Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja i sekcja różnorodnych mysich magazynów tłuszczowych

45.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59499

⸱

11 lipca 2019

 , 
1Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Michigan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Adipocyty istnieją w oddzielnych magazynach i pełnią różne role w swoich unikalnych mikrośrodowiskach. W miarę odkrywania regionalnych różnic w charakterze i funkcji adipocytów, ustandaryzowana identyfikacja i izolacja magazynów ma kluczowe znaczenie dla postępu w tej dziedzinie. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wycinki różnych magazynów tłuszczu myszy.

Streszczenie

Tkanki tłuszczowe to złożone organy o szerokim wachlarzu funkcji, w tym magazynowaniu i mobilizacji energii w odpowiedzi na lokalne i globalne potrzeby, rozłączaniu metabolizmu w celu generowania ciepła oraz wydzielaniu adipokin w celu regulacji homeostazy całego ciała i odpowiedzi immunologicznej. Nowe badania identyfikują ważne różnice regionalne w profilach rozwojowych, molekularnych i funkcjonalnych adipocytów zlokalizowanych w dyskretnych magazynach w całym ciele. Różne właściwości magazynów są istotne z medycznego punktu widzenia, ponieważ choroby metaboliczne często wykazują skutki specyficzne dla zajezdni. Protokół ten zapewni badaczom szczegółowy atlas anatomiczny i przewodnik po sekcjach w celu powtarzalnej i dokładnej identyfikacji i wycinania różnych tkanek tłuszczowych myszy. Standaryzowana sekcja dyskretnych magazynów tłuszczowych pozwoli na szczegółowe porównania ich cech molekularnych i metabolicznych oraz udziału w lokalnych i ogólnoustrojowych stanach patologicznych w różnych warunkach żywieniowych i środowiskowych.

Wprowadzenie

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w homeostazie całego organizmu, w tym w magazynowaniu i uwalnianiu energii w odpowiedzi na potrzeby lokalne i ogólne, termoregulacji oraz wydzielaniu adipokin regulujących bilans energetyczny, metabolizm i odpowiedzi immunologiczne1,2. Adipocyty są rozmieszczone w całym organizmie w postaci oddzielnych depot i w niektórych przypadkach pełnią wyspecjalizowane funkcje w ramach swoich mikrośrodowisk3,4,5. Historycznie badania nad tkanką tłuszczową koncentrowały się na białej tkance tłuszczowej (WAT) i jej roli w utrzymaniu homeostazy energetycznej. Większość adipocytów jest rozmieszczona w organizmie w podskórnych i trzewnych depot WAT. Charakterystyka tych depot ma istotne znaczenie dla zróżnicowanej podatności na choroby metaboliczne. Adipocyty podskórne, znajdujące się pod skórą, są wiązane z ochronnymi efektami metabolicznymi5. Adipocyty trzewne, które otaczają organy żywotne i znajdują się w depot gonadalnych, okołonerkowych, zaotrzewnowych, sieciowych i osierdziowych, są powszechnie wiązane z zaburzeniami metabolicznymi, w tym z cukrzycą typu 2 i chorobami układu sercowo-naczyniowego2. Szeroko badana była również brunatna tkanka tłuszczowa (BAT). Adipocyty brunatne i brunatno-podobne wykazują ekspresję białka rozprzęgającego 1 (UCP1) i odgrywają istotną rolę w adaptacyjnej termogenezie oraz homeostazie glukozy6,7. Klasyczne adipocyty brunatne znajdują się w międzyłopatkowym depot BAT8. Gromady adipocytów brunatnych występują również w innych lokalizacjach, w tym w depot nadobojczykowych, podłopatkowych, szyjnych, przykręgowych i okołoaortycznych8,9.

