Artykuł metodologiczny

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

DOI:

10.3791/59533

⸱

6 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine, 2Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute, 3Department of Genetics and Genome Sciences and Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, 4Section on High Resolution Optical Imaging, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 5WormGUIDES.org, 6Instituto de Neurobiología, Recinto de Ciencias Médicas, Universidad de Puerto Rico

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) wyróżnia się jako jedyny organizm, w którym można zaobserwować in vivo wyzwanie związane ze zrozumieniem komórkowego pochodzenia całego układu nerwowego, z rozdzielczością pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy zintegrowany protokół badania rozwoju neurologicznego w zarodkach C. elegans. Nasz protokół łączy obrazowanie, lineage i neuroanatomiczne śledzenie pojedynczych komórek w rozwijających się zarodkach. Udało nam się uzyskać długotrwałe, czterowymiarowe (4D) obrazowanie żywych zarodków C. elegans z niemal izotropową rozdzielczością przestrzenną dzięki zastosowaniu mikroskopii diSPIM (Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy). Jądra i struktury neuronalne w zarodkach nicieni są obrazowane i izotropowo łączone w celu uzyskania obrazów z rozdzielczością ~330 nm we wszystkich trzech wymiarach. Te zestawy danych 4D o wysokiej rozdzielczości minuta po minucie są następnie analizowane w celu skorelowania ostatecznych tożsamości linii komórkowych z ekspresją genów i dynamiką morfologiczną na poziomie szczegółowości pojedynczej komórki i subkomórki. Nasz protokół jest skonstruowany tak, aby umożliwić modułową realizację każdego z opisanych kroków i usprawnić badania nad embriogenezą, ekspresją genów lub rozwojem neurologicznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans wyróżnia się jako jedyny organizm, w którym każda komórka w zarodku może być obserwowana przez cały okres rozwoju neurologicznego. Mając całą linię komórkową znaną i niezmienniczą1 oraz wraz z rozwojem nowych narzędzi, które umożliwiają znakowanie i ciągłe obrazowanie pojedynczych komórek w zarodkach, biolodzy mogą teraz zacząć badać różne etapy rozwoju układu nerwowego nicieni pod każdym kątem - narodziny komórki; migracja i zróżnicowanie; tworzenie neurytów, ukierunkowany wzrost i fascykulacja; tworzenie synaps; i strojenie obwodów funkcjonalnych. Uchwycenie dynamiki wzrostu neuronów w zarodku C. elegans, poprzez połączenie stabilnie eksprymowanych reporterów i mikroskopii fluorescencyjnej, jest cenne dla społeczności naukowej.

Badania rozwojowe nad C. elegans często wykorzystują niezmienne mapy linii komórkowej i losu komórki, aby poszerzyć kontekstowe zrozumienie na poziomie pojedynczej komórki w nienaruszonym organizmie1. Automatyczna analiza liniowa - przy użyciu StarryNite2,3,4 i AceTree5,6,7,8 oprogramowanie - korzysta z obrazów jąder fluorescencyjnych o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości. Aby działać optymalnie, StarryNite/AceTree zależy również od przewidywalnej, ograniczonej orientacji obrazowanych zarodków podczas rozwoju. Mikroskopia konfokalna, wykonywana na zarodkach C. elegans ściśniętych między dwoma szkiełkami nakrywkowymi, jest standardową metodą mikroskopii z automatycznym liniałem od ponad dekady, ponieważ zapewnia zarówno wysoki kontrast/wysoką rozdzielczość, jak i przewidywalną ograniczoną orientację zarodka7,8. Wcześniej opisaliśmy budowę i zastosowanie nowatorskiego, opartego na arkuszach świetlnych mikroskopu z podwójnym widokiem odwróconej selektywnej płaszczyzny oświetlenia (diSPIM) do obrazowania żywych próbek, takich jak embriogeneza C. elegans9,10,11,12,13. Ogólnie rzecz biorąc, mikroskopia arkuszowa zapewnia niską fototoksyczność, dużą szybkość i długotrwałe obrazowanie żywych próbek 3D14,15. Metoda diSPIM, w szczególności, tworzy czterowymiarowe (4D) obrazy o prawie izotropowej rozdzielczości przestrzennej około 330 nm9.

W porównaniu z mikroskopią konfokalną, diSPIM oferuje wyższy stosunek sygnału do szumu i szybkość, bardziej izotropową rozdzielczość przestrzenną i jest bardziej odpowiedni do długoterminowego obrazowania in vivo16. W związku z tym pracowaliśmy nad dostosowaniem danych diSPIM do wprowadzania danych do StarryNite/AceTree i zbadaliśmy, czy poprawiłoby to analizy lineage. Główną przeszkodą jest to, że próbki diSPIM nie mogą być łatwo ograniczone przez kompresję skorupki jaja, aby przyjąć oczekiwane orientacje dla StarryNite/ AceTree. Losowa orientacja pozycji komórek w analizowanym woluminie obniża dokładność analizy automatycznego określania linii.

Dlatego zastosowaliśmy CytoSHOW, interfejs użytkownika prowadzony przez przeglądarkę, który pozwala użytkownikom wybrać precyzyjną orientację 3D zarodków podczas wstępnego przetwarzania obrazów diSPIM, uzyskując dane obrazu, które są zarówno zoptymalizowane pod względem jakości, jak i kontekstowe do wprowadzenia do StarryNite/AceTree. Po dokonaniu selekcji zobrazowanych zarodków, CytoSHOW zarządza zautomatyzowanym procesem przetwarzania danych. Przycięte i odjęte tło obrazy zarodków są zapisywane w plikach stosu TIFF dla każdej pozycji, punktu czasowego i widoku. Następnie CytoSHOW iteracyjnie wywołuje program SpimFusion w celu wspólnej rejestracji i wspólnej dekonwolucji dwóch wstępnie przetworzonych widoków, używając algorytmu Richardson-Lucy17,18 w celu uzyskania izotropowych obrazów wolumetrycznych o wysokiej rozdzielczości. Specyficzny dla diSPIM zestaw parametrów został zoptymalizowany dla StarryNite, aby regulować jego zachowanie podczas segmentacji obrazu i śledzenia jądra w izotropowo połączonych obrazach. Połączone obrazy i wyniki pochodzenia są następnie edytowane za pomocą AceTree, co pozwala użytkownikom zidentyfikować i naprawić wszelkie błędy w automatycznym śladzie pochodzenia generowanym przez StarryNite. AceTree może również prezentować drzewo genealogiczne i modelowane w 3D renderingi śledzonych jąder w zarodku. Odkryliśmy, że szybkość i dokładność automatycznego określania linii są znacznie zwiększone przy użyciu izotropowo połączonych obrazów, w porównaniu z surowymi obrazami z dowolnej kamery SPIN. Nasz protokół, choć zoptymalizowany pod kątem opisanej tutaj aplikacji C. elegans, może być ogólnie dostosowany do automatycznego lineingowania danych diSPIM wytworzonych dla innych gatunków lub okazów. Jeśli jest to zamierzone zastosowanie protokołu, należy pamiętać, że dla nowych próbek prawdopodobnie wymagane będzie dodatkowe dostrojenie parametrów StarryNite, zgodnie z opisem3,4.

Pomyślne wdrożenie tego protokołu skutkuje obrazami o rozdzielczości izotropowej 4D i umożliwia biologom śledzenie linii komórkowych, jednocześnie identyfikując i analizując neurony w rozwijającym się zarodku C. elegans. Co więcej, dzięki połączeniu kilku algorytmów przetwarzania końcowego - z których najbardziej czasochłonnym jest akceleracja sprzętowa - możemy teraz analizować zarówno drobne szczegóły subkomórkowe, jak i linie komórkowe i losy komórkowe żywych zarodków w czasie rzeczywistym. Ten nowy protokół umożliwia precyzyjną, świadomą manipulację i obserwację zachowania komórek podczas badań dowodowych różnicowania i morfogenezy in vivo. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowe wyjaśnienie opracowanych przez nas ulepszonych protokołów do lineingu i śledzenia komórek w rozwijających się zarodkach C. elegans, aby wzmocnić badania nad embriogenezą, ekspresją genów lub rozwojem neurologicznym.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Montaż stalowej komory obrazowania diSPIM z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wymagane do optymalizacji i automatyzacji analizy pochodzenia zarodków nicieni przez StarryNite/AceTree. Kilka opcji (oznaczonych jako takie) można pominąć w przypadku eksperymentów, które wymagają śledzenia linii komórkowych C. elegans.

