Artykuł metodologiczny

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59512

⸱

20 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Celetrix LLC

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

Streszczenie

Nukleazy edytujące geny, reprezentowane przez białko 9 (Cas9) związane z CRISPR, stają się głównymi narzędziami w badaniach biomedycznych. Pomyślne dostarczenie elementów CRISPR/Cas9 do komórek docelowych przez transfekcję jest warunkiem wstępnym skutecznej edycji genów. Protokół ten pokazuje, że dostarczanie rybonukleoproteiny (RNP) CRISPR/Cas9 za pośrednictwem elektroporacji lampowej (TE) za pośrednictwem elektroporacji (RNP) wraz z jednoniciowymi matrycami dawcy oligodeoksynukleotydu (ssODN) do różnych typów komórek ssaków, prowadzi do solidnych, precyzyjnych zdarzeń edycji genów. Po pierwsze, TE zastosowano do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP i ssODN w celu wywołania mutacji powodujących chorobę w genie podjednostki gamma receptora interleukiny 2 (IL2RG) i genie reduktazy sepiapteryny (SPR) w komórkach fibroblastów królika. Osiągnięto dokładne wskaźniki mutacji wynoszące 3,57%-20%, jak określono za pomocą sekwencjonowania klonowania bakteryjnego TA. Ta sama strategia została następnie zastosowana w ludzkich iPSC na kilku klinicznie istotnych genach, w tym receptorze naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), białku C wiążącym miozynę, sercowym (Mybpc3) i podjednostce hemoglobiny beta (HBB). Konsekwentnie, bardzo precyzyjnie osiągano wskaźniki mutacji (11,65%-37,92%), jak określono za pomocą głębokiego sekwencjonowania (DeepSeq). Niniejsza praca pokazuje, że elektroporacja lampowa CRISPR/Cas9 RNP stanowi skuteczny protokół transfekcji do edycji genów w komórkach ssaków.

Wprowadzenie

CRISPR/Cas9 jest najczęściej używaną programowalną nukleazą do edycji genów. Działa poprzez rozpoznawanie za pośrednictwem pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) zarówno sekwencji docelowych, jak i sąsiedniej sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) w genomie. Nukleaza Cas9 generuje dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB) zlokalizowane trzy nukleotydy przed sekwencją PAM1. DSB są naprawiane albo przez podatne na błędy ścieżki niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR). Aby osiągnąć precyzyjną edycję genów za pośrednictwem szlaku HDR, matryce dawców są często dostarczane w formacie plazmidowego DNA (pDNA) lub jednoniciowego oligodeoksynukleotydu (ssODN).

CRISPR/Cas9 i sgRNA mogą być dostarczane do komórek w trzech formatach: kompleks rybonukleoproteinowy (RNP) białka Cas9 i gRNA2,3; Cas9 mRNA i sgRNA4,5; lub plazmidowe DNA (pDNA), które zawiera niezbędne promotory, sterowane sgRNA i region kodujący Cas96,7,8. Wiele grup wykazało, że gdy CRISPR/Cas9 jest dostarczany jako RNP, wydajność edycji genów często przewyższa te osiągane w formatach pDNA lub mRNA, co można przypisać znacznie mniejszemu rozmiarowi RNP w porównaniu z kwasami nukleinowymi9. Co więcej, wykazano wcześniej, że nowatorska maszyna do elektroporacji lampowej (TE) jest szczególnie skuteczna w zastosowaniach związanych z edycją genów w kilku typach komórek9.

W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół wykorzystania TE do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP do komórek ssaków różnych gatunków w kilku klinicznie istotnych loci. Ta nowatorska technika transfekcji TE i zjawisko wysokiego współczynnika HDR mogą znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące utrzymania, opieki i użytkowania zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Przygotowanie komórek

