu naśladowania stanu pacjentów z rakiem w celu odbudowania klinicznie istotnej odporności. Czasami, aby zidentyfikować zmiany molekularne związane z mechanizmami oporności na leki, stosuje się wysokie stężenie leku. Ten model staje się mniej istotny klinicznie.

Tutaj opisujemy metodę tworzenia trzech niezależnych linii komórkowych opornych na afatynib z komórek PC-9 zawierających delecje 15 pz w eksonie 19 EGFR, a także wstępną charakterystykę linii komórkowych opornych na afatynib

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ustanowienie trzech niezależnych linii komórkowych PC-9 odpornych na afatynib

  1. Oznaczanie początkowego stężenia ekspozycji na afatynib dla komórek PC-9 przy użyciu testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT)
    1. Hodowla komórek PC-9 w pożywce wzrostowej zawierającej płodową surowicę bydlęcą (10%), penicylinę (100 U/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) w 10-centymetrowym naczyniu poddanym działaniu hodowli komórkowej w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    2. Ponownie zawiesić komórki PC-9 przy 4 x 104 komórkach / ml w pożywce wzrostowej, a następnie wysiewać w 50 μl / dołku na 96-dołkowej mikropłytce. Końcowe stężenie komórek wynosi 2,0 x 103 komórki/50 μL/studzienkę. Inkubować przez noc w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37°C.
    3. Dodać 50 μl roztworu afatynibu o różnych stężeniach: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 i 20 μM do studzienek zawierających pożywkę wzrostową (50 μL). Końcowa objętość i stężenia afatynibu wynoszą odpowiednio 100 μl i 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 i 10 μM.
    4. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 96 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    5. Dodać 15 μl roztworu barwnika (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 100 μl roztworu solubilizacyjnego/zatrzymującego (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki i inkubować przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    6. Zmierzyć gęstość optyczną przy 570 nm (OD570) za pomocą czytnika mikropłytek (patrz Tabela materiałów). Przygotować 6-12 powtórzeń i powtórzyć eksperymenty co najmniej trzy razy.
    7. Użyj oprogramowania statystycznego (patrz Spis materiałów), aby graficznie wykreślić te dane jako wykres półlogarytmiczny i obliczyć wartość IC50, czyli stężenie leku, które zmniejsza odpowiedź do 50% jej maksimum (patrz Tabela materiałów).
  2. Ciągła ekspozycja komórek PC-9 na nieodwracalny EGFR-TKI, afatynib, poprzez stopniowe zwiększanie dawki w trzech niezależnych 10-centymetrowych szalkach
    1. Hodowla komórek PC-9 na szalkach p100 zawierających 10 ml pożywki wzrostowej. Gdy komórki PC-9 osiągną etap sub-konfluencji, przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do trzech nowych szalek p100 z 9 ml pożywki wzrostowej. Rozcieńczone w stosunku 1:10 komórki PC-9 stają się subkonfluentne w ciągu 3-4 dni, z liczbą komórek około 4-5 x 105 komórek / ml.
    2. Następnego dnia dodaj 1/10 wartości IC50 afatynibu do każdej z trzech szalek p100.
      nuta: Afatynib rozpuszcza się w DMSO w stężeniach podstawowych 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM i 5 mM. 1 do 10 μl roztworu afatynibu dodaje się do 10 ml pożywki wzrostowej w hodowli, zgodnie z wymaganymi stężeniami końcowymi.
    3. Gdy komórki w szalkach p100 zawierających afatynib ulegną subkonfluencji, dobrze wymieszaj przez aspirację pipetą o pojemności 1 ml i dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do 9 ml świeżej pożywki wzrostowej w nowym naczyniu p100. Następnie dodaj o 10-20% wyższe stężenie afatynibu do nowej hodowli.
    4. Zwiększyć stężenie afatynibu z 0,1 nM do 1 μM w pożywce poprzez stopniowe zwiększanie dawki przy jednoczesnym zwiększaniu stężenia afatynibu o 10-20% na każdym etapie przez okres 10-12 miesięcy.
      nuta: Gdy stężenie afatynibu zbliża się do wartości IC50, wzrost komórek staje się dość powolny. Jeśli komórki zostaną podzielone w stosunku 1:9, mogą nie rosnąć, ponieważ komórki te są zabijane przez wyższe stężenia afatynibu. Dlatego przy wyższych stężeniach afanitybu komórki można podzielić w stosunku 1:2. Najbardziej oporne komórki hodowano w pożywce zawierającej afatynib przez 3-14 dni, a pożywka nie była zmieniana, dopóki oporne komórki nie musiały zostać przeniesione.
    5. Hodować komórki oporne na afatynib przez 2-3 miesiące w pożywce wzrostowej zawierającej 1 μM afatynib. Przy stężeniu afatynibu wynoszącym 1 μM do rozwinięcia oporności na afatynib w tym modelu potrzeba 10-12 miesięcy. Wykonaj test MTT, aby potwierdzić, że komórki są oporne na afatynib. Trzy niezależnie ustalone linie komórkowe oporności na afatynib zostały nazwane AFR1, AFR2 i AFR3.

