Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Podsumowanie

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Streszczenie

Zewnętrzne obciążenie mechaniczne jest znane z wywoływania fenotypowych reakcji komórek i ma fizjologiczne znaczenie w kilku układach tkankowych. Aby uchwycić wpływ zastosowanego zewnątrzkomórkowego naprężenia rozciągającego na populacje komórek in vitro za pomocą testów biochemicznych, wcześniej zaprojektowano urządzenie, które można łatwo wyprodukować i jest wystarczająco małe, aby zmieścić się w inkubatorach do hodowli tkankowych, a także na stolikach mikroskopowych. Jednak poprzedni projekt podłoża z polidimetylosiloksanu nie pozwalał na obrazowanie subkomórkowe w wysokiej rozdzielczości za pomocą obiektywów zanurzeniowych w oleju. W pracy tej opisano przeprojektowaną geometrię podłoża polidimetylosiloksanowego oraz dostosowaną konfigurację obrazowania, które razem mogą ułatwić obrazowanie subkomórkowe w wysokiej rozdzielczości żywych komórek pod obciążeniem. Podłoże to może być używane z tym samym, wcześniej zaprojektowanym urządzeniem, a zatem ma te same zalety, które wymieniono powyżej, oprócz umożliwienia obrazowania optycznego w wysokiej rozdzielczości. Konstrukcję podłoża z polidimetylosiloksanu można ulepszyć poprzez włączenie siatki, która ułatwi śledzenie tej samej komórki przed i po zastosowaniu szczepu. Reprezentatywne wyniki pokazują obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości znakowanych fluorescencyjnie jąder w napiętych komórkach uchwyconych przy użyciu opisanej tutaj metody. Te dane dotyczące dynamiki jądrowej dają wgląd w mechanizm, za pomocą którego zastosowane naprężenie rozciągające sprzyja różnicowaniu komórek progenitorowych oligodendrocytów.

Wprowadzenie

Komórki i tkanki w ciele są poddawane różnym mechanicznym sygnałom, w tym naprężeniom rozciągającym. Jednak wpływ tych wskazówek na biologię komórek nerwowych nie został jeszcze dokładnie zbadany i w pełni zrozumiany. W ośrodkowym układzie nerwowym źródłem obciążenia mechanicznego są wzrosty rozwojowe^1,2,3,4, procesy fizjologiczne, takie jak zginanie rdzenia kręgowego, pulsacja krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego oraz stany patologiczne, takie jak uraz, obrzęk aksonów, blizny glejowe lub wzrost guza5^,6,7,8. Warto zbadać, jak naprężenie rozciągające wpływa na różnicowanie oligodendrocytów i późniejszą mielinizację aksonów, co jest krytycznym procesem w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców. Korzystając z specjalnie zaprojektowanego urządzenia szczepowego i elastomerowych płytek wielodołkowych, poprzednie prace^{9,10 wykazały,} że statyczny jednoosiowy szczep może zwiększać różnicowanie oligodendrocytów poprzez globalne zmiany w ekspresji genów¹⁰. Aby uzyskać dalsze zrozumienie mechanizmów mechanotransdukcji odkształceń w tych komórkach, poprzednia aparatura doświadczalna musi zostać przeprojektowana zgodnie z opisem tutaj, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne w wysokiej rozdzielczości dynamiki jądrowej w żywych komórkach pod obciążeniem. W szczególności opracowano jednodołkową płytkę polidimetylosiloksanową, a konfiguracja obrazowania została przeprojektowana, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe żywych komórek pod obciążeniem przy użyciu 100-krotnej soczewki zanurzeniowej w oleju. Aby wyeliminować negatywne skutki optyczne polidimetylosiloksanu na szlaku świetlnym, komórki są obrazowane nie przez płytkę polidimetylosiloksanu, ale w pozycji odwróconej, przez szkło osłonowe pokrywające komorę komórki. Korzystając z tego nowego projektu obrazowania, nagrywane są setki filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, przedstawiających pojedyncze jądra komórkowe w nienaruszonych komórkach przylegających, w których chromatyna jest znakowana przez znakowanie histonu H2B do białka zielonej fluorescencji. Filmy te pokazują, że odkształcenie rozciągające indukuje zmiany w strukturze i dynamice chromatyny, które są zgodne z postępem różnicowania oligodendrocytów.