  1. Zdobądź ludzkie iPSC (ACS-1030) z American Type Culture Collection (ATCC). Hodowla iPScs na sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej z pożywką do hodowli komórkowych bez podawania (patrz tabela materiałów) w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2 w temperaturze 37 °C) zgodnie z instrukcjami dostawcy.
    1. Na 2 godziny przed transfekcją należy potraktować iPSC inhibitorem Y27632 Y27632 związanym z Rho, zwiniętym zwojem zawierającym kinazę białkową (ROCK) (którego zastosowanie zmniejsza apoptozę zdysocjowanych ludzkich hiPSC oraz zwiększa przeżywalność i skuteczność klonowania hiPSC bez wpływu na ich pluripotencję).
    2. Podczas transfekcji należy rozdzielić iPSC z roztworem oddzielającym komórki (patrz tabela materiałów) na pojedyncze komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Policz liczbę komórek.
  2. Rozpocznij hodowlę komórek fibroblastów królika, używając podstawowej hodowli biopsji tkanki skóry ucha królika, jak opisano wcześniej10.
    1. Biopsję skóry ucha o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm uzyskuje się z czubka ucha królika. Zgolić włosy z tkanki ucha.
    2. Przepłukać 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco z 5% penicyliną-streptomycyną. Przenieś tkankę ucha do nowego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 6 cm, a następnie pokrój tkankę na małe kawałki (~1,0 mm x 1,0 mm). Dodaj kilka kropli płodowej surowicy bydlęcej, aby zapobiec wysychaniu tkanki.
    3. Rozprowadź rozdrobnioną tkankę w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych, a następnie dodaj 10 ml pożywki hodowlanej. Komórki fibroblastów królika są hodowane w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą. Umieścić naczynie do hodowli tkankowych w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2 w temperaturze 37 °C).
    4. Trzy do pięciu dni po posianiu użyj trypsyny-EDTA do trawienia komórek w temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Policz liczbę komórek.

2. Projektowanie i synteza gRNA i oligonukleotydów donorowych

  1. Dla każdego genu zaprojektuj RNA przewodnika na podstawie sekwencji docelowego locus za pomocą narzędzia online (na przykład ).
  2. Wklej interesującą Cię sekwencję DNA.
  3. Wybierz genom i motyw przylegający do protospaceru (PAM). Możliwe sekwencje przewodnikowe w wejściowych sekwencjach DNA zostaną wyświetlone na stronie wyjściowej. Zaleca się wybór gRNA o wyższej przewidywanej wydajności i niższym potencjale poza celem.
  4. Zsyntetyzuj DNA przez komercyjnego dostawcę do transkrypcji gRNA. Wykonać transkrypcję gRNA in vitro za pomocą zestawu do syntezy gRNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Oczyść gRNA za pomocą mikrokolumny do oczyszczania RNA zawartej w zestawie do syntezy gRNA. Zmierz stężenie, a następnie przechowuj gRNA w temperaturze -80 °C.
  6. Zaprojektuj szablon dawcy ssODN dla każdego miejsca mutacji. Numery ssODN mogą być syntetyzowane przez dostawców komercyjnych, takich jak IDT. Ogólnie rzecz biorąc, każdy ssODN ma długość 120-160 nukleotydów (nt), składających się z 60-80 nt w lewym ramieniu homologii i 60-80 nt w prawym ramieniu homologii. Aby zapobiec ponownemu przecięciu edytowanego DNA, w miarę możliwości należy wprowadzić cichą mutację w PAM w ssODN. Miejsce cięcia CRISPR powinno znajdować się jak najbliżej zamierzonej zmiany genomowej.

3. Elektroporacja rurowa Cas9 RNP i ssODN

  1. Przygotować komórki zgodnie z opisem w sekcji 1.
  2. Zawiesić 2-3 x 105 ogniw w 20 μl buforu do elektroporacji. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  3. W przypadku transfekcji Cas9 RNP należy wymieszać 2 μg białka Cas9-NLS z 0,67 μg gRNA w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-15 min. Następnie delikatnie wymieszaj utworzony kompleks RNP wraz z 2 μg ssODN z komórkami.
  4. Przenieś mieszaninę komórek do probówki do elektroporacji o pojemności 20 μl za pomocą uniwersalnych końcówek do pipet dostarczonych z zestawem do elektroporacji probówki. Aby uzyskać lepszą elektroporację, staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia.
  5. Umieść rurkę do elektroporacji w szczelinie elektroporatora i naciśnij "Go", aby zakończyć. Postępuj zgodnie z sugerowanymi przez producenta parametrami dla każdego typu ogniwa. Na przykład w przypadku ludzkich komórek iPS i fibroblastów króliczych ustawione napięcie wynosi 420 V, a czas impulsu wynosi 30 ms. Pomyślny cykl elektroporacji jest sygnalizowany raportem impulsów na ekranie wyświetlacza elektroporatora.
  6. Po elektroporacji przenieś ludzkie komórki iPS do 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej Y-27632 opisanej w części dotyczącej hodowli komórkowej. W przypadku komórek fibroblastów królika przenieś je do DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą.
  7. Umieść zawieszone komórki w jednym dołku na 12-dołkowej płytce do hodowli komórek.
  8. Codziennie zmieniaj pożywkę hodowlaną. Y-27632 usuwa się z pożywki hodowlanej iPSC dla ludzi 24 godziny po elektroporacji.

