Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

Podsumowanie

Bezkomórkowe systemy ekspresji są potężnymi i opłacalnymi narzędziami do wysokoprzepustowej syntezy i badań przesiewowych ważnych białek. W tym miejscu opisujemy przygotowanie bezkomórkowego systemu ekspresji białek przy użyciu natriegenów Vibrio do szybkiej produkcji białek przy użyciu plazmidowego DNA, liniowego DNA i matrycy mRNA.

Streszczenie

Morska bakteria Vibrio natriegens zyskała znaczną uwagę jako nowy mikrobiologiczny gospodarz dla biotechnologii ze względu na szybkie tempo wzrostu. Opisano ogólny protokół przygotowania surowych ekstraktów komórkowych V. natriegens przy użyciu powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego. Ten wysokowydajny protokół został specjalnie zoptymalizowany pod kątem dostępności dla użytkownika i obniżenia kosztów. Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) może być przeprowadzana w małych reakcjach wsadowych 10 μl w formacie 96- lub 384-dołkowym i w sposób powtarzalny daje stężenia > 260 μg/ml super foldera GFP (sfGFP) w ciągu 3 godzin. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego i CFPS może być osiągnięte w ciągu 1-2 pełnych dni przez jednego użytkownika. Protokół ten można łatwo zintegrować z istniejącymi procesami syntezy białek, aby ułatwić postęp w zastosowaniach bioprodukcji i biologii syntetycznej.

Wprowadzenie

Bezkomórkowa synteza białek to wszechstronna i opłacalna metoda ekspresji cennych białek lub peptydów1^,2,3,4. Historycznie rzecz biorąc, bezkomórkową syntezę białek przeprowadzano przy użyciu systemów ekspresji Escherichia coli; Jednak ostatnio nastąpił gwałtowny wzrost wykorzystania alternatywnych, niemodelowych organizmów o nowych właściwościach jako podwozia do ekspresji bez komórek5^{,6,7,8,9,10,11,12}. Organizmy o unikalnych profilach metabolicznych są głównymi kandydatami jako alternatywa dla systemów bezkomórkowych E. coli. Na przykład bakteria morska Vibrio natriegens jest najszybciej rosnącym ze wszystkich znanych organizmów, z obserwowanym czasem podwojenia poniżej 10 min¹³. To przyciągnęło znaczną uwagę V. natriegens jako nowego żywiciela mikrobiologicznego dla badań i biotechnologii^{14,15,16,17,18}. Biorąc pod uwagę, że szybkie tempo wzrostu V. natriegens zostało powiązane z wysokimi wskaźnikami syntezy białek i wydajnością metaboliczną^19,20,21, wykorzystanie jego maszynerii komórkowej do syntezy bezkomórkowej może znacznie rozszerzyć zestaw narzędzi do szybkiej produkcji białek i wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Ostatnio zademonstrowano bezkomórkowy system ekspresji >V. natriegens, który jest w stanie wytworzyć super folder GFP (sfGFP) w stężeniach > 260 μg/mL w ciągu 3 godzin z promotorem T7⁹. Ogólnym celem opracowania tej metody było zapewnienie użytkownikom wysoce dostępnego, opłacalnego, powtarzalnego i wysokowydajnego systemu ekspresji białek bez komórek, który można przygotować przy użyciu zwykłego sprzętu laboratoryjnego w krótkim czasie. Protokół ten wykorzystuje hodowle 1 l w kolbach wstrząsowych, lizę komórek za pomocą sonikacji impulsowej oraz reakcje wsadowe na małą skalę w formacie 96- lub 384-dołkowym, aby zmaksymalizować zrównoleglenie i przepustowość badań przesiewowych. Długotrwała, trwała ekspresja białka jest możliwa dzięki suplementacji kwasu 3-fosfoglicerynowego (3-PGA) jako źródła energii^8,22,23. Po pomyślnym ukończeniu tego protokołu użytkownik będzie miał możliwość ekspresji pożądanego białka lub zestawu białek w formacie bezkomórkowym przy użyciu surowego ekstraktu komórkowego V. natriegens.

Zaczynając od glicerolu, surowe ekstrakty komórkowe V. natriegens są przygotowywane z komórek zebranych w gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) wynoszącej 1,0. Hodowla o pojemności 1 litra da około 2-3 ml ekstraktu, co wystarcza do przeprowadzenia ponad 800 reakcji bezkomórkowych przy 25% surowym ekstrakcie komórkowym. Białka mogą być wyrażane za pomocą plazmidowego DNA, liniowego DNA lub matrycy mRNA; jednak liniowa degradacja matrycy DNA przez endogenne nukleazy pozostaje główną wadą w przypadku stosowania dzikiego typu V. natriegens cell-free system⁹. Począwszy od kultur V. natriegens, białko nadające się do dalszych zastosowań może być osiągnięte przez jednego użytkownika w ciągu 1-2 pełnych dni.

Protokół

1. Przygotowanie surowych ekstraktów komórkowych V. natriegens – kultura bakteryjna

1. Przygotować bakteryjne pożywki wzrostowe V. natriegens LB-V2 zgodnie z tabelą 1. Wysterylizuj pożywkę wzrostową przez autoklawowanie. Poczekaj, aż nośnik osiągnie temperaturę pokojową (RT). Przechowuj nadmiar nośnika w RT.
   ostrożność: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i zapoznać się z instrukcjami specyficznymi dla laboratorium podczas obsługi autoklawu.
2. Użyj glicerolu z dzikimi natriegenami typu V, aby zaszczepić 3 ml pożywki LB-V2. Rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
3. Przepłukać 1 ml nocnej kultury przez odwirowanie przy 10 600 x g na wirówce stołowej przez 1 minutę. Odessać supernatant bez naruszania powstałego osadu i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki LB-V2.
4. Do autoklawowanej 4-litrowej kolby Erlenmeyera z przegrodą i sterylną pokrywą dodać 1 l świeżej pożywki wzrostowej LB-V2. Zaszczepić przy użyciu 1 ml przemytej kultury przez noc (stosunek rozcieńczenia 1:1,000). Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
   UWAGA: Kultury V. natriegens można skalować w górę lub w dół, zachowując stosunek rozcieńczenia 1:1,000. Na przykład, dodać 250 μl przemytej kultury przez noc do 250 ml świeżej pożywki wzrostowej LB-V2 w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodą o pojemności 2 litrów ze sterylną pokrywą.
5. Monitorować OD₆₀₀ w kulturze za pomocą spektrofotometru. Gdy kultura osiągnie OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, zbieraj kulturę przez odwirowanie w temperaturze 3 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Umieść granulat na lodzie.
   UWAGA: V. natriegens rośnie szybko, dlatego konieczne jest ścisłe monitorowanie kultury. Wzrost do OD₆₀₀ = 1,0 powinien zająć około 1,5-2 h przy stosunku rozcieńczenia 1:1,000.
6. Odessać supernatant i natychmiast przechowywać powstały osad bakteryjny w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przystąpić do lizy komórek opisanej w sekcji 2.
   nuta: Ten krok jest dobrym punktem zatrzymania; Zaleca się jednak, aby pelety zostały przetworzone natychmiast lub w ciągu 1-2 dni, aby uzyskać najlepsze wyniki.

