Artykuł metodologiczny

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59491

⸱

26 listopada 2019

 ,  ,  , 
1Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, 2Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, 3Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, 4Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, 5Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Streszczenie

Hormony wysp trzustkowych regulują homeostazę glukozy we krwi. Zmiany stężenia glukozy we krwi wywołują oscylacje cytozolowego wapnia w komórkach wysp trzustkowych, które wyzwalają wydzielanie trzech głównych hormonów: insuliny (z komórek β), glukagonu (komórki α) i somatostatyny (komórki δ). Komórki β, które stanowią większość komórek wysp trzustkowych i są ze sobą sprzężone elektrycznie, reagują na bodziec glukozowy jako jedna jednostka. Pobudliwość mniejszych subpopulacji, komórek α i komórek δ (stanowiących odpowiednio około 20% (30%) i 4% (10%) całkowitej liczby komórek wysepek gryzoni1 (human2) jest mniej przewidywalna i dlatego ma szczególne znaczenie.

Czujniki wapnia są dostarczane do obwodowej warstwy komórek wewnątrz izolowanej wysepki. Wysepka lub grupa wysepek jest następnie unieruchamiana i obrazowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wybór trybu obrazowania to wyższa przepustowość (szerokie pole) i lepsza rozdzielczość przestrzenna (konfokalna). Tradycyjnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna jest stosowana do obrazowania tkanek, ponieważ zapewnia najlepszą separację sygnału między sąsiednimi komórkami. System szerokokątny może być również wykorzystany, jeśli zminimalizowany zostanie zanieczyszczający sygnał z dominującej populacji komórek β.

Po zarejestrowaniu dynamiki wapnia w odpowiedzi na określone bodźce, dane są wyrażane w formie liczbowej jako intensywność fluorescencji w funkcji czasu, znormalizowane do początkowej fluorescencji i skorygowane o linię wyjściową, aby usunąć efekty związane z bieleniem fluoroforu. Zmiany częstości skoków lub częściowego pola pod krzywą (pAUC) są obliczane w zależności od czasu, aby określić ilościowo obserwowane efekty. pAUC jest bardziej czuły i dość wytrzymały, podczas gdy częstotliwość skoków dostarcza więcej informacji na temat mechanizmu wzrostu wapnia.

Mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych odpowiedzi na związki markerowe, takie jak adrenalina i grelina, które wywołują zmiany w cytozolowym wapniu w określonych populacjach komórek wysp trzustkowych.

Wprowadzenie

Celem metody jest obrazowanie zmian w czasie rzeczywistym stężenia cytozolowego wapnia ([Ca2+]cyt) w mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych. Pozwala to na odkrycie mechanizmów rządzących wydzielaniem hormonów w tych komórkach, ujawnienie szczegółów na temat wzajemnych oddziaływań między różnymi typami komórek i, potencjalnie, wprowadzenie wymiaru populacyjnego do szerszego obrazu sygnalizacji wysp trzustkowych.

Wysepki składają się z kilku typów komórek. Oprócz bardziej znanych komórek β wydzielających insulinę, istnieją co najmniej dwie subpopulacje, które są również krytyczne w regulacji poziomu glukozy we krwi3. Komórki α (które stanowią około 17% komórek wysp trzustkowych) wydzielają glukagon, gdy poziom glukozy we krwi jest zbyt niski, co sygnalizuje uwolnienie glukozy do krwiobiegu z magazynów w wątrobie. Nadmierny poziom glukagonu (hiperglukagonemia) i upośledzona kontrola uwalniania glukagonu towarzyszą (i, technicznie, mogą się przyczyniać) stanowi przedcukrzycowemu z upośledzoną wrażliwością na insulinę4. Komórki δ (około 2%) wydzielają somatostatynę w odpowiedzi na zwiększenie poziomu glukozy. Ten wszechobecny hormon peptydowy prawdopodobnie występuje w wysokich stężeniach w pobliżu komórek α i β w wyspach trzustkowych, co ma silne działanie osłabiające za pośrednictwem receptora Gi zarówno na wydzielanie glukagonu, jak i insuliny.

α-komórki i δ-komórki dzielą dużą część maszynerii wykrywającej glukozę ze swoimi bliskimi krewnymi, komórkami β. Wszystkie trzy typy komórek są wyposażone w wrażliwe na ATP kanały K+, skomplikowane czujniki metaboliczne5, które kontrolują potencjał błony plazmatycznej tych pobudliwych komórek. W tym samym czasie wydzielanie insuliny, somatostatyny i glukagonu jest regulowane w różny sposób przez glukozę. Obrazowanie dynamiki Ca2 + w dwóch mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych może zatem dostarczyć informacji na temat wzajemnych oddziaływań między poziomem glukozy we krwi a wydzielaniem wysp trzustkowych.