4. Analiza zdarzeń edycji genów

  1. Zbierz ogniwa 72 godziny po elektroporacji. Trawić komórki z płytki hodowlanej przy użyciu trypsyny-EDTA w przypadku komórek fibroblastów królika lub roztworu do odrywania komórek w przypadku ludzkich iPSC. Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki za pomocą 350 ml buforu do lizy (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, dodać 20 μl 20 mg/ml proteinazy K na 1 ml buforu do lizy), a następnie inkubować w temperaturze 55 °C przez noc.
  2. Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą chloroformu fenolowego przy użyciu standardowych procedur.
  3. Amplifikuj fragmenty DNA o długości 100-200 pz zawierające region docelowy za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności, a następnie oczyść fragmenty DNA z żeli za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu lub bezpośrednio z produktów PCR za pomocą minizestawu PCR SV.
  4. Aby określić skuteczność edycji genów za pomocą sekwencjonowania kolonii bakteryjnych, należy poddać ligazie oczyszczone produkty PCR do wektora pCR4-TOPO za pomocą zestawu do klonowania TOPO TA. Losowo wybierz klony bakterii, a następnie zsekwencjonuj wstawki za pomocą uniwersalnego startera sekwencjonowania dostarczonego przez zestaw do klonowania TOPO TA.
  5. Aby określić wydajność edycji genów za pomocą głębokiego sekwencjonowania, wyślij oczyszczone produkty PCR (~100-200 pz) z kroku 4.3 do sekwencjonowania amplikonów CRISPR w rdzeniu sekwencjonowania DNA.

Wyniki

TE Cas9 RNP i ssODN do komórek fibroblastów królika

Ogólny proces dostarczania Cas9 RNP do komórek ssaków za pośrednictwem TE jest zilustrowany w Rysunek 1. Po pierwsze, mutacje C231Y i Q235X zostały wytworzone w genie IL2RG, a mutacja R150G została wytworzona w genie SPR w komórkach fibroblastów królika. Wiadomo, że mutacje powodujące utratę funkcji w genach IL2RG i SPR powodują odpowiednio pierwotny niedobór odporności11 oraz deficyty motoryczne i poznawcze12.

Konkretne projekty sgRNA są zilustrowane w Rysunek 2A. Startery stosowane do amplifikacji docelowych regionów są wymienione w Tabeli 3. Sekwencje ssODN przedstawiono w tabeli 1. Tempo edycji genów określono za pomocą klonowania bakteryjnego TA (Rysunek 2B). W locus IL2RG C231, spośród 28 zsekwencjonowanych klonów, jeden (3,57%) był nosicielem dokładnej mutacji C231Y, cztery (14,28%) miały mutacje insercji lub delecji (indel), a pozostałe 23 (82%) były typu dzikiego. W locus IL2RG Q235, z 27 klonów, które zostały zsekwencjonowane, dwa (7,41%) były nosicielami dokładnej mutacji Q235X, trzy były nosicielami mutacji indel (11,11%), a pozostałe były typu dzikiego. W locus SPG R150, z 20 zsekwencjonowanych klonów, pięć (25%) było nosicielami dokładnej mutacji R150G, 10 (50%) było nosicielami mutacji indel, a pozostałe były typu dzikiego.

