Ukierunkowane badania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej z blokiem szeregowym i mikroskopią elektronową ze zogniskowaną wiązką jonów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego łączenia mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką bloków szeregowych i skupionej wiązki jonów, aby dotrzeć do interesującego obszaru. Pozwala to na sprawne wyszukiwanie, w trzech wymiarach i lokalizowanie rzadkich zdarzeń w dużym polu widzenia.

Streszczenie

Ten protokół pozwala na efektywne i skuteczne obrazowanie próbek komórek lub tkanek w trzech wymiarach na poziomie rozdzielczości mikroskopii elektronowej. Przez wiele lat mikroskopia elektronowa (EM) pozostawała z natury techniką dwuwymiarową. Wraz z pojawieniem się technik obrazowania za pomocą seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego (objętość EM), wykorzystujących zintegrowany mikrotom lub skupioną wiązkę jonów do krojenia, a następnie oglądania osadzonych tkanek, trzeci wymiar staje się łatwo dostępny. Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBF-SEM) wykorzystuje ultramikrotom zamknięty w komorze SEM. Ma zdolność do obsługi dużych próbek (1 000 μm x 1 000 μm) i obrazowania dużych pól widzenia przy małym rozmiarze piksela X,Y, ale jest ograniczony w wymiarze Z przez nóż diamentowy. Skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM) nie jest ograniczona rozdzielczością 3D (osiągalne są woksele izotropowe ≤5 nm), ale pole widzenia jest znacznie bardziej ograniczone. Protokół ten demonstruje przepływ pracy łączący te dwie techniki, aby umożliwić znalezienie pojedynczych obszarów zainteresowania (ROI) w dużym polu, a następnie zobrazowanie późniejszej objętości docelowej w wysokiej izotropowej rozdzielczości wokseli. Przygotowanie nieruchomych komórek lub tkanek jest bardziej wymagające w przypadku technik objętościowych EM ze względu na dodatkowy kontrast potrzebny do wydajnego generowania sygnału w obrazowaniu SEM. Takie protokoły są czasochłonne i pracochłonne. Protokół ten obejmuje również przetwarzanie tkanek wspomagane mikrofalami, ułatwiające przenikanie odczynników, co skraca czas potrzebny na protokół przetwarzania z dni do godzin.

Wprowadzenie

Ten protokół opisuje przepływ pracy do efektywnego kierowania trójwymiarowej mikroskopii elektronowej (EM) o wysokiej rozdzielczości do określonego obszaru zainteresowania (ROI). Od swoich początków w latach 30. XX wieku EM była zasadniczo techniką dwuwymiarową. Pierwsze opublikowane obrazy dotyczyły całych tkanek lub komórek, ale wkrótce ustąpiły one miejsca skrawkom, które zostały wycięte ręcznie za pomocą ultramikrotomu i zobrazowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). TEM tworzy mikrofotografie o bardzo wysokiej rozdzielczości, na których nawet najmniejsze struktury komórkowe są wyraźnie dostrzegalne. Jednak cienkość przekroju niezbędna do zobrazowania tkanki za pomocą wiązki elektronów sprawiła, że informacja w wymiarze Z była minimalna. Ponieważ komórki są strukturami trójwymiarowymi, interakcje między strukturami komórkowymi a powierzchniami komórek musiały być wywnioskowane na podstawie ograniczonych danych. Zwiększyło to ryzyko błędnej interpretacji, zwłaszcza w przypadku struktur, które były złożone. Niektórym mikroskopistom udało się uzyskać dokładniejsze struktury 3D poprzez seryjne sekcje komórek i tkanek, a następnie żmudną rekonstrukcję ich z indywidualnych obrazów TEM¹. Był to bardzo pracochłonny proces, a przed pojawieniem się obrazowania cyfrowego i renderowania komputerowego wyniki były również trudne do wizualizacji. W ostatnich latach wprowadzono dwie techniki, które stały się znane jako objętościowa mikroskopia elektronowa (objętość EM)², które sprawiły, że EM w trzech wymiarach stało się dostępne dla większej liczby laboratoriów.

Pomysł uzyskania stosu obrazów z wbudowanego bloku wewnątrz mikroskopu elektronowego można prześledzić wstecz do 1981 roku, kiedy Steve Leighton i Alan Kuzirian zbudowali miniaturowy mikrotom i umieścili go w komorze skaningowego mikroskopu elektronowego³ (SBF-SEM). Prototyp ten został ostatecznie skopiowany i ulepszony 23 lata później przez Denka i Horstmanna⁴, a następnie skomercjalizowany. Mniej więcej w tym samym czasie biolodzy dowiedzieli się o innej technologii stosowanej głównie w materiałoznawstwie, skupionej wiązce jonów. Technika ta wykorzystuje pewnego rodzaju wiązkę jonów (gal, plazma) do usunięcia bardzo małej ilości materiału powierzchniowego z próbki (FIB-SEM)⁵. Obie techniki wykorzystują sekcje, a następnie obrazowanie, zapewniając serię obrazów, które można połączyć w stos X, Y, Z. Obie techniki dostarczają informacji 3D, ale w różnych skalach rozdzielczości. SBF-SEM jest ograniczony właściwościami fizycznymi noża diamentowego do plastrów nie cieńszych niż 50 nm w przypadku długich serii obrazowania seryjnego; Jednak rozmiar bloku próbki, który można podzielić na sekcje, jest duży, do 1 mm x 1 mm x 1 mm. Ze względu na duży format cyfrowej akwizycji detektora elektronów rozpraszanych wstecznie (32 tys. x 32 tys. pikseli), który odbiera sygnał z powierzchni bloku, rozmiary pikseli obrazu mogą wynosić nawet 1 nm. Powoduje to powstanie wokseli nieizotropowych, w których wymiar X,Y jest często mniejszy niż Z. Ze względu na precyzję wiązki jonów, FIB-SEM ma możliwość zbierania obrazów z izotropowymi wokselami ≤5 nm. Jednak całkowity obszar, który można sfotografować, jest dość mały. Tabela podsumowująca różne próbki i objętości zobrazowane za pomocą tych dwóch technik została opublikowana wcześniej³.