2. Przygotowanie surowych ekstraktów komórkowych V. natriegens – Liza komórek

1. Przygotować bufor do lizy S30 zgodnie z tabelą 1 w sterylnej wodzie dejonizowanej (DI) i dostosować pH do 7,7 za pomocą lodowatego kwasu octowego.
   ostrożność: Z lodowatym kwasem octowym należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas regulacji pH.
2. Schłodzić bufor do lizy S30 do około 4 °C w lodówce lub na lodzie przed rozpoczęciem procedury lizy komórek.
   nuta: W celu szybkiego schłodzenia bufor do lizy można umieścić w temperaturze -20 °C. Nie pozwól, aby bufor zamarł.
3. Umieść granulki komórkowe na lodzie na 10-20 minut lub do całkowitego rozmrożenia. Ponownie zawiesić wszystkie osady powstałe z tej samej 1 l kultury za pomocą 10 ml zimnego buforu do lizy S30, a następnie przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml. Jeśli granulki nie zostaną zamrożone w zamrażarce w temperaturze -80 °C w kroku 1.6, należy przejść bezpośrednio do zaparcia.
   nuta: Zwiększ objętość buforu do lizy S30 używanego do początkowego ponownego zawieszania granulek w razie potrzeby.
4. Odwirować zawiesinę o sile 3 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu. Umyj osad po raz drugi za pomocą 10 ml zimnego buforu do lizy S30. Umieść pellet na lodzie.
5. W chłodni dodaj 500 μl zimnego buforu do lizy S30 do osadu w probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze ponownie zawiesić osad i ostrożnie przenieść całą zawiesinę granulek do probówki o pojemności 2 ml.
   nuta: Jeśli pipeta o szerokim otworze nie jest dostępna, użyj nożyczek, aby przeciąć koniec końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby zwiększyć otwór do przenoszenia granulek.
   1. Przenieść jak najwięcej osadu bez znacznego zwiększania objętości; jednakże osad powinien być ponownie zawieszony w wystarczającej ilości płynu, aby mógł być poddany sonikacji, jak wskazuje jednorodna zawiesina w probówce o pojemności 2 ml. Nie przepełniaj probówki o pojemności 2 ml. Zawiesina nie powinna przekraczać 1,5 ml; W razie potrzeby podziel na wiele rurek.
6. Trzymaj osad komórkowy na lodzie i pracuj w chłodni. Napełnij zlewkę o pojemności 600 ml lodem i umieść na niej uchwyt na probówkę o pojemności 2 ml.
   nuta: Pomocne jest umieszczenie uchwytu probówki blisko boku zlewki, tak aby zawiesina granulek była widoczna w lodzie w celu monitorowania postępu sonikacji (patrz Rysunek 1).
7. Zawisnąć na krótko w probówce o pojemności 2 ml, aby ujednorodnić komórki, przesunąć probówki, aby usunąć wszelkie komórki na spodzie nasadki i umieścić w uchwycie probówki z otwartą nasadką. Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny tak, aby znajdowała się tuż pod powierzchnią cieczy.
8. Przygotuj zestaw do sonikacji, jak pokazano na Rysunek 2, używając sonikatora i sondy o średnicy końcówki 1/8 cala. Wprowadź następujące ustawienia do sterownika sonikatora: częstotliwość 20 kHz i amplituda 50%, czas włączenia impulsu: 10 s, czas wyłączenia impulsu: 60 s.
9. Uruchom protokół sonizacji impulsowej przez trzy cykle. Jeżeli całkowita objętość zawiesiny granulek wynosi > 500 μl, należy uruchomić protokół sonizacji impulsowej sześć razy.
   >nuta: Ogólnie rzecz biorąc, 3-6 impulsów jest wystarczających do lizy osadów V. natriegens; W zależności od sonikatora mogą być wymagane dodatkowe impulsy. Podczas sonikacji użyj platformy pokrętła regulacyjnego, aby przesunąć sondę w górę iw dół, aby zlizować wszelkie osady, które mogły osiąść na dnie rurki. Rurkę można wyjąć z uchwytu i na krótko zawirować w celu ponownej homogenizacji zawiesiny między impulsami. Zobacz poniższą dyskusję, aby uzyskać pożądaną konsystencję sonikowanych komórek.
   ostrożność: Nosić odpowiednią ochronę słuchu, gdy sonikator jest aktywny.
10. Po sonikacji odwirować surowy ekstrakt komórkowy przy 16 000 x g przez 30−45 minut w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy lizat będzie wolny od jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych, jak pokazano na Rysunek 3.
W chłodni przelać
11. 50 μl powstałych supernatantów do nowych probówek o pojemności 2 ml bez naruszania osadu.
    UWAGA: Wszelkie zanieczyszczenia, które zostaną przypadkowo przeniesione do nowych probówek o pojemności 2 ml, drastycznie zmniejszą zdolność ekstraktu do syntezy białek o wysokiej wydajności.
    1. Opcjonalnie należy odłożyć 10 μl ekstraktu komórkowego do ilościowego oznaczania białka po lizie w oddzielnej probówce o pojemności 2 ml (patrz krok 2.13 poniżej).
12. Błyskawiczne zamrażanie surowych ekstraktów komórkowych poprzez umieszczenie probówek w uchwycie probówki z przymocowanym sznurkiem do zanurzania, jak pokazano na Rysunek 4. Zanurz probówki w Dewarze zawierającym ciekły azot i natychmiast umieść w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    ostrożność: Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej do pracy z ciekłym azotem, w tym fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych, osłony twarzy, fartucha kriogenicznego i rękawic.
13. Opcjonalnie określić ilościowo całkowite białko lizatu komórkowego przy użyciu 10 μl odłożonych na bok z kroku 2.11.1, rozcieńczając próbkę 1:100 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i stosując dowolny standardowy test oznaczania ilościowego białka całkowitego, taki jak test Bradforda, test kwasu bicinchoninowego (BCA) itp.

