Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków

36K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59519

⸱

16 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Hodowlane pierwotne lub ustalone linie komórkowe są powszechnie używane do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych i mechanistycznych jako wstępne podejście przed użyciem modeli zwierzęcych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować ekstrakty z całych komórek i frakcje subkomórkowe do badań (Zn) i innych pierwiastków śladowych za pomocą atomowej spektroskopii absorbancji.

Streszczenie

Metale przejściowe są niezbędnymi mikroelementami dla organizmów, ale mogą być toksyczne dla komórek w wysokich stężeniach, konkurując z fizjologicznymi metalami w białkach i generując stres redoks. Stany patologiczne, które prowadzą do zubożenia lub akumulacji metalu, są czynnikami sprawczymi różnych chorób człowieka. Niektóre przykłady obejmują niedokrwistość, enteropatię akrodermitis oraz choroby Wilsona i Menkesa. Dlatego ważne jest, aby móc mierzyć poziomy i transport metali przejściowych w próbkach biologicznych z dużą czułością i dokładnością, aby ułatwić badania nad tym, w jaki sposób pierwiastki te przyczyniają się do normalnych funkcji fizjologicznych i toksyczności. Na przykład (Zn) jest kofaktorem w wielu białkach ssaków, uczestniczy w zdarzeniach sygnalizacyjnych i jest wtórnym przekaźnikiem w komórkach. W nadmiarze Zn jest toksyczny i może hamować wchłanianie innych metali, podczas gdy w niedoborze może prowadzić do różnych potencjalnie śmiertelnych stanów.

Spektroskopia absorpcji atomowej w piecu grafitowym (GF-AAS) zapewnia bardzo czułą i skuteczną metodę oznaczania stężeń Zn i innych metali przejściowych w różnych próbkach biologicznych. Atomizacja elektrotermiczna za pomocą GF-AAS określa ilościowo metale poprzez rozpylanie małych objętości próbek w celu późniejszej selektywnej analizy absorpcyjnej przy użyciu długości fali wzbudzenia pierwiastka będącego przedmiotem zainteresowania. W granicach liniowości prawa Beera-Lamberta absorbancja światła przez metal jest wprost proporcjonalna do stężenia analitu. W porównaniu z innymi metodami oznaczania zawartości Zn, GF-AAS wykrywa zarówno wolny, jak i skompleksowany Zn w białkach i ewentualnie w małych cząsteczkach wewnątrzkomórkowych z wysoką czułością w małych objętościach próbek. Co więcej, GF-AAS jest również łatwiej dostępny niż spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) lub fluorescencja rentgenowska oparta na synchrotronie. W metodzie tej opisano systematyczne przygotowanie próbek różnych hodowanych linii komórkowych do analiz w GF-AAS. Różnice w tym pierwiastku śladowym porównano zarówno w lizatach całych komórek, jak i we frakcjach subkomórkowych komórek proliferujących i zróżnicowanych jako dowód zasady.

Wprowadzenie

Metale przejściowe i ciężkie, takie jak Zn, Cu, Mn i Fe, występują naturalnie w środowisku zarówno w składnikach odżywczych w żywności, jak i w zanieczyszczeniach. Wszystkie żywe organizmy potrzebują różnych ilości tych mikroelementów; Jednak narażenie na wysokie poziomy jest szkodliwe dla organizmów. Pozyskiwanie metali odbywa się głównie poprzez dietę, ale metale mogą być również wdychane lub wchłaniane przez skórę1,2,3,4,5. Należy zauważyć, że obecność metali w cząsteczkach atmosferycznych wzrasta i w dużej mierze wiąże się z zagrożeniami dla zdrowia. Ze względu na działalność antropogeniczną w pyłach atmosferycznych, wodzie deszczowej i gleb><>. Metale te mają potencjał, aby konkurować z niezbędnymi fizjologicznymi pierwiastkami śladowymi, w szczególności Zn i Fe, i wywołują efekty toksyczne poprzez inaktywację podstawowych enzymów procesów biologicznych.