Obrazowanie żywych komórek pod wpływem zastosowanego obciążenia jest technicznie trudne i wymaga konstrukcji urządzenia, która jest kompatybilna z systemem mikroskopowym. Opisany tutaj projekt na zamówienie stanowi niedrogą alternatywę dla rozwiązań komercyjnych. Jego wymiary umożliwiają jego instalację na stolikach mikroskopowych i obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości przestrzennej podczas stosowanego szczepu. Konfiguracja obrazowania została zaprojektowana tak, aby ułatwić obrazowanie żywych komórek przy użyciu 100-krotnej soczewki olejowej o najwyższej przejrzystości, przez szkło nakrywkowe, a nie przez warstwę płytki polidimetylosiloksanowej, co w przeciwnym razie obniża jakość obrazu i jest powszechne w większości konfiguracji obrazowania pod obciążeniem. Urządzenie, z zamontowaną płytką zawierającą komórki, można również łatwo przechowywać w inkubatorze. To urządzenie jest przeznaczone do stosowania jednoosiowego szczepu do podłoża, które ułatwia przylegającą hodowlę komórek i utrzymuje stabilny i jednolity szczep przez wiele dni. Opisana tutaj konfiguracja może być wykorzystana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości różnych przylegających typów komórek pod obciążeniem, dzięki czemu ma zastosowanie do badań mechanotransdukcji w wielu dziedzinach mechanobiologii komórki.

Protokół

1. Projekt formy z polidimetylosiloksanu do obrazowania w wysokiej rozdzielczości

UWAGA: Forma do produkcji płytek z polidimetylosiloksanu została zaprojektowana z następującymi cechami, aby umożliwić obrazowanie za pomocą soczewki zanurzeniowej ze 100x olejkiem i prawidłowe dopasowanie do specjalnie zbudowanego urządzenia szczepowego (Rysunek 1A,B).

1. Utrzymuj całkowite wymiary płyty tak, aby pasowała do zacisków urządzenia napinającego.
   UWAGA: Tutaj mają wymiary 60 mm x 73 mm.
2. Wykonaj komorę lub studzienkę komórki, która jest znacznie mniejsza niż wymiary boczne całej płytki, aby uniknąć efektów łukowych (zginania poza płaszczyzną), które występują na niezaciśniętych krawędziach płytki polidimetylosiloksanu podczas przykładania naprężenia.
   UWAGA: W tym przypadku komora została zaprojektowana jako kwadrat o wymiarach 23 mm x 23 mm.
3. Głębokość komory na ogniwa powinna być jak najmniejsza (nie większa niż 80 μm), aby umożliwić ustawianie ostrości za pomocą soczewki zanurzonej w oleju 100x przez szkło nakrywkowe umieszczone na górze komory, ale powinna być wystarczająca, aby pomieścić media i uniknąć kontaktu lub ściskania komórek.
4. Podnieś komorę na komórkę na kwadracie o wysokości 3 mm, aby zbliżyć komórki do obiektywu w konfiguracji mikroskopu odwróconego, aby umożliwić łatwe ustawianie ostrości.
   UWAGA: Formy o powyższych cechach mogą być wytwarzane wieloma technikami, w tym np. frezowanym aluminium. Alternatywnie, formy wzorcowe można również montować za pomocą arkuszy akrylowych wyciętych za pomocą wycinarki laserowej, szkła osłonowego #0 do komory ogniwa i super kleju. Ta forma wzorcowa służy do wykonania odcisku z polidimetylosiloksanu, który jest następnie używany do wykonywania form roboczych przy użyciu żywicy odlewniczej.