TE Cas9 RNP i ssODN do ludzkich iPSC

TE został następnie wykorzystany do dostarczenia Cas9 RNP i ssODN do ludzkich iPSC i celowania w klinicznie istotne loci w genach EGFR, Mybpc3 i HBB. Mutacje punktowe w regionie proksymalnym EGFR T790 nadają oporność na inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) z mutacjami aktywującymi EGFR13. Mutacja przesunięcia ramki odczytu w eksonie 16 w Mybpc3 jest związana z kardiomiopatią przerostową14. Mutacja punktowa E6V w genie HBB prowadzi do niedokrwistości sierpowatokrwinkowej15.

Konkretne projekty sgRNA są zilustrowane w Rysunek 3A. Startery stosowane do amplifikacji docelowych regionów są wymienione w Tabeli 3. Sekwencje ssODN przedstawiono w tabeli 1. Tempo edycji genów zostało określone przez DeepSeq ( Rysunek 3B). W locus EGFR 15,68% alleli zawierało dokładne mutacje punktowe (6 315 odczytów), 22,75% było nosicielami mutacji indel (9 162 odczytów), a pozostałe 61,57% było typu dzikiego (24 797 odczytów). W locus Mybpc3 37,92% było nosicielami dokładnej delecji 4-bp TGAA (11 654 odczytów), 2,24% było nosicielami mutacji indel (410 odczytów), a pozostałe 59,84% było typu dzikiego (18 692 odczytów). W locus HBB 11,65% było nosicielami dokładnej mutacji E6V (6 565 odczytów), 23,35% było nosicielami mutacji indel (13 163 odczytów), a pozostałe 65% było typu dzikiego (36 644 odczytów).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy elektroporacji rurki Cas9 RNP.

figure-results-2
Rysunek 2: Edycja genów komórek fibroblastów królika. (A) Ilustracja sekwencji docelowych. W polach zaznaczono docelowe loci. Podkreślone litery odpowiadają sekwencjom gRNA. Czerwone litery oznaczają sekwencje PAM. (B) Wyniki klonowania TA zdarzeń edycji genów. Ramki wskazują precyzyjnie zmutowane loci. Pokazana sekwencja indel jest reprezentatywna tylko dla jednego typu allelu. Inne sekwencje indel nie są pokazane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Edycja genów ludzkich iPSC. (A) Ilustracja sekwencji docelowych. W polach zaznaczono docelowe loci. Podkreślone litery odpowiadają sekwencji gRNA. Czerwone litery oznaczają sekwencje PAM. (B) Wyniki Deepseq zdarzeń edycji genów. Ramki wskazują precyzyjnie zmutowane loci. Czerwone litery oznaczają ciche mutacje, które zostały wprowadzone w szablonach dawcy. Pokazana sekwencja indel jest reprezentatywna tylko dla jednego typu allelu. Inne sekwencje indel nie są pokazane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Locus Sekwencja oligo
 
(mutacja ukierunkowana)
Królik IL2RG (C231Y)AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTATGGATGGGCTCAGCATTGGAGT
GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT
Królik IL2RG (Q235X)AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGGGCTTAGCATTGGAGT
GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT
Królik SPRgacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtggaacatctcgtgctgtgccctgcctgcagccctcagcccttcaagggctggg
Biblioteka CGCTGTAC
(Czynnik chłodniczy R150G)
Ludzki EGFRACGTGATGGAGCGTGGACAACCCCCACGTGCCTGCTGCTGCCTCTCTCACCTCTCCAACTGATTACCCCC
AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAAGACAATATTGGCTCCCCCAGTACAC
(Mutacje punktowe bliskie T790)
Ludzki Mybpc3GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGAGGACCAGCTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT<„br /> GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT
(delecja 4 pz)
Ludzki HBB TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAACCTCAAACCATCAACCTCAAACCATGCATGACTCCTGTGGGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC
CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG
(E6V)

Tabela 1: Sekwencje ssODNs.