Wczesne próby monitorowania pobudliwości komórek α i δ za pomocą elektrofizjologii patch-clamp zostały wkrótce poprzedzone obrazowaniem Ca2+ w pojedynczych komórkach α i δ. Tożsamość komórek w tych eksperymentach zweryfikowano poprzez barwienie a posteriori przeciwciałami anty-glukagonem lub anty-somatostatyną. Wysiłki te były często utrudniane przez odkrycie, że komórki wysp trzustkowych zachowują się zupełnie inaczej w obrębie wyspy trzustkowej i jako pojedyncze komórki. Chociaż komórki β mogą wydawać się głównymi dobroczyńcami układu wysp trzustkowych (ze względu na ich przytłaczającą większość, która leży u podstaw ich silnego sprzężenia elektrycznego), główna rozbieżność została, co zaskakujące, znaleziona w komórkach α. W obrębie nienaruszonej wysepki komórki te są stale i uporczywie aktywowane przy niskim poziomie glukozy, co jest prawdą tylko w przypadku około 7% pojedynczych rozproszonych komórek α6. Uważa się zatem, że raportowanie aktywności komórek α i δ w nienaruszonych wysepkach stanowi bliższe przybliżenie warunków in vivo.

Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwa sposoby raportowania dynamiki Ca2+ z subpopulacji komórek α lub δ: (i) ekspresja genetycznie kodowanego czujnika Ca2+ za pomocą specyficznego dla tkanki promotora lub (ii) użycie związków markerowych. Bardziej eleganckie wcześniejsze podejście dodaje istotną zaletę prawdziwego obrazowania 3D, a tym samym badania rozmieszczenia komórek w obrębie wyspy trzustkowej. Nie można go jednak stosować do nienaruszonego materiału ludzkich wysp trzustkowych. Innym potencjalnym problemem jest "nieszczelność" promotora, szczególnie gdy występuje transdyferencjacja komórek β/α lub odpowiedź komórek α na wysoki poziom glukozy. To ostatnie podejście można zastosować w przypadku świeżo wyizolowanych tkanek, w tym próbek ludzkich lub hodowanych wysepek. Dane są jednak zbierane wyłącznie z obwodowej warstwy komórek wysp trzustkowych, ponieważ dostarczenie cząsteczki barwnika/markera do głębszych warstw bez zmiany architektury wysp trzustkowych jest trudne. Nieoczekiwaną zaletą tego drugiego podejścia jest kompatybilność z trybem obrazowania szerokokątnego, który pozwala na skalowanie eksperymentów do jednoczesnego obrazowania dziesiątek lub setek wysepek (tj. tysięcy do kilkudziesięciu tysięcy komórek).

Wapń jest obrazowany in vivo za pomocą genetycznie kodowanych GCaMP7 (lub pericam8) czujników rodziny, które są wariantami cyklicznie permutowanego białka zielonej fluorescencji (GFP) połączonego z białkiem wiążącym wapń kalmoduliną i jego sekwencją docelową, M13 fragment kinazy łańcucha lekkiego miozyny7,9. GCaMPs charakteryzują się doskonałym stosunkiem sygnału do szumu w zakresie stężeń nanomolowych Ca2+ i wysokim przekrojem 2-fotonowym, co czyni je idealnym wyborem do pracy in vivo 10,11. Wyzwaniem związanym ze stosowaniem czujników rekombinowanych jest ich dostarczanie do komórek. Ekspresja heterologiczna wymaga użycia wektora wirusowego i wielogodzinnej hodowli ex vivo, co często budzi obawy dotyczące potencjalnego odróżnicowania lub pogorszenia funkcji komórek. Chociaż modele myszy wstępnie zaprojektowane do wyrażania GCaMP rozwiązują ten problem, dodają nowe wyzwania, znacznie wydłużając czas realizacji i ograniczając pracę do modelu innego niż ludzki. Bardzo wysoka wrażliwość na zmiany wewnątrzkomórkowego pH to kolejna niekorzystna strona czujników opartych na białkach12, co stanowi jednak mniejszy problem w wykrywaniu sygnałów oscylacyjnych, takich jak Ca2+.

Zaletą barwników do wychwytywania (takich jak zielona fluorescencyjna Fluo4) jest to, że można je załadować do świeżo wyizolowanej tkanki w ciągu około godziny. Jak można się spodziewać, barwniki wychwytywane mają niższy stosunek sygnału do szumu i (znacznie) niższą fotostabilność niż ich rekombinowane odpowiedniki. Nie możemy potwierdzić13 doniesień o toksyczności barwników wychwytywanych przez sup14, jednak częstym problemem jest przeciążenie barwnikiem.

Czerwone rekombinowane czujniki Ca2+ oparte na permutacji kołowej szybko się rozwijają od 2011 roku15, a najnowsze osiągnięcia stanowią silną konkurencję dla GCaMPs16 dla obrazowania tkanek, biorąc pod uwagę większą głębokość penetracji światła czerwonego. Dostępne na rynku czerwone barwniki wychwytywane mogą być niezawodnie stosowane do obrazowania pojedynczych komórek, ale na poziomie tkanek nie mogą dobrze konkurować z zielonymi analogami.