2. Produkcja jednodołkowych płytek polidimetylosiloksanowych i kwadratowych komór

1. Wymieszaj bazę polidimetylosiloksanu i utwardzacz w stosunku 20:1 (wagowo) w jednorazowym kubku. Zważyć łącznie 20 g polidimetylosiloksanu na formę (w celu wykonania jednej płytki z polidimetylosiloksanu) i 150 g polidimetylosiloksanu w plastikowym naczyniu o średnicy 150 mm (w celu wykonania jednej partii kwadratowych przegródek).
2. Pozostawić mieszaninę polidimetylosiloksanu w odgazowywaczu próżniowym pod ciśnieniem -0,8 bara na 30 minut (lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte).
3. Wlej mieszankę polidimetylosiloksanu do foremek (na talerze) lub do plastikowych naczyń o średnicy 150 mm (do kwadratowych przegródek).
4. Na tym etapie usunąć wszelkie dodatkowe pęcherzyki, powietrzem (doustnie) lub ponownie odgazowując formy/naczynia wypełnione polidimetylosiloksanem w próżni -0,8 bara przez 30 minut.
5. Foremki/naczynia pozostawić w piekarniku o temperaturze 80 °C na stole poziomującym na 2 godziny.
6. Ostrożnie wyjmij foremki/naczynia z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Delikatnie obierz utwardzony polidimetylosiloksan po dokładnym przycięciu krawędzi ostrzem (Rysunek 1C).
7. Na polidimetylosiloksanie o średnicy 150 mm narysuj markerem siatkę o wymiarach 2 cm x 2 cm. W każdym kwadracie narysuj kwadrat o wymiarach 1 cm x 1 cm, pozostawiając margines 0,5 cm ze wszystkich stron. Za pomocą ostrza ostrożnie przetnij wzdłuż linii, aby uzyskać kwadratowe przegródki (Rysunek 2A).
8. Oczyścić płytki/kwadratowe komory z polidimetylosiloksanu, inkubując je w 100% acetonie przez 4 godziny, następnie w 100% etanolu przez 4 godziny, a następnie w autoklawie wodnym przez 4 godziny.
9. Umieść talerze/kwadratowe przegródki na papierze podkładowym z folii parafinowej (nie folii parafinowej, ale papieru) w plastikowym naczyniu o średnicy 150 mm (Rysunek 2C).
10. Pozostawić płytkę z polidimetylosiloksanem w piekarniku o temperaturze 80 °C do wyschnięcia na 4 godziny.
11. Uszczelnić naczynia o średnicy 150 mm zawierające płytki i kwadraty pojemników z polidimetylosiloksanu folią parafinową i przechowywać je w chłodni do czasu dalszego użycia.

3. Funkcjonalizacja płytek polidimetylosiloksanowych

1. Usuń folię parafinową, zdejmij pokrywę plastikowego naczynia i umieść płytki z polidimetylosiloksanu i kwadratowe przegródki w świetle ultrafioletowym na 30 minut.
2. Poddać działaniu plazmy (przy 150 W przez 5 minut) płytki z polidimetylosiloksanu (z komorą komórkową skierowaną do góry) bez kwadratowych przegródek, aby powierzchnia hodowli stała się hydrofilowa.
3. Natychmiast umieść kwadratowe przegródki na powierzchni poddanej obróbce plazmowej (Rysunek 2B) i naciśnij ręcznie, aby tymczasowo skleić je ze sobą.
   UWAGA: Nie należy poddawać plazmie kwadratowych przegródek, w przeciwnym razie będą one mocno przylegać do płytki polidimetylosiloksanu i nie odpadną łatwo, gdy będą musiały zostać odklejone podczas obrazowania.
4. Dodać 200 μl 100 mM (3-aminopropylo)trietoksysilanu do studzienki na 2 godziny, aby wprowadzić grupy –NH₂ na powierzchnię polidimetylosiloksanu. Aby przygotować 100 mM roztwór, rozpuść 234 μl czystego (3-aminopropylo)trietoksysilanu w 10 ml wody. Po 2 godzinnej inkubacji umyj studzienki 3x wodą dejonizowaną.
5. Odważyć 2 mg suberatu bisulfosuccinimidylu molekularnego środka sieciującego i rozpuścić go w 700 μl 1 M (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego buforu (pH 8,0) i 2,8 ml wody.
   UWAGA: Spowoduje to otrzymanie 1 mM roztworu subergenianu bissulfosuccinimidylu w 200 mM buforze kwasu sulfonowego (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego. Należy pamiętać, że dobrze sprawdza się również bufor o stężeniu 50 mM.
   1. Dodać 135 μl tego roztworu i 15 μl 1 mg/ml fibronektyny do studzienki w każdej płytce polidimetylosiloksanu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Przemyć 3x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Dodać 500 μl buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej do studzienki. Przykryj naczynie o średnicy 150 mm zawierające polidimetylosiloksan folią parafinową i przechowuj je w chłodnym pomieszczeniu do czasu dalszego użycia.