  1. Narysuj mały prostokąt (2 mm x 5 mm) na środku czystego prostokątnego szkiełka nakrywkowego (nr 1,5, 24 mm x 50 mm) za pomocą sharpie (lub podobnego pisaka).
  2. Odwróć szkiełko nakrywkowe na nieoznaczoną stronę i umieść 10 μl poli-L-lizyny (nr kat. P1524) na zaznaczonym prostokącie.
    UWAGA: Przygotować stężenie robocze 1 mg/ml poli-L-lizyny rozpuszczonej w przefiltrowanej wodzie (lub równoważnym). Do długotrwałego przechowywania należy przygotować 5–10 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu porcje można przechowywać w temperaturze pokojowej (23 °C) przez 3–4 tygodnie.
  3. Pozwól, aby poli-L-lizyna pokryła szkiełko nakrywkowe przez 5 minut (Rysunek 1A). Poli-L-lizyna jest stosowana do powlekania szklanych szkiełek nakrywkowych, w których zostaną zamontowane zarodki, dzięki czemu skorupka jaja zarodka mocno przylega do szkiełka nakrywkowego, nawet gdy obiektywy są zanurzone w podłożu obrazowym.
  4. Umieść szkiełko nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną w dolnej połowie stalowej komory obrazowania.
  5. Umieść górną połowę stalowej komory obrazowania na dolnej połowie ze szkiełkiem nakrywkowym i dokręć czterema dołączonymi do komory. Sprawdź wzrokowo z boku, aby upewnić się, że górna połowa jest równomiernie osadzona w dolnej połowie (Rysunek 1B).
  6. Napełnij komorę 7–8 ml M9 buffer19, buforu izotonicznego, który pomaga zapobiegać uleganiu nieprawidłowemu ciśnieniu osmotycznemu zarodków we wczesnym stadium. Zarodki 1-komórkowe, a nawet 2-komórkowe są osmotycznie wrażliwe i mogą rozwijać się nieprawidłowo, jeśli nie znajdują się w tym buforze izotonicznym. Zarodki mają również tendencję do zatrzymywania się na etapie 3-krotnym, jeśli M9 zostanie zastąpiony wodą.

2. Przygotowanie próbek zarodków C. elegans do montażu

UWAGA: Około 18 godzin przed obrazowaniem, pięć młodych (1 dzień od ostatniego linienia) dorosłych i dziesięć larwalnych w stadium 4 (L4) C. elegans jest wybieranych na płytkę agarową z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) obsianą szczepem E. coli OP50. Platynowe szpikulce są używane do przenoszenia larw i młodych dorosłych C. elegans bez szkody dla zwierzęcia19.

  1. Przygotować 1% roztwór metylocelulozy (nr kat. H7509-25G) w buforze M9.
    UWAGA: Metylocelulozę należy mieszać w ciepłym M9 aż do rozpuszczenia. Po przygotowaniu roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 500 μl 1% roztworu metylocelulozy w M9 do wgłębienia wklęsłego szkiełka mikroskopowego. Ten lepki bufor będzie używany w dwóch przypadkach: 1) podczas zbierania wczesnych zarodków poprzez sekcję dorosłych robaków oraz 2) podczas mycia zarodków w późnym stadium pobranych bezpośrednio z płytki NGM.
    UWAGA: Metyloceluloza służy do zapobiegania przywieraniu zarodków do szkiełka mikroskopowego.
  3. W przypadku obrazowania zarodków w późnym stadium należy pobrać zarodki C. elegans (najlepiej z płytki NGM z udziałem młodych dorosłych) za pomocą szpikulca do rzęs i przenieść zarodki do 1% metylocelulozy na wklęsłym szkiełku mikroskopowym. Szpikulec do rzęs pomaga zmniejszyć siłę, a tym samym zminimalizować stres lub uszkodzenie zarodków podczas przenoszenia. Procedura wykonania kostki do rzęs jest opisana przez Hart20.
  4. Drugą szpikulcem do rzęs (w przeciwnej ręce) delikatnie postukaj o siebie obie rzęsy, aby zawiesić zarodki w metylocelulozie.
  5. Opcjonalnie: Jeśli planujesz linię komórek embrionalnych za pomocą StarryNite, należy zamontować zarodki 1-komórkowe do 4-komórkowych. Aby to zrobić, najpierw wybierz młodych dorosłych z płytki NGM i przenieś ich do roztworu M9-metylocelulozy na wklęsłym szkiełku mikroskopowym za pomocą platynowego drucianego szpikulca.
  6. Opcjonalnie: Za pomocą zaostrzonych końcówek igieł podskórnych (nr 18G x 1 1/2) pokrój zwierzę poprzecznie w środkowej części ciała, aby uwolnić zarodki od 1 do 4 komórek.

3. Pipeta do ust: Montaż rurki aspiratora z pipetą mikrokapilarną

UWAGA: Używamy rurki aspiratora z ręcznie ciągniętą pipetą mikrokapilarną włożoną w gumową uszczelkę tuby. Dzięki temu możemy przenieść zarodki ze szkiełka rozwarstwiającego na powierzchnię pokrytą poli-L-lizyną w komorze obrazowania wypełnionej buforem.

  1. Ręcznie przeciągnij pipetę mikrokapilarną nad otwartym płomieniem, aby utworzyć dwie połówki z rozciągniętymi końcówkami.
  2. Weź połowę pipety mikrokapilarnej i włóż koniec do gumowej uszczelki rurki aspiratora (Rysunek 1C). Drugą połowę pipety mikrokapilarnej należy odłożyć na bok do późniejszego użycia (w razie potrzeby).
  3. Za pomocą zmontowanej rurki aspiratora wyposażonej w pipetę mikrokapilarną delikatnie złamij końcówkę pipety mikrokapilarnej i utwórz otwór, w którym zmieszczą się około 1-2 dwa zarodki (od tego momentu ten instrument nazywa się "pipetą doustną").

4. Montaż zarodków C. elegans na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną

  1. Trzymając delikatnie ustnik aspiratora między zębami, napełnij pipetę mikrokapilarną 10–15 μl buforu M9, a następnie delikatnie zassaj kilka zarodków z wklęsłego szkiełka do naczynia włosowatego.
  2. Przenieś zarodki do stalowej komory obrazowania wypełnionej buforem M9, ustawiając końcówkę kapilary tak, aby zarodki wpadły do środkowego prostokąta szkiełka nakrywkowego.
  3. Unikając uszkodzenia zarodków, delikatnie przesuwaj je szpikulcem do rzęs lub użyj pipety doustnej, aby ustawić zarodki w pionie, aby ustawić zarodki tak, aby długa oś zarodka była prostopadła do długiej osi szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B wstawka, dolny panel).
    UWAGA: Ustawienie zarodka w tej orientacji minimalizuje liczbę wycinków do zobrazowania, skracając w ten sposób dawkę światła i czas przetwarzania danych, jednocześnie poprawiając szybkość akwizycji.
  4. Umieść stalową komorę obrazowania w uchwycie próbki na stoliku mikroskopu (Rysunek 1D).