Najwyraźniej jest bardzo mały wybór technologii obrazowania do eksperymentów na tkankach, gdzie nieostre światło staje się krytycznym problemem. System konfokalny zapewnia akceptowalną rozdzielczość pojedynczej komórki poprzez anulowanie nieostrego światła z dowolnym obiektywem na NA powyżej 0,3 (w przypadku GCaMP6) lub 0,8 (barwnik wychwytywalny). W sensie technicznym konwencjonalny mikroskop konfokalny może być używany do jednoczesnego obrazowania [Ca2+]cyt z setek (GCaMP) lub dziesiątek wysp trzustkowych (barwnik pułapkowy). Jedyną realistyczną alternatywą dla trybu konfokalnego w przypadku ekspresji 3D czujnika w tkance jest być może mikroskopia świetlna.

Sprawy mają się nieco inaczej w przypadku, gdy czujnik jest wyrażony w obwodowej warstwie komórek w tkance wysp trzustkowych. W przypadku jasnych czujników rekombinowanych, które mają żywy wewnątrzkomórkowy wzorzec ekspresji, użycie trybu obrazowania szerokokątnego z obiektywem o niskim NA, może zapewnić wystarczającą jakość i nagrodzić badacza znacznym wzrostem pola widzenia, a tym samym przepustowości. System szerokokątny zapewnia gorszą rozdzielczość przestrzenną, ponieważ nieostre światło nie jest anulowane; dlatego obrazowanie tkanki z obiektywami o wysokiej NA (niskiej głębi ostrości) jest mniej pouczające, ponieważ sygnał pojedynczej komórki jest znacznie zanieczyszczony przez sąsiednie komórki. Zanieczyszczenie jest znacznie mniejsze w przypadku obiektywów o niskiej NA (dużej głębi ostrości).

Są jednak zadania, dla których wysoka przepustowość i/lub częstotliwość próbkowania stają się krytyczną zaletą. α- i δ-komórki wykazują znaczną niejednorodność, co stwarza zapotrzebowanie na duże rozmiary próbek, aby ujawnić wkład subpopulacji. Obrazowanie szerokokątne jest szybkie i bardziej czułe, a system dużego pola widzenia na skalę przemysłową obrazuje setki (GCaMP) lub dziesiątki (Fluo4) wysepek przy tym samym stosunku sygnału do szumu, co eksperymenty konfokalne odpowiednio na dziesięciu lub jednej wysepce. Ta różnica w przepustowości sprawia, że system szerokokątny jest korzystny dla obrazowania populacyjnego z rozdzielczością pojedynczej komórki, co może być szczególnie krytyczne w przypadku małych subpopulacji, takich jak δ-komórkowa. Podobnie, próby rekonstrukcji aktywności elektrycznej na podstawie Ca2+ spiking17 skorzystałyby na wyższej częstotliwości próbkowania zapewnianej przez tryb obrazowania szerokokątnego. Jednocześnie kilka "niszowych" problemów, takich jak aktywność komórek α trzustki po stymulacji dominującej subpopulacji komórek β, wymaga zastosowania systemu konfokalnego. Czynnikiem wpływającym na decyzję o zastosowaniu trybu konfokalnego jest obecność znacznego sygnału zanieczyszczającego z subpopulacji komórek β.

Chociaż nadal możliwe jest stosowanie barwienia przeciwciałami specyficznymi dla hormonów w celu weryfikacji tożsamości komórek po eksperymentach obrazowych, mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych związków markerowych, takich jak adrenalina i grelina, które wykazały, że selektywnie stymulują dynamikę Ca2+ w α-18 i δ-cells19,20.

Analiza danych obrazowania poklatkowego ma na celu dostarczenie informacji wykraczających poza trywialną farmakologię, takich jak niejednorodność populacji, korelacja i interakcja różnych sygnałów. Tradycyjnie dane obrazowe są analizowane jako intensywność w funkcji czasu i normalizowane do początkowej fluorescencji (F/F0). Często potrzebna jest korekta linii bazowej ze względu na bielenie sygnału fluoroforu lub zanieczyszczenie zmianami autofluorescencji lub pH (zwykle indukowane przez milimolowe poziomy glukozy12). Dane Ca2+ mogą być analizowane na wiele różnych sposobów, ale trzy główne trendy to pomiar zmian w częstotliwości skoków, frakcji plateau lub powierzchni pod krzywą, obliczonych w zależności od czasu. Uznaliśmy, że to drugie podejście jest korzystne, zwłaszcza w przypadku mocno niedostatecznie próbkowanych danych konfokalnych. Zaletą metryki pAUC jest jej czułość zarówno na zmiany częstotliwości sygnału, jak i amplitudy, podczas gdy obliczanie częstotliwości wymaga znacznej liczby oscylacji21, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnego obrazowania. Czynnikiem ograniczającym analizę pAUC jest jej wysoka wrażliwość na zmiany linii bazowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały opracowane zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) w Wielkiej Brytanii (1986) oraz wytycznymi etycznymi Uniwersytetu Oksfordzkiego.

