Artykuł metodologiczny

Uratowanie rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu

29.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59537

⸱

24 czerwca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Molecular and Cell Biology, Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Campus Universidad Autónoma de Madrid

W tym artykule

Podsumowanie

Niedawna epidemia wirusa Zika podkreśla znaczenie ustanowienia odwrotnego podejścia genetycznego do opracowania szczepionek i/lub strategii terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół ratowania zakaźnego rekombinowanego wirusa Zika z pełnowymiarowego klonu cDNA złożonego w bakteryjnym sztucznym chromosomie pod kontrolą ludzkiego wirusa cytomegalii o natychmiastowym wczesnym promotorze.

Streszczenie

Związek zakażenia wirusem Zika (ZIKV) z powikłaniami neurologicznymi podczas niedawnej światowej epidemii oraz brak zatwierdzonych szczepionek i/lub leków przeciwwirusowych podkreśliły pilną potrzebę opracowania systemów odwróconej genetyki ZIKV, aby ułatwić badania nad biologią ZIKV i rozwój metod terapeutycznych i/lub profilaktycznych. Jednak, podobnie jak w przypadku innych flawiwirusów, wytwarzanie pełnowymiarowych zakaźnych klonów cDNA ZIKV zostało utrudnione ze względu na toksyczność sekwencji wirusowych podczas ich amplifikacji w bakteriach. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy nietradycyjne podejście oparte na wykorzystaniu sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC). Stosując to podejście, pełnowymiarowa kopia cDNA szczepu ZIKV Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) jest generowana z czterech syntetycznych fragmentów DNA i składana w pojedynczą kopię plazmidu pBeloBAC11 pod kontrolą promotora ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV) o natychmiastowym wczesnym początku. Złożony klon cDNA BAC jest stabilny podczas namnażania się w bakteriach, a zakaźny rekombinowany (r)ZIKV jest odzyskiwany w komórkach Vero po transfekcji klonu cDNA BAC. Opisany tutaj protokół zapewnia potężną technikę generowania zakaźnych klonów flawiwirusów, w tym ZIKV, i innych wirusów o dodatniej nici RNA, szczególnie tych z dużymi genomami, które mają problemy ze stabilnością podczas rozmnażania się bakterii.

Wprowadzenie

ZIKV to przenoszony przez komary przedstawiciel rodzaju Flavivirus z rodziny Flaviviridae, który obecnie stanowi globalny stan zagrożenia zdrowia publicznego1. Podobnie jak inne flawiwirusy, ZIKV jest wirusem otoczkowym RNA o strukturze podobnej do ikozaedrycznej, która zawiera jednoniciową cząsteczkę RNA o dodatnim znaczeniu około 10,8 kb (ryc. 1)2. Genom wirusa koduje dużą poliproteinę składającą się z około 3,423 aminokwasów, która jest przetwarzana przez proteazy wirusowe i komórkowe na trzy białka strukturalne (kapsyd [C], błona przedbłonowa/błonowa [prM/M] i otoczka [E]), które biorą udział w tworzeniu cząstek wirusa i siedmiu białek niestrukturalnych (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5), które uczestniczą w replikacji genomu, nagromadzenie wirusa i unikanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza (ryc. 1)3.