5. Montaż, konfiguracja oprogramowania i optymalizacja lasera do obrazowania embrionalnego za pomocą diSPIM

  1. Zobacz instrukcje krok po kroku, jak złożyć cały diSPIM sprzężony ze światłowodem z dostępnych na rynku części w Kumar et al.10,11 i na http://www.dispim.org. Protokół wideo pokazujący, jak złożyć diSPIM, jest również dostępny na stronie internetowej ASI (http://www.asiimaging.com).
    UWAGA: Konfiguracja instrumentu dla tego protokołu jest identyczna jak w przypadku Kumar et al.10,11 diSPIM, który wykorzystuje do obrazowania soczewki zanurzeniowe 40x 0,8 NA. Jedyną różnicą między konfiguracją w tym protokole a Kumar et al.10,11 jest dodanie lustra dichroicznego (rozszczepienie przy 560 nm) oraz czerwonych i zielonych filtrów pasmowoprzepustowych wewnątrz urządzenia do podziału obrazowania (model A12801-01) zainstalowanego na obu ramionach obrazowania diSPIM. Dodanie optyki rozdzielającej obraz umożliwia jednoczesne przechwytywanie obrazów z dwóch różnych fluoroforów – wzbudzanych przez lasery 561 nm i 488 nm – poprzez rozdzielenie pasm emisyjnych na dwie połówki tego samego chipa kamery.
  2. Po zmontowaniu przyrządu należy sprawdzić ustawienie optyczne diSPIM przed obrazowaniem.
    UWAGA: Aby prawidłowo ustawić kartę diSPIM, patrz https://youtu.be/qnOrg30NNuE, a informacje o sprzęcie http://dispim.org/hardware/objectives i http://www.asiimaging.com.
  3. Skorzystaj z platformy open-source Micro-Manager (https://micro-manager.org/)21, która została zoptymalizowana pod kątem obsługi mikroskopów Light Sheet do wysokoprzepustowego obrazowania komórkowego22. Zalecamy użycie wtyczki ASI diSPIM do akwizycji wielopozycyjnej, która umożliwia jednoczesne obrazowanie do 30 zarodków zgodnie z opisem23.
  4. Przy otwartym Micro-Manager ustaw intensywność lasera na ~179 μW (0,5) dla 488 nm i ~79 μW (0,25) dla 561 nm (rysunek 2A, czerwony prostokąt).
    UWAGA: Są to zalecane ustawienia do długoterminowego obrazowania zarodków C. elegans w odstępach 1-minutowych. Podczas długotrwałego obrazowania dwukolorowego, laser o długości fali 561 nm jest używany do obrazowania jąder (mCherry::Histone) do momentu, gdy zarodki znajdą się w stadium fasoli, w którym to momencie laser 488 nm jest włączany, aby zobrazować również neurony znakowane GFP. Te warunki obrazowania są zoptymalizowane pod kątem minimalizacji fototoksyczności i zapewnienia przeżycia i wylęgu zarodków, umożliwiając jednocześnie długotrwałe (12-14 godzin) ciągłe pozyskiwanie danych neurorozwojowych i liniowych.
  5. W Micro-Manager wybierz menu Wtyczki > Kontrola urządzeń > ASI diSPIM, aby otworzyć okno ASI diSPIM (Rysunek 2B). Wybierz kartę Pozyskiwanie. W sekcji Ustawienia zapisywania danych na tej karcie (zielony prostokąt), sekcji Ustawienia głośności (niebieski kwadrat) i sekcji Ustawienia plasterka (pomarańczowy kwadrat) upewnij się, że każdy parametr jest ustawiony tak, jak pokazano na rysunku 2B.
    UWAGA: Nasze oprogramowanie do analizy obrazu CytoSHOW jest przystosowane do pracy z innymi opcjonalnymi formatami danych wyjściowych, takimi jak serie plików OME-TIFF łączone zbiorczo i serie plików TIFF utworzone po akwizycji za pomocą funkcji eksportu wbudowanej w Micro-Manager. Zazwyczaj używany jest format danych OME-TIFF sortowany z pojedynczym punktem czasowym, ponieważ umożliwia on przeglądanie i przetwarzanie objętości obrazu w czasie rzeczywistym zaraz po pozyskaniu nieprzetworzonych danych.

6. Zoptymalizowane parametry autofokusa do długoterminowego obrazowania zarodków C. elegans

  1. Ustaw parametry autofokusa Micro-Manager na ustawienia zoptymalizowane pod kątem długoterminowego obrazowania diSPIM o jakości rodowej zarodków C. elegans. W oknie ASI diSPIM kliknij zakładkę Autofokus (Rysunek 2C). W sekcji General Autofocus Options (Ogólne opcje autofokusa) (kwadrat) określ parametry dokładnie tak, jak pokazano. Zwróć uwagę, że kanał autofokusa (czerwony kwadrat) powinien określać kanał fluorescencji kanału jądrowego w eksperymentach z lineagingiem.
    UWAGA: Jeśli maksymalne przesunięcie jest większe niż 5 μm, obrazy mają tendencję do utraty ostrości.
  2. Kliknij, wtyczki > narzędzia do akwizycji > nakładka wzoru.
  3. W oknie Nakładka wzorka kliknij przycisk Pokaż siatkę.
  4. W oknie ASI diSPIM kliknij kartę Nawigacja.
  5. Kliknij pola wyboru Belka i Arkusz ścieżki A lub B, a następnie kliknij przycisk Na żywo. Rozpoczyna się akwizycja obrazu. Otworzy się okno podglądu na żywo. Wybierz obszar analizy automatycznego ustawiania ostrości zarodka, rysując ramkę wokół zarodka na wybranym kanale od 6.1.
    UWAGA: Zazwyczaj rejestrujemy 420 punktów czasowych dla 10 zarodków podczas jednej sesji obrazowania. Nieprzetworzone dane na sesję obrazu wynoszą zwykle 1,7 TB, podczas gdy dane zdekonwolucjonizowane i przetworzone przez StarryNite to 1,4 TB (patrz kroki 9 i 10). Zalecamy korzystanie z dysków twardych o dużej pojemności (18 TB w naszym obecnym systemie) do pozyskiwania obrazów oraz platform w chmurze do przechowywania obrazów.
  6. Kliknij przycisk Rozpocznij akwizycję w zakładce "Akwizycja", aby rozpocząć długoterminowe przechwytywanie obrazów wielowymiarowych (Rysunek 2B).

7. Otwieranie surowych obrazów Micro-Manager w CytoSHOW

  1. Pobierz pakiet oprogramowania ze strony http://dispimlineage.wormguides.org.
    UWAGA: Pakiet oprogramowania zostanie pobrany jako plik .zip i przed użyciem należy go rozpakować do katalogu "C:\". Więcej szczegółów dotyczących instalacji można znaleźć na stronie http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm .
  2. Kliknij dwukrotnie plik C:\CytoSHOWextrasForC\CytoSHOW_APP.jnlp, aby rozpocząć uruchamianie CytoSHOW.
  3. Wybierz menu Plik > Nowy monitor > diSPIM (Micro-Manager). Zlokalizuj główny folder zestawu danych, w którym zostały zapisane foldery punktu czasowego pozyskiwania. Wybierz dowolny folder punktu czasowego i kliknij przycisk Otwórz. Wielowymiarowe okna nawigacji (zwane oknami monitorów diSPIM) są otwierane automatycznie zarówno dla SPIMA, jak i SPIMB (Rysunek 3A).
    UWAGA: Te okna będą monitorować folder danych głównych pod kątem nowo zapisanych stosów nieprzetworzonych punktów czasowych (w przypadku, gdy próbka jest nadal rejestrowana). Po uzyskaniu każdego nowego punktu czasowego, każde z okien monitorujących odrębne ramiona SPIM i pozycje próbek zostanie odświeżone, aby wyświetlić cały wielokanałowy zestaw danych 4D dla każdego zarodka.

8. Generowanie obrazów projekcji Max za pomocą CytoSHOW

Nawet przed dekonwolucją, surowe dane mogą być szybko przetworzone, aby ocenić globalne cechy próbki.

  1. Kliknij przycisk Z-MIP w lewym panelu bocznym okna obrazu (Rysunek 3A, czerwony prostokąt), aby wykonać projekcje maksymalnej intensywności na całej głębokości i pełnym kursie danej pozycji lub ramienia SPIM. Pojawi się okno hiperstosu projekcji Z.
  2. W oknie hiperstosu projekcji Z ustaw typ projekcji na Maksymalna intensywność. Określ, które kanały, wycinki i klatki punktów czasowych mają być przetwarzane zgodnie z preferencjami użytkownika.
  3. Kliknij przycisk OK po zakończeniu.
  4. Wybierz lokalizację folderu, w którym chcesz zapisać dane wyjściowe o maksymalnej intensywności w oknie dialogowym pliku, a następnie kliknij przycisk OK. Daj trochę czasu (15–20 minut, w zależności od rozmiaru zestawu danych i mocy obliczeniowej komputera) na wygenerowanie obrazów projekcyjnych przez CytoSHOW.