Oprócz lokalizacji w głównych depot WAT i BAT, adipocyty występują w odrębnych niszach w całym organizmie4, gdzie mogą pełnić wyspecjalizowane funkcje w ramach swoich odpowiednich mikrośrodowisk. Na przykład tkanka tłuszczowa szpiku kostnego (BMAT) służy jako rezerwuar lipidów, jest głównym źródłem krążącej adiponektyny i ściśle oddziałuje z osteoblastami, osteoklastami oraz komórkami krwiotwórczymi10,11. Adipocyty skórne uczestniczą w rozległych procesach, w tym w gojeniu ran, odpowiedzi immunologicznej, termoregulacji i wzroście mieszków włosowych12,13. Ponadto adipocyty epikardialne mogą produkować szereg adipokin i chemokin, które wywierają lokalny i systemowy wpływ na rozwój i progresję choroby wieńcowej14. Ekspansja WAT między- i wewnątrzmięśniowego wykazuje dodatnią korelację ze zwiększoną otyłością, systemową insulinoopornością oraz zmniejszeniem siły i mobilności mięśni15. Dodatkowo adipocyty podkolanowe służą jako rezerwuar lipidów dla ekspansji limfatycznej podczas infekcji16. Choć specyficzne role różnych depot stawowych są zazwyczaj nieznane, uważa się obecnie, że depot Hoffy (podrzepkowy) w kolanie przyczynia się do patologii, w tym do przedniego bólu kolana i choroby zwyrodnieniowej stawów17.

Podczas gdy regionalne różnice w charakterystyce i funkcji adipocytów są przedmiotem intensywnych badań, dziedzina ta jest obecnie ograniczona brakiem zestandaryzowanego protokołu identyfikacji i wycinania różnorodnych depot mysich. Wcześniej opublikowane metody zazwyczaj opisywały izolację jednego lub dwóch konkretnych depot i nie zawierały poziomu szczegółowości wymaganego do jednolitego wycięcia18,19. Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie stanowi kompleksowy przewodnik po konkretnych lokalizacjach anatomicznych i etapach izolacji wielu różnych depot tkanki tłuszczowej myszy. Choć głównym przedmiotem niniejszego manuskryptu są depot WAT, szczegółowo opisano również wycięcie międzyłopatkowego BAT. Tkanki tłuszczowe wycięte zgodnie z tym protokołem mogą być wykorzystane w szerokiej gamie punktów końcowych eksperymentów, w tym w badaniach eksplantów, histologii oraz analizach ekspresji genów.

Celem niniejszej publikacji jest dostarczenie badaczom szczegółowego protokołu pozwalającego na jasną i precyzyjną identyfikację oraz izolację zarówno głównych, jak i słabiej przebadanych depot tłuszczowych myszy (Rycina 1). Zasób ten ułatwi pełniejsze zbadanie cech rozwojowych, molekularnych i funkcjonalnych adypocytów w różnych niszach.

Schemat rozmieszczenia tkanki tłuszczowej u myszy z opisanymi depotami tłuszczowymi, naukowe badanie otyłości.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie depotów tłuszczowych myszy wyizolowanych w niniejszym protokole. Obraz został zaadaptowany z pracy Bagchi i wsp., 20184. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach są wykonywane za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Eutanizacja

UWAGA: Na potrzeby tego protokołu wideo używane są myszy C57BL/6J w wieku od 4 do 6 miesięcy.

  1. Umieść mysz w komorze parownika izofluranu i dostosuj natężenie przepływu izofluranu do 5% lub więcej. Ekspozycję na izofluran należy kontynuować do jednej minuty po ustaniu oddechu. Następnie wyjmij mysz z komory parownika i potwierdź eutanazję za pomocą zatwierdzonego środka wtórnego.
    nuta: Zatwierdzone środki wtórne będą się różnić w zależności od instytucji i protokołu dla zwierząt i mogą obejmować zwichnięcie szyjki macicy lub dekapitację.
  2. Umieść uśpioną mysz na misce sekcyjnej. Wysterylizuj grzbietowe i brzuszne powierzchnie zewnętrzne myszy za pomocą 70% etanolu. Upewnij się, że zewnętrzna powierzchnia myszy jest wystarczająco mokra, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią podczas sekcji.

2. Identyfikacja i izolacja głównych podskórnych węzłów tłuszczowych (przednia podskórna, grzbietowo-lędźwiowa, pachwinowa, pośladkowa) i międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej

