Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Summary

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Abstract

Coraz więcej dowodów sugeruje, że właściwości molekularne i biologiczne różnią się w komórkach czerniaka hodowanych w tradycyjnych dwuwymiarowych naczyniach do hodowli tkanek w porównaniu z in vivo u pacjentów ludzkich. Wynika to z wąskiego gardła selekcji klonalnych populacji komórek czerniaka, które mogą dynamicznie rosnąć in vitro przy braku warunków fizjologicznych. Co więcej, odpowiedzi na terapię w dwuwymiarowych kulturach tkankowych ogólnie nie odzwierciedlają wiernie odpowiedzi na leczenie u pacjentów z czerniakiem, przy czym większość badań klinicznych nie wykazała skuteczności kombinacji terapeutycznych, które okazały się skuteczne in vitro. Chociaż ksenografowanie komórek czerniaka myszom zapewnia fizjologiczny kontekst in vivo, którego nie ma w dwuwymiarowych testach hodowli tkankowych, komórki czerniaka użyte do wszczepienia zostały już poddane selekcji wąskiego gardła dla komórek, które mogły rosnąć w warunkach dwuwymiarowych, gdy linia komórkowa została ustanowiona. Nieodwracalne zmiany, które zachodzą w wyniku wąskiego gardła, obejmują zmiany we właściwościach wzrostu i inwazji, a także utratę określonych subpopulacji. Dlatego modele, które lepiej oddają stan człowieka in vivo, mogą lepiej przewidywać strategie terapeutyczne, które skutecznie zwiększają całkowite przeżycie pacjentów z czerniakiem z przerzutami. Technika ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) polega na bezpośrednim wszczepieniu komórek nowotworowych od pacjenta do biorcy myszy. W ten sposób komórki nowotworowe są konsekwentnie hodowane pod wpływem stresu fizjologicznego in vivo i nigdy nie przechodzą dwuwymiarowego wąskiego gardła, co zachowuje właściwości molekularne i biologiczne obecne, gdy guz znajdował się u ludzkiego pacjenta. Warto zauważyć, że modele PDX pochodzące z miejsc narządowych przerzutów (tj. mózgu) wykazują podobną zdolność przerzutową, podczas gdy modele PDX pochodzące od pacjentów wcześniej nieleczonych i pacjentów z nabytą opornością na terapię (tj. Terapia inhibitorami BRAF/MEK) wykazują podobną wrażliwość na terapię.

Introduction

Modele przedkliniczne są kluczowe dla wszystkich aspektów translacyjnych badań nad rakiem, w tym charakterystyki choroby, odkrywania podatności na działanie unikalnych dla raka w porównaniu z normalnymi komórkami, oraz rozwoju skutecznych terapii, które wykorzystują te podatności w celu zwiększenia ogólnego przeżycia pacjentów. W dziedzinie czerniaka dziesiątki tysięcy modeli linii komórkowych zostały intensywnie wykorzystane do badań przesiewowych leków, z czego >4000 zostało dostarczonych przez samą naszą grupę (seria WMXXX). Te modele linii komórkowych pochodzą od pacjentów z czerniakiem z różnymi postaciami czerniaka skóry (tj. Rozprzestrzenianie się akralne, błony naczyniowej oka i powierzchowne) i różnymi genotypami (tj. Homolog onkogenu wirusa BRAF^V600 i neuroblastoma RAS [mutacja NRAS^Q61R]), które obejmują spektrum chorób występujących w klinice^1,2.

Jednoznacznie, najbardziej skuteczna, ukierunkowana strategia terapeutyczna w dziedzinie czerniaka wyłoniła się z 1) genomowej charakterystyki guzów pacjentów identyfikujących mutacje BRAF w ~50% czerniaków³ i z 2) badania przedklinicznego wykorzystującego modele linii komórkowych czerniaka⁴. Kombinacja inhibitorów BRAF/MEK została zatwierdzona przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w 2014 r. do leczenia pacjentów, u których czerniak zawiera aktywujące mutacje BRAF^V600E/K i może pochwalić się wskaźnikiem odpowiedzi >75%⁵. Pomimo tej początkowej skuteczności, oporność szybko pojawia się w prawie każdym przypadku z powodu różnorodnych wewnętrznych i nabytych mechanizmów oporności oraz niejednorodności wewnątrznowotworowej. Niestety, modele linii komórkowych nie oddają reprezentatywnej heterogeniczności biologicznej, gdy są hodowane w dwuwymiarowej kulturze w plastikowych naczyniach, co maskuje ich klinicznie predykcyjny potencjał, gdy badacze próbują eksperymentalnie określić terapie, które mogą być skuteczne u pacjentów z określoną postacią lub genotypem czerniaka⁶. Zrozumienie, w jaki sposób najlepiej modelować heterogeniczność wewnątrznowotworową pacjenta, pozwoli badaczom na lepsze opracowanie metod terapeutycznych, które mogą zabijać subpopulacje oporne na terapię, które prowadzą do niepowodzenia obecnych standardowych terapii.