1. Izoluj mysie wyspy trzustkowe

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną i roztwór izolacyjny.
    1. Uzupełnić pożywkę hodowlaną: RMPI1640 (patrz tabela materiałów), uzupełniona 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny. Dozować pożywkę do dwóch plastikowych szalek Petriego o średnicy 60 mm (niepokrytych żadnym klejem) i przechowywać szalki w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, wilgotność bezwzględna).
    2. Uzupełnić roztwór izolacyjny (50 ml/mysz): pożywka Hanksa z 5 mM glukozy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny. Przechowywać na lodzie (4 °C).
    3. Uzupełnić roztwór enzymu (np. liberazy): 0,2 mg/ml w roztworze izolacyjnym, 2 ml na mysz. Przechowywać na lodzie (4 °C). Opcjonalnie należy wstępnie przetestować aktywność liberazy i zoptymalizować parametry inkubacji dla każdej partii enzymu22.
  2. Wstrzyknąć roztwór enzymu do przewodu żółciowego myszy.
    1. Złóż w ofierze mysz (12-tygodniową samicę, C57Bl/6J) poprzez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym rozetnij warstwę skóry i mięśni za pomocą cienkich nożyczek i zlokalizuj przewód żółciowy.
    3. Podwiązywać jelito po obu stronach połączenia z drogami żółciowymi za pomocą bawełnianej nici.
    4. Delikatnie podnieś przewód żółciowy za pomocą zakrzywionych cienkich kleszczyków zegarmistrzowskich i wprowadź lodowaty roztwór enzymatyczny do przewodu za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml z igłą 30G. Na tym etapie należy zaobserwować napompowanie trzustki.
    5. Zbierz napompowaną trzustkę za pomocą kombinacji kleszczyków do kciuków z nosem i cienkich kleszczyków zegarmistrzowskich do probówki sokoła o pojemności 15 ml i trzymaj ją na lodzie (4 °C). Dodać 1 ml roztworu enzymu do probówki.
  3. Uwolnij i zbierz wyspy trzustkowe z trzustki.
    1. Inkubować napompowaną trzustkę roztworem enzymu przez 16 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Można zastosować delikatne potrząsanie, ale nie jest ono krytyczne, pod warunkiem, że napompowanie było dobre.
    2. Zatrzymaj trawienie, dodając lodowaty roztwór izolacyjny do 10 ml. Delikatnie wstrząśnij digestem: powinno rozpadnąć się na małe kawałki.
    3. Przepłukać trawinę trzykrotnie w 10 ml roztworu izolacyjnego, odstawić na 5 minut w temperaturze 1 x g do osadzenia uwolnionych wysepek na lodzie. Delikatnie odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
    4. Dodaj zimny RPMI do trawienia (aby uzyskać do 10 ml).
    5. Użyj plastikowych szalek Petriego (krok 1.1.1), aby wybrać wysepki. Zdekantuj pożywkę RMPI z jednej z szalek Petriego i delikatnie wlej trochę (4-5 ml) roztworu mineralnego. Zbierz uwolnione wysepki, które wyglądają jak okrągłe, gładkie kawałki o dużej gęstości, za pomocą pipety P10 do drugiej szalki Petriego.
    6. Hodowla wysepek w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, wilgotność bezwzględna). Na tym etapie eksperyment można wstrzymać. Niektórzy uważają, że pozostawienie wysepek na 1-2 godziny pomaga odzyskać siły po naprężeniach mechanicznych podczas izolacji.