3. Przygotowanie bezkomórkowych składników reakcji

1. Ogólne składniki reakcji
   1. Przygotować zapasy robocze Mg-glutaminianu i K-glutaminianu w probówkach o pojemności 50 ml ze sterylną wodą demineralizowaną o stężeniach odpowiednio 100 mM i 2000 mM.
   2. Przygotować zapas roboczy z 50% (w/v) glikolu polietylenowego (PEG)-8000, dodając 100 ml sterylnej wody demineralizowanej do zlewki o pojemności 250 ml. Umieść małe mieszadło magnetyczne w zlewce. Odważyć 50 g PEG-8000 i dodać do 100 ml wody w zlewce.
   3. Umieścić zlewkę na rozgrzanej płytce mieszającej ustawionej na 100 °C i mieszać z prędkością 250 obr./min, aż PEG-8000 znajdzie się w roztworze. Poczekaj, aż płynna mieszanina PEG-8000 ostygnie przed przelaniem do probówek o pojemności 50 ml.
2. Główny miks rozwiązań energetycznych
   1. Przygotować 5 M roztwór KOH, dodając 140 g granulek KOH do 500 ml sterylnej wody DI.
      ostrożność: Przygotuj ten roztwór w kapturze chemicznym i noś środki ochrony osobistej podczas pracy z mocnymi zasadami. Roztwór stanie się gorący, więc nakrętka butelki musi być luźna, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia. Przed użyciem poczekaj, aż roztwór KOH dotrze do RT.
   2. Przygotuj bufor 1750 mM HEPES-KOH, dodając 20,85 g HEPES do butelki o pojemności 100 ml. Powoli dodawaj sterylną wodę DI, aż objętość osiągnie 40 ml. Butelka Vortex do rozpuszczenia HEPES. Użyj 5 M roztworu KOH, aby dostosować pH do 8,0, a następnie doprowadzić objętość roztworu do 50 ml.
      ostrożność: Z KOH należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas regulacji pH.
   3. Przygotować pozostałe 10 składników podstawowych Energy Master Mix w stężeniach wskazanych w Tabeli 2 w sterylnej wodzie DI i umieścić każdy bulion na lodzie. Rozmrozić 100 mM ZAPASÓW ATP, GTP, CTP i UTP w temperaturze pokojowej i umieścić na lodzie.
      nuta: W razie potrzeby można użyć termomiksera ustawionego na 37 °C i 350 obr./min do rozpuszczenia odczynników w roztworze. Nie przegrzewaj ani nie pozostawiaj odczynników na termomikserze przez dłuższy czas.
   4. Do probówki o pojemności 15 ml dodać każdy składnik mieszanki głównej roztworu energetycznego zgodnie z kolejnością i objętością określonymi w tabeli 2. Zmieszaj roztwór po dodaniu każdego składnika. Pozwoli to uzyskać 5 ml 10-krotnej mieszanki głównej roztworu energetycznego.
   5. Podzielić 10-krotną mieszankę wzorcową roztworu energetycznego na 200 μl porcji w probówkach o pojemności 2 ml. Błyskawiczne zamrożenie każdej podwielokrotności zgodnie z instrukcją wykonania w kroku 2.12. Natychmiast umieść je w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
3. Główna mieszanka aminokwasów
   1. Aby przygotować świeżą mieszankę 4x aminokwasów głównych, zacznij od rozmrożenia każdego zapasu aminokwasów w temperaturze pokojowej, a następnie umieść każdy z nich na lodzie. Użyj mieszalnika wirowego i/lub termomiksera ustawionego na 37 °C i 350 obr./min, aby upewnić się, że wszystkie zapasy aminokwasów są całkowicie rozpuszczone.
      nuta: Cysteina może nie rozpuścić się całkowicie; Może być dodawany do głównej mieszanki aminokwasów w postaci zawiesiny. Nie przegrzewaj ani nie pozostawiaj odczynników na termomikserze przez dłuższy czas.
   2. W probówce o pojemności 15 ml dodaj aminokwasy o odpowiedniej objętości do sterylnej wody DI, tak aby końcowe stężenie każdego z nich wynosiło 8 mM w następującej kolejności: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU i CYS. Po dodaniu każdego aminokwasu zmieszaj roztwór mieszanki głównej. Objętości wymienione w Tabeli 2 będą stanowić 2,4 ml głównej mieszanki aminokwasów.
   3. Podzielić 4x główną mieszankę aminokwasów na 200 μl porcji w probówkach o pojemności 2 ml. Błyskawiczne zamrożenie każdej podwielokrotności zgodnie z instrukcją wykonania w kroku 2.12. Natychmiast umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
4. Wytwarzanie gotowej do reakcji matrycy DNA plazmidu
   nuta: Ekspresja białek bezkomórkowych w tym systemie została zoptymalizowana przy użyciu wektora ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) T7-pJL1-sfGFP (Tabela materiałów). Zaleca się stosowanie tego plazmidu jako kontroli wydajności reakcji bezkomórkowej oraz szkieletu pJL1 do klonowania i ekspresji innych sekwencji białkowych. Można użyć innych plazmidowych matryc DNA; jednak ważne jest, aby pamiętać, że transkrypcja jest kontrolowana przez sekwencję promotora T7 i obecność polimerazy RNA T7. Prosty protokół produkcji na dużą skalę dowolnej matrycy plazmidowego DNA z przekształconej E. coli opisano poniżej.
   1. Oczyść żądany wektor za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcją producenta (tabela materiałów).
      UWAGA: Zaleca się maksymalne zagęszczenie matrycy DNA plazmidu, aby spełnić ścisłe ograniczenia objętościowe reakcji bezkomórkowej. Ogólnie rzecz biorąc, należy dążyć do zapasu roboczego o pojemności 750−1500 ng/μl.
5. Wytwarzanie gotowej do reakcji matrycy mRNA
   nuta: Ta sekcja jest opcjonalna. Ekspresję białka badano przy użyciu matrycy mRNA wygenerowanej z transkrypcji in vitro plazmidu T7-pJL1-sfGFP przez wymienioną polimerazę RNA T7 (tabela materiałów).
   1. Przygotować matrycę mRNA z plazmidowego DNA kodującego interesujące białko przy użyciu składników reakcji transkrypcji in vitro w tabeli 3. Inkubować reakcje przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
      nuta: Zaleca się wykonywanie 8-10 razy więcej tych reakcji równolegle, aby wytworzyć wystarczającą ilość materiału.
   2. Zbierz wszystkie reakcje transkrypcji. Oczyść za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora mRNA zgodnie z instrukcją producenta (tabela materiałów). Eluować matrycę mRNA do sterylnej wody DI. Przechowuj matrycę mRNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