  1. Identyfikacja i izolacja przedniej podskórnej WAT
    nuta: Przedni podskórny WAT znajduje się między łopatkami, schodząc od karku do pachy mouse7. Ten magazyn został alternatywnie opisany jako suprascapular8 lub interscapular20 WAT i leży bezpośrednio na szczycie międzyłopatkowej zajezdni BAT.
    1. Aby odizolować przednią tkankę podskórną, połóż mysz na brzuchu w pozycji leżącej. Przymocuj kończyny górne i dolne do miski preparacyjnej za pomocą kołków preparacyjnych.
    2. Użyj kleszczy, aby podnieść skórę grzbietową na karku. Użyj nożyczek do tęczówki, aby wykonać małe (1 mm) nacięcie w skórze.
    3. Włóż jedno ostrze nożyczek do tęczówki do początkowego cięcia i wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej (2–3 cm) przez skórę, zaczynając od karku i schodząc wzdłuż kręgosłupa do połowy pleców.
    4. Wykonaj dwa poziome nacięcia (1 cm każde) za pomocą nożyczek do tęczówki, rozciągając się na boki od linii środkowej, u góry i u dołu początkowego pionowego nacięcia.
    5. Użyj kleszczy, aby ostrożnie odkleić skórę i odsłonić przedni magazyn podskórny.
    6. Użyj nożyczek do tęczówki, aby usunąć magazyn zgodnie z naturalnymi granicami tkanki.
      nuta: Metoda ta izoluje zarówno przednią podskórną WAT, jak i międzyłopatkową BAT.
    7. Umieścić rozpreparowany magazyn na szalce rozbiorowej i ostrożnie usunąć zanieczyszczający BAT za pomocą nożyczek do irysa.
  2. Identyfikacja i izolacja klaslastycznych BAT
    nuta: Klasyczny BAT znajduje się pod przednim podskórnym magazynem WAT.
    1. Aby wyizolować BAT, użyj nożyczek do tęczówki, aby ciąć poziomo wzdłuż dolnej krawędzi przedniej tkanki podskórnej, wzdłuż naturalnej granicy magazynu.
    2. Następnie za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj dwa pionowe nacięcia wzdłuż bocznych krawędzi magazynu, podążając za naturalnymi granicami tkanki.
    3. Użyj kleszczy, aby ostrożnie podnieść magazyn i odsłonić międzyłopatkowy BAT w kształcie motyla osadzony w WAT. Ostrożnie odciąć BAT od otaczającego WAT.
  3. Identyfikacja i izolacja tylnego podskórnego WAT,
    1. Połóż mysz na plecach w pozycji leżącej.
    2. Po zabezpieczeniu kończyn górnych i dolnych za pomocą kołków preparacyjnych za pomocą kleszczy unieś skórę u podstawy mostka i wykonaj małe (1 mm) nacięcie w skórze.
    3. Włóż jedno ostrze nożyczek do tęczówki do początkowego cięcia i wykonaj nacięcie w linii środkowej (4–5 cm) przez skórę, zaczynając od podstawy mostka i schodząc do podstawy ogona. Zachowaj ostrożność podczas wykonywania tego nacięcia, ponieważ skóra brzuszna jest bardzo cienka i jest ściśle związana ze ścianą leżącej poniżej jamy otrzewnej.
    4. Wykonaj dwa poziome nacięcia (1 cm każde) za pomocą nożyczek do tęczówki, rozciągając się na bok od linii środkowej, u góry początkowego pionowego nacięcia.
    5. Użyj kleszczy, aby ostrożnie odkleić skórę od jamy otrzewnej i nogi, aby znaleźć tylny podskórny WAT, który powinien pozostać związany ze skórą. Zabezpiecz rozciągniętą skórę za pomocą szpilek preparacyjnych, aby ułatwić całkowite wycięcie WAT.
      nuta: Chociaż tylny podskórny WAT wydaje się być ciągły, w rzeczywistości składa się z trzech odrębnych składów: grzbietowo-lędźwiowego, pachwinowego i pośladkowego1. Zajezdnia grzbietowo-lędźwiowa rozciąga się od odcinka lędźwiowego kręgosłupa do podstawy kończyny tylnej. Trójkątny magazyn pachwinowy rozciąga się od podstawy kończyny tylnej brzusznie w poprzek pachwiny i zawiera wydatny węzeł chłonny. Magazyn pośladkowy rozciąga się niżej od podstawy pachwiny i owija się wokół nogi do podstawy ogona.