krokproblemMożliwe przyczynyRozwiązania
2.1Niska stopa indelZła konstrukcja przewodnika RNA, zapasy przewodnika RNA >6 miesięcy, niskie stężenie przewodnikowego RNAPrzeprojektuj przewodnik RNA, wyprodukuj/zamów nowy przewodnik RNA.
2.3Niska sprawność PGEzły projekt DNA dawcy, niska wydajność przewodnika RNA, niewłaściwa ilość DNA dawcy lub niska jakość DNAZwiększ długość ramienia homologii, wprowadź mutację PAM, wprowadź ciche mutacje do DNA dawcy, użyj bardziej wydajnego przewodnika RNA, zoptymalizuj stosunek białka Cas9 do prowadzącego RNA.
3.4Nieudana transfekcjaPęcherzyki powietrza powstające podczas przenoszenia mieszaniny ogniwo-bufor do rurki do elektroporacji, nieprawidłowe ustawienie napięcia/czasu trwaniaStaraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza, dostosuj napięcie/ustawienie czasu trwania.
3.6niska żywotność ogniw po elektroporacjiNiska przeżywalność pojedynczego człowieka ipscDodaj inhibitor ROCK po elektroporacji, zwiększ liczbę komórek.
4.1Nieudany PCRWysoka zawartość GC lub powtarzająca się sekwencjaZoptymalizuj stan PCR, dodaj DMSO do systemu PCR.

Tabela 2: Poradniki rozwiązywania częstych problemów.

powiedział: powiedział: powiedział: :
Nazwa podkładukolejnośćnuta
Zobacz materiał Rb-IL2RG-FCATGACAGTGACAGGGTCCC powiedział:Do amplifikacji fragmentu DNA IL2RG królika
Rb-IL2RG-RTGCCAGAGACACAAGCGAAC
Rb-SPR-FGTACTTTGGAGGGACAGAGGDo amplifikacji fragmentu DNA SPR królika
RB-SPR-RCTCAGCACCCTGACACTGGG powiedział: CTCAGCACCCTGACACTGGG
H-EGFR-FTGATGGCCAGCGTGGACAAC powiedział: TGATGGAGCGTGGACAACDo amplifikacji fragmentu ludzkiego DNA EGFR
H-EGFR-RACCAGTTGAGCAGGTACTGGG
H-Mybpc3-FATGCCCCGTGCTTCTGGAAC powiedziałDo amplifikacji ludzkiego fragmentu DNA Mybpc3
H-Mybpc3-RTCAGGGGAGCCAACCCTCAT powiedział:
H-HBB-FTAACCTTGATACCAACCTGC powiedział:Do amplifikacji ludzkiego fragmentu DNA HBB
H-HBB-RCATTTGCTTCTGACACAACT

Tabela 3: Podkłady użyte w kroku 4.3.

Dyskusja

Metoda elektroporacji lampowej okazała się skuteczna w dostarczaniu CRISPR/Cas9 RNP i ssODN do komórek króliczych i ludzkich, co doprowadziło do solidnej, precyzyjnej edycji genów (PGE). Podstawową różnicą między TE a innymi konwencjonalnymi urządzeniami do elektroporacji jest zastosowanie rurki, w której dwie elektrody znajdują się na górze i na dole rurki, a próbka jest ładowana w całości, a następnie zamykana po elektroporacji (rysunek 1). Natomiast w konwencjonalnej kuwecie elektrody znajdują się po bokach, a próbka nie jest w pełni uszczelniona podczas elektroporacji. Ta nowa konstrukcja zmniejsza wytwarzanie pęcherzyków powietrza i ściska rozmiar pęcherzyków powietrza, co w konsekwencji poprawia równomierny rozkład napięcia elektrycznego, a w rezultacie prowadzi do zmniejszenia śmierci komórek i wysokiej wydajności transfekcji9. W niniejszej pracy osiągnięto wysokie wskaźniki PGE (15%-37%) ukierunkowane na geny EGFR, Mybpc3 i HBB w ludzkich iPSC. Wyniki te są zgodne z wcześniejszym raportem, w którym wysokie wskaźniki PGE osiągnięto w ludzkich komórkach macierzystych9.