9. Analiza linii komórkowych w izotropowych danych wolumetrycznych o wysokiej rozdzielczości

  1. Opcjonalnie: Po otwarciu surowych danych za pomocą monitora diSPIM w CytoSHOW, wybierz narzędzie do zaznaczania wielokątów (Rysunek 3A, czarne strzałki) i kliknij tuż poza przednimi, tylnymi, grzbietowymi i brzusznymi krawędziami zarodka (w tej dokładnej kolejności), aby wygenerować wzór "muszki" na zarodku. Wykonaj dla obu widoków (SPIM-A i SPIM-B, Rysunek 3A).
    UWAGA: Ten wybór określa eliptyczny obszar zainteresowania (ROI), w którym zarodek jest wyśrodkowany, i rejestruje oś przednio-tylną zarodka. Wzór muszki sugeruje CytoSHOW, że użytkownik planuje dokładniej określić precyzyjną rotację końcowych izotropowo połączonych objętości do orientacji, która jest optymalna dla analiz liniowych za pomocą StarryNite/AceTree. W przypadkach, gdy linia StarryNite nie jest częścią planu eksperymentalnego, można wybrać inne narzędzia wyboru i kształty, aby ustawić zwrot z inwestycji w przetwarzanie obrazu.
  2. Jeśli wiele zarodków zostało jednocześnie zobrazowanych przy użyciu opcji akwizycji wielopozycyjnej, otwórz i wykonaj krok 9.1 dla wszystkich zarodków. Pozwoli to na równoległe wykonanie przyszłych kroków dla wszystkich zarodków podczas jednej sesji. Zamknij okienka SIMA i SPIMB dla zarodków, których nie chcesz przetwarzać.
  3. Kliknij przycisk diSPIM na lewym panelu bocznym okna monitora diSPIM (Rysunek 3A, podświetlony na żółto). Spowoduje to wyświetlenie podpanelu kontrolek specyficznych dla przetwarzania diSPIM.
  4. Wyrównaj kanały zielony i czerwony dla każdego ramienia SPIN. Ponieważ rozdzielacze kanałów emisji są używane do jednoczesnego rejestrowania różnych czerwonych i zielonych obrazów w tej samej kamerze, ważne jest, aby wizualnie wyrównać dokładną rejestrację pikseli tych dwóch fizycznie sąsiadujących pól obrazu, gdy są one nałożone. Ponowne użycie tych samych korekt wyrównania jest zazwyczaj możliwe w wielu kolejnych sesjach obrazowania, ale należy je sprawdzić (jak w krokach 9.4.1–9.4.5).
    1. Zaczynając od panelu SPIMA, wybierz czerwony kanał, przesuwając pasek przewijania CM w lewo (Rysunek 3A, pomarańczowa strzałka, lewy panel).
    2. Za pomocą regulatorów x, y i z (Rysunek 3A, pomarańczowy kwadrat), przesuń czerwony kanał, aby dopasować go do zielonego.
    3. Kliknij przycisk diSPIM (Rysunek 3A, podświetlony na żółto), aby zamknąć podpanel i wyzwolić propagację tych samych przesunięć do wszystkich innych okien Pozycji.
    4. Upewnij się, że prawidłowe wyrównanie zostało rozpropagowane do innych klatek i punktów czasowych, przesuwając pasek przewijania "z" (Rysunek 3A, niebieska strzałka, lewy panel) i/lub pasek przewijania "t" (Rysunek 3A, zielona strzałka, lewy panel). Jeśli przeprowadzono akwizycję wielopozycyjną i zobrazowano kilka zarodków (krok 5.3), wyrównanie powinno było również rozprzestrzenić się na te zarodki. Potwierdź to, sprawdzając również liczby regulatorów x, y i z (Rysunek 3A, pomarańczowy kwadrat, który powinien być taki sam dla panelu SPIMA wszystkich zarodków).
    5. Powtórz kroki 9.4.1–9.4.4 dla okna monitora SPIMB diSPIM (Rysunek 3A, prawy panel).
  5. Kliknij przycisk "diSPIM", a następnie przycisk "Bezpiecznik" (Rysunek 3A, niebieski prostokąt), aby otworzyć okno dialogowe o nazwie "Deconvolve/Fuse diSPIM Raw Data Volumes" (Rysunek 3B). Ustaw parametry, jak pokazano w Rysunek 3B. Te parametry zostały pokrótce omówione w następujących krokach podrzędnych:
    1. Ustaw rejestrację klucza na kanale 1 (laser 488 nm) lub 2 (laser 561 nm). Wybierz kanał z gęstszym lub bardziej wszechobecnym sygnałem. Do eksperymentów z liniaturą zawsze wybieraj kanał używany do obrazowania wszechobecnej fluorescencji histonów jądrowych.
    2. Ustaw orientację względną głośności wejściowej na +1 lub -1. Prawidłowy wskaźnik orientacji zależy od rozmieszczenia konkretnej kamery diSPIM (Rysunek 4).
      UWAGA: Jeśli nie masz pewności, przetestuj każdą opcję, duplikując pojedynczy punkt czasowy zarówno z okna monitora SPIM A, jak i B diSPIM, wykonując kroki 9.1–9.12 i arbitralnie wybierając względną orientację woluminów wejściowych do przetestowania. Nieprawidłowa orientacja spowoduje rozmycie obrazów z artefaktami, podczas gdy prawidłowa orientacja zapewni wyraźne obrazy. Wartość orientacji względnej woluminów wejściowych, która daje wyraźny obraz, może być następnie ponownie wykorzystana do wszystkich przyszłych danych z danego instrumentu diSPIM.
    3. Wybierz, czy wolumin z bezpiecznikiem ma być zorientowany tak samo jak wolumin wejściowy A czy B (w zależności od preferencji użytkownika).
    4. Wybierz opcję "Nowa rejestracja dla każdego woluminu". Ta opcja kontroluje sposób, w jaki SpimFusion oblicza macierze rejestracji dla każdej pary woluminów w każdym punkcie czasowym. Opcja "Fresh" pozwala algorytmowi na adaptacyjną optymalizację rejestracji w każdym punkcie czasowym.
    5. Ustaw liczbę iteracji dekonwolucji na 10. Liczba ta ma tendencję do niezawodnego uzyskiwania pożądanej wysokiej rozdzielczości w sposób efektywny czasowo.
    6. Opcjonalnie: Jeśli wymagane jest automatyczne lineaging (wysoce zalecane), zaznacz opcję Auto-launch StarryNite lineaging of Fused Volumes. Ta opcja automatycznie uruchomi StarryNite w celu segmentacji i śledzenia komórek w obrazowanych woluminach wyprodukowanych przez SpimFusion.
    7. Opcjonalnie: Aby uzyskać najwyższą dokładność w automatycznym lineingu, najlepiej jest przemieścić izotropowo połączone objętości zarodków w kanoniczną orientację "ADL" (Aprzednia [x-zachód], Dorsal[y-północ], Lewo [z-blisko]). Wybierz opcję Zdefiniuj orientację wyjściową woluminu w podglądzie, aby wskazać ten wybór. CytoSHOW odpowie poprzez przetworzenie początkowej pary izotropowo połączonych woluminów, umożliwiając użytkownikowi dokładną obserwację i określenie rotacji potrzebnych do osiągnięcia rejestracji ADL.
    8. Kliknij przycisk Tak po wybraniu wszystkich parametrów.
  6. Określ katalog wyjściowy, w którym mają być zapisywane przetworzone pliki. Kliknij przycisk OK.
  7. Opcjonalnie: Jeśli wybrano opcję Zdefiniuj orientację wyjściową woluminu w podglądzie, ustaw pasek przewijania t (Rysunek 3A, zielona strzałka, lewy panel) w oknie SPIM-A na wczesny punkt czasowy, w którym komórki ABa i ABp osiągnęły metafazę. Ustaw pasek przewijania t w oknie SPIM-B na późniejszy etap programowania z przecinkiem. Pomoże to w określeniu orientacji ADL.
  8. Opcjonalnie: Kliknij przycisk OK, gdy wszystko będzie gotowe. Jeśli opcja podglądu w wersji 9.5.7 powyżej została wybrana, tylko dwa woluminy podglądu zostaną izotropowo połączone dla punktów czasowych wskazanych przez suwaki t okien obrazów SPIM-A i SPIM-B. Te dwa podglądowe punkty czasowe mogą być użyte do określenia precyzyjnego wyrównania objętości wyjściowych zarodków do orientacji ADL, jak wyjaśniono poniżej.
    1. Znajdź nowo wyświetlony 3DProjY_Decon-Fuse_.... okno. Przesuń pasek przewijania t do punktu czasowego 2 tego okna podglądu. Przesuwaj suwak Z, aż pojawi się widok bezpośrednio w dół długiej osi zarodka.
    2. Przesuń pasek przewijania t z powrotem do punktu czasowego 1 w 3DProjY_Decon-Fuse_.... okno. Wybierz narzędzie do zaznaczania linii i narysuj zaznaczenie linii od komórki EMS (najbardziej brzuszne okrągłe jądro) przez płaszczyznę płytek metafazowych komórki AB.
    3. Kliknij pomarańczowy przycisk Podgląd diSPIM na 3DProjY_Decon-Fuse_.... okno. Drobne korekty orientacji podglądu zobrazowanego woluminu zostaną zapisane do użycia w przetwarzaniu pełnego zestawu danych.
  9. Opcjonalnie: Okno dialogowe Deconvolve/Fuse diSPIM Raw Data Volumes pojawi się ponownie, tak jak w kroku 9.5 powyżej. Kliknij przycisk Tak bez wybierania opcji Zdefiniuj orientację wyjściową woluminu w podglądzie. Określ folder wyjściowy dla pełnego przebiegu przetwarzania danych.
  10. Ustaw paski przewijania t (Rysunek 3A, zielona strzałka, lewy panel) okien monitora diSPIM na początkowy punkt czasowy (SPIMA) i końcowy punkt czasowy (SPIMB) pełnego zakresu obrazów do przetworzenia. Następnie kliknij przycisk OK.
  11. Wraz z postępem SpimFusion, CytoSHOW otwiera i odświeża wielowymiarowe okno pokazujące pokrojoną izotropową objętość fuzji 4D dla każdego zarodka, a także dwa okna z obracającymi się projekcjami 4D o maksymalnej intensywności objętości izotropowej. W tym czasie nie należy przerywać ani zamykać żadnego okna CytoSHOW, dopóki fuzja izotropowa i śledzenie linii nie zostaną zakończone.
  12. Opcjonalnie: Zauważ, że gdy ekran powitalny StarryNite pojawi się, a następnie zniknie, pełny potok przetwarzania danych został zakończony. To okno nie może być zamknięte podczas przetwarzania, w przeciwnym razie StarryNite zostanie przerwane.