2. Załaduj barwnik lub odciągnij czujnik

  1. Przygotuj barwnik, który można złapać.
    1. Rozpuścić podwielokrotność (zwykle 50 μg) barwnika wychwytywalnego (np. Fluo-4) w DMSO do stężenia podstawowego 2 mM. Dodaj kwas pluronowy do końcowego stężenia 1% (używając 20% zapasu w DMSO), aby poprawić rozpuszczalność barwnika.
    2. Barwnik należy podzielić na porcje w małych probówkach do PCR (po 2 μl w każdej). Barwnik można przechowywać w stanie zamrożonym (-20 °C) przez kilka tygodni.
  2. Alternatywnie należy przygotować rekombinowany czujnik.
    1. Rozprowadzić czujnik (np. wektor adenowirusowy kodujący GCaMP6f) w 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. (Opcjonalnie) należy wstępnie przetestować miano stada wirusa, infekując wyspy trzustkowe (jak poniżej) przy użyciu kilku seryjnych rozcieńczeń, aby ujawnić optymalne stężenie dla infekcji.
      UWAGA: Rekombinowane czujniki kodowane przez różne wektory (lentiwirus, BacMam, AAV) wymagają innego protokołu infekcji. Upewnij się, że sprawdziłeś to u dostawcy wektorów i zoptymalizuj współczynnik roboczy do swoich potrzeb. "Zapas roboczy" adenowirusa może być przechowywany w temperaturze -20 °C i kilkakrotnie zamrażany/rozmrażany. Nadmierne cykle zamrażania i rozmrażania zmniejszają efektywne miano wirusa.
  3. Przygotuj roztwór do obrazowania.
    1. Uzupełnić roztwór do obrazowania, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1 NaH2PO4, 5 NaHCO3, 10 HEPES (pH 7,4, z NaOH).
    2. Uzupełnić zapas glukozy (0,5 M) i mannitolu (0,5 M) w roztworze do obrazowania. Wywar można przechowywać w lodówce (4 °C) przez kilka tygodni.
  4. Załaduj barwnik, który można złapać.
    1. Uzupełnić roztwór roboczy barwnika, rozpuszczając 2 μl barwnika w 600 μl roztworu do obrazowania zawierającego 6 mM glukozy. Roztwór można podgrzać lub wirować w celu poprawy rozpuszczalności.
    2. Załaduj wysepki wyizolowane w kroku 1 do roztworu roboczego barwnika. Ładowanie można wykonać za pomocą płytki wielodołkowej lub szalki Petriego. W tym drugim przypadku należy umieścić 100 μl kropli roztworu roboczego na dnie nieprzylepnej szalki Petriego (35 lub 60 mm) i odpipetować 10-30 wysepek do kropli.
    3. W przypadku różnych grup wysepek (np. typu dzikiego/knock-out) należy rozmieścić wiele studzienek i wiele kropel, aby załadunek mógł odbywać się jednocześnie.
    4. Inkubować wysepki w roztworze roboczym barwnika w temperaturze pokojowej w ciemności przez 70-90 minut. Nie przesadzaj z inkubacją.
    5. Sprawdź obciążenie pod mikroskopem fluorescencyjnym; wysepki powinny uzyskać łagodną fluorescencję, przy czym niektóre komórki powinny być jaśniejsze niż reszta. Zaokrąglanie komórek i lokalizacja jądrowa barwnika są oznakami przeciążenia.
    6. Przenieść wyspy trzustkowe do bezbarwnikowego roztworu do obrazowania zawierającego 6 mM glukozy. Wysepki można natychmiast wykorzystać do obrazowania, ale opcjonalnie barwnik można pozostawić do deestryfikacji na kolejne 10-15 minut. Wysepki zatrzymują barwnik przez kilka godzin i dlatego mogą być używane do obrazowania na kilka zmian.
  5. Alternatywnie należy zainfekować wysepki wektorem rekombinowanym.
    1. Pokryj wysepki kropelkami w pożywce do hodowli RPMI (krok 1.1.1) (np. 30 μL), aby zminimalizować potrzebną objętość wektora.
    2. Dodaj wektor w stosunku około 105 jednostek zakaźnych na wyspę, co powinno idealnie skutkować mnogością infekcji >2. Idealnie byłoby, gdyby stosunek był zoptymalizowany do minimalnego stosunku, który zapewniałby ekspresję w warstwie obwodowej. Pomocne może być miareczkowanie wstępne (krok 2.2.3).
    3. Wprowadź 20-50 wysepek do kropli i hoduj przez 8-48 godzin. (Najlepiej z dnia na dzień). Wyspy trzustkowe powinny rozwinąć słabą zieloną fluorescencję w większości komórek, bez zmian w morfologii komórek.
      UWAGA: Powodzenie infekcji i ekspresja zależy od czasu ekspozycji na roztwór wirusa. Idealnie byłoby, gdyby wirus pozostał w roztworze przez noc, ale opcjonalnie można go usunąć już po 15 minutach. Jednak zakaźność, a co za tym idzie ekspresja, będzie prawdopodobnie znacznie niższa.