3. Identyfikacja i izolacja trzewnych magazynów tłuszczu (gonadalne, okołonerczowe, zaotrzewnowe, onerowe, osierdziowe)

  1. Identyfikacja i izolacja trzewnych magazynów WAT
    nuta: Magazyny WAT, które w dużej mierze znajdują się w jamie klatki piersiowej i otrzewnej, utrzymują mysz w pozycji leżącej. Przymocuj kończyny górne i dolne do miski preparacyjnej za pomocą kołków preparacyjnych.
    1. Za pomocą kleszczy podnieś cienką ścianę jamy otrzewnej u podstawy mostka i wykonaj małe nacięcie (1 mm) za pomocą nożyczek do tęczówki.
    2. Włóż jedno ostrze nożyczek do tęczówki do nacięcia i wykonaj pionowe nacięcie w dół (4–5 cm) od górnej części jamy otrzewnej (podstawy mostka) do odbytnicy.
    3. Wykonaj dwa poziome nacięcia (1 cm każde) nożyczkami do tęczówki, rozciągające się na boki od linii środkowej, u góry i u dołu pionowego nacięcia.
    4. Użyj kleszczy, aby odkleić otrzewną i odsłonić zawartość jamy brzusznej. Przypnij rozciągniętą otrzewną do miski prosektoryjnej.
  2. Identyfikacja i izolacja gonad WAT
    nuta: Gonad WAT otacza macicę i jajniki u kobiet (jajnikowe lub parametryczne) oraz najądrza i jądra u mężczyzn (najądrza). WAT jajnika otacza jajniki, macicę i pęcherz moczowy. U otyłych zwierząt WAT gonad i okołonerkowy może wydawać się ciągły - w tym przypadku należy oddzielić magazyny w rogu macicy i jajnikach. Najądrze WAT jest związane z najądrzem, jądrami i wydatnym naczyniem krwionośnym najądrza.
    1. Zlokalizuj gonady (jądra lub jajniki) i użyj kleszczy, aby podnieść powiązany gonady WAT.
    2. Użyj nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie wyciąć WAT z gonad.
  3. Identyfikacja i izolacja PERINERAL WAT
    nuta: Okołonanerkowa WAT otacza nerki obustronnie. U otyłych zwierząt może się wydawać, że ten magazyn rozciąga się niżej do górnej części rogu macicy i jajników. Chociaż WAT okołonerkowy był tradycyjnie klasyfikowany jako depot trzewny21, kilka grup zidentyfikowało go jako brązowy depot na podstawie śledzenia linii i badań wychwytu glukozy znakowanego radioizotopem8,9,20. Histologicznie składa się z mieszaniny białych i brązowych adipocytów.
    1. Aby wyciąć magazyn okołonerkowy, zlokalizuj nerkę i użyj kleszczy, aby ją podnieść i pociągnąć w linii środkowej, aby zobaczyć wyraźny podział między magazynami okołoonerkowymi i zaotrzewnowymi.
    2. Wyciąć WAT bezpośrednio związany z nerkami. Upewnij się, że nadnercza, znajdujące się nad nerkami, zostały usunięte z WAT.
  4. Identyfikacja i izolacja retroperitoneal WAT
    nuta: Zaotrzewnowy WAT znajduje się w pozycji przykręgosłupowej, wzdłuż granicy między tylną ścianą brzucha a rdzeniem kręgowym.
    1. Aby wyciąć ten magazyn, użyj kleszczy, aby podnieść nerkę do góry i w kierunku linii środkowej, aby wyraźnie zobaczyć granicę między magazynami okołonerkowymi i zaotrzewnowymi.
      nuta: U otyłych zwierząt zidentyfikowanie tej granicy może być trudne.
    2. Następnie za pomocą nożyczek do tęczówki ostrożnie wypreparuj zaotrzewnowy WAT z tylnej ściany otrzewnej.
  5. Identyfikacja i izolacja omentalnego WAT
    nuta: Omental WAT zlokalizowany jest wzdłuż większej krzywizny żołądka. Chociaż tkanka tłuszczowa jest ważnym magazynem u ludzi, na ogół występuje tylko u chorobliwie otyłych myszy.
    1. Aby zidentyfikować trzewny omentalny WAT, użyj kleszczy, aby podnieść żołądek do góry. Użyj nożyczek do tęczówki, aby usunąć powiązaną tkankę tłuszczową wzdłuż dolnej granicy brzucha. Nie należy mylić omental WAT z trzustką.
  6. Identyfikacja i izolacja krezki WAT
    nuta: Krezka WAT to struktura przypominająca pajęczynę otaczającą i związaną z jelitem cienkim i grubym.
    1. Aby wyciąć ten magazyn, usuń jelita z reszty przewodu pokarmowego, przecinając podstawę żołądka i odbytnicy. Użyj kleszczy, aby wyjąć jelita z jamy trzewnej i rozplątać je.
    2. Użyj nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie wypreparować krezkową WAT z dala od jelit, zaczynając od dwunastnicy i kontynuując do końca okrężnicy. Ostrożnie usuń węzły chłonne, które są ściśle związane z magazynem krezkowym.
  7. Identyfikacja i izolacja osierdzia WAT
    nuta: WAT osierdzia znajduje się na zewnątrz osierdzia trzewnego i na zewnętrznej powierzchni osierdzia ciemieniowego, często wzdłuż dolnej części serca14.
    1. Aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej, trzymaj mysz w pozycji leżącej. Przymocuj kończyny górne i dolne do miski preparacyjnej za pomocą kołków preparacyjnych.
    2. Za pomocą kleszczy unieś wyrostek ksylifoidalny (chrząstka u podstawy mostka) i wykonaj małe (1 mm) nacięcie w ścianie klatki piersiowej.
    3. Włóż jedno ostrze nożyczek do tęczówki do nacięcia i wykonaj dwa poziome nacięcia (każde 1 cm) wystające na bok od podstawy mostka. Spowoduje to odsłonięcie przepony i dolnej granicy jamy klatki piersiowej.
    4. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać dwa wznoszące się pionowe nacięcia (3–4 cm) przez klatkę piersiową, rozciągające się wyżej od bocznych granic klatki piersiowej do obojczyka.
    5. Użyj kleszczy, aby podnieść brzuszną połowę klatki piersiowej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać ostateczne cięcie (2 cm) wzdłuż dolnej długości obojczyka, aby usunąć klatkę piersiową i odsłonić zawartość klatki piersiowej.
    6. Jeśli jest osierdziowa, ostrożnie wypreparuj tkankę tłuszczową osierdzia z zewnętrznej powierzchni osierdzia.