4. Funkcjonalizacja plastikowych naczyń i kolb

1. Inkubować plastikowe naczynia i kolby z roztworem poli-D-lizyny (PDL, w sterylnej wodzie) o stężeniu 5 μg/ml przez 1 godzinę. Dodać 1,5 ml tego roztworu (liganda) na szalkę o średnicy 35 mm, 3 ml na naczynie o średnicy 60 mm i 10 ml na kolbę hodowlaną^o średnicy 75 cm2.
2. Umyj naczynia i kolby 2x sterylną wodą.
3. Pozostawić je do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 1 godzinę (lub do wyschnięcia) i przechowywać w chłodni w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

5. Pożywka proliferacji i różnicowania dla mysich komórek progenitorowych oligodendrocytów

1. Przygotować 50 ml 100-krotnych roztworów pożywki do proliferacji i różnicowania, zrobić porcje po 2,5 ml i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Skład pożywki proliferacyjnej to 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 62 ng/ml progesteronu, 16 μg/ml putrescyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μg/ml holotransferyny, 5 ng/ml seleninu sodu, 1x penicylina-streptomycyna, 10 ng/ml płytkowy czynnik wzrostu i 10 ng/ml czynnik wzrostu fibroblastów w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z wysoką glukozą i pirogronianem. Podczas gdy albumina surowicy bydlęcej, progesteron, putrescyna i selenin sodu mogą być tworzone i przechowywane w 100x, insulina, holotransferyna i penicylina-streptomycyna muszą być dodawane świeże podczas przygotowywania roztworu 1x. Czynniki wzrostu muszą być utworzone w stężeniu 10 μg/ml i muszą być dodawane świeże do komórek każdego dnia (1 μl/ml pożywki). Skład pożywki różnicującej to 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 62 ng/ml progesteronu, 16 μg/ml putrescyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μg/ml holotransferyny, 5 ng/ml seleninu sodu, 1x penicylina-streptomycyna, 400 ng/ml trijodotyroniny, 400 ng/ml L-tyroksyny i 0,5% płodowej surowicy bydlęcej w DMEM z wysoką glukozą i pirogronianem. Trójjodotyronina i L-tyroksyna mogą być tworzone z innymi odczynnikami i przechowywane w temperaturze 100x. Insulina, holotransferyna i penicylina-streptomycyna muszą być dodawane świeże podczas przygotowywania 1x roztworu.
2. W celu przygotowania 50 ml 100-krotnej pożywki proliferacyjnej, rozpuścić 510 mg albuminy surowicy bydlęcej w 17 ml pożywki Dulbecco, 310 μg progesteronu w 31 μl etanolu, 80 mg putrescyny w 500 μl pożywki Dulbecco, 25 μg seleninu sodu w 10 μl pożywki Dulbecco, i pełne DMEM do 50 ml
3. W celu przygotowania 50 ml 100x roztworu pożywki różnicującej należy dodatkowo rozpuścić 2 mg trójjodotyroniny w 40 μl wodorotlenku sodu i 2 mg L-tyroksyny w 40 μl wodorotlenku sodu, a następnie uzupełnić roztwór do 50 ml pożywką Dulbecco. Przefiltrować roztwór przez sterylną jednostkę filtrującą jednorazowego użytku, podwielokrotność, i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
4. Aby przygotować 250 ml 1x pożywki proliferacyjnej/różnicującej, zmieszaj 2,5 ml 100x roztworu pożywki proliferacyjnej/różnicującej z 12,5 mg holotransferyny, 125 μl 10 mg / ml insuliny i 2,5 ml 100x penicyliny-streptomycyny. Napełnij roztwór do 250 ml pożywką Dulbecco i przefiltruj go przez sterylną jednorazową jednostkę filtrującą.
   UWAGA: Czynniki wzrostu muszą być dodawane świeże i bezpośrednio do hodowli komórkowej, a nie do całej partii odtworzonej pożywki.