Mutacje powodujące chorobę były celem w genach IL2RG i SPR w komórkach królika. Ostatnio króliki z nokautem IL2RG zostały wyprodukowane jako modele dla ludzkiego ciężkiego złożonego niedoboru odporności sprzężonego z chromosomem X (SCID-X1)16,17. Niniejsza praca pokazuje, że mutacje IL2RG u pacjentów (np. C231Y i Q235X) mogą być skutecznie generowane w komórkach królika, co demonstruje możliwość tworzenia modeli królików SCID-X1 zawierających mutacje pacjenta. Wykazano również, że mutacje SPR R150G mogą być skutecznie tworzone w komórkach króliczych. Mutacja ta powoduje deficyty motoryczne i poznawcze u dzieci12. Te modele królików z mutacjami IL2RG i SPR, po wygenerowaniu, mogą służyć jako cenne modele przedkliniczne do badań translacyjnych. Mogą być również wykorzystane do opracowania terapii opartych na edycji genów dla tych chorób monogenowych.

Jednym z problemów związanych z aplikacjami do edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 są zdarzenia edycji poza celem. Wskaźniki indel przeanalizowano w przewidywanych górnych miejscach poza celem dla sgRNA użytych w tym badaniu (Tabela S1), przy użyciu metod opisanych wcześniej9. W sumie przeanalizowano siedem potencjalnych loci górnych poza celem dla sg-rb-IL2RG-01, pięć dla sg-rb-SPR, siedem dla sg-hEGFR, pięć dla sg-hMybpc3 i siedem dla sg-hHBB), przy użyciu starterów wymienionych w tabeli S2. W testach T7E1 nie ujawniono żadnych niedocelowych indeli (Figura S1), co wskazuje na minimalne ryzyko niedocelowej edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu tych sgRNA. Wskazuje to również, że sama metoda elektroporacji lampy nie powoduje ani nie zwiększa zmian poza celem. Niemniej jednak należy dołożyć starań, aby ograniczyć lub wyeliminować niechciane edycje niezgodne z celem. Sekwencjonowanie całego genomu może być konieczne w celu wykluczenia takich zdarzeń w przypadku komórek, które są przeznaczone do zastosowań klinicznych.

Na poziomie technicznym następujące czynniki są uważane za kluczowe dla osiągnięcia wydajnej, precyzyjnej edycji genomu za pomocą elektroporacji probówkowej CRISPR/Cas9 RNP. Po pierwsze, zaleca się wybór wydajnego sgRNA o przewidywanym niskim potencjale off-target. Ważne jest, aby zweryfikować wydajność indel wybranego sgRNA przed użyciem go do zastosowań PEG. Nierzadko zdarza się, że oprogramowanie przewidywane dobre sgRNA zawodzi na etapie walidacji.

Po drugie, aby osiągnąć wysokie PGE, zaleca się indukowanie mutacji PAM u dawcy ssODN, gdy tylko jest to możliwe. Uzasadnieniem jest to, że w ten sposób zapobiega się ponownemu cięciu CRISPR/Cas9 po integracji szablonu dawcy. W niektórych przypadkach PGE sama wprowadza mutacje PAM. W innych przypadkach możliwe jest wprowadzenie cichych mutacji do sekwencji PAM. W przypadku, gdy mutacja PAM nie jest możliwa, zaleca się próbę włączenia kilku cichych mutacji do dawcy, które odpowiadają sekwencji sgRNA.

Po trzecie, szczególnie istotne dla TE, ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia komórek i mieszaniny RNP do rurki do elektroporacji. Chociaż konstrukcja rurki TE już minimalizuje tworzenie się pęcherzyków powietrza, ostrożne obchodzenie się z nią jeszcze bardziej ograniczy, a może nawet całkowicie pozwoli uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Przewodnik rozwiązywania częstych problemów, które można napotkać podczas stosowania elektroporacji lampowej do precyzyjnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9, znajduje się w tabeli 2.

Podsumowując, wykazano tutaj, że elektroporacja lampowa jest skutecznym sposobem dostarczania CRISPR/Cas9 RNP i ssODN do komórek ssaków w celu osiągnięcia wysokich wskaźników PGE. Ta nowa technika transfekcji TE i jej solidne, precyzyjne tempo edycji genów może ułatwić rozwój aplikacji do edycji genów.