4. Przeprowadzanie reakcji eekspresji białek bezkomórkowych przy użyciu surowego ekstraktu V. natriegens

1. Bezkomórkowa ekspresja białek przy użyciu plazmidu lub liniowej matrycy DNA
   1. Wyjmij 10 porcji głównej mieszanki roztworu energetycznego i 4 porcje głównej mieszanki aminokwasów z zamrażarki -80 °C, rozmrozić w temperaturze pokojowej i umieścić na lodzie. Wyjmij zapasy polimerazy RNA T7 i inhibitora RNazy z zamrażarki w temperaturze -20 °C i umieść na lodzie. Rozmrozić matrycę DNA w RT i umieścić na lodzie.
   2. Przygotować bezkomórkową mieszaninę wzorcową reakcji zgodnie z tabelą 4, dodając każdy składnik w następującej kolejności do probówki o pojemności 2 ml na lodzie: główna mieszanka aminokwasów, główna mieszanina roztworu energetycznego, Mg-glutaminian, K-glutaminian, matryca DNA, PEG-8000, polimeraza RNA T7 i inhibitor RNazy. Delikatnie przesuwaj probówkę po każdym dodaniu do mieszanki głównej.
      nuta: Jeśli matryca liniowa ma być użyta do ekspresji białka bezkomórkowego, dodaj 5-10 razy więcej materiału w porównaniu z matrycą plazmidową, aby uzyskać znaczne plony białka.
   3. Usunąć surowy lizat komórkowy V. natriegens przygotowany w kroku 2.12 z zamrażarek o temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie na 10-20 minut do rozmrożenia. Dodać odpowiednią objętość surowego ekstraktu komórkowego do bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji, zgodnie z tabelą 4 i delikatnie wymieszać, przesuwając lub pipetując w górę i w dół.
   4. Końcowa ekspresja białek bezkomórkowych za pomocą termocyklera
      1. Odpipetować 10 μl bezkomórkowej mieszaniny wzorcowej reakcji na dno 96- lub 384-dołkowej płytki do PCR. Pomiędzy każdym przeniesieniem na płytkę PCR, wymieszaj mieszankę główną, delikatnie przesuwając probówkę.
         nuta: Bezkomórkowa mieszanka wzorcowa reakcji powinna być dobrze wymieszana przez cały czas, aby zmaksymalizować odtwarzalność reakcji i ekspresję białka bezkomórkowego we wszystkich próbkach.
   5. Krótko odwirować płytkę o stężeniu 1 000 x g przez 10 sekund, aby zebrać wszelkie mieszanki wzorcowe, które mogły utknąć po bokach studzienek. Uszczelnij studzienki klejem do płytek, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieść płytkę PCR w termocyklerze ustawionym na 26 °C z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 °C.
      nuta: Równomierne rozprowadzanie ciepła i podgrzewana pokrywa termocyklera znacznie poprawiają wydajność ekspresji białka.
   6. Inkubować reakcje bezkomórkowe przez co najmniej 3 godziny. Po inkubacji ekspresja białek może zostać oczyszczona, oznaczona ilościowo i wykorzystana w dalszych procesach.
      nuta: Ekspresję białek można bezpośrednio określić ilościowo w reakcji bezkomórkowej przy użyciu metody wybranej przez użytkownika. Na przykład białka fluorescencyjne można określić ilościowo za pomocą zewnętrznej krzywej wzorcowej lub można zmierzyć radioaktywność, jeśli używa się znakowanego radioaktywnie aminokwasu w reakcji bezkomórkowej. Spektroskopia w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV lub testy białka całkowitego generalnie nie są zalecane do bezpośredniego pomiaru produkcji białek w reakcjach bezkomórkowych bez wstępnego oczyszczenia.
   7. Alternatywnie, monitoruj kinetykę ekspresji białek bezkomórkowych za pomocą czytnika płytkowego.
      1. Odpipetować 10 μl bezkomórkowej mieszaniny wzorcowej reakcji na dno czarnej 384-dołkowej płytki testowej z przezroczystym szklanym dnem. Przechowywać płytkę testową na lodzie lub pracować w chłodni podczas dodawania mieszanki wzorcowej, aby zapewnić uzyskanie pełnego profilu kinetycznego. Uszczelnić studzienki przezroczystym klejem do płytek, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieścić płytkę testową w czytniku płytek ustawionym na 26 °C.
   8. Inkubować reakcje bezkomórkowe przez 3-6 godzin, monitorując odpowiednie długości fal wzbudzenia/emisji fluorescencji odpowiadające ekspresji białka. Na przykład monitor przy Ex/Em = 485 nm/528 nm dla sfGFP.
2. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu matrycy mRNA
   1. Rozmrozić matrycę mRNA przygotowaną w kroku 3.5.2 w RT i umieścić na lodzie.
   2. Wykonaj kroki od 4.1.1 do 4.1.6, jak określono wcześniej dla liniowej lub plazmidowej matrycy DNA, korzystając z tabeli 4, aby przygotować alternatywną, bezkomórkową mieszankę wzorcową reakcji dla matrycy mRNA.

5. Kalibracja V. natriegens Reakcje bezkomórkowe z sfGFP

UWAGA: Ta sekcja jest opcjonalna. Optymalne stężenie jonów reakcyjnych bez komórek może się nieznacznie różnić dla każdego surowego preparatu ekstraktu w zależności od warunków stosowanych do lizy komórek. Rozważ wykonanie opcjonalnego protokołu kalibracji jonów reakcyjnych bez komórek opisanego poniżej przy użyciu sfGFP, jeśli wydajność reakcji jest znacznie niższa niż oczekiwano (stężenia < 1,0 μg/ml).

1. Przygotować roztwory kalibracyjne jonów^Mg2+ i K⁺, jak określono w tabeli 5, w sterylnej wodzie demineralizowanej z zapasów 100 mM Mg-glutaminianu i 2 000 mM K-glutaminianu przygotowanych w kroku 3.1.1. Roztwory kalibracyjne należy umieszczać na lodzie, aż będą potrzebne.
2. Postępując zgodnie z mapą kalibracyjną w Tabeli 6, odpipetować 1 μl roztworów kalibracyjnych jonów Mg-glutaminianu i 2 μl roztworów kalibracyjnych jonów K-glutaminianu do odpowiednich studzienek na 384-dołkowej płytce PCR.
   1. Kolejność operacji na tym etapie jest następująca: Odpipetować roztwór kalibracyjny jonów Mg-glutaminianu na dno każdej studzienki, a następnie roztwór kalibracyjny jonów K-glutaminianu na bok studzienki, nie dotykając cieczy już obecnej w studzienkach.
   2. Uszczelnij studzienki, umieszczając klej na wierzchu płytki, aby zapobiec parowaniu podczas przygotowywania wzorcowej mieszanki reakcyjnej bez komórek kalibracyjnych. Delikatnie postukaj w płytkę 384-dołkową, aby wymieszać roztwory kalibracyjne glutaminianu Mg i K.
      nuta: Pipeta powtarzalna jest wysoce zalecana, aby wykonać ten etap w sposób powtarzalny i szybki.
3. Przygotować wzorcową mieszaninę wzorcową reakcji bez komórek kalibracyjnych, jak określono w tabeli 5, używając matrycy plazmidowego DNA T7-pJL1-sfGFP w probówce o pojemności 2 ml. Dodaj każdy składnik w następującej kolejności do mieszanki głównej: główna mieszanka aminokwasów, główna mieszanka roztworu energetycznego, matryca DNA T7-pJL1-sfGFP, PEG-8000, polimeraza RNA T7 i inhibitor RNazy. Delikatnie przesuwaj probówkę, aby wymieszać po każdym dodaniu składnika.
   nuta: Nie dodawaj Mg²⁺ ani K⁺ do wzorcowej mieszanki kalibracyjnej bez komórek.
4. Usuń klej z płytki. Ostrożnie odpipetować 7 μl wzorcowej mieszaniny wzorcowej do reakcji bez komórek kalibracyjnych na boki studzienek, nie dotykając roztworu kalibracyjnego zmieszanych jonów już obecnego w studzienkach. Ponownie uszczelnij studzienki klejem i delikatnie postukaj w 384-dołkową płytkę do PCR, aby wymieszać bezkomórkową mieszankę wzorcową z roztworem do kalibracji jonów.
   nuta: Pipeta powtarzalna jest wysoce zalecana, aby wykonać ten etap w sposób powtarzalny i szybki.
5. Krótko odwirować płytkę 1,000 x g przez 10 s, aby zebrać niezmieszaną ciecz, która mogła utknąć po bokach studzienek. Umieścić płytkę 384-dołkową w termocyklerze ustawionym na temperaturę 26 °C z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 °C.
6. Inkubować reakcje bezkomórkowe przez 3 godziny. Po inkubacji przenieść zawartość każdej studzienki na czarną 384-dołkową płytkę testową ze szklanym dnem za pomocą wielokanałowej pipety i odczytać fluorescencję sfGFP przy Ex/Em = 485 nm/528 nm za pomocą czytnika płytek w celu określenia kombinacji stężeń jonów, która daje największą ilość białka.