6. Hodowla komórkowa

1. Zacznij od komórek progenitorowych oligodendrocytów zawieszonych w pożywce proliferacyjnej. Umieść te komórki w gęstości 35 000 komórek/^cm2 na powierzchniach z tworzywa sztucznego pokrytych PDL (szalki lub kolby, patrz sekcja 4). Dostosować objętość pożywki proliferacyjnej do 3 ml na 10^cm2 powierzchni podłoża z tworzywa sztucznego; Mniejsza objętość pożywki może prowadzić do zlepiania się komórek wynikającego z sił napięcia powierzchniowego, podczas gdy większa objętość pożywki w naczyniach może powodować rozlanie.
2. Czynniki wzrostu (płytkowy czynnik wzrostu i czynnik wzrostu fibronektyny) należy dodawać codziennie, utrzymując ich stężenie na poziomie 10 ng/ml i co drugi dzień wymieniać połowę pożywki proliferacyjnej.
3. Trzeciego dnia oderwać komórki od powierzchni tworzywa sztucznego za pomocą delikatnego roztworu do oddzielania komórek (np. akutazy): usunąć pożywkę, przemyć 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, dodać 1 ml roztworu oddzielającego na powierzchnię 20^cm2, pozostawić naczynie/kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut i delikatnie stukać, aż wszystkie komórki się oderwą (patrz pod mikroskopem).
4. Pipetować za pomocą końcówki o pojemności 200 μl, aby rozbić grudki na pojedyncze komórki, przenieść je do probówki o pojemności 50 ml, rozcieńczyć w pożywce proliferacyjnej, wirować z prędkością 0,2 x g przez 10 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce proliferacyjnej, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml. Policz komórki za pomocą cytometru.
5. Przemyć płytki polidimetylosiloksanu funkcjonalizowanego fibronektyną 2 razy po 15 minut na mycie pożywką proliferacyjną.
6. Wysiewaj 35 000 komórek na płytkę polidimetylosiloksanu w 700 μl pożywki proliferacyjnej.
7. Dodaj konstrukt plazmidowy H2B-GFP do znakowania histonu H2B białkiem zielonej fluorescencji.
   UWAGA: Tutaj do każdej płytki dodano 1,4 μl mieszanki transfekcyjnej CellLight H2B-GFP BacMam2 (2 μl na 50 000 komórek).
8. Po 24 godzinach zamontuj próbki polidimetylosiloksanu z komórkami, które mają być rozciągnięte na jednoosiowym urządzeniu do odkształcania (jak pokazano na Rysunek 2D). Zmienić pożywkę we wszystkich próbkach na pożywkę różnicującą.
9. Aby odcedzić próbki, zmierz długość komory nienaprężonej komórki (Rysunek 3A) i przekręć mikrometru stopnia, aby zwiększyć długość komory celi o żądaną wartość (np. 10%, patrz Rysunek 3B). Rozciągnięte i nierozciągnięte próbki polidimetylosiloksanu pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C do czasu obrazowania.