Pierwiastek śladowy Zn jest redoks neutralny i zachowuje się jak kwas Lewisa w reakcjach biologicznych, co czyni go podstawowym kofaktorem niezbędnym do fałdowania białek i aktywności katalitycznej w ponad 10% białek ssaków8,9,10; w związku z tym jest niezbędny dla różnych funkcji fizjologicznych8,11. Jednak, podobnie jak w przypadku wielu pierwiastków śladowych, istnieje delikatna równowaga między tymi metalami, które ułatwiają normalne funkcje fizjologiczne i powodują toksyczność. U ssaków niedobory Zn prowadzą do niedokrwistości, opóźnienia wzrostu, hipogonadyzmu, nieprawidłowości skórnych, biegunki, łysienia, zaburzeń smaku, przewlekłych stanów zapalnych oraz upośledzenia funkcji immunologicznych i neurologicznych11,12,13,14,15,16,17,18. W nadmiarze, Zn jest cytotoksyczny i upośledza wchłanianie innych niezbędnych metali, takich jak miedź19,20,21.

Dodatkowo, niektóre metale, takie jak Cu i Fe, mogą potencjalnie uczestniczyć w szkodliwych reakcjach. Produkcja reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą chemii Fentona może zakłócać składanie białek klastra siarki żelaza i zmieniać metabolizm lipidów22,23,24. Aby zapobiec tym uszkodzeniom, komórki wykorzystują białka opiekuńcze i transportery wiążące metale, aby zapobiec skutkom toksycznym. Niewątpliwie homeostaza metali musi być ściśle kontrolowana, aby zapewnić, że określone typy komórek utrzymują odpowiedni poziom metali. Z tego powodu istnieje znaczna potrzeba udoskonalenia technik dokładnego pomiaru metali śladowych w próbkach biologicznych. W organizmach rozwijających się i dojrzałych istnieje zróżnicowane biologiczne zapotrzebowanie na pierwiastki śladowe na poziomie komórkowym, na różnych etapach rozwoju oraz w warunkach normalnych i patologicznych. Dlatego precyzyjne określenie tkankowych i ogólnoustrojowych poziomów metali jest niezbędne do zrozumienia homeostazy metali w organizmie.

Spektrometria absorpcji atomowej w piecu grafitowym (GF-AAS) jest bardzo czułą techniką stosowaną do małych objętości próbek, dzięki czemu idealnie nadaje się do pomiaru metali przejściowych i ciężkich obecnych w próbkach biologicznych i środowiskowych25,26,27,28. Ponadto, ze względu na wysoką czułość techniki, wykazano, że jest ona odpowiednia do badania właściwości transportu precyzyjnego ATPazy Na+/K+-ATPazy i żołądkowej H+/K+-ATPazy przy użyciu oocytów Xenopus jako systemu modelowego29. W GF-AAS rozpylone pierwiastki w próbce pochłaniają długość fali promieniowania emitowanego przez źródło światła zawierające interesujący nas metal, przy czym pochłonięte promieniowanie jest proporcjonalne do stężenia pierwiastka. Elementarne wzbudzenie elektronowe odbywa się po absorpcji promieniowania ultrafioletowego lub widzialnego w skwantowanym procesie unikalnym dla każdego pierwiastka chemicznego. W procesie jednoelektronowym absorpcja fotonu polega na tym, że elektron przemieszcza się z niższego poziomu energetycznego na wyższy poziom w atomie, a GF-AAS określa ilość fotonów pochłoniętych przez próbkę, która jest proporcjonalna do liczby pierwiastków pochłaniających promieniowanie rozpylonych w rurce grafitowej.

Selektywność tej techniki opiera się na strukturze elektronowej atomów, w której każdy pierwiastek ma określoną linię widmową absorpcji/emisji. W przypadku Zn długość fali absorbancji wynosi 213,9 nm i można ją precyzyjnie odróżnić od innych metali. Ogólnie rzecz biorąc, GF-AAS może być używany do ilościowego oznaczania Zn z odpowiednimi granicami wykrywalności (LOD) oraz wysoką czułością i selektywnością25. Zmiany pochłoniętej długości fali są integrowane i przedstawiane jako szczyty absorpcji energii na określonych i izolowanych długościach fal. Stężenie Zn w danej próbce oblicza się zwykle na podstawie krzywej wzorcowej znanych stężeń zgodnie z prawem Beera-Lamberta, w której absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia Zn w próbce. Jednak zastosowanie równania Beera-Lamberta do analiz GF-AAS również wiąże się z pewnymi komplikacjami. Na przykład różnice w atomizacji i/lub niejednorodne stężenia próbek mogą mieć wpływ na pomiary metalu.