Przygotowanie tkanek do objętości EM jest trudniejsze niż dla standardowego TEM lub SEM, ponieważ próbki muszą być barwione, aby zapewnić odpowiednią generację sygnału w SEM. Często barwienia muszą być zoptymalizowane nie tylko pod kątem konkretnego typu tkanki, ale także pod kątem dodawania kontrastu do niektórych struktur komórkowych, aby ułatwić identyfikację i rekonstrukcję. Używany tutaj protokół jest oparty na standardzie NCMIR⁶. Dodatkowe barwienie zwykle oznacza dodatkowe kroki protokołu. W związku z tym w przypadku objętości EM standardowe protokoły muszą zostać rozszerzone, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu na wniknięcie odczynników do próbki. Przetwarzanie wspomagane mikrofalami może skrócić czas potrzebny na barwienie z godzin do minut i sprawia, że przygotowanie próbki objętościowej EM jest bardziej efektywne⁷. Metoda ta ma zastosowanie do wszystkich typów komórek i tkanek⁸ oraz do pytań badawczych, w których niejednorodność tkanki sprawia, że pobieranie próbek z określonego obszaru jest niezbędne⁹.

Po uzyskaniu stosu danych, można go wyrównać, a interesujące struktury podzielić na segmenty od reszty danych i modelować w 3D. Chociaż automatyzacja obrazowania wielu wycinków tkanki sprawiła, że pozyskiwanie obrazów jest stosunkowo proste, proces cyfrowej rekonstrukcji i wizualizacji danych jest czasochłonnym zadaniem. Oprogramowanie do tego celu nie jest jeszcze zintegrowane ani w pełni zautomatyzowane. Ponieważ większość wczesnych prac z wykorzystaniem objętości EM była skierowana na neurobiologię, techniki barwienia i cyfrowej segmentacji struktur, takich jak aksony, są dość zaawansowane w porównaniu z innymi komórkami i organellami. Podczas gdy literatura na temat innych tkanek nieneuronalnych szybko rośnie, nieliniowe lub nieregularne struktury wymagają więcej ręcznego wprowadzania danych.

Używanie zarówno SBF-SEM, jak i FIB-SEM jest użytecznym podejściem do celowania i obrazowania specyficznych, niejednorodnych struktur tkankowych w wysokiej rozdzielczości w 3D. Połączenie tego z mikrofalowym wspomaganym przetwarzaniem tkanek znacznie skraca czas potrzebny na przygotowanie próbki. Łącznie ten przepływ pracy sprawi, że generowanie zestawów danych obrazów izotropowych wokseli o wysokiej rozdzielczości drobnych struktur stanie się wydajnym i szybszym procesem.