7. Obrazowanie

1. Włącz mikroskop. Ustawić temperaturę inkubatora mikroskopu na 37 °C.
2. Ustaw obiektyw, który ma być używany (100-krotne zanurzenie w olejku) do pozycji środkowej, ponieważ wieżyczka obiektywu nie będzie później dostępna. Odkręć obiektyw i przykręć go z powrotem za pomocą pierścienia obiektywu (Rysunek 4A), aby obiektyw można było zbliżyć do komórek. Jeśli używany jest tutaj obiektyw olejowy, na tym etapie dodaj kroplę oleju.
3. Zsyntetyzuj wcześniej (poprzez druk 3D lub obróbkę skrawaniem) plastikowy lub metalowy uchwyt, który ma dwie ważne cechy - kątowe okno i stopień (Rysunek 4B).
   UWAGA: Okno obsługuje szklane szkiełko nakrywkowe o grubości #0, które utrzyma medium, gdy urządzenie naprężające jest w stanie odwróconym. Ukośne nacięcie na krawędziach okna (Rysunek 4D) pozwala obiektywowi zbliżyć się do szkiełka nakrywkowego. Stopień w uchwycie pozwala nam sprowadzić rozciągnięty polidimetylosiloksan niżej, bliżej celu.
4. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe (grubość #0, o wymiarach 25 mm x 25 mm lub 35 mm średnicy) na górnej powierzchni uchwytu, rozprowadzając smar próżniowy na obrzeżach okna (Rysunek 4C), a następnie przyklej plastikowe okienko do stolika mikroskopu (Rysunek 4D i Rysunek 5A).
5. Przykręć stolik z translacją z do stolika mikroskopu i przesuń go do najwyższej pozycji z (Rysunek 5A).
6. Usunąć 500 μl pożywki z rozciągniętej płytki polidimetylosiloksanu, która ma być zobrazowana, i dodać tę pożywkę na szklane szkiełko nakrywkowe w białym plastikowym okienku.
7. Ostrożnie odłącz kwadratową komorę od płytki z polidimetylosiloksanem za pomocą sterylnej pęsety.
8. Trzymaj urządzenie naprężające w pozycji pionowej (komórki skierowane do góry) nad białym plastikowym okienkiem i ostrożnie odwróć urządzenie naprężające, tak aby dodatkowe medium spadło bezpośrednio na środek szklanego szkiełka nakrywkowego (Rysunek 5B) (komórki skierowane w dół).
9. Umieść dolną część urządzenia naprężającego na stoliku z translacją z za pomocą taśmy dwustronnej (Rysunek 5C, D).
10. Patrząc przez okular w jasnym polu, powoli opuść urządzenie naprężające w dół (Rysunek 5E) (obniżając stopień translacji z) i przesuń obiektyw w górę, aby ustawić ostrość na komórkach.
    1. Wykonuj ten krok bardzo powoli, krok po kroku. Jeśli urządzenie naprężające zbyt mocno naciska na szkiełko nakrywkowe, komórki mogą zostać ściśnięte (powodując ich śmierć), a jeśli obiektyw zbyt mocno naciska na szkiełko nakrywkowe, szkiełko nakrywkowe może pęknąć (powodując wyciek medium i rozlanie się na obiektyw).
11. Zeskanuj płytkę polidimetylosiloksanu w kierunkach x i y, aby znaleźć komórkę, która ma jądro fluorescencyjne (pod epifluorescencją ze wzbudzeniem o długości fali 488 nm) i odpowiednią morfologię komórki (w jasnym polu).
12. Jeśli boczne przemieszczenie stolika mikroskopu nie wpływa zbytnio na ogniskowanie w pionie, wybierz wiele obszarów zainteresowania za pomocą funkcji wielopunktowej w oprogramowaniu. Czasami ostrość jest bardzo wrażliwa na wszelkie boczne przemieszczenia stolika. W takich przypadkach obrazuj jedną komórkę na raz. Zaznacz pozycje x, y i z dla każdej interesującej nas komórki.
13. Rejestruj obrazy jądra o szerokim polu (lub z otwartym otworkiem) o długości fali 488 nm oraz komórki o wzbudzeniu w jasnym polu w odstępach 30 s na klatkę przez łączny czas trwania co najmniej 30 minut.