2. Charakterystyka trzech niezależnych komórek opornych na afatynib

  1. Wyznaczanie krzywej wzrostu rodzicielskich komórek PC-9 i tworzenie komórek opornych na afatynib
    1. Hodować komórki PC-9, AFR1, AFR2 i AFR3 w pożywce wzrostowej w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    2. Ponownie zawiesić komórki w temperaturze 5 x 103 komórek/ml z pożywką wzrostową i wysiać 100 μl / studzienkę na 96-dołkowej mikropłytce, tak aby końcowe stężenie komórek wynosiło 500 komórek/100 μl/basenik.
      nuta: Test MTT przeprowadza się w celu zmierzenia wartości OD570 po 0, 1, 2, 3, 5 i 7 dniach. Na każdy dzień potrzebnych jest sześć 96-dołkowych mikropłytek.
    3. Test MTT należy wykonywać co 24 godziny, a następnie w dniach 0, 1, 2, 3, 5 i 7. Zmierzyć wartości OD570 i przygotować 6-12 powtórzeń; Powtórz eksperymenty co najmniej trzy razy i graficznie wykreśl wyniki za pomocą oprogramowania statystycznego (patrz Spis materiałów).
  2. Identyfikacja zmian genomowego DNA w EGFR metodą PCR
    w czasie rzeczywistym nuta: Afatynib jest małocząsteczkowym inhibitorem, który jest ukierunkowany na kinazę tyrozynową EGFR. Status ekspresji EGFR określa się na poziomie DNA i białka.
    1. Genomowe DNA izoluje się przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierzyć stężenie wyizolowanego genomowego DNA za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów) i dostosować wszystkie próbki genomowego DNA do 25 ng / μl.
    2. Amplifikować 50 ng genomowego DNA, co odpowiada 2 μl z 25 ng/μl zapasów, używając mieszanki wzorcowej SYBR Green (patrz Tabela materiałów) i przeanalizować wyniki za pomocą systemu detekcji RT-PCR opartego na fluorescencji (patrz Tabela materiałów).
      nuta: Warunki cykliczne PCR rozpoczęły się od początkowego etapu denaturacji w temperaturze 95 °C przez 20 s, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 3 s, wyżarzania w 60 °C przez 30 s. Konkretne zestawy starterów są następujące: EGFR F: 5′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3′, R: 5′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3′. Gen normalizacyjny LINE-1 F: 5′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3′, R: 5′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′.
  3. Ocena wpływu zmian białka na poziom EGFR za pomocą analizy western blot
    1. Leczyć komórki afatynibem w sposób ciągły przed eksperymentami przez 24 godziny. Przemyć komórki PC-9, AFR1, AFR2 i AFR3 dwukrotnie PBS, a następnie zasiać je w pożywce wzrostowej bez afatynibu. Umyj komórki PC-9, AFR1, AFR2 i AFR3 dwukrotnie 5 ml lodowatego PBS.
    2. Poddać lizie komórki w buforze RIPA zawierającym 1 % koktajl inhibitorów proteazy (patrz tabela materiałów) oraz koktajl inhibitorów fosfatazy II i III (patrz tabela materiałów) i inkubować ten roztwór w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Odwirować lizaty przez 10 minut w temperaturze 100 x g i w temperaturze 4 °C i zebrać oczyszczone lizaty.
    3. Oznaczyć stężenia białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (patrz tabela materiałów), dostosować wszystkie próbki białek do 0,5 lub 1 μg/μl przy użyciu 4x buforu próbki (500 mM Tris (pH 6,8), 40% glicerolu, 8% SDS, 20%H2O, 0,02% błękitu bromofenolowego) i gotować w temperaturze 96 °C przez 5 minut. Przechowywać te próbki białka w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy western blot.
    4. Oddzielić równe ilości próbek białka, najlepiej 20-30 μl, przez 8% stronę SDS i przenieść białka na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF).
      nuta: Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) jest powszechnie stosowana w laboratorium do rozdzielania białek na podstawie ich masy cząsteczkowej.
      1. Oczyść szklane płytki etanolem i zmontuj szklaną płytkę i przekładki. Przygotuj 8% żeli poliakrylamidowych zawierających 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% bis-akrylamidu, 10% SDS, 10% APS i TEMED. Polimeryzować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
      2. Następnie przygotuj żel do układania w stos zawierający 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-akrylamidu, 10% SDS, 10% APS i TEMED. Dodaj roztwór żelu do układania w stosy, włóż grzebień i polimeryzuj żel przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Umieść żele w aparacie do elektroforezy i napełnij zbiornik buforem do pracy (0,25 M Tris, 1,92 M glicyny i 1% SDS). Załadować równą ilość próbek białka (20-30 μL) i uruchomić żel pod napięciem 180 V. Elektroforezę należy przerwać po wypłynięciu czoła barwnika z żelu, po około 60 minutach.
      4. Płukać żel przez 1-2 minuty TBST, a następnie przenieść białka na membranę PVDF za pomocą półsuchego blota (patrz tabela materiałów) przez 1,5 godziny przy stałym prądzie 300 mA.
    5. Zatkać błony 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku (patrz tabela materiałów) rozcieńczonym roztworem TBST (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie zbadać membrany przeciwciałami anty-EGFR, anty-fosfo-EGFR (Y1068), anty-HER2, anty-HER3, anty-MET i antyaktyną (rozcieńczonymi w TBST w stosunku 1:3 000) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Umyj membrany TBST trzykrotnie przez 10 minut, a następnie wystawij membrany na działanie przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego 1:200 w TBST) przez 1-1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Umyć membrany pięciokrotnie TBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wystawić je na działanie roztworu ECL (patrz Tabela Materiałów) i zwizualizować sygnały za pomocą folii.