Protokół

1. Utrwalanie i przetwarzanie próbek do mikroskopii elektronowej

1. Utrwal siewki Arabidopsis thaliana wyhodowane na płytkach agarowych w 0,5% paraformaldehydzie, 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) pH 6,8 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: Aldehydy są drażniące i oraz mają potencjał rakotwórczy, mutagenny i teratogenny. Ze wszystkimi roztworami należy obchodzić się przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego i pod wyciągiem.
2. Odetnij wierzchołki korzeni rośliny wyhodowanej w kroku 1.1 i umieść 2-3 końcówki w probówkach o pojemności 0,5 ml zawierających ten sam utrwalacz na noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Objętość tego i wszelkich roztworów w pozostałych etapach jest określana przez objętość próbki; Minimalny stosunek próbki do roztworu wynosi 10:1. Próbki większe niż 1 mm w dowolnym wymiarze będą trudne do barwienia, więc praca z większymi blokami tkanek jest trudniejsza. Nie wszystkie tkanki mają te same cechy; Na przykład liście i łodygi roślin mogą być trudne do zabarwienia. Jeśli pożądane są większe próbki lub trudne typy tkanek, przed przejściem do zbierania danych należy przeprowadzić optymalizację przetwarzania próbek.
3. Przygotuj roztwór tiokarbohydrazydu (TCH), który powinien być świeży i dostępny przed krokiem 1.7. Dodać 0,1 g tiokarbohydrazydu do 10 ml podwójnie destylowanej wody (_ddH2O) i rozpuścić przez ogrzewanie do 60 °C w suszarce przez 1 godzinę. Przed użyciem przefiltrować roztwór TCH za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
4. Usunąć utrwalacz z probówek i zastąpić go 0,1 M PB o pH 6,8. Umieść probówki na orbitalnym stole wibracyjnym z prędkością 100 obr./min i myj przez 10 minut. Powtórz mycie przy użyciu świeżego PBS 5 razy.
5. Po namocowaniu wierzchołków korzeni poprzez zastąpienie PB 2% tetratlenkiem osmu (OsO₄) i 0,2% czerwienią rutenową w 0,1 M PB o pH 6,8. Włóż rurki do kuchenki mikrofalowej z otwartymi pokrywkami i uruchom program 9 (Tabela 1).
   UWAGA: Osm jest niezwykle niebezpieczny w przypadku spożycia, bardzo niebezpieczny w przypadku wdychania i niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą. Zawsze należy obchodzić się z odpowiednim sprzętem ochronnym i pod wyciągiem.
   UWAGA: W całym protokole pokrywki rurek są zawsze otwarte podczas etapów kuchenki mikrofalowej.
6. Umyj końcówki korzeni dwukrotnie za pomocą ddH₂O przez 5 minut każdy na blacie. Do trzeciego i czwartego prania ddH₂O użyj programu 15 w kuchence mikrofalowej (Tabela 1). Po pierwszych 40 sekundach płukania ddH₂O wyjmij próbki z kuchenki mikrofalowej i zastąp bufor świeżym ddH₂O. Włóż próbki z powrotem do kuchenki mikrofalowej i kontynuuj program.
   UWAGA: Kuchenka mikrofalowa włączy alarm, gdy bufor będzie wymagał odświeżenia. Upewnij się, że pokrywa komory próżniowej jest za każdym razem prawidłowo zakładana.
7. Próbki inkubować w uprzednio przygotowanym roztworze TCH w temperaturze pokojowej przez 2 minuty na stole laboratoryjnym, a do dalszej inkubacji stosować program mikrofalowy 8 (tabela 1). Nie zmieniaj roztworu między stołem a kuchenką mikrofalową.
8. Umyć próbki zgodnie z opisem w kroku 1.6.
9. Umieścić próbki w 1% OsO₄ w ddH₂O dla programu mikrofalowego 9 (Tabela 1).
10. Umyć próbki zgodnie z opisem w kroku 1.6.
11. Próbki inkubować w 1% octanie uranylu w ddH₂O przy użyciu programu mikrofalowego 16 (Tabela 1).
    UWAGA: Octan uranylu jest toksyczny, drażniący i ma potencjał rakotwórczy, mutagenny i teratogenny. Zawsze należy obchodzić się z odpowiednim sprzętem ochronnym.
12. Umyć próbki zgodnie z opisem w kroku 1.6.
13. Przygotuj roztwór ołowiu Waltona do użycia w kroku 1.14. Najpierw przygotuj roztwór podstawowy kwasu L-asparaginowego, dodając 0,998 g kwasu L-asparaginowego do 250 ml ddH₂O i dostosowując pH do 3,8 za pomocą 1 M KOH. Następnie rozpuść 0,066 g azotanu ołowiu w 10 ml roztworu podstawowego kwasu L-asparaginowego i dostosuj pH do 5,5. Roztwór pozostawić w piekarniku w temperaturze 60 °C na 30 min.
    UWAGA: Nie powinny tworzyć się żadne osady.
14. Próbki inkubować w roztworze ołowiu Waltona przez 30 minut w piecu w temperaturze 60 °C.
15. Umyć próbki zgodnie z opisem w kroku 1.6.
16. Odwodnić próbki w EtOH w stopniowanych krokach 50%, 70%, 90% w ddH₂O, a następnie 2x w 100% EtOH. Użyj programu mikrofalowego 10 (Tabela 1), a kuchenka mikrofalowa będzie monitować użytkowników co 40 s o zastąpienie roztworu następnym krokiem EtOH. To ostatni krok wykonany w kuchence mikrofalowej.
17. Następnie odwadniać w 100% tlenku propylenu 2x po 10 minut w temperaturze pokojowej na stole, zastępując roztwór między etapami.
    UWAGA: Tlenek propylenu może rozpuszczać niektóre tworzywa sztuczne, takie jak polistyren; Na tym etapie użyj szklanych fiolek lub wstępnie przetestuj tworzywa sztuczne pod kątem odporności.
    UWAGA: Tlenek propylenu jest wysoce łatwopalny. Zawsze należy obchodzić się z urządzeniem przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego i w dygestorium.
18. Rozpocznij infiltrację wierzchołków korzeni od inkubacji w 50% żywicy Spurra w tlenku propylenu (min 2 h).
    UWAGA: Składniki żywicy Spurr są drażniące. Zawsze należy obchodzić się z urządzeniem przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego i w dygestorium.
19. Zastąp roztwór 100% Spurr's i pozostaw na noc w RT.
20. Zmień na świeżą 100% żywicę Spurr's 2 razy (min. 2 h inkubacji).
21. Umieścić próbki w formie do zatapiania, ponownie zawierającej świeżą 100% żywicę Spurra i polimeryzować w piecu w temperaturze 65 °C przez 36−48 h.
    UWAGA: Zastosowana forma do zatapiania zależy od rodzaju tkanki i podejścia zastosowanego do obrazowania. W tym przypadku użyto płaskiej silikonowej formy do zatapiania (Rysunek 1A).