4. Identyfikacja i izolacja innych składów tłuszczu

  1. Identyfikacja i izolacja nasierdzia WAT
    nuta: WAT nasierdziowy znajduje się w osierdziu trzewnym i jest bezpośrednio związany z powierzchnią mięśnia sercowego.
    1. Jeśli występują, adipocyty nasierdziowe można obserwować histologicznie po izolacji i utrwaleniu perfundowanego serca w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez 24 godziny.
  2. Identyfikacja i izolacja popliteal WAT
    nuta: Podkolanowy WAT znajduje się w dole podkolanowym w tylnej części kolana i zawiera duży węzeł chłonny. Ten magazyn nie jest zwykle widoczny u młodych zwierząt.
    1. Aby wyizolować WAT podkolanowy, użyj nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie usunąć skórę od podstawy kończyny tylnej do stopy.
    2. Przyłóż rzepkę do miski sekcyjnej i zabezpiecz wyciągniętą nogę szpilką w stopie. Upewnij się, że dół podkolanowy z tyłu kolana jest skierowany do góry.
    3. Użyj nożyczek do tęczówki, aby wykonać cięcie na dolnej granicy przyśrodkowej i bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki. Użyj kleszczy, aby podnieść mięsień i odsłonić trójkątny magazyn podkolanowy.
    4. Użyj nożyczek do tęczówki, aby wyciąć magazyn wzdłuż naturalnych granic tkanek.
  3. Identyfikacja i izolacja WAT
    nuta: Skórny WAT to cienka warstwa adipocytów znajdująca się między siatkowatą skórą właściwą a warstwą mięśniową panniculus carnosus.
    1. Aby zidentyfikować adipocyty skórne metodami histologicznymi, umieść mysz na brzuchu w pozycji leżącej. Po zabezpieczeniu kończyn górnych i dolnych za pomocą szpilek preparacyjnych, spryskaj zewnętrzną powierzchnię myszy 70% etanolem, aby zwilżyć skórę.
    2. Użyj skalpela, aby usunąć mokre futro z kwadratowej części skóry na grzbiecie myszy.
    3. Użyj nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie wyciąć ogoloną część skóry, która będzie obejmować siatkowatą skórę właściwą, skórny WAT, panniculus carnosus i trochę podskórnego WAT.
    4. Za pomocą skalpela przeciąć wyciętą skórę na cienkie pionowe paski.
    5. Ułóż cienkie pionowe paski lepką podskórną warstwą WAT skierowaną w dół.
    6. Zaczynając od jednego końca, zwiń pasek na siebie, aby utworzyć spiralę. Lepka podskórna warstwa WAT na zewnątrz spirali pozwoli rolce zachować swój kształt podczas mocowania.
    7. Umieść spiralę w studzience na 24-dołkowej płytce zawierającej 10% neutralnej buforowanej formaliny na 24 godziny przed przetwarzaniem histologicznym22.
  4. Identyfikacja i izolacja międzymięśniowego WAT
    nuta: Międzymięśniowy WAT jest szeroko definiowany jako adipocyty znajdujące się pod powięzią głęboką mięśni. Termin ten obejmuje adipocyty przeplatane włóknami mięśni szkieletowych, znane również jako domięśniowy WAT, oraz adipocyty znajdujące się w samych wiązkach mięśniowych. Myszy typu dzikiego na ogół nie mają dużej liczby adipocytów międzymięśniowych. Jednak w pewnych warunkach możliwe jest zidentyfikowanie międzymięśniowego WAT metodami histologicznymi. W niektórych warunkach adipocyty międzymięśniowe można również znaleźć w mięśniach gładkich, takich jak przepona.
    1. Na przykład, aby odizolować mięsień piszczelowy przedni (TA), umieść mysz na plecach w pozycji leżącej i przymocuj kończyny dolne do miski preparacyjnej za pomocą szpilek preparacyjnych. Zwilż skórę 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią.
    2. Użyj nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie usunąć skórę z nogi i odsłonić grupę mięśni czworogłowych, znajdującą się powyżej kolana na trzonie kości udowej oraz TA znajdującą się poniżej kolana na brzusznej powierzchni kości piszczelowej.
      nuta: TA jest gruba w pobliżu bliższego końca kości piszczelowej i bardziej ścięgnista w pobliżu dystalnego końca.
    3. Użyj nożyczek do tęczówki, aby wyciąć fragment mięśnia i utrwalić 10% neutralną buforowaną formalinę przez 24 godziny przed przetwarzaniem histologicznym22.
  5. Identyfikacja i izolacja dostawowych składów WAT
    nuta: Dostawowe magazyny WAT zlokalizowane są w obrębie stawów maziowych.