Najważniejsze dla ograniczonej wartości predykcyjnej modeli linii komórkowych jest to, jak są one początkowo ustalane. Nieodwracalne zmiany zachodzą w krajobrazie klonalnym guza, gdy jednokomórkowa zawiesina guza pacjenta jest hodowana na dwuwymiarowych, plastikowych naczyniach do hodowli tkankowych, w tym zmiany w potencjale proliferacyjnym i inwazyjnym, eliminacja określonych subpopulacji i zmiana informacji genetycznej⁷. Ksenoprzeszczepy na myszach z tych modeli linii komórkowych czerniaka stanowią najczęściej wykorzystywaną platformę in vivo do badań przedklinicznych; Jednak strategia ta cierpi również z powodu słabej rekapitulacji złożonej heterogeniczności guza obserwowanej klinicznie. Aby przezwyciężyć tę wadę, rośnie zainteresowanie włączeniem bardziej wyrafinowanych modeli przedklinicznych czerniaka, w tym modelu PDX. Modele PDX są wykorzystywane od >30 lat, a przełomowe badania na pacjentach z rakiem płuc wykazały zgodność między reakcją pacjentów na czynniki cytotoksyczne a odpowiedzią modelu PDX pochodzącego od tego samego pacjenta⁸. Ostatnio zaczęto wykorzystywać modele PDX jako narzędzie z wyboru do badań przedklinicznych zarówno w przemyśle, jak i w ośrodkach akademickich. Modele PDX, ze względu na ich lepszą rekapitulację heterogeniczności guza u ludzi, są bardziej istotne klinicznie do wykorzystania w wysiłkach optymalizacyjnych terapii niż ksenoprzeszczepy linii komórkowych⁹. W czerniaku istnieją ogromne przeszkody, które utrudniają leczenie zaawansowanej choroby¹⁰. Klinicznie istotne modele PDX zostały wykorzystane do modelowania oporności klinicznej i identyfikacji strategii terapeutycznych z klinicznie dostępnymi środkami w leczeniu nowotworów opornych na terapię^11,12. Krótko mówiąc, przedstawiony tutaj protokół generowania modeli PDX wymaga podskórnej implantacji świeżej tkanki z pierwotnego lub przerzutowego czerniaka (pobranej przez biopsję lub operację) myszom z zerowym receptorem NOD / scid / IL2 (NSG). Różne grupy stosują różne warianty podejścia metodologicznego; Istnieje jednak podstawowy rdzeń¹³.

Protocol

Następujące protokoły dla zwierząt są zgodne z wytycznymi komisji etyki humanitarnej Instytutu Wistar oraz wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Pobieranie tkanek nowotworowych czerniaka

1. Pobrać tkankę nowotworową (określaną jako pasaż 0) od pacjentów z czerniakiem za pomocą jednej z następujących metod chirurgicznych lub biopsji.
   1. W przypadku tkanki do wycinania chirurgicznego należy przechowywać co najmniej 1 g tkanki (przerzuty do sekcji i zmiany pierwotne) w transportowych pożywkach magazynujących (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamycyny) w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
   2. W przypadku tkanek do biopsji chirurgicznej należy przechowywać mniej niż 1 g tkanki (często biopsje dziurkujące przerzutów podskórnych [s.c.] i przerzutów do węzłów chłonnych [LN]) w pożywce transportowej w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
   3. W przypadku tkanki pobranej z biopsji gruboigłowej należy przepłukać cylinder (rdzeń) tkanki o wymiarach około 10 mm x 1 mm (często biopsje wątroby) do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml transportowej pożywki do przechowywania w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
   4. W przypadku tkanek aspirowanych cienkoigłowo (FNA) bardzo małą ilość tkanki (o wielkości mniejszej niż 1 mm) pobraną bezpośrednio od pacjenta należy przechowywać w igle i strzykawce w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
2. Dostarczyć tkankę w transportowym podłożu magazynującym w temperaturze 4 °C lub na lodzie tego samego dnia lub z wysyłką w nocy po wycięciu chirurgicznym lub biopsji. Przetwarzaj tkankę w ciągu 1-2 godzin od porodu.