2. Przygotowanie osadzonych próbek do obrazowania

1. Wyjmij próbki z pieca, usuń żywicę z formy do zatapiania (Rysunek 1B).
2. Za pomocą żyletki z grubsza przytnij próbkę do bloku o maksymalnych wymiarach 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm (Rysunek 1C).
   UWAGA: Aby zapobiec ładowaniu w SBF-SEM, ważne jest, aby odciąć jak najwięcej gołej żywicy i sprawić, by próbka była jak najbardziej płaska/cienka. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie boki bloku zawierały już tkankę, ale co najważniejsze, strona, która zostanie przymocowana do metalowego kołka (patrz krok 2.3), musi zawierać odsłoniętą tkankę, tak aby tkanka była w bezpośrednim kontakcie z metalem przewodzącym.
3. Usuń próbkę z obcej żywicy i przymocuj ją do metalowej szpilki (Rysunek 1D) z przewodzącą żywicą epoksydową, upewniając się, że część tkanki dotyka metalowego kołka. Pozostaw żywicę epoksydową do utwardzenia przez noc w piekarniku w temperaturze 65 °C.
   UWAGA: Upewnij się, że próbka jest umieszczona na środku kołka, ponieważ ruch stolika w SB-SEM jest ograniczony. Usunięcie bardzo małej próbki otoczonej żywicą z dodatkowej żywicy może być trudne, ponieważ mała próbka będzie miała tendencję do odlatywania po odłączeniu. Prostym i skutecznym rozwiązaniem tego problemu jest pokrycie próbki arkuszem folii parafinowej, jak pokazano na filmie uzupełniającym w referencji¹.
4. Zamocuj nosidełko w uchwycie na ultramikrotom. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar żywicy epoksydowej i użyj ultramikrotomu i noża diamentowego, aby wygładzić powierzchnię i boki bloku, tworząc piramidę. Upewnij się, że przynajmniej część tkanki jest już odsłonięta na powierzchni blokowej.
   UWAGA: Dodatkowy krok polegający na użyciu noża diamentowego jest opcjonalny, ale ułatwia zbliżenie się do powstałego bloku w SBF-SEM, ponieważ cień noża na powierzchni bloku jest wyraźniejszy, co ułatwia oszacowanie odległości między nożem a powierzchnią bloku.
5. Umieścić przycięty blok próbki w powlekarce napylającej i pokryć próbkę cienką warstwą (2−5 nm) platyny (Pt).
   UWAGA: Platyna na powierzchni bloku zostanie odcięta podczas podejścia w SBF-SEM (patrz poniżej), ale platyna na bokach piramidy zapewni dodatkowe przewodnictwo. W tym przykładzie próbka została pokryta platyną, ale złoto lub złoto/pallad jest również skuteczne; Jednak powlekanie złotem spowodowało zwiększenie ilości zanieczyszczeń na powierzchni bloku podczas wykonywania obrazowania.

3. Obrazowanie w SBF-SEM

1. Włóż nośnik do mikroskopu SBF-SEM i zbliż nóż do powierzchni próbki. Za pomocą noża diamentowego odciąć górną część próbki tak, aby warstwa Pt została już usunięta i przynajmniej część tkanki została odsłonięta.
   UWAGA: Ponieważ proces ten jest różny dla każdego mikroskopu SBF-SEM, nie każdy krok jest tutaj określony. Dopóki powierzchnia próbki jest wolna od Pt i gotowa do obrazowania, możliwe będą kolejne kroki.
2. Rozpocznij obrazowanie w niskiej rozdzielczości i krótkim czasie przebywania, aby uzyskać przegląd próbki i zlokalizować obszar zainteresowania (Rysunek 1E).
   UWAGA: W tym przypadku 512 x 512 pikseli i czas zatrzymania 1 μs zostały użyte do szybkiego skanowania i pozycjonowania stołu montażowego, a 2,000 x 2,000 pikseli z czasem zatrzymania 1 μs użyto do optymalizacji okna obrazowania i dostosowania ostrości.
3. Używając napięcia przyspieszającego 1,5-2,0 kV przy prądzie 80−100 pA, uchwyć obraz tkanki.
   UWAGA: Pokazany tutaj przykład został zobrazowany w systemie o wysokiej próżni, w którym prąd wiązki musi być regulowany, aby zminimalizować ładowanie, które jest bardzo zależne od próbki. Zazwyczaj wiązka elektronów jest ustawiona na 1,5−2,0 kV, ale będzie to zależne od próbki. Przy większych powiększeniach (zwykle > 10 000x) żywica jest zbyt mocno dotknięta wiązką, aby zagwarantować płynne cięcie, więc zazwyczaj rozmiar piksela jest ustawiony na 8−20 nm przy rozmiarze obrazu 8 000−10 000 x 8 000−10 000 pikseli z odpowiadającymi mu powiększeniami 430 – 1 400x i rozmiarami pola odpowiednio 64 x 64 μm i 200 x 200 μm.
4. Określ obszar zainteresowania i zdecyduj, ile sekcji jest potrzebnych do pokrycia interesującego go obszaru i rozpocznij proces obrazowania za pomocą detektora elektronów rozpraszanych wstecznie.
   UWAGA: W przedstawionym przykładzie 500 odcinków o długości fali 80 nm zostało zobrazowanych przy pikselach 10 nm i obrazach o wymiarach 10 000 x 10 000 pikseli (czas przebywania 1 μs). Mikroskop był ustawiony na 1,6 kV i 100 pA. Ogólnie rzecz biorąc, liczba sekcji zależy od próbki i wielkości zwrotu z inwestycji i może wahać się od 100 s do 1,000 s kolejnych sekcji. Wynikowy zestaw danych składa się z pojedynczych obrazów każdej sekcji. Te obrazy muszą zostać przekonwertowane na stos 3D.