Atomizacja metalu wymagana do analizy pierwiastków śladowych GF AAS składa się z trzech podstawowych kroków. Pierwszym krokiem jest desolwatacja, w której ciekły rozpuszczalnik jest odparowywany; pozostawienie suchych związków po osiągnięciu przez piec temperatury około 100 °C. Następnie związki są odparowywane poprzez podgrzanie ich od 800 do 1 400 °C (w zależności od analizowanego pierwiastka) i stają się gazem. Wreszcie związki w stanie gazowym są rozpylane w temperaturach od 1,500 do 2,500 °C. Jak omówiono powyżej, wzrost stężenia metalu będącego przedmiotem zainteresowania spowoduje proporcjonalny wzrost absorpcji wykrytej przez GF-AAS, jednak piec zmniejsza zakres dynamiczny analizy, który jest roboczym zakresem stężeń, które można określić za pomocą przyrządu. W związku z tym technika ta wymaga niskich stężeń i starannego wyznaczenia zakresu dynamicznego metody poprzez wyznaczenie LOD i granicy liniowości (LOL) prawa Beera-Lamberta. LOD jest minimalną ilością wymaganą do wykrycia substancji, zdefiniowaną jako trzykrotność odchylenia standardowego Zn w matrycy. LOL to maksymalne stężenie, które można wykryć za pomocą prawa Beera-Lamberta.

W tej pracy opisujemy standardową metodę analizy poziomów Zn w ekstraktach z całych komórek, frakcjach cytoplazmatycznych i jądrowych oraz w proliferujących i różnicujących się hodowanych komórkach (Rysunek 1). Dostosowaliśmy protokół szybkiej izolacji jąder do różnych systemów komórkowych, aby zapobiec utracie metalu podczas przygotowywania próbki. Wykorzystane modele komórkowe to pierwotne mioblasty pochodzące z mysich komórek satelitarnych, mysie komórki nerwiaka zarodkowego (N2A lub Neuro2A), mysie adipocyty 3T3 L1, ludzka nienowotworowa linia komórek nabłonka piersi (MCF10A) oraz nabłonkowe komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK). Komórki te zostały stworzone z różnych linii i są dobrymi modelami do badania specyficznych dla danej linii zmian poziomów metali in vitro.

Pierwotne mioblasty pochodzące z mysich komórek satelitarnych stanowią dobrze dopasowany model in vitro do badania różnicowania mięśni szkieletowych. Proliferacja tych komórek jest szybka, gdy są hodowane w warunkach wysokiej surowicy. Różnicowanie w linię mięśniową jest następnie indukowane przez warunki niskiej surowicy30. Linia komórkowa nerwiaka zarodkowego myszy (N2A) została wyprowadzona z grzebienia nerwowego myszy. Komórki te prezentują morfologię neuronalnych i ameboidalnych komórek macierzystych. Po bodźcu różnicującym komórki N2A wykazują kilka właściwości neuronów, takich jak neurofilamenty. Komórki N2A są używane do badania choroby Alzheimera, przerostu neurytów i neurotoksyczności31,32,33. Mysia linia komórkowa preadipocytów 3T3-L1 jest powszechnie stosowana do badania zmian metabolicznych i fizjologicznych związanych z adipogenezą. Komórki te mają morfologię podobną do fibroblastów, ale po pobudzeniu do różnicowania wykazują aktywację enzymatyczną związaną z syntezą lipidów i akumulacją trójglicerydów. Można to zaobserwować jako zmiany morfologiczne powodujące powstawanie cytoplazmatycznych kropelek lipidów34,35. MCF10A to nienowotworowa linia komórek nabłonka sutka pochodząca od kobiety przed menopauzą z chorobą torbielowatą sutka36. Jest szeroko stosowany w badaniach biochemicznych, molekularnych i komórkowych związanych z karcynogenezą sutka, takich jak proliferacja, migracja komórek i inwazja. Linia komórek nabłonkowych nerki psów Madin-Darby (MDCK) jest szeroko wykorzystywana do badania właściwości i zdarzeń molekularnych związanych z ustaleniem fenotypu nabłonkowego. Po osiągnięciu konfluencji, komórki te stają się spolaryzowane i tworzą zrosty komórka-komórka, cechy charakterystyczne tkanek nabłonkowych ssaków37.