Wyniki

Opisany protokół produkcji białek przy użyciu bezkomórkowego systemu ekspresji V. natriegens może być wykonany w ciągu 1−2 dni przez jednego użytkownika, począwszy od inokulacji kultury do białka dostępnego do dalszych zastosowań. Przygotowanie surowych ekstraktów komórkowych i mieszanek głównych stanowi znaczną część tego czasu; jednak po przygotowaniu większość odczynników luzem może być przechowywana przez długi czas (Tabela 7) i używana w razie potrzeby, co skraca czas potrzebny na wypełnienie protokołu.

Opisany system ekspresji najlepiej stosować z matrycą plazmidowego DNA lub mRNA generowanym przez reakcje transkrypcyjne in vitro. Chociaż liniowe DNA może być również używane jako matryca do produkcji białka, daje znacznie mniejszą ilość białka. Na przykład, w optymalnych warunkach reakcji w temperaturze 26 °C, pojedyncza reakcja bezkomórkowa o objętości 10 μl może wytworzyć > 260 μg / ml sfGFP w ciągu 3 godzin przy użyciu 0,3 pmol matrycy DNA plazmidu lub porównywalną > 125 μg / ml sfGFP przy użyciu 14 pmol transkryptu mRNA (Figura 5A, B). Jednak 0,3 pmol liniowego DNA wytworzy znacznie mniej białka (< 20 μg/ml). Dla każdego typu matrycy większość białka zostanie wyprodukowana w ciągu 1-1,5 godziny; Zaleca się jednak, aby reakcja trwała co najmniej 3 godziny. Stężenia sfGFP w reakcji bezkomórkowej oznaczono za pomocą regresji liniowej przy użyciu oczyszczonej krzywej wzorcowej sfGFP mierzącej fluorescencję przy Ex/Em = 485 nm/528 nm.

Na wydajność produkcji białka znacząco wpływa stężenie jonów potasu i magnezu (odpowiednio K⁺ i^Mg2+). W zoptymalizowanych warunkach stwierdzono, że optymalne stężenia jonów Mg²⁺ i K⁺ wynoszą odpowiednio 3,5 mM i 80 mM (Rysunek 6A,B). Odchylenia od optymalnych stężeń jonów mogą skutkować zmniejszoną zdolnością bezkomórkowego systemu ekspresji do wytwarzania białka ze znaczną wydajnością. Dodatkowa kalibracja może być konieczna, jeśli wydajność reakcji jest znacznie niższa niż oczekiwano. Opcjonalny protokół kalibracji jonów opisano w punkcie 5. Pozwala to na pewną elastyczność w kompensacji zmienności surowego ekstraktu komórkowego wynikającej z poszczególnych urządzeń i warunków lizy komórek.

Rysunek 1: Zbliżenie na zlewkę i uchwyt probówki na platformie sonizacyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja sprzętu sonifikacyjnego do przygotowania surowego ekstraktu komórkowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Widok osadu po sonikacji i odwirowaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zanurzenie do zamrażania błyskawicznego w celu przechowywania ekstraktu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Reprezentatywne wyniki dla syntezy białek bezkomórkowych V. natriegens przy użyciu różnych typów matryc. (A) test końcowy produkcji sfGFP przy użyciu równomolowych stężeń plazmidu i liniowej matrycy DNA (0,3 pmol), a także rosnących stężeń matrycy mRNA. Stężenie sfGFP w bezkomórkowych oznaczeniach oznaczono za pomocą krzywej wzorcowej oczyszczonego sfGFP mierzonej przy Ex/Em = 485 nm/528 nm po 180 minutach inkubacji w temperaturze 26 °C w optymalnych warunkach reakcji w objętościach 10 μL. (B) Test kinetyczny produkcji sfGFP przy użyciu równomolowych stężeń plazmidu i liniowej matrycy DNA, a także zwiększania stężeń matrycy mRNA. Pomiary sfGFP wykonywano co 3 minuty przy Ex/EM = 485 nm/528 nm przez 180 minut całkowitego czasu inkubacji w optymalnych warunkach reakcji w objętościach 10 μL. Zarówno w przypadku testów końcowych, jak i kinetycznych, próbki skorygowano ślepą próbą przy użyciu reakcji bezkomórkowych uzupełnionych wszystkimi składnikami z wyjątkiem matrycy. Pokazana jest średnia i odchylenia standardowe (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki kalibracji stężenia jonów. (A) Reakcje bezkomórkowe V. natriegens uzupełniono zwiększającymi stężeniami^Mg2+ i inkubowano w temperaturze 26 °C przez 180 minut w reakcjach 10 μl. Całkowite stężenie K⁺ wynosiło 160 mM dla wszystkich stężeń^Mg2+. Stężenie sfGFP w bezkomórkowych badaniach oznaczono za pomocą standardowej krzywej oczyszczonego sfGFP mierzonej przy Ex/Em = 485 nm/528 nm. (B) Reakcje bezkomórkowe V. natriegens uzupełniono zwiększającymi stężeniami K⁺ i inkubowano w temperaturze 26 °C przez 180 minut w reakcjach 10 μl. Całkowite stężenie^Mg2+ wynosiło 3,5 mM dla wszystkich stężeń K⁺. W obu kalibracjach próbki zostały skorygowane ślepą próbą przy użyciu reakcji bezkomórkowych uzupełnionych wszystkimi składnikami z wyjątkiem matrycy. Pokazana jest średnia i odchylenia standardowe (n = 3). Ten rysunek został zmodyfikowany z Wiegand et al.⁹. Przedruk za zgodą Wieganda, D.J., Lee, H.H., Ostrov, N., Church, G.M. Ustanawianie systemu ekspresji Vibrio natriegens bez komórek. ACS Biologia syntetyczna. 7 (10), 2475−2479 (2018). Prawa autorskie 2018 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. pkt. Rozdział Rozdział

Tabela 1 A	Przygotowanie pożywki do hodowli bakterii LB-V2
składnik	Ilość (g)	Stężenie końcowe (mM)	Objętość końcowa (L)
Rosół LB (młynarz)	25		1
Zawartość NaCl	Godzina 11.69	200
MgCl2	Godzina 2,20	Rozdział 23,1
Kcl	0,31	Rozdział 4.2
Tabela 1 B	Przygotowanie buforu do lizy S30A
składnik	Ilość (g)	Stężenie końcowe (mM)	Objętość końcowa (L)
Roztwór Tris (pH 8,0) - 1 M (ml)*	25	50	0.5
Mg-glutaminian	Wynik 2,72	14
K-glutaminian	6.10	60
Ditionitreitol (DTT) - 1 M (ml)*	1	cyfra arabska

Tabela 1: Odczynniki do przygotowania 1 L pożywki bakteryjnej LB-V2 i 0,5 L buforu do lizy komórek S30A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik w Excelu. 

szt. zł szt. zł szt. zł ( szt. zł szt. zł szt. szt. szt. pkt. szt. TGL szt. szt. szt. zł zł pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. ) pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt.