4. Przetwarzanie danych SBF-SEM

1. Korzystając z Fidżi, wybierz sekwencję file-import-image i zlokalizuj stos obrazów, aby załadować obrazy. W zależności od rozmiaru zestawu danych zaznacz pole "użyj stosu wirtualnego".
   UWAGA: Jeśli zestaw danych jest naprawdę duży, najpierw przekonwertuj go na 8-bitowy (jeśli jest zbierany w 16 bitach) i jeśli to konieczne, umieść dane w koszu, aż osiągną odpowiedni rozmiar.
2. Za pomocą przycisku odtwarzania u dołu obrazu przewiń zestaw danych, aby sprawdzić, czy przebieg obrazowania zakończył się pomyślnie. Sprawdź, czy nie ma typowych artefaktów obrazowania dla SBF-SEM, takich jak sekcje spadające z noża na powierzchni bloku, ładowanie w obszarach gołej żywicy, wycinanie artefaktów noża (poziome linie na obrazie).
3. Za pomocą polecenia image-properties dostosuj rozmiar piksela i głębokość woksela (tj. grubość przekroju) używane podczas uruchamiania. Jeśli dane są już podzielone na kosze, weź to pod uwagę.
4. Za pomocą polecenia plugins-registration-linear stack alignment z SIFT w celu zarejestrowania danych.
   UWAGA: Rejestracja danych SBF-SEM jest konieczna, ponieważ podczas obrazowania może wystąpić niewielki ruch próbki spowodowany ładowaniem lub dryftem próbki. Ponieważ jest to tylko minimalny ruch w XY, potrzebne jest tylko tłumaczenie.
5. Sprawdź wyrównanie, przewijając zestaw danych i, jeśli to możliwe, użyj polecenia zapisz w menu pliku, aby zapisać wyrównany zestaw danych jako plik 3D-tif.
6. Dokładnie przeanalizuj zestaw danych, aby sprawdzić, czy uwzględniono zwrot z inwestycji i czy zawiera informacje potrzebne do odpowiedzi na pytanie biologiczne. Na ostatnim obrazie stosu (= bieżąca powierzchnia bloku) wybierz nowy zwrot z inwestycji dla obrazowania FIB-SEM.
   UWAGA: Jeśli na bieżącej powierzchni bloku nie ma odpowiedniego obszaru do obrazowania FIB-SEM, można wyciąć więcej sekcji z bloku (który nadal znajduje się w SBF-SEM), aż pojawi się ROI. Istnieje limit woluminu, który można obrazować za pomocą FIB. Zwrot z inwestycji na obrazie SBF-SEM może wynosić maksymalnie w X,Y 30-40 μm x 15-20 μm.

5. Obrazowanie w FIB-SEM

1. Wykonaj zdjęcia poglądowe próbki w SBF-SEM, najlepiej z jedną lub kilkoma krawędziami próbki, które są następnie rozpoznawalne w FIB-SEM (Rysunek 2A,C).
   UWAGA: W tym przykładzie obrazy przeglądowe SBF-SEM zostały wykonane przy rozmiarze piksela 10 nm, 8 000 x 8 000 pikseli przy czasie przebywania 1 μs. Mikroskop był nadal ustawiony na 1,6 kV i 100 pA.
2. Usunąć próbkę z SBF-SEM i umieścić w powlekarce. Pokryj próbkę platyną ≥20 nm do obrazowania FIB-SEM.
3. Załaduj próbkę do FIB-SEM i za pomocą wtórnego detektora elektronów przy napięciu 15 kV, 1 nA zlokalizuj ROI zidentyfikowany w SBF-SEM na powierzchni bloku (Rysunek 2B,D).
   UWAGA: Obrazowanie przy napięciu 15 kV jest konieczne, aby widzieć przez powłokę platynową.
4. Doprowadź ROI próbki do punktu zbieżności belek FIB i SEM, przesuwając i przechylając stolik (Rysunek 3A).
   UWAGA: Kolumna FIB jest zwykle montowana pod kątem (Rysunek 3A). Oznacza to, że każda próbka musi być przechylona w taki sposób, aby powierzchnia, która ma być zobrazowana i przecięta, była ustawiona równolegle do belki FIB. Powierzchnia, która ma być zobrazowana, jest teraz nachylona w stosunku do belki SEM, a rów tkanki musi zostać usunięty, zanim SEM będzie mógł zobrazować ROI (Rysunek 3E)
5. Korzystając z wiązki FIB i systemu wtrysku gazu, nałóż warstwę ochronną platyny o grubości 1 μm na powierzchnię powyżej ROI (Rysunek 3C). Następnie, używając niskiego prądu frezowania (50-100 pA), wyfrezuj cienkie linie w osadzaniu platyny w celu automatycznego ustawiania ostrości i śledzenia 3D podczas procesu obrazowania (Rysunek 3D). Używając kolumny FIB i wtryskiwacza gazu węglowego, pokryj te linie osadzaniem węgla.
   UWAGA: Rozmiar ROI odpowiada tutaj rozmiarowi ROI na obrazie SBF-SEM, a zatem maksymalny rozmiar może wynosić 30-40 μm x 15-20 μm. W tym przykładzie zobrazowano zwrot z inwestycji wynoszący 17 μm x 8 μm. Osadzanie węgla jest potrzebne do ochrony linii i stworzenia czarno-białego kontrastu między węglem a platyną, który jest idealny do automatycznego ustawiania ostrości. Prądy mielenia stosowane na każdym etapie można znaleźć w tabeli 2.
6. Korzystając z dużego prądu frezowania, wyfrezuj rów o grubości 30 μm przed ROI, tworząc powierzchnię obrazowania dla wiązki SEM (Rysunek 3E).
   UWAGA: Wiązka FIB jest z natury destrukcyjna, tym bardziej przy dużych prądach. Upewnij się, że obrazowanie przy wysokich prądach jest ograniczone do minimum, a obraz jest w małym powiększeniu i przy dużych prędkościach skanowania, aby uniknąć stopienia żywicy przy ROI.
7. Wygładź powierzchnię obrazowania prądem frezowania bliższym prądowi używanemu podczas procesu obrazowania. Przerwij polerowanie, gdy wszystkie znaki autofokusa i śledzenia 3D są wyraźnie widoczne na powierzchni obrazowania (Rysunek 3F). Postęp FIB można śledzić, obrazując powierzchnię za pomocą EM (za pomocą detektora elektronów rozpraszanych wstecznie) podczas polerowania.
8. Określ obszar do zobrazowania na nowo utworzonej powierzchni i ustaw parametry obrazowania. Upewnij się, że wiązka elektronów jest skupiona na powierzchni, ustaw jasność i kontrast oraz ustaw rozmiar piksela i grubość sekcji. Utrzymuj czas obrazowania poniżej 1 minuty, dostosowując czas przebywania i średnią linii.
   UWAGA: Ważne jest, aby używać niskiego napięcia do obrazowania wiązką elektronów, aby upewnić się, że obrazowana jest tylko powierzchnia bloku (tj. że nie są obrazowane żadne elektrony z głębszej części próbki). Odbywa się to poprzez utrzymywanie napięcia poniżej 2 kV i stosowanie detektora elektronów rozpraszanych wstecznie z napięciem sieciowym, co pozwala na obrazowanie tylko elektronów o wysokiej energii. W tym przykładzie wiązka elektronów została ustawiona na 1,5 kV i 1 nA przy napięciu sieci 1,2 kV na detektorze elektronów rozproszonych wstecznie. Również w tym przypadku użyto rozmiaru piksela 5 nm z sekcjami 5 nm, aby uzyskać zestaw danych z izotropowymi wokselami. Obszar o wymiarach 17 μm x 10 μm został sfotografowany przy czasie przebywania 6,5 μs i średniej liniowej 1,0.
9. Ustaw okna automatycznego dostrajania i śledzenia 3D, używając tego samego rozmiaru piksela, czasu zatrzymania i średniej linii, które są używane do obrazowania.
   UWAGA: Ten proces będzie się różnić dla różnych systemów, dlatego wymieniony jest tylko krok bez określania różnych działań.
10. Rozpocznij proces obrazowania i monitoruj stabilność procesu podczas pierwszych 50−100 sekcji. Gdy system będzie działał bez zakłóceń, opuść pomieszczenie i upewnij się, że w pomieszczeniu jest jak najmniej zakłóceń.
    UWAGA: Czas trwania biegu i liczba sekcji będą zależeć od wielkości zwrotu z inwestycji i grubości sekcji. W FIB-SEM oś Z jest w rzeczywistości wysokością pola ROI na obrazie SBF-SEM (maks. 15−20 μm; Rysunek 3E).
11. Zarejestruj dane FIB-SEM w taki sam sposób, jak opisano powyżej dla danych SBF-SEM.