8. Analiza danych

1. Fluktuacje jądrowe
   1. Otwórz sekwencję obrazów jądra (Rysunek 6A) w oprogramowaniu do analizy obrazu i proguj obrazy poklatkowe jądra (na przykład użyj polecenia Threshold w ImageJ lub polecenia Graythresh w oprogramowaniu MATLAB).
   2. Pobierz obszar jądra (w pikselach) w funkcji czasu, wykreśl go w oprogramowaniu do wykreślania danych (Rysunek 6B) i dopasuj wielomian trzeciego rzędu do danych (Rysunek 6C) (na przykład użyj metody Analiza | Dopasowanie | Polecenie Dopasowanie wielomianowe w Początku układu współrzędnych lub polecenie Dopasowanie wielomianowe w oprogramowaniu MATLAB).
   3. Odejmij wartość dopasowanego wielomianu od rzeczywistego obszaru (w pikselach) dla każdego punktu czasowego. Ten skorygowany obszar jest znany jako obszar resztkowy.
      UWAGA: Ten proces usuwa wszelkie tendencje wzrostowe lub spadkowe w danych wynikające z błędów instrumentalnych i jest nazywany detrendingiem.
      1. Oblicz procent powierzchni resztkowej, dzieląc powierzchnię resztkową w każdym punkcie czasowym przez wartość dopasowanego wielomianu w tym punkcie czasowym (Rysunek 6D).
   4. Obliczyć odchylenie standardowe szeregów czasowych powierzchni resztkowej. To odchylenie standardowe oznacza amplitudę fluktuacji jądrowych.
2. Wykreślanie danych i analiza statystyczna
   1. Obliczyć amplitudę fluktuacji jądrowych jako średnią co najmniej 20 jąder na warunek.
   2. Przeprowadź jednoczynnikowy test statystyczny analizy wariancji z poprawką Bonferroniego, aby określić, czy istnieje znacząca różnica w amplitudzie fluktuacji w funkcji warunków zainteresowania (na przykład z zastosowanym odkształceniem i bez niego).

Wyniki

Ostatnie prace mające na celu zbadanie wpływu szczepu rozciągającego na oligodendrocyty¹⁰ wykazały, że 10% jednoosiowy szczep rozciągający sprzyja różnicowaniu komórek progenitorowych oligodendrocytów poprzez globalne zmiany w ekspresji genów. Mechanizm stojący za tymi zmianami w ekspresji genów można badać poprzez obrazowanie parametrów subkomórkowych, takich jak struktura cytoszkieletu, lokalizacja czynnika transkrypcyjnego, dynamika jądra i organizacja chromatyn...

Dyskusja

Wcześniej zaprojektowano urządzenie¹ do stosowania zewnątrzkomórkowego naprężenia rozciągającego na przylegające komórki. Konstrukcja podłoża polidimetylosiloksanowego w tej pracy była wystarczająca do testów biochemicznych, a także do obrazowania rozciągniętych komórek w niskiej rozdzielczości. W ramach tej pracy podłoże zostało przeprojektowane i wprowadzono nowatorską konfigurację obrazowania, która ułatwia obrazowanie żywych komórek subkomórkowych o wysokiej rozdzielczości. Zalety tego systemu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pierwotne komórki pierwotne			Pierwotne komórki progenitorowe oligodendrocytów wyizolowane od nowonarodzonych szczurów zostały dostarczone przez laboratorium dr S. Y. Chew na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang
Media
DMEM wysoki   glukoza	Gibco	11996-065-500ml
Pen/Strep	Gibco	15070-063-100ml
FGF	Prospec	CYT-608-50ug
PDGF	Prospec	CYT-776-10ug
Media Składniki magazynowe
BSA	Sigma	A9418-10G
Progesteron	Sigma	P8783-1G
Putrescyna	Sigma	P5780-5G
Selenin sodu	Sigma	S5261-10G
Tri-jodotyronina	Sigma	T6397-100MG
Tyroksyna	Sigma	T1775-100MG
Holo-Transferyna	Sigma	T0665-500MG
Insulina	Sigma	I9278
Forma i płytka
PDMS - Dow Corning Sylgard 184	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG
Forma - Płynne tworzywo sztuczne	Smooth-On	Smooth Cast 310 - Powłoki podłoża o rozmiarze
śladu
poli-D-lizyna	Sigma	P6407-5MG
Fibronektyna	Sigma	F1141-2MG
mocny>Barwienie histonowe
Sondy molekularne	CellLigt H2B-GFP BacMam	C10594
Funkcjonalizacja powierzchni
APTES	Sigma	A3648-100ml
BS3	Covachem	13306-100mg
HEPES bufor pH 8,0	Alfa Aesar	J63578-AK-250ml
Odklejanie komórek
Accutase	Invitrogen	A1110501-100ml