    1. Aby zidentyfikować WAT podrzepkowe, na przykład metodami histologicznymi, należy pobrać kości nóg zgodnie z opisem w sekcji BMAT.
    2. Po usunięciu kompleksu udowo-piszczelowego użyj nożyczek tęczówkowych i gazików, aby usunąć jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej. Nie należy łamać stawu piszczelowo-udowego.
    3. Utrwalić kompleks udowo-piszczelowy w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez 24 godziny przed odwapnieniem i przetwarzaniem histologicznym (opisany poniżej, krok 4.6.8).
  6. Identyfikacja i izolacja tkanki tłuszczowej szpiku kostnego
    nuta: Tkanka tłuszczowa szpiku kostnego (BMAT) zawarta jest w kościach, przeplatana komórkami krwiotwórczymi. Anatomicznie BMAT można sklasyfikować jako konstytutywny (dystalna kość piszczelowa i kręgi ogonowe) lub regulowany (środkowa i bliższa kość piszczelowa, kość udowa i kręgi lędźwiowe)10,11. Czysta izolacja adipocytów szpiku kostnego do analizy RNA i białek jest wyzwaniem u myszy. Jednak kości myszy można łatwo zebrać, utrwalić, odwapnić i zatopić parafiną w celu analiz histologicznych.
    1. Na przykład, aby zebrać kości nóg, najpierw usuń nogi z myszy. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć staw panewkowo-udowy, utrzymując nienaruszoną głowę kości udowej.
    2. Użyj nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie usunąć skórę z nogi, odsłaniając mięśnie nóg.
    3. Ostrożnie wypreparuj główne mięśnie kości udowej i piszczelowej za pomocą nożyczek do tęczówki i gazików.
    4. Kiedy kość udowa jest odsłonięta, podążaj za krawędzią kości do stawu miednicy i kości udowej i ostrożnie uwolnij głowę kości udowej ze stawu panewkowo-udowego. Użyj gazy, aby oczyścić pozostałą tkankę z kości udowej.
    5. Podążaj za granicą kości piszczelowej do stawu skokowego. Ostrożnie zwolnij kostkę przyśrodkową, znajdującą się na końcu kości piszczelowej, ze stawu skokowego.
    6. Po wyizolowaniu kompleksu udowo-piszczelowego usuń jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej za pomocą nożyczek do tęczówki i/lub gazy.
    7. Oddziel kość piszczelową od kości udowej, wkładając jedno ostrze nożyczek tęczówki do stawu piszczelowo-udowego i delikatnie przeciąć więzadła poboczne przyśrodkowe i boczne oraz więzadła krzyżowe przednie i tylne. Nie należy wyjmować torebki stawu kolanowego, aby upewnić się, że kość piszczelowa pozostaje nienaruszona. Użyj gazy, aby oczyścić pozostałą tkankę z kości piszczelowej.
    8. Utrwal kości w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie umyj i przechowuj zgodnie z przyszłymi potrzebami.
      1. Aby przeanalizować parametry kości za pomocą tomografii mikrokomputerowej (μCT), przechowuj kości w buforze fosforanowym Sorensena, pH 7,423.
      2. W celu ilościowego określenia BMAT i analiz histologicznych odwapnić kości w 14% EDTA, pH 7,4, przez 10-14 dni.
      3. Po odwapnieniu użyj barwienia tetratlenkiem osmu i analizy μCT, aby określić ilościowo BMAT24. W przeciwnym razie, przetwarzaj i zatapiaj parafinę w kościach do histologii23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślną identyfikację i izolację różnych depot tłuszczowych myszy można przeprowadzić zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Makroskopowe lokalizacje anatomiczne depot podskórnych (A, E-F), brunatnych (B), trzewnych (C, D, G-J) oraz podkolanowych (K) przedstawiono na Rysunku 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponieważ coraz częściej uznaje się znaczenie różnorodnych cech molekularnych i funkcjonalnych dyskretnych klastrów adipocytów, ważne jest, aby badacze w tej dziedzinie jednolicie identyfikowali i wycinali magazyny tłuszczu do dalszych analiz. Do tej pory istnieje niewiele protokołów do ustandaryzowanej lokalizacji i izolacji szerokiej gamy mysich magazynów tłuszczu. Wcześniej publikowane metody koncentrują się głównie na jednym lub dwóch magazynach i brakuje im szczegółów niezbędnych do jednolitej identyfikacji i wyodręb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