Historycznie rzecz biorąc, zakażenie ZIKV było związane z łagodną chorobą przebiegającą z gorączką4,5. Jednak wybuchowa niedawna pandemia zakażeń ZIKV w Ameryce Południowej i Środkowej, na Południowym Pacyfiku i na Karaibach6,7,8 i jej związek z występowaniem zespołu Guillaina-Barrégo i małogłowia9,10,11,12,13, zmieniły historyczne postrzeganie i wzmocniły znaczenie ZIKV jako ważnego ludzkiego patogenu. W tym sensie rozwój narzędzi molekularnych, takich jak zakaźne klony cDNA, ułatwi badanie patogenezy wirusa i opracowanie genetycznie zdefiniowanych szczepionek oraz identyfikację leków przeciwwirusowych do leczenia zakażenia ZIKV. Jak opisano w przypadku innych flawiwirusów, generowanie zakaźnych klonów ZIKV jest trudne ze względu na obecność tajemniczych promotorów bakteryjnych w genomie wirusa14, które umożliwiają nieszczelną ekspresję toksycznych białek wirusowych podczas namnażania klonów cDNA w bakteriach przy użyciu standardowych plazmidów o wysokiej liczbie kopii15,16,17. Aby przezwyciężyć ten problem toksyczności, w ciągu ostatnich dwóch lat z powodzeniem wdrożono kilka nietradycyjnych podejść18. Obejmują one użycie plazmidów o niskiej liczbie kopii19,20, wprowadzenie intronów w celu zakłócenia toksycznych regionów21,22,23, ligacja in vitro fragmentów cDNA24,25, mutacyjne wyciszanie tajemniczych promotorów bakteryjnych obecnych w genomie wirusa26,27, zakaźne subgenomiczne amplikony (ISA)28,29, metoda montażu Gibsona30, oraz zastosowanie reakcji rozszerzenia polimerazy kołowej (CPER)31.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół inżynierii pełnowymiarowego klonu cDNA szczepu ZIKV-RGN13, przy użyciu BAC w celu rozwiązania problemu toksyczności, oraz ratowania zakaźnego rZIKV poprzez bezpośrednią transfekcję klonu cDNA BAC do komórek Vero32, linii komórkowej zatwierdzonej przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do rozwoju szczepionek dla ludzi33. W tym systemie pełnowymiarowa kopia cDNA genomu wirusa jest składana w plazmid BAC pBeloBAC1134 (Figura 2A), plazmidzie o niskiej liczbie kopii (jedna do dwóch kopii na komórkę) pochodzącym z czynnika Escherichia coli F35, co minimalizuje toksyczność sekwencji flawiwirusa podczas jego namnażania się w bakteriach. cDNA genomu ZIKV jest składany w pBeloBAC11 pod kontrolą ludzkiego promotora CMV o natychmiastowym początku, aby umożliwić ekspresję wirusowego (v)RNA w jądrze transfekowanych komórek przez komórkową polimerazę RNA II i otoczony na końcu 3' rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) (RZ), po którym następują sekwencje terminacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) i sygnały poliadenylacji w celu wytworzenia syntetycznych RNA z autentycznymi 5'- i 3'-końce genomu wirusa, odpowiednio, (Figura 2B). Ten system uruchamiany przez cDNA powoduje wewnątrzkomórkową ekspresję wirusowego RNA z czapeczką, umożliwiając odzyskanie zakaźnego ZIKV bez konieczności etapu transkrypcji in vitro. Podejście BAC zapewnia potężną metodologię mającą zastosowanie do konstruowania stabilnych i w pełni funkcjonalnych zakaźnych klonów cDNA dla innych flawiwirusów, a także innych wirusów RNA o dodatniej nici36,37,38,39,40,41.

Protokół

1. Budowa zakaźnego klonu cDNA ZIKV w BAC

UWAGA: Strategia montażu ZIKV w BAC jest opisana dla szczepu RGN 13 (numer dostępu KU527068) (Rysunek 2).