2. Przetwarzanie tkanki nowotworowej do implantacji myszy

1. Wycięcie chirurgiczne lub biopsja chirurgiczna przetwarzanie tkanek
   1. Przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i oddziel tkankę nowotworową od otaczającej normalnej tkanki tak bardzo, jak to możliwe.
   2. Usuń tkankę martwiczą (zwykle identyfikowaną jako blado-biaława tkanka znajdująca się centralnie w guzie) z pozostałego guza w jak największym stopniu.
   3. Użyj skalpela, aby podzielić początkowy fragment guza na mniej więcej równe części (~3 mm x 3 mm) w celu chirurgicznej implantacji myszy (ryc. 2).
   4. Opcjonalnie, jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanki nowotworowej, należy ją zamrozić w celu przeprowadzenia dalszych testów (sekwencjonowanie RNA [RNASeq], sekwencjonowanie całego eksomu [WES] itp.).
   5. Zrób zawiesinę guza, mieląc tkankę nowotworową za pomocą techniki krzyżowego ostrza z dwoma ostrzami skalpela. Zmiel kawałki guza tak drobno, jak to możliwe, aby utworzyć zawiesinę, która jest teraz gotowa do chirurgicznej implantacji myszy.
   6. Alternatywnie, jeśli tkanka nowotworowa jest zbyt twarda do mechanicznej dysocjacji, należy zastosować procedurę dysocjacji trawienia, aby utworzyć żelową zawiesinę i zawiesinę jednokomórkową do implantacji i / lub wstrzyknięcia.
      1. Zmiel kawałki guza tak drobno, jak to możliwe, aby uzyskać zawiesinę.
      2. Umieścić zawiesinę w probówce o pojemności 50 ml z zimnym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS)^-/- (bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺); następnie odwirować i osadzać przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
      3. Zawiesić zawiesinę w 10 ml podgrzanej świeżej pożywki fermentacyjnej (200 U/ml kolagenazy IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U/ml DNazy w HBSS-^/-) na 1 g tkanki nowotworowej.
      4. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20 minut i energicznie mieszać co 5 minut za pomocą jednorazowej pipety.
      5. Przemyć do 50 ml HBSS-^/-, a następnie odwirować przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
      6. Dodać 5 ml podgrzanego TEG (0,025% trypsyny + 40 μg/ml glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N',N'--tetraoctowego [EGTA] + 10 μg/ml alkoholu poliwinylowego [PVA]) na 1 g tkanki nowotworowej, delikatnie zawiesić/wstrząsnąć i umieścić probówkę w temperaturze 37 °C na 2 minuty bez mieszania.
      7. Dodać co najmniej 1 równą objętość zimnego podłoża barwiącego (1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] + 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego [HEPES] + 1x penicylina-streptomycyna w pożywce L15) w celu wygaszenia trypsyny i odwirować przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
      8. Ponownie zawiesić próbkę w 10 ml pożywki barwiącej na 1 g tkanki nowotworowej i przefiltrować ją przez sitko do komórek 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową do wstrzyknięcia myszy (ryc. 2).
      9. Gnojowica pozostała na wierzchu sitka komórkowego może być również zbierana w celu chirurgicznej implantacji myszy.
2. Przetwarzanietkanek z biopsji lub
   1. Wlać tkankę cylindra rdzeniowego do rurki do transportu tkanek na 5-centymetrową szalkę Petriego.
   2. Usuń nadmiar płynu, zeskrob tkankę do krawędzi szalki Petriego, drobno zmiel tkankę nowotworową, dodaj ~100–150 μl HBSS^-/- na wierzch tkanki nowotworowej i szybko wciągnij HBSS/zawiesinę tkanki nowotworowej do strzykawki o pojemności 1 ml.
   3. Podłączyć igłę 23 G do strzykawki o pojemności 1 ml, przepuścić HBSS/zawiesinę tkanki nowotworowej przez igłę do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml.
   4. Ponownie narysuj zawiesinę guza do strzykawki z igłą nadal założoną, aż będzie mogła płynnie przejść przez igłę.
   5. Na koniec wciągnąć zawiesinę guza z powrotem do strzykawki i odłączyć igłę 23 G.
   6. Przymocować igłę 27 G i pobrać równą objętość (~100–150 μl) sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz Tabela materiałów) do strzykawki.
   7. Powoli dodawać równą objętość sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml z zawiesiną guza/HBSS-^/-, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków.
   8. Wciągnij po raz ostatni z powrotem do strzykawki, a tkanka guza z biopsji grubioigłowej jest teraz gotowa do wstrzyknięcia myszy.
3. Przetwarzanie tkanek FNA
   1. Umieścić strzykawkę zawierającą próbki FNA (uwięzione w igle) na lodzie.
   2. Oddzielić igłę (zawierającą tkankę FNA) od strzykawki i usunąć tłok ze strzykawki, dodać ~150–200 μL HBSS^-/- do górnej części strzykawki.
   3. Ponownie włożyć tłok do strzykawki i igły (zawierającej tkankę FNA) i wypchnąć HBSS-^/- przez igłę do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml. Ten krok usuwa guz FNA z igły.
   4. Powtórzyć krok 2.3.3 z zawiesiną HBSS-^/-/FNA dwukrotnie, używając tej samej strzykawki, aby zmaksymalizować pobieranie tkanki nowotworowej z igły.
   5. Dodaj równą objętość (~100–150 μl) sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml zawierającej zawiesinę HBSS/FNA.
   6. Odpowiednio wymieszać, powoli wciągając sztuczną matrycę zewnątrzkomórkową/zawiesinę HBSS-^/-/FNA z powrotem do igły 23 G i powtarzając dwukrotnie.
   7. Pobrać całą sztuczną macierz zewnątrzkomórkową/objętość HBSS-^/-/FNA z powrotem do strzykawki, zastąpić igłę 23 G igłą 27 G, a próbka FNA jest teraz gotowa do wstrzyknięcia myszy.