	Przygotowanie 10x Mieszanki Głównej Roztworu Energetycznego
składnik	Stężenie zapasów (mM)	Stężenie końcowe (mM)	Ilość (μL)	Objętość końcowa (μL)
HEPES-KOH pH 8	Rok 1750	500	1428,57	5000
Atp	100	15	750,00
GTP (GTP)	100	15	750,00
Informacja o zgodności z umową	100	9	Z godziny 450,00
Utp	100	9	Z godziny 450,00
tRNA z E. coli MRE 600 (mg/mL)*	100	cyfra arabska	Godzina 100,00
Hydrat koenzymu A	200	2.6	o godz. 65,00
NAD	200	3.3	82,50
obóz	650	7,5	Klasa 57,69
Kwas folinowy	100	0,7	godz. 35.00
spermidyna	1600	10	Godzina 31,25
3-PGA (pol.	Rok 2000	300	750,00
Sterylna woda dejonizowana			Z dnia 49,99
	Przygotowanie 4x Aminokwasowej Mieszanki Głównej
składnik	Stężenie zapasów (mM)	Stężenie końcowe (mM)	Ilość (μL)	Objętość końcowa (μL)
Ala	Rozdział 168	8	114,3	2400
Arg	Rozdział 168	8	114,3
Asn	Rozdział 168	8	114,3
Asp	Rozdział 168	8	114,3
Numer gln	Rozdział 168	8	114,3
Jednostka GLU	Rozdział 168	8	114,3
GLY	Rozdział 168	8	114,3
jego	Rozdział 168	8	114,3
Iie	Rozdział 168	8	114,3
Lys	Rozdział 168	8	114,3
Spełnione	Rozdział 168	8	114,3
PHE (Organizacja Zdrowia	Rozdział 168	8	114,3
pro	Rozdział 168	8	114,3
SER	Rozdział 168	8	114,3
THR	Rozdział 168	8	114,3
Val	Rozdział 168	8	114,3
Trp	Rozdział 168	8	114,3
Tyr	Rozdział 168	8	114,3
Mołdawski	140	8	137,1
CYS (CYS)	Rozdział 168	8	114,3
Sterylna woda dejonizowana			91,4

Tabela 2: Odczynniki do przygotowania 5 ml 10x roztworu energetycznego master mix i 2,4 ml 4x aminokwas master mix. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik w Excelu.

Rozdział szt. szt. ( szt. szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt. szt.

	T7 Polimeraza RNA w reakcjach transkrypcji in vitro
składnik	Stan magazynowy (mM)	Stężenie końcowe (mM)	Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 50x Reakcje
10x Bufor reakcyjny RNAPol			godz. 1.00	50
Atp	100	0,5	0,10	5
GTP (GTP)	100	0,5	0,10	5
Informacja o zgodności z umową	100	0,5	0,10	5
Utp	100	0,5	0,10	5
Matryca DNA (ng/μL)*	1000	500	0,50	25
Polimeraza RNA T7	200	2.6	Godzina 2.00	100
Inhibitor rnazy, mysi	200	3.3	0,50	25
Sterylna woda dejonizowana			godz. 15.60	780
Objętość reakcyjna (μL):	20

Tabela 3: Składniki transkrypcji in vitro do generowania mRNA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik w Excelu.

szt. pkt. pkt. szt. szt. pkt. Rozdział pkt. pkt. szt. pkt. pkt. szt. Rozdział pkt. pkt.

	Bezkomórkowy Mistrz Reakcji
składnik	Stężenie zapasów (mM)	Stężenie końcowe (mM)	Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 50x Reakcje
Ekstrakt (%)*		25	Godzina 2,50	godz. 125,00
Mg-glutaminian	100	3,5	0,35	godz. 17.50
K-glutaminian	Rok 2000	Rozdział 80	0,40	godz. 20.00
4x Mistrzowska Mieszanka Aminokwasów	8,0	cyfra arabska	Godzina 2,50	godz. 125,00
10x Miks Główny Rozwiązania Energetycznego			godz. 1.00	Godzina 50.00
Plazmidowe DNA (ng/μL)*	1000	500	0,50	godz. 25.00
50% PEG-8000 (%)*	50	cyfra arabska	0,40	godz. 20.00
Polimeraza RNA T7			godz. 1.00	Godzina 50.00
Inhibitor RNazy, mysi			0,10	Godzina 5.00
Sterylna woda dejonizowana			Wydanie orzeczenia 1,25	62,50
Objętość reakcyjna (μL):	10
	Alternatywna bezkomórkowa mieszanka wzorcowa reakcji dla szablonu mRNA
składnik	Stężenie zapasów (mM)	Stężenie końcowe (mM)	Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 50x Reakcje
Ekstrakt (%)*		25	Godzina 2,50	godz. 125,00
Mg-glutaminian	100	3,5	0,35	godz. 17.50
K-glutaminian	Rok 2000	Rozdział 80	0,40	godz. 20.00
4x Mistrzowska Mieszanka Aminokwasów	8,0	cyfra arabska	Godzina 2,50	godz. 125,00
10x Miks Główny Rozwiązania Energetycznego			godz. 1.00	Godzina 50.00
Matryca mRNA (ng/μL)*	Rok 2000	4000	Godzina 2.00	Godzina 100,00
50% PEG-8000 (%)*	50	cyfra arabska	0,40	godz. 20.00
Inhibitor RNazy, mysi			0,10	Godzina 5.00
Sterylna woda dejonizowana			0,75	Godzina 37,50
Objętość reakcyjna (μL):	10

Tabela 4: Składniki zoptymalizowanej mieszanki V. natriegens bezkomórkowej mieszanki wzorcowej dla matrycy DNA i matrycy mRNA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik w Excelu.

szt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. szt. szt. pkt. Rozdział szt. szt. pkt. pkt. Rozdział szt. szt. pkt. Rozdział pkt.