Oświadczenia

J. C. pracuje w firmie Celetrix LLC, producencie elektroporatorów lampowych. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C. i J. X. nie deklarują braku sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R21OD023194 do JX). W pracach wykorzystano usługi podstawowe wspierane przez Centrum Zaawansowanych Modeli Nauk Translacyjnych i Terapii (CAMTraST) w Centrum Medycznym Uniwersytetu Michigan.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AccutaseSTEMCELL Technologies792Roztwór do odłączania komórek dla ludzkich komórek iPSC, po raz pierwszy użyty w kroku 1.1.2. 
Nukleaza Cas9 3NLSIDT1074182białko Cas9, po raz pierwszy użyte w kroku 3.3. 
DMEMThermo Fisher11965092Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2.3. 
DPBSThermo Fisher1708075Do przygotowania hodowli komórkowej, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2.2. 
EDTALonza51201Do wytwarzania buforu do lizy, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1. 
Bufor do elektroporacjiCeletrix13– 0104Bufor do elektroporacji, po raz pierwszy użyty w kroku 3.2. 
Rurki do elektroporacjiCeletrix20 μ L: 12– 0107; 120 μ L: 12– 0104Rurka do elektroporacji, po raz pierwszy użyta w kroku 3.4. 
ElektroporatorCeletrixCTX-1500A LEMaszyna do elektroporacji rurkowej, po raz pierwszy użyta w kroku 3.5
Surowica bydlęcapłodu Sigma Aldrich12003CDo hodowli komórkowej, po raz pierwszy użyta w kroku 1.2.2. 
Forma CO2 InkubatoryThermo FisherModel 370Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyty w kroku 1.1. 
Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28115Do oczyszczania żelu, po raz pierwszy użyty w kroku 4.3. 
Ludzkie  indukowane pluripotencjalne komórki macierzysteKolekcja kultur typu amerykańskiegoACS-1030Ludzkie iPSC, po raz pierwszy użyte w kroku 1.1. 
Matrigel                                                     Corning354277Sztuczna matryca zewnątrzkomórkowa; do wstępnego powlekania płytki do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyta w kroku 1.1. 
mTeSR 1 średni STEMCELL Technologies85850Bezkarmowe podłoże do hodowli komórkowych dla ludzkich iPSC, po raz pierwszy użyte w kroku 1.1. 
PCR SV miniGeneAll103-102Do oczyszczania produktu PCR, po raz pierwszy użyty w kroku 4.3. 
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher15140163Do przygotowania hodowli komórkowej, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2.2. 
Chloroform fenolowyThermo Fisher15593031Do ekstrakcji DNA, po raz pierwszy użyty w kroku 4.2. 
Precyzyjny zestaw do syntezy gRNAInvitrogenA29377Do generowania gRNA o pełnej długości (przewodnika RNA), po raz pierwszy użyty w kroku 2.4. 
Roztwór proteinazy KThermo FisherAM2548Do ekstrakcji DNA, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1. 
Q5 polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0491Do amplifikacji PCR, po raz pierwszy użyta w kroku 4.3. 
Dodecylosiarczan soduSigma AldrichL3771Do wytwarzania buforu do lizy, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1. 
Zestaw do klonowania TA Thermo FisherK457502Do sekwencjonowania klonów TA, po raz pierwszy użyty w kroku 4.4. 
Naczynie do hodowli tkankowych (10 cm)FALCON353003Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyte w kroku 1.2.3. 
Naczynie do hodowli tkankowej (12 dołków)FALCON353043Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyte w kroku 3.7. 
Naczynie do hodowli tkankowych (6 cm)FALCON353004Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyte w kroku 1.2.2. 
Tris HClThermo FisherBP1757-500Do wytwarzania buforu do lizy, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1. 
Trypsin-EDTAThermo Fisher25200056Do trawienia komórek, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2. 4.
Uniwersalne końcówki do pipet Celetrix14-0101Do elektroporacji, po raz pierwszy użyty w kroku 3.4. 
Y27632LC LabsY-5301Hibotor apoptozy, po raz pierwszy użyty w kroku 1.1.1. 

Bibliografia

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  3. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  4. Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
  5. Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  6. Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
  7. Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
  8. Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
  9. Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649(2018).
  10. Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
  11. Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  12. Friedman, J., et al. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  13. Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
  14. Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
  15. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  16. Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429(2018).
  17. Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNP CRISPR Cas9ludzkie iPSCfibroblasty kr likadonor ssODNbufor do elektroporacjibia ko Cas9 z NLSsekwencjonowanie g bokiebakteryjne klonowanie TA

Powiązane artykuły