3. Implantacja i iniekcja guza u myszy

1. Implantacja chirurgicznego wycięcia lub biopsji chirurgicznej Tissue
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylne przez autoklawowanie lub użycie wstępnie wysterylizowanych narzędzi jednorazowych.
   1. Ogol włosy z dolnej części pleców 6-8 tygodniowych samców lub samic myszy NSG, pozostawiając obszar o wymiarach około 1,5 cm x 3 cm bez włosów. Znieczulenie myszy za pomocą izofluranu i potwierdź, delikatnie ściskając stopę w ramach testu reakcji. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
   2. Umieść pojedyncze myszy na poduszce grzewczej w stożku nosowym aparatu do znieczulenia, wyszoruj ogolony obszar chlorheksydyną. Następnie zalać 70% etanolem i pozostawić do odparowania.
   3. Przygotuj kawałki lub podziel zawiesinę guza na szalce Petriego na pojedyncze kopce do implantacji chirurgicznej (tj. na trzy równe kopce, jeśli mają być wszczepione 3 myszy).
   4. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie o długości około 5 mm na środku grzbietu myszy, weź jedną parę kleszczy i podnieś skórę po stronie nacięcia po przeciwnej stronie operatora.
   5. Weź nożyczki do drugiej ręki i oddziel skórę od warstwy mięśniowej, delikatnie przecinając błonę powięziową małymi nacięciami nożycowymi, tworząc w ten sposób "kieszeń" na tkankę nowotworową.
   6. Podnieś jeden fragment guza lub pojedynczy kopiec tkanki zawiesiny guza za pomocą ostrza skalpela i delikatnie umieść tkankę w utworzonej kieszeni.
   7. Podaj 100 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na wzgórek tkanki nowotworowej w kieszeni.
   8. Za pomocą dwóch par kleszczy pociągnij nacięcie na obu końcach, tak aby krawędzie rany zbliżyły się do siebie, i zamknij ranę, zakładając jeden lub dwa klipsy do rany.
   9. Wstrzyknąć podskórnie 1-5 mg/kg meloksykamu jako środek przeciwbólowy u myszy po operacji.
   10. Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją z powrotem w pierwotnej klatce, obserwuj mysz podczas budzenia. Nie wracaj do klatki, dopóki w pełni nie wyzdrowiejesz.
   11. Usuń klipsy do ran po około 7 dniach. Jeśli gojenie nie jest pełne po 7 dniach, pozostaw klips do rany na dodatkowy jeden lub dwa dni.
       UWAGA: W przypadku użycia zawiesiny pojedynczej komórki z chirurgicznego wycięcia lub biopsji chirurgicznej, zmiesza się ona ze sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową (w stosunku 1:1) do wstrzyknięcia myszom.
2. Wstrzyknięcie FNA lub tkanki biopsji grubioigłowej
   1. Umieść mysz NSG na stojaku ze stalową siatką, chwyć ją mocno za ogon i delikatnie pociągnij mysz do tyłu. Mocno chwyci siatkę przednimi nogami. Alternatywnie, unieruchamiaj mysz w ręce niedominującej i pozwól, aby obszar boczny był widoczny
   .
   2. Zdezynfekować skórę boku wacikami nasączonymi alkoholem, powoli i równomiernie wstrzyknąć zawartość strzykawki pod skórę myszy.
   3. Wyciągnij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce.