Aby przetestować zdolność AAS do pomiaru poziomu Zn w komórkach ssaków, przeanalizowaliśmy całe i subkomórkowe frakcje (cytozol i jądro) tych pięciu linii komórkowych. Pomiary AAS wykazały różne stężenia Zn w tych typach komórek. Stężenia były niższe w proliferujących i różnicujących się pierwotnych mioblastach (od 4 do 7 nmol/mg białka) i wyższe w czterech ustalonych liniach komórkowych (w zakresie od 20 do 40 nmol/mg białka). Niewielki, nieistotny wzrost poziomu Zn wykryto w różnicowaniu pierwotnych mioblastów i komórek nerwiaka zarodkowego w porównaniu z komórkami proliferującymi. Odwrotny efekt wykryto w zróżnicowanych adipocytach. Jednak proliferujące komórki 3T3-L1 wykazywały wyższe stężenia metalu w porównaniu z komórkami zróżnicowanymi. Co ważne, w tych trzech liniach komórkowych frakcjonowanie subkomórkowe wykazało, że Zn jest różnie rozmieszczony w cytozolu i jądrze w zależności od stanu metabolicznego tych komórek. Na przykład w proliferujących mioblastach, komórkach N2A i preadipocytach 3T3-L1 większość metalu jest zlokalizowana w jądrze. Po indukcji różnicowania za pomocą określonych zabiegów komórkowych, Zn lokalizował się w cytozolu w tych trzech typach komórek. Co ciekawe, obie nabłonkowe linie komórkowe wykazywały wyższe poziomy Zn podczas proliferacji w porównaniu do osiągania konfluencji, w której utworzyła się charakterystyczna ciasna monowarstwa. W proliferujących komórkach nabłonkowych linia komórkowa sutka MCF10A miała równy rozkład Zn między cytozolem a jądrem, podczas gdy w linii komórkowej pochodzącej z nerki większość metalu znajdowała się w jądrze. W tych dwóch typach komórek, gdy komórki osiągnęły zbieg, Zn był głównie zlokalizowany w cytozolu. Wyniki te pokazują, że GF-AAS jest bardzo czułą i dokładną techniką przeprowadzania analizy pierwiastkowej w próbkach o niskiej wydajności. GF-AAS w połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i może być przystosowany do badania poziomów pierwiastków śladowych w różnych liniach komórkowych i tkankach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek ssaków

