Method Article

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

DOI:

10.3791/59490

⸱

April 3rd, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie spektrometrii mas (IMS) jest rutynowo stosowane do trzech typów próbek: skrawków tkanek, sferoid i kolonii drobnoustrojów. Te typy próbek zostały przeanalizowane przy użyciu spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową (MALDI-TOF MS) w celu wizualizacji rozmieszczenia białek, lipidów i metabolitów w badanej próbce biologicznej. Opracowaliśmy nowatorską metodę przygotowania próbek, która łączy mocne strony trzech poprzednich zastosowań, aby zająć się niedostatecznie zbadanym podejściem do identyfikacji komunikacji chemicznej w raku, poprzez wysiewanie kultur komórek ssaków do agarozy w kokulturze ze zdrowymi tkankami, a następnie suszenie próbki. Tkanki i komórki ssaków są hodowane w bliskim sąsiedztwie, co umożliwia komunikację chemiczną poprzez dyfuzję między tkanką a komórkami. W określonych punktach czasowych próbka na bazie agarozy jest suszona w taki sam sposób, jak kolonie drobnoustrojów przygotowane do analizy IMS. Nasza metoda została opracowana w celu modelowania komunikacji między surowiczym rakiem jajnika o wysokim stopniu złośliwości pochodzącym z jajowodu, który oddziałuje z jajnikiem podczas przerzutów. Optymalizacja przygotowania próbki pozwoliła na zidentyfikowanie noradrenaliny jako kluczowego składnika chemicznego w mikrośrodowisku jajników. Ta nowo opracowana metoda może być zastosowana do innych systemów biologicznych, które wymagają zrozumienia komunikacji chemicznej między sąsiednimi komórkami lub tkankami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas obrazowania (IMS) została zoptymalizowana w celu scharakteryzowania przestrzennego rozkładu cech molekularnych w trzech szeroko stosowanych zastosowaniach: plastry tkanek, sferoidy i kolonie drobnoustrojów1,2,3. Wycinki tkanek można wykorzystać do oceny lokalizacji metabolitów w kontekście warunków biologicznych w gospodarzu, zarówno ukierunkowanych, jak i niedocelowych w określonym zakresie masy. Jednak różnice między cechami molekularnymi są najbardziej znaczące i oczywiste, gdy porównuje się zdrową tkankę ze stanem chorobowym, na przykład guzem. To podejś....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez komitet Institutional Animal Use and Care (IACUC) na Uniwersytecie Illinois w Chicago.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Utrzymuj mysie komórki nabłonka jajowodowego (MOE) w temperaturze 37°C z 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze w pożywce alfa Minimum Essential Medium (αMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 10 mg/ml insuliny, transferyną, selenem (ITS), 1,8 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 100 U/ml penicyliny-streptom....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalnie wysuszony preparat ITO spowoduje, że próbka będzie płaska, wysuszona z minimalnymi lub żadnymi zmarszczkami na powierzchni agarozy i kawałkami agarozy, które zachowują przestrzenną separację na szkiełku (Rysunek 3). Rysunek 3A pokazuje optymalne suszenie, podczas gdy Rysunek 3B pokazuje zmarszczki, których należy unikać. Ta optymalizacja wymaga uważnego monitorowania suwaka w piekarniku, ponieważ do.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje coraz więcej dowodów, które sugerują rolę noradrenaliny w HGSOC 12,17,18, a ta technika przyczyniła się do uzyskania większej ilości informacji mechanistycznych. Z co najmniej ośmioma warunkami biologicznymi obecnymi na tym samym szkiełku, metoda może uwzględniać kontrole biologiczne, takie jak specyficzność genów i komórek, a także kontrole pożywek w jednym przebiegu IMS. Chociaż metoda została zoptymalizowana pod kąte.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zostało zapewnione przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds z The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); Fundusze startowe Uniwersytetu Illinois w Chicago (L.M.S.); Grant 543296 z Sojuszu Funduszy Badań nad Rakiem Jajnika (M.D.); i UG3 ES029073 (J.E.B.) oraz przez National Center for Advancing Translational Sciences, National Institute of Health, poprzez UL1TR002003 grantowe (& LMS).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml probówki FalconDenvilleC1017-ODo zbierania komórek
Komora 8-dołkowa (komora Millipore EZ)MilliporePEZGS0816Ponownie wykorzystana z Millipore Szkiełko komorowe Millicell EZ-slide
AcetonitrylSigma-Aldrich34998-4LRozpuszczalnik do natryskiwanej matrycy
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)Fisher10-022-CVPożywka do hodowli komórkowych
Prędkość Autoflex MALDI-TOF LRFBrukerDo analizy danych IMS
WirówkaEppendorf5810 RDo zbierania komórek i usuwania supernatantu
CHCA MatrixBruker Daltonic8201344Matrix natryskiwany na wysuszone szkiełko
DHB MatrixBruker Daltonic 8201346Matrix w sprayu na wysuszone szkiełko
Jednorazowe skalpeleFisher22-079-707Do usuwania jajników
Nożyczki preparacyjneFisher13-804-6Do usuwania jajników
DMEM MediaGibco11995-065Pożywka zmieszana z
naskórkowym czynnikiem wzrostu agarozyPeprotech Inc.100-15Pożywki do hodowli komórkowych suplement
Probówki EppendorfaGenesee Scientific22-282Dla podwielokrotności agarozy
Estradiol-17βSimga-AldrichE2758Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Surowica bydlęcapłodu Denvillefb5001Suplement pożywki do hodowli komórkowych
FlexControl 3.4Oprogramowanie do akwizycji danychBruker Daltonic
FlexImaging 4.1Oprogramowanie do analizy danych Bruker DaltonicIMS
Kleszcze (cienkie)Fsiher22-327379Do usuwania jajniki
GentamycynaCellgro30-005-CRPożywka do hodowli komórkowych
Insulina, transferyna, selen (ITS)Sigma-Aldrich11074547001Suplement do pożywek do hodowli komórkowych
Szkiełko z powłoką ITO Platforma8237001doinkubacji kohodowli
L-15 firmy LeibovitzGibco11415064Pożywki stosowane podczas wytwarzania tkanek rozwarstwienie
L-glutaminyGibco25030-081Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Niskotopliwa agarozaSigma-AldrichA9414-10GZmieszany z podłożem do powlekania
Basen na mediaCorning4870Służy do cięcia plastikowych przegród do dzielonych komór
Penicylina-streptomycynaGibco15140-122Suplement pożywki
do hodowli komórkowychWzorzec kalibracji peptydówBruker Daltonic8206195Kaliberant dla średniego zakresu mas
Phophorus redSigma-Aldrich343-242-5GKalibert dla niskiego zakresu mas
SCiLS Lab 2015Bruker DaltonicIMS analiza statystyczna danych
Kleszcze chirurgiczne ()Fisher08-875-8BDo usuwania jajników
TFAFisher TechnologieA116-50Dodano do roztworu matrycowego
Urządzenie natryskowe TM HTXTechnologies Donakładania matrycy
IMS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Mass SpectrometryMALDI TOF MSSmall Molecule CommunicationOvarian Cancer MetastasisAgarose CocultureTissue Cell CocultureSample Preparation MethodDesiccation ProcessSpatial IntegrityLabel Free Analysis

Related Articles