  1. Wybierz unikalne miejsca restrykcyjne odpowiednio rozmieszczone w genomie wirusa, które są nieobecne w plazmidzie pBeloBAC11 (Rysunek 2A).
    nuta: Dla ZIKV-RGN wybrano miejsca restrykcyjne Pml I, Afe I i BstB I (pozycje genomowe odpowiednio 3 347, 5 969 i 9 127). W przypadku, gdy w genomie wirusa nie są dostępne odpowiednie miejsca restrykcyjne, należy wygenerować nowe miejsca restrykcyjne, wprowadzając ciche mutacje nukleotydowe w genomie wirusa podczas projektowania fragmentu cDNA.
  2. Wygeneruj przez syntezę chemiczną cztery fragmenty cDNA obejmujące genom o pełnej długości (od Z1 do Z4), otoczone promotorem CMV na końcu 5' i HDV RZ, terminacją BGH i sekwencjami poliadenylacji na końcu 3' ( Figura 2B). Każdy fragment musi być otoczony wybranymi miejscami restrykcji (krok 1.1).
    nuta: Fragment Z1 jest używany jako szkielet do klonowania pozostałych fragmentów w pBeloBac11. W tym celu musi zawierać ludzki promotor CMV i musi być otoczony na końcu 5' przez ApaL I (w celu sklonowania tego fragmentu w pBeloBAC11) i Asc I (nieobecnym w genomie wirusa), a na końcu 3' przez miejsca restrykcyjne wybrane do złożenia zakaźnego klonu (Pml I, Afe I i BstB I), a następnie Mlu I (nieobecny w genomie wirusa) i BamH I (w celu sklonowania tego fragmentu w pBeloBAC11). Fragment Z4 musi zawierać region genomu od ostatniego wybranego miejsca restrykcyjnego (BstB I) do końca genomu wirusa, a następnie sekwencje HDV RZ, zakończenia BGH i poliadenylacji oraz miejsce restrykcji Mlu I (Figura 2B). Alternatywnie, fragmenty cDNA (Z1-Z4) mogą być generowane przez kombinację standardowych reakcji łańcuchowych polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) i nakładających się PCR przy użyciu określonych oligonukleotydów.
  3. Złóż zakaźny klon cDNA poprzez sekwencyjne klonowanie fragmentów od Z1 do Z4 do pBeloBAC11 (Rysunek 2B).
    1. Trawić plazmid pBeloBAC11 i fragment Z1 za pomocą ApaL I i BamH I. W tym celu należy zmieszać 2 μg plazmidu pBeloBAC11 lub 1 μg fragmentu Z1 z 10 μl 10x buforu reakcyjnego, 20 jednostkami każdego enzymu i wodą, aby osiągnąć końcową objętość 100 μL. Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 godziny.
    2. Defosforylacja wektora BAC za pomocą fosfatazy alkalicznej krewetek (SAP). W tym celu dodać 2,5 μl (2,5 jednostki) SAP do strawionego BAC i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Inaktywować SAP na gorąco przez inkubację w temperaturze 75 °C przez 15 minut.
    3. Oczyść zdefosforylowany wektor BAC i fragment Z1 za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia żelu zoptymalizowanego do oczyszczania fragmentów DNA większych niż 10 kb (patrz tabela materiałów).
    4. Przeprowadź reakcję ligacji, aby wytworzyć plazmid (p)BAC-Z1. W tym celu zmieszać 150 ng oczyszczonego, strawionego wektora BAC z oczyszczoną wkładką, stosując stosunek molowy wektora do wstawki 1:3, 1,5 μl 10x buforu ligazy DNA T4 zawierającego 10 mM ATP, jedną jednostkę ligazy DNA T4 i wodę do końcowej objętości 15 μl.
    5. Mieszaninę do podwiązywania inkubować przez 20 godzin w temperaturze 16 °C. Jako kontrolę reakcji podwiązywania, należy przeprowadzić równolegle reakcję podwiązywania bez wkładki. Inaktywować ligazę termicznie przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 15 min.
      nuta: W przypadku tępo zakończonych DNA inkubować reakcję ligacji przez 20 godzin w temperaturze 14 °C. Ze względu na duży rozmiar wektora BAC (Rysunek 2A), konieczne jest użycie większych ilości wektora i insertu niż w przypadku ligacji z użyciem konwencjonalnych plazmidów w celu zwiększenia wydajności ligacji.
    6. Przekształć 50 μl elektrokompetentnych ogniw E. coli DH10B z 2 μl reakcji ligacji (etap 1.3.5) przez elektroporację (pojemność 25 μF, 2,5 kV i rezystancja 100 Ω), przy użyciu kuwet do elektroporacji wyposażonych w elektrody rozmieszczone w odstępach 0,2 cm, zgodnie ze standardowymi protokołami.
    7. Przenieś komórki do probówki polipropylenowej z 1 ml pożywki SOC (2% trypton, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukozy [pH 7,0]) i inkubuj je w temperaturze 37°C przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem (200-250 obr./min). Umieść komórki na płytkach agarowych z bulionu Luria (LB) zawierających 12,5 μg/ml chloramfenikolu i inkubuj je w temperaturze 37°C przez 16 godzin.
    8. Wybierz od 8 do 12 kolonii bakteryjnych, wykonaj replikę na świeżej płytce agarowej LB zawierającej 12,5 μg / ml chloramfenikolu i sprawdź, czy zawierają one właściwą wkładkę za pomocą bezpośredniej analizy PCR przy użyciu określonych oligonukleotydów.
    9. Wybierz dodatnią kolonię z repliki płytki, hoduj ją w 100 ml LB zawierającym 12,5 μg / ml chloramfenikolu i wyizoluj cDNA BAC metodą lizy alkalicznej przy użyciu komercyjnego zestawu midi do plazmidu, postępując zgodnie z zaleceniami dotyczącymi oczyszczania dużych plazmidów o niskiej kopii (patrz Tabela materiałów).
      nuta: BC cDNA otrzymane tą metodą może być zanieczyszczone do 30% bakteryjnego genomowego DNA, ale jest odpowiedniej jakości do przeprowadzenia analizy restrykcyjnej, sekwencjonowania i klonowania. W zależności od wielkości BAC można uzyskać wydajność 4-6 μg plazmidu BAC.
    10. Zweryfikuj integralność genetyczną sklonowanego cDNA za pomocą analizy restrykcyjnej. Trawić 500 ng plazmidu pBAC-Z1 za pomocą Asc I i Pml I w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i potwierdzić obecność fragmentu Z1 za pomocą elektroforezy żelowej. Aby dodatkowo potwierdzić, że niepożądane mutacje nie zostały wprowadzone, należy zsekwencjonować wstawkę za pomocą określonych oligonukleotydów.
    11. Zaczynając od plazmidu pBAC-Z1 zawierającego wybrane miejsca restrykcyjne (Pml I, Afe I, BstB I i Mlu I), sekwencyjnie klonuj fragmenty Z2 do Z4, aby wygenerować zakaźny klon cDNA o pełnej długości pBAC-ZIKV (Figura 2B), postępując zgodnie z podobnymi podejściami eksperymentalnymi, jak opisano powyżej dla fragmentu Z1 (kroki 1.3.1-1.3.10).