3. Obrazowanie dynamiki Ca2+

  1. Unieruchomić wysepki pod (odwróconym) mikroskopem.
    1. Zmontuj komorę obrazowania do mikroskopii odwróconej. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe (grubość 1 lub 1,5) wewnątrz komory i upewnij się, że interfejs szklanej komory jest wodoszczelny. Sprawdź, czy szkiełko nakrywkowe znajduje się w zasięgu obiektywu mikroskopu (krytyczne w przypadku nieporęcznego obiektywu o wysokim NA).
    2. Przygotuj akcesoria do unieruchamiania. Wytnij małe prostokąty (20 mm x 20 mm) z drobnej siatki i grubych oczek. Wprowadź dwie "ścianki" dystansowe na drobną siatkę za pomocą taśmy klejącej o grubości 45-50 μm. Należy użyć podwójnych warstw przekładki, jeśli rozmiar wysepek, które mają być zobrazowane, znacznie przekracza konwencjonalne 100 μm.
    3. Zanurz siatki i ciężar w roztworze do obrazowania za pomocą szalki Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że plastik i metal są mokre.
    4. Pod mikroskopem preparacyjnym obróć drobną siatkę ze "ściankami" przekładki do góry nogami, przekładkami skierowanymi do góry. Pobrać kilka wysepek załadowanych barwnikiem wychwytywanym lub odciągających rekombinowaną elektrodę za pomocą pipety P20 i delikatnie umieścić je na wierzchu drobnej siatki, między dwoma przekładkami. Upewnij się, że na siatce i podkładkach nie ma nadmiernych ilości roztworu do obrazowania.
    5. Podnieś siatkę z wysepkami za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i umieść ją do góry nogami w komorze obrazowania, tak aby przekładki były skierowane w dół i przylegały bezpośrednio do szkiełka nakrywkowego komory. Upewnij się, że wysepki są uwięzione między przekładkami a siatką w środku szkiełka nakrywkowego.
    6. Umieść grubą siatkę i ciężarek na wierzchu drobnej siatki w komorze. Wprowadzić roztwór do obrazowania do komory. Upewnij się, że wysepki są unieruchomione i gotowe do obrazowania. Unikaj nadmiernego potrząsania komorą (dopuszczalne są drobne zakłócenia, takie jak przenoszenie komory do mikroskopu i wkładanie do podgrzewanego sceny).
      UWAGA: Podobny układ unieruchomienia można zastosować do systemu pionowego.
  2. Ustaw mikroskop.
    1. Wybierz tryb obrazowania i obiektyw, ustaw komorę z wysepkami z kroku 3.1 na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą.
      1. Ustaw regulację temperatury (najlepiej między 30 °C a 36 °C) i peryfuzję. W przypadku systemu odwróconego należy ustawić dopływ poniżej odpływu w komorze i ustawić strumień odpływu na większy niż strumień dopływu (co zwykle osiąga się za pomocą rurki o szerszej średnicy wewnętrznej w pompie perystaltycznej).
      2. Upewnij się, że odpływ ma minimalną powierzchnię kontaktu z roztworem, tak aby usuwał roztwór w wielu sekwencyjnych małych kropelkach, unikając długich przerw ciągłego usuwania roztworu. To ostatnie jest głównym źródłem artefaktów w obrazowaniu poklatkowym sygnałów okresowych, ponieważ pojawiają się one jako regularne okresowe oscylacje intensywności każdego obrazowanego piksela i są często interpretowane jako "wolne fale".
      3. Rozpocząć peryfuzję roztworem do obrazowania zawierającym 3 mM glukozy.
    2. Wybierz ścieżkę światła i filtry do obrazowania zielonych fluoroforów; wzbudzenie między 470 a 500 i emisja między 505 a 550 będą działać dla każdego z nich.
    3. Uruchom obrazowanie na żywo, aby skonfigurować parametry obrazowania. Dostosuj widok, aby uchwycić interesujące Cię wysepki.
    4. Zoptymalizuj stosunek sygnału do szumu obrazu. W tym celu dostosuj natężenie światła wzbudzenia, czas ekspozycji i binning. Upewnij się, że ustawienia pozwalają na odrębną wizualizację każdej komórki w wysepce przy minimalnym możliwym natężeniu światła i ekspozycji.
    5. Wykonaj akwizycję obrazu. W zależności od zadania zdjęcia mogą być wykonywane z częstotliwością od 0,1 do 5 Hz. Jest to znacznie poniżej kryteriów Nyquista dla szybkich oscylacji sterowanych przez Na+ w komórkach α i δ (>300 Hz), co oznacza, że dane są domyślnie niedostatecznie próbkowane. Jednak zwiększenie częstotliwości akwizycji w celu dopasowania do tego zapotrzebowania nie jest możliwe w obrazowaniu wielokomórkowym/wielowyspowym z dużym polem widzenia. GCaMP może być obrazowany szybciej, podczas gdy Fluo4 nieuchronnie wybiela się w warunkach szybkiej akwizycji.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że oscylacje [Ca2 +] cyt w komórkach wysp trzustkowych są napędzane przez aktywność elektryczną, stosowanie niskich wskaźników akwizycji może wydawać się przeciwne do zamierzonego. W rzeczywistości jednak szybkość akwizycji na poziomie około lub powyżej 1 Hz może być wystarczająca do rozwiązania zachowania impulsowego β komórki13, podczas gdy próg wykrywania oscylacji napędzanych kanałem sodowym w komórkach α i δ jest znacznie powyżej 300 Hz. Niezależnie od tego, czy oscylacje cyt w α czy δ-komórkowych [Ca2 +] są rejestrowane przy 1 Hz czy 0,1 Hz, będą one poważnie niedopróbkowane i będą odzwierciedlać obchodzenie się z Ca2+ przez komórkę, a nie aktywność elektryczną.
      1. Sprawdź jakość uzyskanych danych: przy 3 mM glukozy aktywność komórek α powinna być wyraźnie widoczna/wykrywalna. Upewnij się, że tak jest i przejdź do pełnowymiarowego obrazowania poklatkowego.
  3. Obrazowanie poklatkowe
    1. Skorzystaj z internetowego wykresu dynamiki sygnału, zaimplementowanego w oprogramowaniu do akwizycji, jeśli jest ono dostępne. Jeśli tworzenie wykresów online nie jest opcją, zastosuj tabelę przeglądową, która wyświetla intensywność sygnału w najbardziej kompleksowy sposób (np. "tęcza").
    2. Zastosuj bodźce w sposób odwracalny: zapisz odzyskiwanie sygnału do poziomu podstawowego. Zignoruj artefakty na samym początku i na końcu nagrania; to ostatnie może wyglądać jak nieodwracalny "wzrost"/"spadek" fluorescencji sondy spowodowany zmianami pH lub śmiercią komórki.
    3. Różnicuj komórki α za pomocą oscylacyjnej dynamiki Ca2+, przy niskim poziomie glukozy. Wprowadź adrenalinę lub glutaminian do roztworu kąpieli, odwracalnie na 2-5 minut. Nastąpi gwałtowny skok w [Ca2+]cyt, po którym nastąpi spowolnienie lub anulowanie oscylacji.
      UWAGA: Adrenalina jest uznanym związkiem markerowym dla komórek α, który ma selektywny pozytywny wpływ na tę subpopulację komórek wysp trzustkowych, w którym pośredniczy uwalnianie Ca2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych18. Glutaminian został przedstawiony jako kolejny agonista specyficzny dla komórek α23.
    4. Dodaj/usuń grelinę, która według ostatnich doniesień selektywnie aktywuje δ-komórkę19,20. Obserwuj szybki odwracalny wzrost [Ca2 + ]cyt w małej subpopulacji komórek wysp trzustkowych.
    5. Dodaj/usuń 20 mM glukozy. Obserwuj skoordynowaną odpowiedź oscylacyjną w subpopulacji komórek β. Zwróć uwagę na reakcję komórek, które wcześniej zostały aktywowane przez adrenalinę lub glutaminian i grelinę.
    6. Zapisz sekwencję obrazów. Rozważ użycie opcji "Autozapisz" podczas nagrywania.