4. Monitoruj wzrost guza

1. Monitoruj myszy raz w tygodniu, aby sprawdzić, czy nie ma wyczuwalnych guzów.
2. Gdy guzy osiągną mierzalny rozmiar (około 50 mm³), użyj suwmiarki, aby zarejestrować wymiary guza. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć objętość guza: (szerokość x szerokość x długość) / 2.
3. Zbierz guz, gdy objętość guza osiągnie około 1,5 cm³ (około 4-10 tygodni). Guz nazywa się teraz pasażem myszy 1 (MP1).

5. Pobieranie guza w celu bankowania tkanki, reimplantacji i eksperymentu/charakterystyki

1. Poddaj mysz eutanazji w komorze CO₂ , sprawdź parametry życiowe, aby potwierdzić śmierć, a następnie zanurz mysz w roztworze Virkon, aby sterylizować skórę przez 30 sekund w bio-szafce.
2. Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy chirurgicznych, aby podnieść skórę przylegającą do guza i wykonać poziome cięcie.
3. Użyj techniki separacji, aby zmobilizować skórę po obu stronach guza i nad guzem, odsłaniając guz.
4. Użyj nożyczek lub ostrza skalpela, aby oddzielić guz od powięzi.
5. Wyciąć guz i przenieść guz na sterylną szalkę Petriego, pokroić guz na małe kawałki i usunąć tkankę martwiczą z guza.
6. Bank tkanki nowotworowej do przyszłej implantacji.
   1. Weź 2-3 małe kawałki guza mniejsze niż ~10 mm x 10 mm i zmiel je na kawałki mniejsze niż ~1 mm x 1 mm.
   2. Przenieś całą zmieloną tkankę do fiolki kriogenicznej o pojemności 2 ml, dodaj 1 ml pożywki do zamrażania (10% DMSO + 90% FBS).
   3. Dobrze wymieszaj i umieść fiolki kriogeniczne we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania komórek na bazie izopropanolu na suchym lodzie.
   4. Przechowywać pojemnik w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez noc, a następnie przenieść fiolki kriogeniczne do przechowywania ciekłego azotu (LN₂).
7. Błyskawiczne zamrażanie tkanek do dalszych testów (RNASeq, WES itp.).
   1. Umieść kawałki tkanki nowotworowej (~3 mm x 3 mm) w fiolce kriogenicznej i natychmiast umieść fiolkę kriogeniczną w LN₂. Przechowywać fiolki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

6. Próby terapii PDX

UWAGA: Potrzeba dwóch faz ekspansji, aby wyhodować wystarczającą ilość tkanki nowotworowej, aby wygenerować niezbędną liczbę myszy z PDX do próby terapeutycznej.