Mg2+ Kalibracja		Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 100x Reakcje	Ilość (μL) 100x Reakcje
Końcowy (mM)	skład	100 mM Mg-Glu	diH20	100 mM Mg-Glu	DejonizowanyH2O
Rozdział 2.5	0	0,00	godz. 1.00	0	100
3,5	1	0,10	0,90	10	90
Rozdział 4.5	cyfra arabska	0,20	0,80	20	Rozdział 80
Rozdział 5.5	3	0,30	0,70	Rozdział 30	70
Objętość reakcyjna (μL):	10
K+ Kalibracja		Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 100x Reakcje	Ilość (μL) 100x Reakcje
Końcowy (mM)	skład	2000 mM K-Glu	diH20	2000 mM K-Glu	DejonizowanyH2O
Rozdział 40	Rozdział 30	0,15	1,85	12	Rozdział 148
Rozdział 80	70	0,35	Rejon 1,65	28	Rozdział 132
160	150	0,75	Wydanie orzeczenia 1,25	60	100
320	Rozdział 310	1,55	0,45	124	36
Objętość reakcyjna (μL):	10
	Kalibracja jonowa Bezkomórkowa mieszanka wzorcowa reakcji
składnik	Stężenie zapasów (mM)	Stężenie końcowe (mM)	Ilość (μL) 1x Reakcja	Ilość (μL) 50x Reakcje
Ekstrakt (%)*		25	Godzina 2,50	godz. 125,00
Mg-glutaminian	zmienna	zmienna	godz. 1.00	Godzina 50.00
K-glutaminian	zmienna	zmienna	Godzina 2.00	Godzina 100,00
4x Mistrzowska Mieszanka Aminokwasów	8,0	cyfra arabska	Godzina 2,50	godz. 125,00
10x Miks Główny Rozwiązania Energetycznego			godz. 1.00	Godzina 50.00
Plazmidowe DNA (ng/μL)*	1000	Z kolei 250	0,25	godz. 12.50
50% PEG-8000 (%)*	50	cyfra arabska	0,40	godz. 20.00
Polimeraza RNA T7			godz. 1.00	Godzina 50.00
Inhibitor RNazy, mysi			0,10	Godzina 5.00
Sterylna woda dejonizowana			0,00	0,00
Objętość reakcyjna (μL):	10

Tabela 5: Wzorcowe mieszanki kalibracji stężenia jonów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik w Excelu.

Mapa kalibracji jonów CF		40 mM K+			80 mM K+			160 mM K+			320 mM K+
		1	cyfra arabska	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
2,5 mM Mg2+	ZA
3,5 mM Mg2+	W
4,5 mM Mg2+	Z
5,5 mM Mg2+	D

Tabela 6: Mapa kalibracji jonów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik w Excelu.

	Warunki przechowywania i okres trwałości komponentów CF
składnik	Miejsce przechowywania	Okres przydatności do spożycia
Sterylne podłoże wzrostowe LB-V2	4 °C	3-6 miesięcy
V. natriegens Surowy ekstrakt komórkowy	-80 °C	1-3 tygodnie
100 mM Mg-glutaminianu	Temperatura pokojowa	6 miesięcy
2000 mM K-glutaminianu	Temperatura pokojowa	6 miesięcy
50% PEG-8000	Temperatura pokojowa	6 miesięcy
10x Miks Główny Rozwiązania Energetycznego	-80 °C	3-6 miesięcy
4x Mistrzowska Mieszanka Aminokwasów	-80 °C	3-6 miesięcy
Plazmid/liniowa matryca DNA	-20 °C	6-12 miesięcy
Matryca mRNA	-80 °C	3-4 tygodnie

Tabela 7: Warunki przechowywania bez komórek i okres przydatności do spożycia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik w Excelu.

Dyskusja

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem natriegenów typu dzikiego i pożywek rozwojowych bakterii składających się z LB uzupełnionego solami V2 (Tabela materiałów). Inne szczepy V. natriegens mogą być hodowane w podobny sposób w celu wytworzenia surowych ekstraktów komórkowych do reakcji bezkomórkowych; Ich zastosowanie wymaga jednak dodatkowej optymalizacji tego protokołu. Dodatkowo, ten bezkomórkowy system ekspresji białek został zoptymalizowany przy użyciu kwasu 3-fosfoglicerynowego (3-PGA) jako podstawowego źródła regeneracji energii. Można stosować inne źródła odzyskiwania energii; Jednak optymalizacja odczynników i kalibracja będą prawdopodobnie wymagane do uzyskania wysokowydajnej ekspresji białka^10,11.

Zwrócenie szczególnej uwagi na kilka kluczowych etapów w tym protokole zapewni maksymalną wydajność ekstraktu w celu uzyskania wysokiej wydajności produkcji białek bezkomórkowych. Po pierwsze, surowy ekstrakt komórkowy musi być przygotowany z kultur komórkowych V. natriegens zebranych w środkowej fazie wykładniczej wzrostu; Wydajność białka jest maksymalna, gdy kultury osiągną OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2. Podczas gdy bezkomórkowa produkcja białek jest możliwa z komórek zebranych w różnym zakresie gęstości optycznej, wcześniej odkryliśmy, że komórki zebrane w wykładniczym stanie wzrostu dają znacznie więcej białka⁹. Zaobserwowany wpływ gęstości optycznej na wydajność surowego ekstraktu komórkowego jest zgodny z tymi zgłoszonymi dla innych bezkomórkowych systemów ekspresji pochodzących z komórek hodowanych w warunkach hodowli okresowej¹. Ponieważ V. natriegens rośnie w szybkim tempie, kluczowe znaczenie ma ścisłe monitorowanie gęstości optycznej kultur. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że kultury V. natriegens powinny w sposób powtarzalny osiągnąć OD₆₀₀ wynoszący 1,0 w ciągu 1−1,5 godziny przy użyciu tego protokołu; Jednak indywidualne warunki wzrostu, takie jak użycie kolb z przegrodami i bez przegrody, które wpływają na napowietrzenie, lub inkubacja powietrze kontra woda, która wpływa na szybkość i stabilność temperatury inkubacji, mogą zmienić czas wzrostu. Ponadto ogólnie zaleca się hodowlę co najmniej 250 ml V. natriegens w kolbie z przegrodami o pojemności 1 l, aby zapewnić osad o dużych komórkach podczas zbioru, co ułatwia manipulację i przenoszenie. To znacznie poprawia skuteczność przygotowania surowego ekstraktu komórkowego, a także zwiększa całkowitą objętość ekstraktu wytwarzanego z osadu. W przypadku stosowania preparatu na mniejszą skalę, warunki hodowli i odczynniki można odpowiednio dostosować. W przypadku fermentacji na dużą skalę może być wymagana dalsza optymalizacja warunków hodowli. Wreszcie, aby zapewnić wysoką wydajność białka, bardzo ważne jest, aby granulki komórkowe były przetwarzane natychmiast po zbiorze lub w ciągu 1-2 dni od przechowywania w temperaturze -80 °C.

Właściwa liza osadu komórkowego za pomocą sonikacji impulsowej ma kluczowe znaczenie dla powodzenia ekspresji białek bezkomórkowych i jest często najtrudniejszym aspektem tego protokołu dla nowych użytkowników. Zazwyczaj dobrze zlizowany granulat daje znaczną ilość płynnego ekstraktu, który jest wolny od zanieczyszczeń. Ekstrakt powinien być lekko lepki, ale można go łatwo pipetować podczas porcjowania do probówek do przechowywania przed błyskawicznym zamrożeniem w ciekłym azocie. Rysunek 3 przedstawia przedstawienie dobrze zlizywanego osadu (rysunek 3A) w porównaniu ze słabo zlizowanym osadem (rysunek 3B) po etapie wirowania po lizie. Główną wskazówką całkowitej lizy komórek jest całkowite stężenie białka w surowym ekstrakcie komórkowym > 20 mg/ml, określone za pomocą testu białka całkowitego (krok 2.13). Nadmierna sonikacja lub nadmierne podgrzanie surowego ekstraktu komórkowego spowoduje uszkodzenie maszynerii komórkowej, czego nie można określić bez przeprowadzenia reakcji bezkomórkowej. W związku z tym bardzo korzystne jest przetestowanie wydajności ekstraktu z reakcją kontrolną przed poświęceniem znacznej ilości czasu i wysiłku na dalsze zastosowania ekspresji białek. Chociaż dodatkowa optymalizacja może być konieczna dla różnych urządzeń do sonikacji, opisane etapy sonikacji impulsowej są wysoce powtarzalne w naszych rękach.