O.A.M. jest wspierany przez granty NIH DK062876 i DK092759; D.P.B. jest wspierany przez University of Michigan Medical Scientist Training Program (T32GM007863), University of Michigan Training Program in Organogenesis (T32HD007605), University of Michigan Rackham Merit Fellowship oraz Tylenol Future Care Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralna buforowana formalinaFisher Scientific22-110-869
Płytki 24-dołkowe, nieobrobioneSigma-AldrichCLS3738
70% etanolu (rozcieńczony od 95%)Fisher Scientific04-355-226
Kleszcze preparacyjne z zakrzywionymi końcówkamiVWR89259-946
Patelnia sekcyjnaCarolina Biological Supply Company
Nożyczki preparacyjne (ostra/końcówka)VWR82027-588
Gąbki z gazyVitality Medical2634Curity Gąbka z gazy 4 cale x 4 cale, 12-warstwowe
szpilki Handi-Pins do preparacjiCarolina Biological Supply Company
Nożyczki do przysłony (proste)VWR470018-890
IsofluraneVetOne
SkalpelVWR100499-578Rękojeść z pióra z ostrzem, jednorazowa
629004 629132 501017

Bibliografia

  1. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
  4. Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
  5. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  6. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  7. Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
  8. Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
  9. Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099(2014).
  10. Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
  11. Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
  12. Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
  13. Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
  14. Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
  15. Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
  16. Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
  17. Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
  18. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174(2014).
  19. Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
  20. de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
  21. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
  22. Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
  23. Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808(2015).
  24. Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
  25. Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084(2013).
  26. Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230(2015).
  27. Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
  28. Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja tkanki t uszczowejizolacja mi dzy opatkowej BATtylna podsk rna WATidentyfikacja trzewnej WATwyci cie gonadalnej WATdisekcja depotu oko onerkowegoizolacja zaotrzewnowej WATekstrakcja podkolanowej WATbarwienie hematoksylin i eozyn
Identyfikacja i sekcja różnorodnych mysich magazynów tłuszczowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.