Wyniki

Obrazy z SBF-SEM dają przegląd tkanki, dając wgląd w orientację przestrzenną komórek i połączeń międzykomórkowych (Rysunek 4A). Późniejsze obrazowanie FIB-SEM w nowym regionie, który zwykle jest regionem zainteresowania określonym po inspekcji przebiegu SBF-SEM, dodaje szczegóły o wysokiej rozdzielczości określonych komórek i/lub struktur (Rysunek 4B).

Rysunek 4C,D pokazuje różnicę w renderowaniu nieizotropowych wokseli danych SBF-SEM (Rysunek 4C) i danych izotropowych wokseli FIB-SEM (Rysunek 4D). Grubość z zastosowana w SBF-SEM oznacza, że tynk wyraźnie pokazuje przekroje, co skutkuje efektem "schodów" na powierzchni. W danych FIB-SEM sekcje 5 nm zapewniają, że rendering wydaje się znacznie gładszy, a poszczególne sekcje całkowicie wtapiają się w powierzchnię.

Rysunek 1: Tworzenie powierzchni bloku z próbki osadzonej w żywicy. (A) Wierzchołek korzenia zatopiony w żywicy. (B) Za pomocą żyletki nadmiar żywicy jest odcinany, aż pozostanie blok o grubości 0,5 mm². (C,D) Przycięty blok przykleja się do metalowego kołka, a po nocy spędzonej w piekarniku boki bloku są przycinane, a powierzchnia wygładzana nożem diamentowym za pomocą ultramikrotomu. (E) Wewnątrz SBF-SEM próbka jest zorientowana tak, aby można było rozpoznać powierzchnię bloku i ROI, podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Korelacja między SBF-SEM i FIB-SEM. Obrazy poglądowe powierzchni bloku przy użyciu SBF-SEM (A) i FIB-SEM (B), podziałka = 5 μm. (C,D) Powiększ ROI. Czerwone pole wyznacza obszar, który ma być zobrazowany za pomocą FIB-SEM, pasek skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat FIB-SEM i etapy przygotowania. (A) Schemat przedstawiający orientację belki FIB, wiązki SEM i próbki. Próbka musi być umieszczona w punkcie zbieżności belek FIB i SEM, aby móc frezować i obrazować w tym samym obszarze. (B) Schematyczny rysunek wykopu potrzebnego do obrazowania SEM odcinków usuniętych przez FIB. (C) Obraz wykonany wiązką FIB pokazujący osadzanie się platyny na ROI, podziałka 5 μm. (D) Obraz wykonany wiązką FIB pokazujący linie używane do automatycznego ustawiania ostrości i śledzenia 3D. Linie pośrodku służą do automatycznego ustawiania ostrości, a linie zewnętrzne zapewniają śledzenie 3D. Osadzanie węgla na wierzchu linii zapewnia wymagany kontrast (platyna kontra węgiel) do wykonania tych zadań, podziałka liniowa 5 μm. (E) Obraz wykonany belką FIB po frezowaniu rowu, podziałka liniowa 5 μm. (F) Obraz wykonany wiązką SEM, przedstawiający obszar zainteresowania zobrazowany podczas przebiegu FIB-SEM, podziałka 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyniki SBF-SEM i FIB-SEM przed i po segmentacji. (A) Widok 3D zbioru danych SBF-SEM (100 x 100 x 40 μm, podziałka liniowa = 10 μm), (B) widok 3D zbioru danych FIB-SEM (17 x 10 x 5,4 μm, podziałka liniowa = 2 μm), (C) Wyrenderowane wakuole podzielone na segmenty z danych SBF-SEM przez progowanie, podziałka = 2 μm D. Wyrenderowane granulki podzielone na segmenty z danych FIB-SEM przez progowanie, Podziałka = 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział

Protokół do przetwarzania mikrofalowego
Program #	Opis	Pytanie użytkownika (wł./wył.)	Czas (godz.:min:s)	Moc (waty)	Temp (°C)	Chłodnica obciążenia (wyłączona/automatyczna/włączona)	Pompa próżniowa/bełkotkowa (wyłączona/cykl bąbelk/odkurzacz/odkurzacz włączony/vap)	Stała temperatura
								Pompa (wł./wył.)	Temperatura (°C)
8	TCH	od	0:01:00	150	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	0	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	150	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
9	OSMIUM	od	0:02:00	100	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:02:00	0	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:02:00	100	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:02:00	0	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:02:00	100	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
10	50% EtOH	na	0:00:40	150	50	od	od	na	Rozdział 30
	70% EtOH	na	0:00:40	150	50	od	od	na	Rozdział 30
	90% EtOH	na	0:00:40	150	50	od	od	na	Rozdział 30
	100% EtOH	na	0:00:40	150	50	od	od	na	Rozdział 30
	100% EtOH	na	0:00:40	150	50	od	od	na	Rozdział 30
15	0,1 mln KAKODYLAN	na	0:00:40	Z kolei 250	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
	0,1 mln KAKODYLAN	na	0:00:40	Z kolei 250	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
15	ddH2O	na	0:00:40	Z kolei 250	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
	ddH2O	na	0:00:40	Z kolei 250	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
16	Octan uranylu	od	0:01:00	150	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	0	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	150	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	0	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	150	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	0	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30
		od	0:01:00	150	50	od	CYKL PRÓŻNI	na	Rozdział 30

Tabela 1. Szczegółowy protokół obróbki mikrofalowej.

krok	aktualny	Szacowany czas
Osadzanie platyny	3n A	10-15 minut
Frezowanie, Autotune i znaczniki śledzenia	50-100 pA	4-6 minut
Osadzanie węgla	3 nA	5-10 minut
Frezowanie rowu zgrubnego	15-30 nA	30-50 minut
Powierzchnia polerska	1,5-3 nA	15-20 minut
Przebieg obrazowania	700 pA-1,5 nA	Godziny-dni

Tabela 2. Prądy mielenia FIB używane do przygotowania próbki i przebiegu obrazowania

Dyskusja

Objętościowa mikroskopia elektronowa jest bardziej wymagająca i czasochłonna niż konwencjonalna SEM lub TEM. Ze względu na konieczność barwienia tkanek lub komórek en bloc, etapy przetwarzania muszą być wystarczająco długie, aby zapewnić przenikanie odczynników do całej próbki. Wykorzystanie energii mikrofalowej w celu ułatwienia penetracji sprawia, że przetwarzanie jest krótsze, bardziej wydajne i poprawia barwienie. Ponieważ przygotowanie do EM jest znacznie bardziej rygorystyczne niż do mikroskopii świetlnej, wszystkie roztwory i odczynniki muszą być ściśle kontrolowane pod względem jakości. Zmiany pH, toniczności, stosowanie zanieczyszczonych odczynników i wprowadzanie zanieczyszczeń z powodu złej techniki mogą mieć szkodliwy wpływ na ostateczny obraz.

Objętość EM wymaga również indywidualnie dostosowanych protokołów dla każdego typu próbki. Tkanki ssaków różnych typów: rośliny, pojedyncze komórki, takie jak drożdże, trypanosomy, C. elegans itp., Wszystkie potrzebują swoich własnych odmian, aby osiągnąć optymalne wyniki. Utrwalanie i barwienie musi być zaprojektowane w taki sposób, aby zachować integralność strukturalną i utrzymać próbkę jak najbardziej zbliżoną do jej morfologii in vivo. Utrwalenie tkanek w temperaturze fizjologicznej, pH i toniczności ma kluczowe znaczenie dla uczynienia próbki tak żywą, jak to tylko możliwe. Zamrażanie próbek pod wysokim ciśnieniem (HPF) może pomóc w zachowaniu bardziej realistycznej sytuacji (lub być może po prostu uzyskać różne artefakty), ale w przypadku innych niż komórki i bardzo cienkie tkanki HPF zawiedzie, ponieważ lód szklisty może być generowany tylko w małych ilościach. Dlatego w przypadku wielu pytań utrwalanie chemiczne jest jedyną opcją. Bez względu na to, czy utrwalenie jest HPF czy chemiczne, w każdym eksperymencie EM wyniki strukturalne muszą być dokładnie porównane z podobnymi wynikami z obrazowania żywych komórek lub tkanek, aby sprawdzić, czy są spójne. Barwienie musi być również zoptymalizowane pod kątem konkretnego pytania, na które należy odpowiedzieć, oraz protokołu, który zostanie użyty do wizualizacji obrazów cyfrowych.