4. Analiza danych

  1. Przeanalizuj obraz poklatkowy.
    1. Zaimportuj obraz poklatkowy do oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ/FIJI o otwartym kodzie źródłowym.
    2. Jeśli podczas nagrywania nastąpił znaczny/gwałtowny ruch, odrzuć dane jako niemożliwe do naprawienia. Użyj pluginów StackReg lub TurboReg24, aby skorygować drobne dryfy.
    3. Utwórz obraz maski do wykrywania komórek i mapowania obszaru zainteresowania (ROI). Preferowanym sposobem osiągnięcia tego celu byłoby utworzenie obrazu stosu przy użyciu jednej z funkcji, takich jak "średnia intensywność" lub "maksymalna intensywność". Funkcja, która ma być zastosowana, to ta, która zapewni najlepsze rozpoznanie poszczególnych komórek.
    4. Proguj obraz maski, usuń wszystkie dane poza regionem wysepki. Funkcja działa w trybie automatycznym dla obrazów 32-bitowych.
    5. Wykrywanie maksimów na obrazie progowym. Maksima mogą być reprezentowane przez punkty, regiony, a nawet sektory, jeśli obraz jest gęsty.
    6. Zastosuj funkcję "znajdź maksima" bez żadnych ograniczeń rozmiaru i wklej wykryte maksima do edytora obszaru zainteresowania (ROI).
    7. Wygładź/interpoluj każdy z zmapowanych ROI; możliwe, że ROI będą wymagały rozszerzenia. Można napisać prosty skrypt (4.1.6-4.1.8) i uruchomić go kilka razy, aby zapewnić najlepsze wyniki wykrywania komórek. Kilka zwrotów z inwestycji może się pokrywać, ale zdarza się to rzadko.
    8. Przeanalizuj pozycję ROI i wklej odpowiednie dane X i Y do oprogramowania do tabel elektronicznych (np. Microsoft Excel).
    9. Przeanalizuj intensywność szarości w funkcji czasu dla wszystkich zwrotów z inwestycji i wklej dane do oprogramowania do stołu elektronicznego.
  2. Analizuj dane liczbowe.
    1. Zaimportuj dane do oprogramowania do analizy danych. W zależności od wyboru oprogramowania i czasu trwania/próbkowania/rozmiaru eksperymentu, może to być prosta operacja kopiowania i wklejania lub samodzielna procedura. Zapewnić uporządkowanie i przechowywanie danych numerycznych.
    2. Zaimportuj sygnatury czasowe lub notatki czasowe, jeśli są dostępne.
    3. Znormalizuj surowe dane dotyczące intensywności fluorescencji ("F") do początkowej wartości fluorescencji ("F0"). Nie musi to być fluorescencja w pierwszym punkcie, ale może to być średnia z kilku pierwszych punktów. Normalizacja powinna zmniejszyć zmienność danych, a w idealnym przypadku (brak dryfującej linii bazowej) skutkować możliwym do analizy zestawem danych ("F/F0").
    4. Jeśli zmienność między komórkami w zbiorze danych F/F0 jest nadal znaczna (długie zapisy, wybielanie), należy przeprowadzić korektę linii bazowej. W tym celu należy zdefiniować region "kontrolny", tj. zakres czasu, w którym zastosowano roztwór kontrolny (dla mysich wysp trzustkowych 3 mM glukozy bez żadnych agonistów/antagonistów).
      1. Jeśli obszar kontrolny ma wyraźny sygnał nieoscylacyjny, załóżmy, że F/F0 powraca do wartości początkowej (F/F0=1) po każdym zastosowaniu roztworu kontrolnego. Skoryguj dane poklatkowe dla każdej komórki, dzieląc dane na segmenty, oddzielone punktami, gdy dodano roztwór kontrolny, i stosując korekcję liniową do każdego segmentu. Nie należy używać korekcji wielomianowej ani innej korekcji nieliniowej, ponieważ powoduje to powstanie artefaktów.
      2. Jeśli zakres kontrolny ma wyraźne oscylacje lub występują dodatkowe czynniki (takie jak autofluorescencja FAD), użyj algorytmu wykrywania spajków17. Prostym i szybkim sposobem na obejście tego celu jest transformacja falkowa czuła na maksima (Rysunek 3A).
    5. Określ ilościowo dane. Chociaż Ca2+ jest sygnałem wysoce dynamicznym, przedstawianie danych Ca2+ w kategoriach bezwzględnych wartości F/F0 jest powszechnie akceptowane w literaturze biomedycznej. Jeśli chcesz porównać wyniki wielu eksperymentów, wybierz dane.
      1. Zmierz częstotliwość kolców Ca2+ (Rysunek 4A,D) i jej reakcję na dodanie (ant)agonistów. W tym celu należy podzielić nagranie na równe przedziały czasowe i obliczyć przebieg czasowy częściowej częstotliwości (częstotliwość skoku w każdym z interwałów), licząc skoki w obrębie przedziału i normalizując do czasu trwania interwału.
      2. Alternatywnie ustaw próg i oblicz frakcję plateau (pf) dla każdego z interwałów zdefiniowanych powyżej (Rysunek 4B,F). Ułamek ten wskazuje procent czasu w przedziale, który komórka spędziła w stanie "wzbudzenia".
      3. Alternatywnie, oblicz częściową powierzchnię pod krzywą (pAUC) dla każdego z interwałów zdefiniowanych powyżej (Rysunek 4C,G). Ta metryka jest wrażliwa na zmiany zarówno częstotliwości, jak i amplitudy skoków.
        UWAGA: Jednym z zastrzeżeń dotyczących częstotliwości pomiaru jest brak czułości na czas trwania skoku i słaba stabilność. Ponieważ dane są mocno niedostatecznie próbkowane w porównaniu ze skokami elektrycznymi, liczba skoków na interwał jest dość mała, a zatem jedyny dodatkowy skok może dramatycznie wpłynąć na wynik. "Wąskim gardłem" pAUC jest jego wrażliwość na zmiany w linii bazowej. Chociaż jest mniej podatny na artefakty i bardziej wrażliwy na zmiany [Ca2+] cyt niż częstotliwość, pAUC nie dostarcza jednak zbyt wielu informacji na temat natury dynamiki Ca2+. Frakcja plateau to rozszerzenie koncepcji otwartego prawdopodobieństwa na układ całokomórkowy. Jest jednak mniej wytrzymały niż pAUC ze względu na jego zależność od wartości progowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyspy ulegają dość efektywnemu obciążeniu barwnikami zatrzymywanymi (Rysunek 1A), chyba że skład lipidowy błony został zaburzony (np. w wyniku przewlekłej ekspozycji na kwasy tłuszczowe). Wektor ludzkiego adenowirusa typu 5 (Ad5) również celuje we wszystkie komórki wysp (Rysunek 1B). Problemy mogą wystąpić w przypadku ekspresji więcej niż jednego rekombinowanego sensora w tej samej komórce. Ponadto wyspy są zazwyczaj bardzo dobr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole istnieją trzy etapy, które mają kluczowe znaczenie dla ogólnego sukcesu. Udane wstrzyknięcie enzymu Liberazy do przewodu żółciowego decyduje nie tylko o sukcesie ilościowym procedury izolacji, ale także wpływa na jakość izolowanych wysp trzustkowych. Nienapompowana trzustka może powodować brak niektórych ważnych odpowiedzi metabolicznych w izolowanych wyspach trzustkowych. Po drugie, obciążenie barwnikiem/ekspresja czujnika określa stosunek sygnału do szumu w nagraniu poklatkowym. Sygnały są nieobecne lub tłu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