Zastosowanie liniowej matrycy DNA pochodzącej z amplifikacji PCR, trawienia enzymów restrykcyjnych lub komercyjnej syntezy genów może znacznie zwiększyć zdolność do wysokoprzepustowej i szybkiej produkcji białek w bezkomórkowych systemach ekspresji²⁴. Chociaż wykazano produkcję białka z amplifikowanej matrycy liniowej z amplifikacją PCR, wydajność tych reakcji jest około 13,5 razy niższa w porównaniu z reakcjami z użyciem matrycy plazmidowego DNA w proporcjach równomolowych⁹. Wynika to przede wszystkim z niestabilności liniowej matrycy DNA, która prawdopodobnie ulega degradacji przez endogenne nukleazy obecne w surowym ekstrakcie komórkowym V. natriegens. Podczas gdy białko lambda faga GamS było wcześniej używane do ochrony liniowej matrycy DNA^24,25, okazało się, że jest niekompatybilne z ekstraktami V. natriegens ⁹. Ponadto, podczas gdy zwiększenie stężenia liniowej matrycy DNA może pozwolić na wyższą wydajność białka, jego szybka degradacja w surowym ekstrakcie komórkowym nadal będzie poważnym problemem.

Rozwiązaniem problemu liniowej degradacji matrycy DNA może być uzupełnienie reakcji bezkomórkowych matrycą mRNA wygenerowaną z transkrypcji in vitro liniowego DNA. Z drugiej strony, zastosowanie inhibitora RNazy zapewnia znaczną ochronę przed degradacją transkryptu mRNA, a znaczne plony białka można uzyskać w 10 μl bezkomórkowej reakcji (ryc. 5A,B). Klonowanie liniowego DNA do okrągłej matrycy poprzez ligację TA, klonowanie TOPO, montaż Golden Gate lub inne metody rekombinacji mogą być stosowane w celu obejścia degradacji matrycy. Niemniej jednak konieczne będą dalsze podejścia do hamowania aktywności nukleazy w celu efektywnej ekspresji białek przy użyciu liniowej matrycy DNA.

Do tej pory zaproponowano kilka różnych podejść do przygotowania surowego ekstraktu do bezkomórkowej ekspresji białek 9,10,11,26. Opracowując ten protokół, staraliśmy się zmaksymalizować dostępność dla użytkowników, obniżyć ogólne koszty i zminimalizować czasochłonne kroki. Na przykład, wysoka wydajność białka jest osiągana przy użyciu prostego, dwuetapowego procesu sonikacji-wirowania i nie wymaga homogenizatorów komórkowych, długich etapów dializy ani reakcji spływu. Jest prosty do wykonania w krótkim czasie i nie wymaga wysokiego poziomu wiedzy laboratoryjnej. W związku z tym może ułatwić ekspresję bezkomórkową jako standard dla translacyjnych badań akademickich i projektowania procesów przemysłowych.

Protokół ten rozszerza zestaw narzędzi dostępnych do badania i użyteczności V. natriegens, niemodelowego organizmu o unikalnych właściwościach biologicznych. Wyższą wydajność białka można osiągnąć poprzez zastosowanie pół- lub w pełni ciągłych reakcji bezkomórkowych, aby umożliwić regenerację energii, ponowne dostarczenie aminokwasów i usunięcie produktów przemiany materii ^3,5,27. Co więcej, inżynieria V. natriegens typu dzikiego w celu wytwarzania szczepów z niedoborem DNAse lub RNAse, usunięcie szkodliwych i konkurencyjnych szlaków metabolicznych oraz ekspresja dodatkowych tRNA może znacznie zwiększyć produkcję białek w tym systemie^28,29. W miarę jak odkrywamy biologię leżącą u podstaw jego szybkiego wzrostu, dalszy rozwój systemów bezkomórkowych V. natriegens może przyspieszyć możliwości bioprodukcyjne i umożliwić solidną ekspresję peptydów terapeutycznych, małych cząsteczek i materiałów syntetycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 15 ml	Corning	352196
2 ml	Eppendorf	22363352
384-dołkowe czarne płytki testowe	Corning	3544
384-dołkowe płytki PCR	Eppendorf	951020702
50 ml	Corning	352070
96-dołkowe płytki do PCR	Eppendorf	30129300
Monohydrat soli sodowej adenozyny 3',5'-cyklicznego monofosforanu	Sigma	A6885
Adenozyno-5'-trifosforan - 100 mM	NEB	N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler	ThermoFisher	4388444
Assay Plate Adhesives		BioRad MSB1001
β-nikotynamidoadenina hydrat dinukleotydu (NAD)	Sigma/Roche	10127965001
Hydrat koenzymu A	Sigma	C4283
5'-trifosforan cytydyny - 100 mM	NEB	N0450L
Sól disodowa kwasu D-(-)-3-fosfoglicerynowego (3-PGA)	Sigma	P8877
Dewar Flask - 4L	ThermoScientific	10-194-100C
Roztwór DL-ditiotreitolu - 1 M	Sigma	42816
Hydrat soli wapniowej kwasu folinowego	Sigma	47612
Lodowaty kwas octowy	Sigma	A6283
5'-trifosforan guanozyny - 100 mM	NEB	N0450L
HEPES	Sigma	H3375
Tetrahydrat soli hemimagnezowej kwasu L-glutaminowego	Sigma	49605
Monohydrat soli potasowej kwasu L-glutaminowego	Sigma	G1149
LB Rosół (Miller)	Sigma	L3522
Chlorek magnezu (MgCl2)	Sigma	M8266
Plazmid pJL1-sfGFP	Addgene	69496
Plasmid Plus Maxi zestaw	Qiagen	12963
Poli(glikol etylenowy) (PEG)-8000	Sigma	89510
Chlorek potasu (KCl)	Sigma	P9333
Granulki wodorotlenku potasu	Sigma/Roche	1050121000
Q125 Sonicator i sonda CL-18 z końcówką cala ?-calowego	Qsonica	4422
Zestaw do czyszczenia i koncentratora RNA	Zymo	R1013
Inhibitor RNazy, mysi	NEB	M0314
Próbnik aminokwasów RTS	Biotechrabbit	BR1401801
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma	S7653
Spermidyna	Sigma	S0266
T7 Polimeraza RNA	NEB	M0251
Roztwór Tris (pH 8,0) - 1 M	Invitrogen	AM9856
tRNA z E. coli MRE 600	Sigma/Roche	10109541001
5'-trifosforan urydyny - 100 mM	NEB	N0450L
Vibrio natriegens (typ dziki) Liofilizowany materiał	ATCC	14048