1. Pobrać kriowial zawierający zbankowaną tkankę PDX z LN₂ i umieścić kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pożywka zamrażająca zawierająca tkankę nowotworową zacznie się topić.
2. Opróżnij zawartość kriowialu do wstępnie ogrzanego HBSS-^/- w probówce o pojemności 50 ml i umyj chusteczkę.
3. Tkanka w granulkach przez odwirowanie przez 5 minut przy 1 200 obr./min.
4. Usunąć HBSS^-/- z próbki guza przez aspirację próżniową za pomocą pipety Pasteura.
5. Wsuń tkankę PDX z probówki o pojemności 50 ml na szalkę Petriego o średnicy 5 cm lub 10 cm i umieść na mokrym lodzie.
6. Postępuj zgodnie z powyższym protokołem implantacji, aby wszczepić bankowaną tkankę z fiolki kriogenicznej 5 myszom NSG w pierwszej rundzie ekspansji guza PDX.
7. Gdy guzy osiągną ~ 600–800 mm³, zbierz 1-2 guzy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki z powyższym protokołem przetwarzania tkanki nowotworowej: dysocjacja mechaniczna, procedura dysocjacji trawienia kolagenazy.
8. Komórki osadkowe i ponownie zamieszać w 6 ml HBSS ^-/-/sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (stosunek 1: 1), wstrzyknąć podskórnie ~ 50 myszy NSG, ze 100 μl mieszaniny komórek na mysz w drugiej rundzie ekspansji guza PDX.
9. Mierz wielkość guza za pomocą suwmiarki co dwa tygodnie.
10. Poczekaj na wielkość guza ~100 mm³ w ciągu 3-5 tygodni, losowo podziel myszy na grupy i rozpocznij leczenie.
11. Gdy wielkość guza osiągnie maksymalną objętość zatwierdzoną przez IACUC, należy przerwać leczenie.
12. Postępuj zgodnie z powyższym protokołem zbioru guzów, aby zebrać zamrożone kawałki guza, kawałki guza do bloków parafinowych.

Results

Tkanka nowotworowa dla modeli PDX czerniaka może pochodzić z wielu różnych źródeł i może być również przetwarzana zgodnie z dynamiką wzrostu poszczególnych modeli i pożądanym zastosowaniem tkanki PDX. Priorytetem przy tworzeniu modelu PDX jest posiadanie wystarczającej ilości materiału do przechowywania do wykorzystania w przyszłości i DNA do charakterystyki (Rysunek 1).

Gdy wystarczająca ilość materiału zostanie zbankowana, tkanka nowotworowa może zostać rozszerzon...

Discussion

Opisaliśmy tutaj generowanie modeli PDX czerniaka z tkanką pacjenta pochodzącą z guzów pierwotnych i przerzutowych, biopsji gruboigłowych i FNA. Po bezpośrednim wszczepieniu do myszy NSG guzy wykazują podobne właściwości morfologiczne, genomowe i biologiczne do tych obserwowanych u pacjenta. W przypadku, gdy tylko niewielka ilość tkanki jest dostępna dla badaczy, jak to często ma miejsce w przypadku FNA, technika PDX pozwala na ekspansję tkanki nowotworowej w celu scharakteryzowania DNA, RNA i białka, a także na próby te...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Kat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (bez Ca++ lub Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2,5% Trypsyna	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL porcje przechowywane w – 20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorheksydyna	Fisher Scientific Cat	# 50-118-0313
Kolagenaza IV (2,000 u / ml)	Worthington	Kat #4189	uzupełnić w HBSS-/- z kolagenazy IV w proszku (Worthington #4189, u/mg wskazane na butelce i różni się w zależności od partii); zamrażać 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Nr kat. # C6295-50ML
DNaza	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Kat # D4527
EGTA (bis(eter 2-aminoetylowy) glikolu etylenowego (N,N,N' Kwas N'-tetraoctowy)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamycyna	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isofluran	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Nośnik L15 firmy Leibovitz	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Sztuczna macierz zewnątrzkomórkowa
Meloksykam	HENRY SCHEIN ZDROWIE ZWIERZĄTRekwizycja # ::Henry Schein	Kot # 025115	1-5mg/kg, jako środek przeciwbólowy
NOD/SCID/IL2-receptor zerowy (NSG) Myszy	Instytut Wistar,	hodowla
PVA (alkohol poliwinylowy)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Kot # P8136-250G
RPMI 1640 Średni (Mod.) 1X z L-Glutaminą	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Skalpel	Feather Cat	# 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Klipsy do ran	MikRon	Cat #427631