  1. Uwagi ogólne
    1. Postępuj zgodnie z technikami aseptycznymi dla hodowli komórek ssaków, które zostały wcześniej przejrzane38.
    2. Utrzymuj wszystkie linie komórkowe w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Warunki hodowli komórkowej różnią się w zależności od typu komórki. Ważne jest, aby utrzymać odpowiednie warunki hodowli dla każdej użytej linii komórkowej, ponieważ zmiany w tych procedurach doprowadzą do nieprawidłowych fenotypów i niepowodzenia hodowli komórkowej.
    3. Upewnij się, że jesteś zaznajomiony z interesującą Cię linią komórkową i postępuj zgodnie z protokołami dostarczonymi dla każdego typu komórki wybranego do określonych eksperymentów (patrz kilka przykładów poniżej).
  2. Ogólna procedura trypsynizacji i przechodzenia przez przylegające komórki
    1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z płytki hodowlanej przez aspirację.
    2. Delikatnie umyj komórki za pomocą PBS bez wapnia i magnezu (5 ml na 10cm2 powierzchni hodowli). Dodaj roztwór myjący z boku płytki, aby uniknąć oderwania monowarstwy komórek; Zakręć płytką, aby zmaksymalizować pokrycie roztworu. W przypadku komórek nabłonkowych konieczne jest inkubowanie komórek przez 10 do 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C w PBS, aby ułatwić dysocjację komórek w kolejnych etapach.
    3. Usunąć roztwór myjący przez aspirację.
    4. Dodać wystarczającą ilość odczynnika dysocjacyjnego (0,25% trypsyny) do płytki (około 0,7 ml na 10 cm2). Delikatnie zakręć płytką, aby uzyskać pełne pokrycie monowarstwy komórek.
    5. Inkubuj kulturę w temperaturze pokojowej przez 2 do 5 minut. Rzeczywisty czas inkubacji różni się w zależności od użytej linii komórkowej, w przypadku komórek nabłonkowych zaleca się inkubację przez 10 do 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek.
    6. Gdy większość komórek odłączy się, odzyskaj zawiesinę komórek w 5 ml wstępnie podgrzanego posiewu lub pożywki wzrostowej (poniżej znajduje się kilka przykładów). Mechanicznie dysocjuj grudki komórek, kilkakrotnie pipetując monowarstwę komórki.
    7. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować je przy 1 000 x g przez 2 do 5 minut. Szybkość i czas wirowania różnią się w zależności od typu komórki. Usuń pożywkę przez delikatne zasysanie, uważając, aby nie dotknąć osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w 5 do 10 ml odpowiedniej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i usunąć próbkę do policzenia za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    8. Wykorzystaj odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby wysiać zalecaną gęstość dla każdej konkretnej linii komórkowej (poniżej znajduje się kilka przykładów). Uzupełnić odpowiednią ilością pożywki hodowlanej w zależności od wielkości naczynia hodowlanego i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.
  3. Pierwotne mioblasty pochodzące z mysich komórek satelitarnych
    1. Przed rozpoczęciem przygotuj płytki pokryte kolagenem do pierwotnego wzrostu mioblastów. Roztwór zawierający 0,02% kolagenu i 0,05 M kwasu octowego w wodzie dejonizowanej musi być sterylizowany przez filtrację za pomocą sterylnego urządzenia filtrującego 0,22 μm. Inkubować płytki hodowlane z roztworem kolagenu przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego dnia odessać roztwór kolagenu, pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu w sterylnej szafce i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Minimalne objętości kolagenu to: dla 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 ml; 10 cm = 5 ml.
    3. Wysiewaj pierwotne mioblasty w 1 x 104 komórki/cm2 w 55 cm2 płytki hodowlane pokryte kolagenem. Pożywką proliferacyjną jest pożywka hodowlana Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 zawierająca 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 ng/ml rekombinowanego podstawowego fibroblastycznego czynnika wzrostu (FGF) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.