  4. Analiza mutacji EGFR metodą sekwencjonowania
    1. Amplifikacja genomowego DNA przy użyciu specyficznych starterów dla eksonów EGFR 19-21. Warunki cyklu PCR rozpoczynają się od początkowego etapu denaturacji w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, po którym następuje 30 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 10 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę
      nuta: Specyficzne startery dla EGFR ekson 19: F: 5′-GCAATATCGGTTAGGTGCGGCTC-3′ R: 5′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3′, ekson 20: F: 5′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3′, R: 5′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3′ i ekson 21: F: 5′-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3′, R: 5′-GCTCACCCAATGTCTGGAGA-3′.
    2. Oczyścić amplifikowane produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (patrz tabela materiałów) i uporządkować amplikony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat tworzenia trzech linii komórkowych oporności na afatynib z komórek PC-9 przy użyciu procedury stopniowego zwiększania dawki jest pokazany w Rysunek 1. Rysunek 2 pokazuje spadek proliferacji komórek macierzystych PC-9 wraz ze wzrostem stężenia afatynibu, co wskazuje, że komórki PC-9 są wrażliwe na ekspozycję na afatynib. Rysunek 3 pokazuje oporność trzech linii komórkowych na afatynib. Żadna z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisaliśmy metodę tworzenia trzech niezależnych linii komórkowych opornych na afatynib i scharakteryzowaliśmy te komórki przez porównanie z rodzicielskimi komórkami PC-9. Poprzez stopniowe zwiększanie dawki, rodzicielskie komórki PC-9 nabywały oporność na afatynib przez okres 10-12 miesięcy. Klinicznie mechanizmy oporności na TKI EGFR są niejednorodne, dlatego po początkowym leczeniu afatynibem komórki PC-9 podzielono na trzy niezależne szalki p100 i poddano dalszej ekspozycji na afatynib. Początkowo wzrost komórek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkowi Advanced Cancer Translational Research Institute za przemyślane komentarze, a Editage za pomoc w edycji w języku angielskim. Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI (numer grantu: 16K09590 dla T.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
afatynibSelleckS1011
monoklonalne anty-EGFRtechnologia sygnalizacji komórkowej4267S
test kwasu bicinchonincsigmaB9643
hodowla komórkowa 10 cm naczynieViolamo2-8590-03
BANKER1 Pożywka do kriokonserwacjiTakaRaCB011
CellTiter 96Promega  G4100  Test proliferacji komórek niepromieniotwórczych; Roztwór barwnika i roztwór solubilizacyjny/zatrzymujący
DMSOWako043-07216
Roztwór ECLPerkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700Applied Biosystemsna fluorescencji system detekcji RT-PCR 
Oprogramowanie GraphPad Prism v.7 GraphPad, Inc.oprogramowanie statystyczne
Spektrofotometr NanoDrop Lite Spektrofotometrtermiczny
Beztłuszczowe mleko w proszkutechnologia sygnalizacji komórek9999S
Pen Strepgibco15140-163
inhibitorów fosfatazy 2sigmaP5726
koktajl inhibitorów fosfatazy 3sigmaP0044
Czytnik mikropłytek Powerscan HTBioTek
  Power SYBR Green master mix Applied BiosystemsSYBR Green master mix
inhibitor proteazy koktajlsigmaP8340
QIAamp DNA Mini kitQiagen51306Zestaw do oczyszczania DNA
QIAquick PCR Zestawdo oczyszczania QIAGEN
RPMI-1640 Wako189-02025z L-glutaminą i fenolem Czerwony
TBST w proszkusigmaT9039
Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowaBio-Radpółsuchy aparat t4ransfer
96-dołkowa mikropłytkaThermo130188
przeciwciało oparty koktajl PCR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
  2. Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
  3. Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
  4. Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
  5. Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
  6. Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
  7. Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26(2011).
  8. Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
  9. Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
  10. Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
  11. Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
  12. Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
  13. Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
  14. Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
  15. Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
  16. Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
  17. Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
  18. Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
  19. Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
  20. Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Afatinib ResistancePC 9 CellsEGFR MutationsStepwise Dose EscalationMTT AssayWestern Blot AnalysisEGFR SequencingGenomic DNA IsolationProtein Concentration AssayCell Growth Curve

Powiązane artykuły