10. Otwieranie serii śledzenia linii StarryNite w AceTree (opcjonalne)

  1. Otwórz dostarczoną niestandardową wersję "AceTree_16BitCompat.jar".
  2. Wybierz menu Plik > Otwórz plik konfiguracyjny. Zlokalizuj swój katalog wyjściowy wcześniej wskazany dla CytoSHOW. Otwórz podfolder Decon_Fuse_..._Pos[n] dla zarodka [n]. Wybierz aaa_edited.xml i Otwórz.
  3. Użyj narzędzi Edytuj > Edytuj w menu AceTree, aby otworzyć okna Edytuj, Ścieżka i Dostosuj lub Usuń komórki.
  4. Kliknij półcieniowany okrąg Rysunek 5B, czerwony kwadrat, aby dostosować intensywność czerwonego i zielonego.
  5. Kontynuuj wizualizację i edycję pochodzenia zgodnie z wcześniejszym opisem5,6,8 (rękopisy są również zawarte w naszym pakiecie do pobrania).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najpierw sprawdziliśmy żywotność embrionów zobrazowanych przy użyciu parametrów protokołu do akwizycji diSPIM (sekcje 1-6). Dziesięć zarodków obrazowano jednocześnie w temperaturze 20 °C, jedna objętość/zarodek/minutę, od stadium 2-komórkowego do etapu 2-krotnego (7,5 godziny, 451 objętości/zarodek). Do monitorowania podziałów komórkowych podczas embriogenezy użyliśmy szczepu BV514, który powszechnie wyraża konstrukty reporterowe mCherry::Histone ze zintegrowanej tablicy transgenowej ujIs11324. Rysunek 6 pokazuje oś czasu tej pierwszej połowy rozwoju embrionalnego jednego z obrazowanych embrionów. Każdy obraz reprezentuje pojedynczą projekcję o maksymalnej intensywności (wytworzoną przez kroki 7-8) obrazowanego zarodka. Odkryliśmy, że zoptymalizowane protokoły nie wywołały żadnej wykrywalnej fototoksyczności dla zarodków, co oceniano na podstawie czasu podziałów komórek (nie pokazano), czasu wykluwania i czasu związanego z kamieniami milowymi rozwoju (Rysunek 6 i referencje1,25,26).

Następnie zastosowaliśmy protokół do analizy dynamiki wzrostu pojedynczych neuronów w rozwijających się zarodkach. Zobrazowaliśmy DCR7692 (olaex4655), transgeniczny szczep nicienia, który eksprymuje GFP z promotora neuropeptydu flp-19 w podzbiorze niezidentyfikowanych komórek (DACR2819, Pflp-19 (3,6 kb)::Syn21::GFP::CAAX::p 10 3'UTR). Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, ustaliliśmy, że niezidentyfikowane komórki odpowiadają neuronom ruchowym RMDDL i RMDDR, komórce kanału wydalniczego i dwóm komórkom mięśniowym (Ryc. 7). Następnie zbadaliśmy i określiliśmy ilościowo dynamikę wzrostu neuronów RMDDL i RMDDR. Zaobserwowaliśmy, że neurony RMDDL i RMDDR mają ukośny kształt już 360 minut po zapłodnieniu, przy czym dłuższa oś komórkowa reprezentuje kolejną oś wzrostu neurytów (Rysunek 7 i film S1). Korzystając z wtyczki "simple neurite tracing" w FIDŻI i stosując ją do rekonstrukcji 3D izotropowo połączonych objętości, następnie określiliśmy ilościowo stereotypowy wzrost neurytów RMDDL i RMDDR dla sześciu zarodków. Ustaliliśmy, że dynamika wzrostu była stereotypowa dla RMDDL i RMDDR w zarodkach (zwanych dalej RMDD). Od 385-410 minut po zapłodnieniu neuryty RMDD rozszerzyły się o 6,0±0,5 μm (średnio ± SEM; n = 12 neurytów) przed ciałami komórek (Ryc. 7B, C, I). Od 415 do 445 minut po zapłodnieniu oba neuryty rozciągają się grzbietowo do i wokół przypuszczalnego pierścienia nerwowego (gwiazdka w Ryc. 7D). Średnio każdy neuryt RMDD rozciągał się od 11,0 ± 0,6 μm (średnio ± SEM; n = 12 neurytów) z ciała komórki przed synchronicznym spotkaniem ze swoim przeciwległym odpowiednikiem na wierzchołku pierścienia (Rysunek 7I). Co ważne, nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że jesteśmy w stanie zbadać, porównać i określić ilościowo cechy rozwojowe neuronów dla pojedynczych, możliwych do zidentyfikowania komórek przy użyciu naszego zintegrowanego protokołu (Rysunek 7 i Figura 8).