      UWAGA: Komórki proliferacyjne i wyjściowe powinny być utrzymywane poniżej 50% zręby. Kontakt z komórkami indukuje zaangażowanie komórek w różnicowanie miogeniczne i upośledza zdolności wzrostu hodowli.
    4. Aby różnicować pierwotne mioblasty, pozwól komórkom osiągnąć 80% do 100% zbieżności, co zwykle następuje po 48 godzinach posiewu. Następnie zmień na pożywki różnicujące (DMEM, 2% surowica końska, 1% insulina, transferyna, suplement selenu A i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny). Odświeżaj podłoże codziennie aż do zbiorów.
  4. Mysi neuroblastoma (N2A)
    1. Płytki N2A komórki o gęstości 2 x 104 komórki/cm2 w pożywce wzrostowej, zawierającej mieszaninę pożywki o obniżonej surowicy/DMEM zawierającej wysoką glukozę i L-glutaminę (1:1, v:v), suplement 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Utrzymuj kulturę zapasów poniżej 50% konfluencji.
    2. Indukuj różnicowanie komórek N2A, gdy zbieg osiągnie 25% do 40%. Zmienić na pożywkę różnicującą zawierającą mieszaninę pożywki o zmniejszonej surowicy/DMEM, 1% FBS i 20 μM kwasu retinowego przez 7 do 10 dni. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień, aż do zbioru komórek.
      UWAGA: W miarę różnicowania się komórek N2A niektóre komórki stają się okrągłe, łatwo się odklejają i mogą ulegać apoptozie. Zachowaj ostrożność podczas zasysania i dodawania pożywki hodowlanej do płytek.
  5. 3T3 L1 mysie preadipocyty
    1. Utrzymuj mysie komórki 3T3 / L1 w DMEM o wysokim poziomie glukozy, uzupełnione 10% FBS i 100 U / ml penicyliny / streptomycyny. Proces adipogenny jest zależny od zbiegania się komórek; Dlatego nie pozwól, aby kultura podstawowa rosła powyżej 50% konfluencji, ponieważ wyższa konfluencja upośledza zdolność komórek do różnicowania.
    2. Umieść komórki w odległości 2 x 104 komórek/cm2. Przy tej gęstości komórki osiągną konfluencję w ciągu 3 dni.
    3. Indukuj różnicowanie adipogenne dwa dni po osiągnięciu przez komórki 100% zbieżności. Pożywka indukcyjna składa się z DMEM zawierającego 10% FBS, 10 μg/ml insuliny, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyksantyny, 1 μM deksametazonu i 10 μM troglitazonu.
    4. Po 48 godzinach inkubacji wymienić pożywkę indukcyjną na pożywkę różnicującą (DMEM zawierający 10% FBS i 5 μg/ml insuliny). Odświeżaj podłoże co drugi dzień, aż do zbiorów. Reprezentatywne próbki o pełnym zróżnicowaniu są zwykle pobierane między 7 a 10 dniem po indukcji adipogennej.
      UWAGA: W miarę postępu adipogenezy komórki stają się okrągłe i mają tendencję do łatwego odklejania się. Zachowaj ostrożność podczas zasysania i dodawania pożywki hodowlanej do płytek.
  6. Ogniwa MCF10A
    1. Płytki komórek MCF10A w DMEM/F12 (1:1, v:v), uzupełnione 5% FBS, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 10 μg/ml insuliny i 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF). Zalecana gęstość wysiewu to 1 x 105 komórek/cm2. W tych warunkach komórki osiągną 100% konfluencję w ciągu 4 dni. Odświeżaj podłoże co 2 do 3 dni aż do zbiorów.
      UWAGA: Ogniwa MCF10A są trudne do odłączenia. Zaleca się inkubację komórek przez 10 do 15 minut w temperaturze 37 °C w PBS wolnym od wapnia z 0,5 mM EDTA przed trypsynizacją.
  7. Komórki nerkowe psów Madin-Darby (MDCK)
    1. Płytki komórki MDCK w DMEM uzupełnione 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Zalecana gęstość wysiewu to 1 x 105 komórek/cm2, gdzie komórki osiągną 100% zbieżność w ciągu 3 dni. Odświeżaj podłoże co 2 dni aż do zbiorów.
      UWAGA: Ogniwa MDCK są trudne do odłączenia. Zaleca się inkubację komórek przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C w PBS wolnym od wapnia i magnezu przed trypsynizacją. Aby zapobiec zbrylaniu się komórek, nie należy mieszać płytek poprzez uderzanie lub potrząsanie kolbą w oczekiwaniu na oderwanie się komórek.