AH otrzymał stypendium doktoranckie Diabetes UK, EV był wspierany przez OXION-Wellcome Trust Training Programme, AIT zorganizowało stypendium podoktoranckie Oxford Biomedical Research Council.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40x/1,3
Emisja
mikroskopu
Pobudzenie
Surowica bydlęcapłodu Sigma-AldrichF7524-500ML
Fluo4Thermo Fisher (Life Technologies)F14201
GCaMP6f, in (typ ludzki 5) wektor adenowirusowyVector Biolabs1910
Roztwór HanksaThermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
LiberaseSigma-Aldrich5401020001
penicylina/streptomycynaThermo Fisher (GibCo, Life Technologies)15140122
RPMI mediumThermo Fisher (GibCo, Life Technologies)61870044
System konfokalny Zeiss LSM510-METACarl Zeiss
Obiektyw Axiovert 200

Bibliografia

  1. Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629(1995).
  2. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  3. Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
  4. Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
  5. Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
  6. Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
  7. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137(2001).
  8. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  9. Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97(2014).
  10. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
  12. Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
  13. Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
  14. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039(2018).
  15. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  16. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727(2016).
  17. Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
  18. Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  19. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  20. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  21. Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826(2014).
  22. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  23. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  24. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  25. Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
  26. Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
  27. Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
  28. Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
  29. Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
  30. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  31. Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
  32. Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
  33. Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
  34. Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
  35. Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
  36. Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
  37. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
  38. Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
  39. Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638(2013).
  40. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  41. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  42. van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnaobrazowanie szerokopolowecz stotliwo skok w wapniacz ciowy pole pod krzywstymulacja adrenalin i ghrelinunieruchomienie wysepekanaliza obrazowania wapnia

Powiązane artykuły