figure-results-1
Rysunek 1: konfiguracja montażu próbki diSPIM. (A) Przygotowanie szkiełka nakrywkowego z poli-L-lizyną. We wstawce użyto 10 μl lizyny Poly-L do pokrycia szkiełka nakrywkowego przez 5 minut. Poli-L-lizyna pozwala skorupce zarodka mocno przylegać do szkiełka nakrywkowego w prostokącie. (B) Schemat stalowej komory obrazowania i zmontowanej komory. We wstawce reprezentatywne zarodki są zorientowane tak, aby oś przednio-tylna była prostopadła do długiej osi na szkiełku nakrywkowym. (C) Zmontowana probówka aspiratora z pipetą mikrokapilarną. (D) Stalowa komora obrazowania zamontowana w uchwycie na próbkę pod obiektywami diSPIM 40x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Długoterminowa konfiguracja obrazowania diSPIM w Micro-Managerze. (A) Zalecane parametry mocy lasera diSPIM (czerwony prostokąt) zoptymalizowane pod kątem długotrwałego obrazowania przy jednoczesnym zmniejszeniu fototoksyczności (oceniane na podstawie wyższego wskaźnika wylęgu zarodków C. elegans). Ustaw laser 561 nm na 79 μW (0,25) i laser 488 nm na 179 μW (0,5). Należy pamiętać, że dokładna kalibracja ustawień oprogramowania do mocy lasera różni się w zależności od instalacji diSPIM. Zaleca się, aby użytkownicy mierzyli i kalibrowali moc lasera w celu uzyskania mocy lasera 79 μW (561 nm) i 179 μW (488 nm). (B) parametry diSPIM do zapisywania danych (zielony prostokąt), ustawień głośności (niebieski kwadrat) i ustawień plasterków (pomarańczowy kwadrat). (C) parametry autofokusa diSPIM do długoterminowego obrazowania embriogenezy C. elegans (patrz kroki 6.1-6.6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wizualizacja obrazu i konfiguracja przetwarzania danych za pomocą CytoSHOW. (A) Surowe obrazy diSPIM otwarte przez CytoSHOW. CytoSHOW jest w stanie otworzyć obrazy przechwycone przez obie ścieżki kamery (SPIM A i B). Te surowe obrazy są otwierane w wielowymiarowych oknach zwanych monitorem diSPIM. W monitorze diSPIM generowany jest "wzór muszki" w celu wybrania przednich, tylnych, grzbietowych i brzusznych krawędzi zarodka (patrz krok 9.1). Wybór muszki wskazuje orientację zarodka do dekonwolucji i śledzenia linii wspomaganego StarryNite. (B) Zoptymalizowane parametry używane do generowania obrazów izotropowych. W oknie Deconvolved while acquisition ustaw parametry określone w krokach 9.5.1-9.5.8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Konfiguracja kamery diSPIM. (A) Fotografia rozmieszczenia i orientacji kamery diSPIM. (B) Przedstawienie obrotu SPIM A o +90 stopni w celu dopasowania do zebranych obrazów SPIM B. (C) Głośność wejściowa w stosunku do wskaźnika orientacji +1 w oparciu o konfigurację naszej kamery diSPIM (patrz krok 9.5.2). Przed rejestracją obracamy obrazy SPIM A o +90 stopni wokół osi Y, aby dopasować obrazy SPIM B. Podziałka = 10 μm. Obrazy są reprezentatywnymi pojedynczymi widokami, projekcjami o maksymalnej intensywności i obrazami dekonwolucyjnymi 1,5-krotnego zarodka z oznaczonymi jądrami (561 nm, czerwony) i neuronami (488 nm, zielony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Selekcja i edycja linii embrionalnej C. elegans w AceTree. (A) Używamy AceTree do edycji śladów pochodzenia StarryNite (zobacz referencje5,6,8; rękopisy są również zawarte w naszym pakiecie do pobrania). AceTree wyświetli nazwy systematyczne C. elegans dla każdego jądra (zielonego prostokąta) po zakończeniu kroków 10.1-10.2. To okno (A) zawiera informacje (prostokąt) o każdej komórce w śladzie pochodzenia (ABa, wyróżnione na niebiesko), które pomagają użytkownikom podczas śledzenia i edytowania śladów pochodzenia. Zaleca się, aby użytkownicy weryfikowali i porównywali komórki w linii produkcyjnej i ich pozycje z linią komórek embrionalnych C. elegans wcześniej opisaną przez Sulston et al.1 Ponadto, jeśli użytkownicy są zainteresowani lokalizacją określonych komórek w zdekonwoluowanej serii danych (patrz poniżej, B), wpisz nazwę systematyczną C. elegans w pasku wyszukiwania (pomarańczowy prostokąt). (B) Zdekonwolucjonizowana seria danych użytkownika otwiera się również automatycznie po wykonaniu kroków 10.1-10.2. Pokazany tutaj izotropowo połączony obraz czterokomórkowego zarodka z jądrami oznaczonymi na czerwono. Podczas śledzenia jąder użytkownicy powinni zmieniać intensywność obrazu (czerwony kwadrat) i poruszać się w czasie i z za pomocą strzałek na klawiaturze (czas-lewo/prawo, z-góra/dół). (C) Rysunek 3D punktu czasowego w (B) z pewnymi funkcjami (fioletowy prostokąt), który umożliwia obracaną wizualizację 3D. Aby zapoznać się z przeglądem AceTree i jego funkcjonalności 3D, zobacz referencje5,6,8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Dynamika rozwoju zarodków C. elegans w czasie na diSPIM. Na górnym panelu znajdują się obrazy diSPIM przedstawiające pierwszą połowę rozwoju embrionalnego jednego z obrazowanych zarodków (szczep BV514 ujIs11324). Zarodki były obrazowane w sposób ciągły, co minutę przez 7,5 godziny (w temperaturze 20 °C). Pierwsze dwa zdjęcia górnego panelu przedstawiają 4- i 8-komórkowe zarodki z jądrami (kolor czerwony) i pozycjami ciał polarnych (gęste czerwone kule, oznaczone niebieskimi gwiazdkami). Każdy obraz reprezentuje pojedynczą projekcję o maksymalnej intensywności obrazowanego zarodka. Podziałka = 10 μm. Oś czasu (pozioma kreska) reprezentuje minuty po zapłodnieniu (m.p.f.) rozwoju zarodków C. elegans. Sprawdziliśmy, że parametry naszego protokołu dotyczące akwizycji diSPIM nie wywołują żadnej wykrywalnej fototoksyczności dla obrazowanych zarodków, co oceniano na podstawie żywotności, czasu podziałów komórek, czasu wylęgu i czasu kamieni milowych rozwoju (patrz referencje1,25,26). Zauważamy, że czas kamieni milowych rozwoju był powtarzalny we wszystkich zarodkach przy naszych parametrach obrazowania (SEM ± 8,174 minuty dla 6,4-godzinnych sesji obrazowania; n = 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Identyfikacja komórkowa i charakterystyka dynamiki wzrostu neurytów w rozwijających się zarodkach C. elegans. Dwukolorowe obrazowanie szczepu powstałego przez skrzyżowanie BV514 ujIs11324 (dla linii) i DCR7692 (olaex4655), transgenicznego szczepu nicienia, który wykazuje ekspresję GFP z promotora neuropeptydu flp-19 w podzbiorze niezidentyfikowanych komórek. (A-H) Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, ustaliliśmy, że niezidentyfikowane komórki odpowiadają neuronom ruchowym RMDDL i RMDDR (żółte strzałki), komórce kanału wydalniczego (niebieskie strzałki) i dwóm komórkom mięśniowym (białe strzałki). (I) Kwantyfikacja dynamiki wzrostu neuronów RMDDL i RMDDR za pomocą wtyczki FIJI "proste śledzenie neurytów" i zastosowanie jej do rekonstrukcji 3D izotropowo połączonych objętości. Zauważ, że zarówno RMDDL, jak i RMDDR wykazują stereotypową dynamikę wzrostu, z których każda rozciąga się synchronicznie na łączną długość 11,0±0,6 μm (średnio ± SEM; n = 12 neurytów) i spotykają się na grzbietowym wierzchołku pierścienia nerwowego (patrz również film S1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Badanie izotropowych obrazów diSPIM morfologii neuronów w zarodkach C. elegans. Izotropowa wizualizacja neuronów AVHL i AVHR (żółte strzałki). Za pomocą diSPIM można uchwycić morfologie neuronów, uzyskując czterowymiarowe (4D) obrazy o izotropowej rozdzielczości przestrzennej około 330 nm. diSPIM pozwala użytkownikom na wirtualne obracanie objętości obrazu z identyczną rozdzielczością we wszystkich kierunkach. Obrazy w A-D są projekcjami o maksymalnej intensywności tej samej izotropowo połączonej objętości obrazu diSPIM z wyraźnych obrotów wokół długiej osi zarodka. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film uzupełniający S1: Zarodek C. elegans rozwija się od 280 do 434 minut po zapłodnieniu. Izotropowy film szczepu DCR7692 (olaex4655) wyrażającego ujIs113 wszędzie z DACR2819 słabo znakującymi neuryty RMDD (ryc. 7A-D, żółte strzałki). DACR2819 oznacza również dwie komórki mięśniowe (ryc. 7A-D, białe strzałki) i komórkę kanału wydalniczego (ryc. 7A-D, niebieska strzałka) podczas rozwoju embrionalnego (ryc. 7A-D). Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans wyróżnia się jako jedyny organizm, którego końcowe pozycje i połączenia każdego dorosłego neuronu są znane27. Jednak dynamika rozwojowa prowadząca do organizacji obwodów roboczych i sieci tworzących konektom C. elegans pozostaje nieznana. Opierając się na możliwościach wynikających z postępów w mikroskopii świetlnej, możemy teraz uchwycić i przeanalizować pozycje komórek, morfogenezę i neurogenezę w całym rozwoju embrionalnym C. elegans .

Procedura, którą opisaliśmy i którą rutynowo stosujemy w laboratorium, daje izotropowe obrazy 4D znakowanych neuronów i jąder do linii komórkowej w zarodkach C. elegans . Co ważniejsze, zoptymalizowaliśmy warunki obrazowania długoterminowego za pomocą diSPIM i połączyliśmy możliwości półautomatycznego lineingu z obrazami o wysokiej rozdzielczości, aby poprawić szybkość i precyzję analizy embriogenezy C. elegans . Ten zintegrowany protokół umożliwi użytkownikom wizualizację i identyfikację komórek oraz ilościowe określenie trójwymiarowych cech, takich jak migracja neurytów i fascykulacja aksonów, poprzez początek wczesnych drgawek. Procedura ta może być łatwo zaadaptowana do każdego obiektu z systemem ASI diSPIM i zalecamy ten system specjalnie dla tego protokołu. Inne preparaty SPIM oferowane na rynku mogą różnić się od konfiguracji ASI w komorze próbki i właściwościach optycznych. Jednak dane wyeksportowane z innych platform mogą być również przesyłane przez nasz potok danych. W związku z tym możliwa jest ocena ich wartości w lineagingu, wymagającym teście jakości obrazu i stabilności instrumentu. Mimo że aktywnie wykorzystujemy diSPIM do regularnego obrazowania innych okazów (takich jak zarodki drosophila i danio pręgowanego), opisana i kompleksowa analiza pochodzenia zarodków jest obecnie nadal ograniczona do gatunków nicieni. W przypadku większych lub grubych próbek decydujemy się na zastosowanie metod skanowania etapowego, które skanują próbki przez nieruchomy arkusz świetlny. Kumar i in. wcześniej zademonstrowali to ulepszone cięcie diSPIM, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy z grubych próbek bez dodatkowych modyfikacji diSPIM10.

Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują montaż zarodków C. elegans na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną, pozyskiwanie danych i przetwarzanie danych. Zbieranie i montowanie zarodków C. elegans na szklanym szkiełku nakrywkowym może być wyzwaniem dla niedoświadczonych użytkowników, ale tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół kluczowych kroków ułatwiających naukę. Jeśli pożądane jest długoterminowe obrazowanie, najlepsze wyniki uzyskujemy pobierając czterokomórkowe lub wcześniejsze zarodki od 8-10 młodych dorosłych28. Należy pamiętać, że starsi dorośli są mniej pożądani do zbierania zarodków we wczesnym stadium, ponieważ mają tendencję do zawierania starszych zarodków w macicy i niezapłodnionych jaj. Jeśli chodzi o montowanie zarodków, problemy, takie jak zablokowanie zmontowanego aspiratora (pipety doustnej) lub zbyt duży otwór w pipecie mikrokapilarnej, mogą uniemożliwić prawidłowe zamontowanie i orientację zarodków. Aby przygotować się do optymalnego obrazowania, przeprowadzamy testy przed akwizycją na wczesnych i późnych zarodkach przed skurczem, aby sprawdzić działanie arkuszy świetlnych, kamer, obiektywów i autofokusa. Najlepsze wyniki uzyskujemy, gdy wszystkie te operacje są testowane i uzyskujemy wysokiej jakości obrazy podczas naszych testów przed akwizycją. Jest to szczególnie istotne w przypadku generowania obrazów o izotropowej rozdzielczości przestrzennej, dla których surowe obrazy uzyskane z obu widoków (obiektywów) muszą być wysokiej jakości. Po akwizycji woluminy uzyskane dla każdego widoku są przetwarzane w celu uzyskania obrazów izotropowych. Ważne jest, aby użyć odpowiedniej karty procesora graficznego (GPU) zgodnie z opisem w tym protokole (patrz poniżej). Poprawia to szybkość przetwarzania, z jaką generowane są izotropowo połączone obrazy, skracając czas analizy danych. Konieczne jest również, aby użytkownicy korzystali z najnowszej wersji CytoSHOW i korzystali z parametrów dostarczonych z naszym pakietem do pobrania do automatycznego liniowania StarryNite. Jeśli użytkownicy są zainteresowani zastosowaniem automatycznego lineingu, dla innych próbek (np. danio pręgowanego, drosophila itp.), wymagana będzie dodatkowa optymalizacja parametrów używanych w StarryNite (patrz referencje 3,4).

Chociaż nasz zintegrowany protokół dostarcza obrazów i wyników lineingu w zarodku przed drganiem, użytkownicy powinni mieć świadomość, że automatyczne lineowanie w zarodku po skurczu jest obecnie niewykonalne: pozycje jądra zmieniają się w ciągu kilku sekund w zarodku po skurczu, zbyt szybko, aby umożliwić śledzenie linii. Jednak diSPIM rzeczywiście wykazał obiecującą zdolność do wychwytywania zdarzeń neurorozwojowych i śledzenia niektórych pozycji komórek w postdrgawkowych etapach embriogenezy 23,29. Jeśli użytkownicy są zainteresowani badaniem zarodka po drganiu, diSPIM zapewnia szybkość uzyskiwania wolumetrycznych migawek i śledzenia drobnych zdarzeń neurorozwojowych, takich jak wzrost neurytów, w szybko poruszających się zarodkach.

Protokół ten będzie miał fundamentalne znaczenie dla ukończenia atlasu30 WormGUIDES komórka po komórce, ponieważ zapewni zintegrowane podejście z obrazami izotropowymi o wysokiej rozdzielczości do identyfikacji i uchwycenia morfologii 3D znakowanych neuronów w ciągu pierwszych 430 minut embriogenezy. W chwili obecnej prototypowy atlas WormGUIDES dostarcza informacji o położeniu jądrowym komórek w rozwijającym się zarodku i ma na celu uchwycenie dynamiki rozwoju podzbioru neuronów embrionalnych. Protokół ten będzie kluczem do integracji dodatkowych rozwijających się neuronów z atlasem30 WormGUIDES.

Nasz zintegrowany protokół uprości również badanie nowych profili ekspresji genów w zarodku C. elegans. U transgenicznych C. elegans wiele specyficznych dla komórek promotorów przestrzennie i czasowo kontroluje ekspresję transgenu. Podczas gdy wzorce ekspresji większości genów zostały szeroko scharakteryzowane u dorosłego zwierzęcia 31,32,33,34, prawie wszystkie nie zostały jeszcze scharakteryzowane w rozwijającym się (zwłaszcza w późnym stadium) zarodku. Promotor C. elegans był użytecznym zasobem dla społeczności robaków do stymulowania ekspresji transgenu specyficznego dla komórki, a także określania, czy funkcja genu jest autonomiczna dla komórki, czy nieautonomiczna. Uchwycenie izotropowych i dynamicznych wzorców ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości oraz precyzyjna identyfikacja komórek wykazujących ekspresję poprzez linię będzie cenne dla wielu członków społeczności naukowej.

Embriogeneza obejmuje dwa powiązane ze sobą główne procesy: różnicowanie komórkowe i morfogenezę tkanek. Wiadomo bardzo dużo o mechanizmach i cząsteczkach, które definiują różne typy komórek podczas rozwoju C. elegans. Jednak niewiele wiadomo na temat mechanizmów ważnych dla migracji komórek, adhezji komórek i kształtu komórek w zarodku C. elegans . Mając znaną niezmienniczą linię komórkową C. elegans , nasz protokół pozwala nam łatwo dostrzec skatalogowaną mikroanatomię 3D zarodka podczas morfogenezy na nowych poziomach szczegółowości: np. fascykulacji aksonów, synaptogenezy i aktywności neuronalnej. Ardiel i wsp. wcześniej wykazali moc diSPIM do wychwytywania stanów przejściowych wapnia na poziomie pojedynczego neuronu w zarodkach C. elegans 23. Wiele innych aspektów fizjologii rozwoju dojrzało do zbadania za pomocą tych metod.

Wreszcie, protokół ten jest w dużej mierze zautomatyzowany i systematycznie skraca czas potrzebny na wygenerowanie obrazów dekonwolucji i przeprowadzenie lineingu komórek za pomocą StarryNite i Acetree. Strategie programowe użyte w tym protokole mogą być zastosowane do wielu zagadnień biologicznych odległych od bardzo konkretnych dziedzin, w których je tutaj pokazaliśmy.

Szczegółowe informacje na temat kompatybilności oprogramowania i dostępu do pobierania

Informacje na temat Micro-Manager i wtyczek do obrazowania diSPIM są dostępne na http://dispim.org/software/micro-manager i https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.

Potok przetwarzania danych wymaga obecnie systemu operacyjnego Windows. Dołączyliśmy pojedynczy plik archiwum, aby uprościć instalację wszystkich wymaganych programów do przetwarzania danych i plików pomocniczych. Jest on dostępny do pobrania pod adresem http://dispimlineage.wormguides.org.

CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) jest oparty na szeroko stosowanej platformie analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym, ImageJ (v1). Aby korzystać z CytoSHOW, na komputerze musi być zainstalowana i aktualna wersja oprogramowania Java, a aktualizacje programu CytoSHOW są wdrażane automatycznie za pośrednictwem programu Java Web Start. Wiele funkcji CytoSHOW opartych na ImageJ jest opisanych i zilustrowanych na https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW został dostosowany do wyświetlania wielowymiarowych surowych danych z ASI diSPIM, a także innego oprogramowania do obrazowania, które tworzy dane wyjściowe TIFF. Zasadniczo, inne systemy obrazowania SPIM z wieloma widokami mogą być wspierane przez niewielkie modyfikacje CytoSHOW, aby umożliwić przeprowadzenie tego protokołu na różnych systemach mikroskopowych.

SpimFusion został napisany w CUDA/C++ przy użyciu Visual Studio 2013 z zestawem narzędzi CUDA w wersji 7.5. Uruchomienie SpimFusion wymaga określonego sprzętu komputerowego: karty procesora graficznego (GPU) NVIDIA z możliwościami obliczeniowymi CUDA 1.0 lub nowszymi oraz co najmniej 2 GB pamięci karty graficznej. W momencie publikacji naszego protokołu, SpimFusion jest niepublikowany (Min Guo i Hari Shroff), ale dostępny w archiwum pakietów oprogramowania, o którym mowa powyżej.