2. Przygotowanie próbki do hodowli komórek ssaków do AAS: frakcjonowanie całych komórek i subkomórkowych

  1. Hoduj interesujące komórki na 55 cm2 płytkach. Użycie mniejszych płytek hodowlanych może prowadzić do uzyskania próbek, w których poziom metali mieści się w granicach wykrywalności GF-AAS.
  2. Ekstrakt z całych komórek
    1. Zassać pożywkę hodowlaną za pomocą pułapki próżniowej. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie ślady nośnika. Przepłucz komórki z żądanych punktów czasowych lub warunków hodowli trzykrotnie lodowatym PBS wolnym od wapnia i magnezu.
    2. Natychmiast zeskrobać komórki z płytki za pomocą nowego plastikowego skrobaka do komórek w 1 ml PBS wolnego od wapnia i magnezu. Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 2 minuty przy 2 000 x g i odessać supernatant. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Przechowywać próbki granulek w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 2.4.
  3. Frakcjonowanie subkomórkowe
    1. Zassać pożywkę hodowlaną za pomocą pułapki próżniowej. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie ślady nośnika. Przepłucz komórki z żądanych punktów czasowych lub warunków hodowli trzykrotnie lodowatym PBS wolnym od wapnia i magnezu. Zeskrob komórki z płytki za pomocą 1 ml lodowatego PBS wolnego od wapnia i magnezu.
    2. Przenieść próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie. Wirować przez 10 s przy 10 000 x g. Kontynuować szybką izolację jąder, jeśli pożądana jest analiza metali frakcji cytoplazmatycznych i jądrowych. Ta procedura zminimalizuje potencjalną utratę metali w wyniku ekstrakcji komórek39,40.
    3. Usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl lodowatego PBS wolnego od wapnia i magnezu, zawierającego 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), niejonowego detergentu. Przenieść 100 μl do nowej probówki do mikrowirówki i traktować ją jako próbkę całej komórki. Podwielokrotność ta stanowi 25 % próby.
    4. Wyizolować jądra, pipetując zawiesinę komórek 5 do 10 razy na lodzie za pomocą końcówki do mikropipety P1000. Izolacja jąder komórek nabłonkowych wymaga stężenia 0,5 % NP-40. Osiągnij dysocjację komórek, przepuszczając zawiesinę komórkową przez igłę 26 3/4 G 10 do 15 razy, a następnie 10 do 15 przejść przez igłę 30 1/2 G.
      UWAGA: Sprawdź integralność jąder za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu obiektywu 40x.
    5. Pozostałą zawiesinę lizatu komórkowego (300 μl) odwirować przez 10 s przy 10 000 x g. Supernatant będzie zawierał frakcję cytozolową. Przenieść 300 μl do nowej probówki do mikrowirówki.
    6. Przepłukać osad zawierający frakcję jądrową w 500 μl PBS wolnym od wapnia i magnezu, zawierającym 0,1% NP-40, a następnie odwirować przez 10 s przy 10 000 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający jądra w 100 μl tego samego roztworu.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Poddać komórki lizie przez trzy cykle sonikacji (30 s wł./30 s wyłącz., przy 50 kHz, 200 W) przez 5 min. Określić ilościowo całkowitą zawartość białka w próbce za pomocą Bradford41.
  5. Przeprowadzić kontrolę jakości czystości frakcji metodą western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla frakcji jądrowej (histony, remodelery chromatyny, białka macierzy jądrowej) lub cytozolowej (β-tubulina, β-aktyna) (Rysunek 2).
    UWAGA: Nie używaj sonikatorów z metalową końcówką. Mogą one zanieczyścić próbkę metalami.