Bliskość zarówno systemu SBF-SEM, jak i FIB jest wielką zaletą w wielu eksperymentach. Duże pole widzenia i wysoka rozdzielczość X,Y SBF-SEM ułatwiają znajdowanie poszczególnych struktur/komórek/zdarzeń i zapewniają ogólną orientację przestrzenną komórek w tkankach. Ponadto jego zdolność do umożliwiania obrazowania przez próbkę w Z jest bardzo duża; Jednak rekonstrukcje, które wymagają drobnych szczegółów geometrycznych, mogą zakończyć się niepowodzeniem lub wytworzyć artefakty przy użyciu tej techniki ze względu na generowane przez nią nieizotropowe woksele. FIB jest ograniczony przez fizykę procesu do mniejszego pola obrazowania, ale jego rozdzielczość 3D jest wystarczająca do bardzo dokładnych rekonstrukcji. Połączenie tych dwóch technik jest proste, ponieważ próbki mogą przemieszczać się z SBF-SEM do FIB bez dalszego przetwarzania lub przygotowania. Zdajemy sobie sprawę, że korzystanie z SBF-SEM do przeszukiwania próbki w celu znalezienia określonego obszaru jest bardzo kosztownym użyciem znacznie bardziej wydajnego narzędzia. Jednak możliwość natychmiastowego zobaczenia nowej powierzchni bloku i określenia, czy zwrot z inwestycji został osiągnięty, jest wielką zaletą. Ponadto alternatywy polegające na zastosowaniu szeregowych półcienkich (0,5 μm) odcinków LM mogą usuwać małe struktury przed ich wykryciem, a kontrola bloku za pomocą pojedynczych odcinków TEM, które muszą zostać przycięte, umieszczone na siatce, a następnie oglądane w równie drogim TEM nie jest tak wydajna jak przedstawiona metoda.

Ponieważ istnieje wiele programów do segmentacji i renderowania danych, a potrzeby danej struktury mogą nie być najlepiej zaspokajane przez pojedynczą aplikację, nie można zaproponować standardowego przepływu pracy. Niektóre proste struktury mogą być segmentowane za pomocą algorytmu progowania, jeśli mieszczą się w bardzo wąskich wartościach skali szarości. Struktury neuronalne mogą być półautomatycznie segmentowane za pomocą programu takiego jak Ilastik¹¹ , ale będzie to mniej przydatne w przypadku organelli o bardziej losowych lub złożonych kształtach, takich jak ER. Microscopy Image Browser to bardzo elastyczny program, który może wyrównywać, segmentować i renderować dane objętościowe EM, ale wymaga znacznej interakcji użytkownika¹². Z reguły czas potrzebny na cyfrową wizualizację wyników znacznie przekroczy czas przygotowania próbki i obrazowania.

Techniki EM objętościowe otworzyły trzeci wymiar analizy ultrastrukturalnej. Inne metody otrzymywania 3D EM mają ograniczenia w swojej objętości (tomografia TEM), lub wydajności (przekrój szeregowy TEM). Chociaż w większości przypadków techniki EM są zbyt skomplikowane i kosztowne, aby można je było wdrożyć w indywidualnych laboratoriach, liczba wspólnych obiektów oferujących te techniki stale rośnie, a liczba typów próbek, które udało się zobrazować, gwałtownie wzrosła. Dla tych, którzy mają konkretne pytanie i konkretną tkankę, prawdopodobnie ktoś będzie w stanie udzielić porad i instrukcji dotyczących jej przygotowania i obrazowania. Sprzęt EM objętościowy można ulepszyć, aby uwzględnić zdolność do obsługi większych próbek w SBF-SEM oraz możliwość mielenia większych zwrotów z inwestycji za pomocą FIB. Oprogramowanie, które jest w stanie segmentować interesujące nas struktury w bardziej zautomatyzowany sposób, znacznie uprości proces analizy danych, a poprawa szybkości obliczeń skróci czas potrzebny na to. Pomimo obecnych ograniczeń, objętość EM jest nadal użytecznym narzędziem, a połączenie SBF-SEM i FIB-SEM zapewnia wydajny przepływ pracy do identyfikacji rzadkich zdarzeń i obrazowania ich w wysokiej rozdzielczości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3View 2XP	Gatan	NA	W komorze ultramikrotom do buforu kakodylanu SBFI
0,2 M roztwór	EM Sciences	11652
Przewodząca żywica epoksydowa (prace obwodowe)	Komponenty RS	496-265
Nóż diamentowy Diatome Histo 4,0 mm	EM Sciences	40-HIS
Tablet do digitalizacji	Wacom	DTV-1200W	Nie już dostępne
Rurki Eppendorf	Eppendorf	0030 120.094
Płaska forma do zatapiania	EM Sciences	70900
Aldehyd gluterowy 25% roztwór	EM Sciences	16220
Kwas garbnikowy o wysokiej masie	MW EM Sciences	21700
Cytrynian ołowiu	Sigma-Aldrich	22861
NaCl	Sigma-Aldrich	746398
% roztwór tetratlenku osmu	EM Sciences	19170
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Pelco Biowave Pro +	Ted Pella	36700
Żelazocyjanek potasu	Sigma-Aldrich	P3289
Quorum Q150T ES napylarka do napylania	Quorum Technologies	27645
Reichert-Jung Ultramikrotom ultramikrotom	NA	NA	Nie jest już dostępny
Kakodylan sodu 0,2 M	EM Sciences	11653
Zestaw żywicy Spurrs	EM Sciences	14300
Octan uranylu	EM Sciences	22400