Specjalnie zbudowana wersja StarryNite oparta na wierszu poleceń wymaga zainstalowania swobodnie dostępnego środowiska uruchomieniowego kompilatora MATLAB, ale nie wymaga licencji na komercyjne oprogramowanie MATLAB. Środowisko uruchomieniowe kompilatora MATLAB jest zawarte we wspomnianym powyżej archiwum pakietów oprogramowania. Kod StarryNite używany w tym protokole jest zasadniczo niezmieniony w stosunku do kodu używanego dla obrazów konfokalnych6. Jednak kilka kwestii operacyjnych związanych z tworzeniem obrazów wejściowych do przetwarzania StarryNite i obsługą wyników StarryNite zostało tutaj rozwiązanych za pomocą metod w CytoSHOW, które umożliwiają ciągły potok przetwarzania danych dla skondensowanych izotropowych woluminów diSPIM. Zmiany te są zautomatyzowane przez kod CytoSHOW, który obsługuje te kroki przetwarzania wstępnego i końcowego. CytoSHOW edytuje również wstępnie zoptymalizowany zestaw parametrów StarryNite specyficzny dla diSPIM, aby automatycznie dostroić algorytm segmentacji do intensywności fluorescencji jąder w obrazowanych danych. Unikalne parametry używane przez StarryNite w każdym zestawie danych diSPIM są następnie zapisywane w pliku wraz z obrazem wyjściowym i danymi pochodzenia.

Niestandardowa wersja AceTree, która działa z obrazami 16-bitowymi i zachowuje kompatybilność z renderowaniem Java3D, najlepiej nadaje się do tego protokołu. Jest również zawarty we wspomnianym powyżej archiwum pakietów oprogramowania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Johnowi Murrayowi za zintegrowany szczep, ujIs113, do wygenerowania szczepu liniowego BV514; Brandon Harvey (NIBIB) za pomoc w testowaniu protokołu; Jonowi Danielsowi i Gary'emu Rondeau (Applied Scientific Instrumentation) za pomoc w tworzeniu Micro-Manager i instrumentu diSPIM; oraz Andrew Yorkowi i Hankowi Edenowi za ich krytyczne opinie na temat systemu diSPIM. Dziękujemy również Centrum Badawczemu dla Instytucji Mniejszościowych oraz Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) za udostępnienie platformy spotkań i burzy mózgów. Wiele z tych prac zostało przeprowadzonych w Morskim Laboratorium Biologicznym w Woods Hole w ramach programu Whitmana. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Programs Narodowego Instytutu Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii NIH oraz przez grant NIH nr U01-HD075602 i nr R24-OD016474. Mark W. Moyle był wspierany przez F32-NS098616, a Leighton H. Duncan był wspierany przez Dodatek do R24-OD016474.

Materiały

et al

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Steps 1-4
Concave SlidesThermoFisher Scientific 1519006Średnica 5-18 mm, głębokość 0,6-0,8 mm, 1,2-1,5 mm
Mikroskop preparacyjny z 10-krotnym przeprowadzką; – 50 i razy; Zakres zoomuMoticSMZ-171
E. coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50
Szkiełka nakrywkowe szklane, nr 1,5, 24 i razy; 50 mmVWR International48393-241
M9 BufferStiernagle, T. Konserwacja C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).
Metyloceluloza  Sigma-AldrichH7509-25G
Rurka aspiratora do pipet mikrokapilarnychSigma-AldrichA5177
Pipety mikrokapilarne, średnica wewnętrzna 0,4 mmIgła Drummond Scientific1-000-800
, nr 18G x 1 i frac12; (1,2 mm x 40 mm)BD Precision Glide305196
płytkiprzygotowane zgodnie z opisem Brennera (1974)
O-ring do komory obrazowaniaO-ringi WestM1,5X40
Pipeta PasteuraCorning/Sigma-AldrichCLS7095D5X
Drut platynowy, średnica 0,5 mmSigma-Aldrich267201
Poli-L-lizynaSigma-AldrichP1524
Prostokątna komora ze stali nierdzewnej (76,0 mm x 50,5 mm)Oprzyrządowanie Applied Sciences (ASI)I2450
Robak doHart, AC Zachowanie. WormBook.  (2006).
Worm PickStiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).
Nazwa>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Steps 5-6
488 nm filtr długoprzepustowySemrockLP02-488 RU-2
561-nm filtr wycinającySemrockNF03-561E-25
BLP02-561R-25, ilość 2Semrock561 nm EdgeBasic najlepszy stosunek jakości do ceny długoprzepustowy filtr krawędziowy
Oprogramowanie sterujące dla dolnej kameryJenoptikProgRes CapturePro
diSIPM film montażowyOprzyrządowanie do badań naukowych stosowanych (ASI)https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com
film o wyrównaniu diSPIMOprzyrządowanie do badań stosowanych (ASI)https://youtu.be/qnOrg30NNuE
obrazowaniem diSPIMIntel Intel Xeon CPU E5-2630 2,6 GHz, łącznie 12 rdzeni,  64  GB pamięci, Windows 7
FF01-525/45-25, ilość 2Jednozakresowy filtr pasmowoprzepustowy Semrock 525/45 nm
Konfiguracja przyrządów Applied Scientifics Instrumentations (ASI)Konfiguracja przyrządów dla tego protokołu jest identyczna jak w Kumar et al 10,11   diSPIM, który wykorzystuje do obrazowania soczewki zanurzeniowe 40x 0,8 NA. (Patrz kroki 5.1 i uwaga)
Micro ManagerMicro-Managerhttps://micro-manager.org/
Modyfikacje konfiguracji Kumar et al diSPIM (patrz poniżej)
Stół optyczny z izolatorami, 4 stopy i czasy; 6 stóp i razy 12 caliTMC784-651-02DR i 14-416-34
NazwaCompany Numer katalogowyKomentarze
Kroki 7-10
Analysis PCIntel Intel Core i7-8700K CPU 3,70 GHz, łącznie 6 rdzeni, 64 GB pamięci, Windows 10
Analysis PC Karta graficznaNVIDIDANVIDIA GeForce GTX 1080 Ti
Instalacja instrukcjePakiethttp://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm
Pakiet oprogramowaniaPakiethttp://dispimlineage.wormguides.org
NGM rzęs Komputer z FF555-DI03-25X36, ilość 2 Semrock 555 nm edge BrightLine jednokrawędziowy dichroiczny beamsplitter Obrazowanie PC Karta graficzna NVIDIDA NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti Kumar Konfiguracja diSPIM oprogramowania oprogramowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
  2. Bao, Z., et al. Automated cell lineage tracing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (8), 2707-2712 (2006).
  3. Santella, A., Du, Z., Bao, Z. A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing. BMC Bioinformatics. 15, 217(2014).
  4. Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D. BMC Bioinformatics. 11, 580(2010).
  5. Boyle, T. J., Bao, Z., Murray, J. I., Araya, C. L., Waterston, R. H. AceTree: a tool for visual analysis of Caenorhabditis elegans embryogenesis. BMC Bioinformatics. 7, 275(2006).
  6. Katzman, B., Tang, D., Santella, A., Bao, Z. AceTree: a major update and case study in the long term maintenance of open-source scientific software. BMC Bioinformatics. 19 (1), 121(2018).
  7. Murray, J. I., et al. Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans. Nature Methods. 5 (8), 703-709 (2008).
  8. Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).
  9. Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).
  10. Kumar, A., et al. Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM). The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).
  11. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).
  12. Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).
  13. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).
  14. Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
  15. Stelzer, E. H. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
  16. Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).
  17. Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).
  18. Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14, Unit14 20 (2010).
  22. Gualda, E. J., et al. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomedical Optics Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).
  23. Ardiel, E. L., et al. Visualizing Calcium Flux in Freely Moving Nematode Embryos. Biophysical Journal. 112 (9), 1975-1983 (2017).
  24. Walton, T., et al. The Bicoid class homeodomain factors ceh-36/OTX and unc-30/PITX cooperate in C. elegans embryonic progenitor cells to regulate robust development. PLoS Genetics. 11 (3), e1005003(2015).
  25. Altun, Z. F. WormAtlas. , (2002).
  26. Wood, W. B. Embryology: In the nematode C. elegans. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8, 215-241 (1988).
  27. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314 (1165), (1986).
  28. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2011).
  29. Christensen, R. P., et al. Untwisting the Caenorhabditis elegans embryo. eLife. 4, (2015).
  30. Santella, A., et al. WormGUIDES: an interactive single cell developmental atlas and tool for collaborative multidimensional data exploration. BMC Bioinformatics. 16, 189(2015).
  31. Dupuy, D., et al. A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome. Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).
  32. Reece-Hoyes, J. S., et al. Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns. BMC Genomics. 8 (27), (2007).
  33. WormBase. , Available from: https://www.wormbase.org (2019).
  34. Lee, R. Y. N., et al. WormBase 2017: molting into a new stage. Nucleic Acids Research. 46 (D1), D869-D874 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Embriogeneza C elegansdwukierunkowy odwr cony SPIManaliza linii kom rkowychobrazowanie 4D ywych embrion wobrazowanie o rozdzielczo ci subkom rkowejneurorozw j C elegansprotok obrazowania diSPIMzautomatyzowane ledzenie kom rekwysokorozdzielcze dane 4D

Powiązane artykuły