3. Analiza zawartości Zn w całych komórkach i subkomórkowych frakcjach kultur komórkowych ssaków za pomocą atomowej spektroskopii absorbancji

  1. Próbki kultur komórkowych (całe komórki lub frakcje jądrowe) należy mineralizować przez trawienie kwasowe przy użyciu równej objętości stężonego HNO3 klasy metali śladowych (UWAGA) przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C, a następnie przez noc w temperaturze 20 °C.
  2. Zatrzymać reakcję, dodając 30% objętości reakcyjnejH2O2. Doprowadzić objętość próbki do 500 μl za pomocą 18 MΩ oczyszczonej wody.
    UWAGA: Obchodzenie się z HNO3 powinno odbywać się w okularach ochronnych przed chemikaliami, osłonie twarzy chroniącej przed rozpryskami, rękawicach i zatwierdzonej masce oddechowej, jeśli odpowiednia wentylacja (okap wyciągowy) nie jest dostępna. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Przygotować roztwory wzorcowe i próbki doświadczalne do pomiarów Zn za pomocą AAS wyposażonego w piec grafitowy.
    1. Użyć 2% (v/v) roztworu HNO3 w wodzie dejonizowanej, pochodzącego z tej samej partii, która jest używana do krzywej wzorcowej, co roztwór ślepej próby do kalibracji w całym tekście. Stosować wzorce czystości analitycznej rozcieńczone w wodzie oczyszczonej o mocy 18 MΩ.
    2. Przygotować wzorzec 1,000 ppb Zn z dostępnego w handlu roztworu podstawowego Zn 1,000 ppm z 2% (v/v) roztworem HNO3 w wodzie dejonizowanej. Przygotować robocze roztwory wzorcowe ze wzorca 100 ppb, rozcieńczając je do 5, 8, 10, 15, 20 i 25 ppb bezpośrednio 2% (v/v) roztworem HNO3 w wodzie dejonizowanej. Przygotować wzorce Zn i ślepą próbę z modyfikatorem matrycy 0,1% (1 g/l) Mg(NO3)2.
      UWAGA: LOD Zn wynosi 0,01 ppb (μg/L). Zwiększając stężenie wzorców, granicę liniowości Zn wyznaczono na 20 ppb (Rysunek 3).
    3. Pomiar wzorca i próbek w tych samych zoptymalizowanych warunkach: natężenie przepływu przy wprowadzaniu 250 ml/min, temperatura wtrysku 20 °C i temperatura GF 1 800 °C.
      UWAGA: Temperatura GF została zwiększona do 2450 °C dla etapów czyszczenia, przed wstrzyknięciem nowej próbki lub wzorca.
    4. Zoptymalizuj lampę (C-HCL) do prądu 20 A, długości fali 213,9 nm i szczeliny 0,7 nm.
    5. Zmierzyć zmineralizowane próbki za pomocą krzywej wzorcowej Zn w celu określenia zawartości metalu. Ponieważ mierzone są małe objętości, próbki mogą odparować, jeśli pomiary trwają długo. Dlatego zaleca się dodawanie wody do próbek. Rozcieńczyć próbki oczyszczoną wodą o mocy 18 MΩ poddaną działaniu 0,01% HNO3 (czystości analitycznej), jeżeli uzyskane dane wykraczają poza granicę oznaczalności.
      UWAGA: Zazwyczaj próbki rozcieńcza się do objętości 500 μl i umieszcza w automatycznym podajniku próbek AAS, który ma być mierzony zaraz po ustaleniu krzywej wzorcowej. Wymagana objętość powinna zostać określona przez użytkownika i powinna uwzględniać końcowe obliczenia stężeń. Zaleca się zakończenie oznaczania Zn za pomocą AAS całego eksperymentu za jednym razem. Wstrzymanie pomiarów może prowadzić do dużych różnic eksperymentalnych i niespójności.
  4. Przelicz pomiary ppb na molowość uzyskaną z Zn mierzoną za pomocą AAS. Weźmy pod uwagę masę Zn (65,39 amu). Podziel ilość ppb uzyskaną przez AAS przez 63 390 000. W komórkach stężenia Zn wahają się od jednostek pmol do μmol.
    1. Podzielić stężenie Zn (pmol lub μmol) przez początkową masę białka w próbce oznaczoną przez Bradforda (etap 2.4). W obliczeniach tych zostanie obliczona ilość metalu (pmol lub μmol Zn) zawartego w przypadającej na mg białka w próbce.
      UWAGA: Ważne jest, aby wziąć pod uwagę współczynniki rozcieńczenia stosowane podczas oznaczania metali.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przetestowano zdolność GF-AAS do wykrywania śladowych poziomów Zn w komórkach ssaków (Rysunek 1). W tym celu hodowano pierwotne mioblasty pochodzące z komórek satelitarnych myszy oraz ustalone linie komórkowe N2A (pochodzące z neuroblastoma), 3T3 L1 (adipocyty), MCF10A (nabłonek piersi) i komórki MDCK (nabłonek nerki psa). Najpierw wyizolowano frakcje całokomórkowe, cytozolowe i jądrowe wszystkich tych typów komórek, a następnie oceniono czystość frakcji za p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spektroskopia absorpcji atomowej jest bardzo czułą metodą oznaczania ilościowego Zn w próbkach biologicznych o małej objętości/masie. Opisana optymalizacja pomiaru Zn sprawia, że zastosowanie tej metody jest proste i gwarantuje idealne warunki analityczne. Tutaj, za pomocą GF-AAS, określiliśmy stężenie Zn w całych komórkach oraz we frakcjach cytozolowych i jądrowych z różnych linii komórkowych. Wyniki pokazują, że technika ta jest porównywalna z technikami uzyskiwanymi za pomocą sond fluorescencyjnych i ICP-MS. Na przykł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez Nagrodę Naukowców ds. Różnorodności Wydziału od Szkoły Medycznej Uniwersytetu Massachusetts dla T.P.-B. N.N.-T. jest wspierany przez SEP-CONACYT, grant 279879. J.G.N jest wspierany przez National Science Foundation Grant DBI 0959476. Autorzy są wdzięczni dr Darylowi A. Bosco za dostarczenie linii komórkowej N2A oraz Danielli Cangussu za jej wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma AldrichI5879
Kwas octowySigma Aldrich1005706
Przeciwciało anty Brg1 (G7)Santa Cruz biotechnologiessc-17796
Przeciwciało anty b-tubuliny (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
BradfordBiorad5000205
DeksametazonSigma AldrichD4902
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
Zmodyfikowana mieszanka pożywki Eagle's Eagle's (DMEM/F12)ThermoFischer-Gibco11320033
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
Nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF)Sigma AldrichE9644
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
Fibroblastyczny czynnik wzrostu-zasadowy (FGF) (AA 10-155)TermoFischer-GibcoPHG0024
Surowica końskaThermoFischer-Gibco16050122
HydrokortyzonSigma AldrichH0888
Nadtlenek wodoru (H2O2)Sigma Aldrich95321
InsulinaSigma Aldrich91077C
Insulina-Transferyna-Selen-AThermoFischer51300044
Kwas azotowy (HNO3)Sigma Aldrich438073
Nonidet P-40 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (Zredukowane podłoże w surowicy)ThermoFischer-Gibco31985070
Penicylina-StreptomycynaThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (kolagen)Advanced BioMatrix5005
Kwas retionowySigma AldrichPHR1187
TroglitazonSigma Aldrich648469-M
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermoFischer-Gibco25200056
Czysty (Zn) Czysty jednoelementowy wzorzec, 1 000 &mikro; g / ml, 2% HNO3Perkin ElmerN9300168
Established Cell Lines
3T3-L1Kolekcja kultur typu amerykańskiegoCL-173
MCDKKolekcja kultur typu amerykańskiegoCCL-34
MCF10AKolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-10317
N2AAmerican Opis Kolekcja kulturCCL-131
Sprzęt
Spektrofotometr Atomic AbsortionPerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200

Bibliografia

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201(2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614(2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542(2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektroskopia absorpcji atomowejanaliza cynkufrakcjonowanie komórekfrakcje subkomórkowewalidacja metodą Western blottrawienie kwasem azotowympiec grafitowywykrywanie śladowych ilości metaliprzygotowanie hodowli komórkowych
Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.