2. Przygotowanie pBAC-ZIKV o wysokiej czystości do ratowania zakaźnych rZIKV

UWAGA: Przygotowanie na dużą skalę ultraczystego zakaźnego klonu pBAC-ZIKV, odpowiedniego do transfekcji i ratowania zakaźnych wirusów, odbywa się metodą alkalicznej lizy za pomocą komercyjnego zestawu specjalnie opracowanego do oczyszczania BAC (zobacz Tabelę Materiałów). Zestaw musi zawierać etap trawienia egzonukleazą zależny od ATP, który usuwa bakteryjne zanieczyszczenie genomowym DNA, umożliwiając izolację BC cDNA o stopniu czystości podobnym do uzyskanego metodą chlorku cezu.

  1. Hoduj pojedynczą kolonię E. coli DH10B przenoszącą zakaźny klon pBAC-ZIKV w 5 ml pożywki LB zawierającej 12,5 μg/ml chloramfenikolu w temperaturze 37°C przez 8 godzin, delikatnie wstrząsając (200-250 obr./min).
  2. Dodać 1 ml kultury bakteryjnej (krok 2.1) do 500 ml LB z 12,5 μg/ml chloramfenikolu w kolbie o pojemności 2 litrów i hodować komórki w temperaturze 37°C przez 14-16 godzin (do osiągnięcia OD600 0,6-0,8).
    nuta: Bogate buliony, takie jak Terrific Broth (TB), mogą wytwarzać bardzo wysokie gęstości komórek, co skutkuje niższą wydajnością i mniejszą czystością cDNA BAC.
  3. Oczyść zakaźny klon cDNA BAC przez lizę alkaliczną przy użyciu komercyjnego zestawu opracowanego specjalnie do oczyszczania BAC, zgodnie ze specyfikacjami producenta (patrz tabela materiałów). Utrzymuj oczyszczony bioray cDNA w temperaturze 4 °C. W zależności od wielkości BAC można uzyskać wydajność 30 μg ultraczystego klonu cDNA BAC.
    nuta: Nie susz osadu DNA dłużej niż 5 minut, ponieważ przesuszenie utrudni rozpuszczenie cDNA BAC. Ze względu na duży rozmiar klonu cDNA BAC należy unikać wirowania lub pipetowania, aby zapobiec ścinaniu plazmidu.

3. Uratowanie zakaźnego rZIKV z klonu cDNA BAC poprzez transfekcję komórek Vero

UWAGA: Zakaźny rZIKV jest odzyskiwany przez transfekcję komórek Vero klonem cDNA pBAC-ZIKV, przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji kationów lipidów (patrz Tabela materiałów; Rysunek 3).

  1. Dzień przed transfekcją płytka na 6-dołkowych płytkach 5 x 105 komórek Vero / studzienka w pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle'a Dulbecco [DMEM] uzupełniona 5% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 2 mM L-glutaminy i 1% aminokwasów endogennych) bez antybiotyków, aby wytworzyć 90% zlewających się monowarstw komórek do czasu transfekcji.
    nuta: Zalecamy przeprowadzenie akcji ratunkowej z wirusem w trzech egzemplarzach.
  2. Zrównoważyć pożywkę o obniżonej zawartości surowicy (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej i przygotować mieszaniny do transfekcji w sterylnych probówkach do mikrofucji dla każdej próbki do transfekcji w następujący sposób.
    1. Dodać 4 μg klonu cDNA BAC do 250 μl pożywki zredukowanej w surowicy i ostrożnie wymieszać, unikając wirowania, aby zapobiec ścinaniu plazmidu.
    2. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 12 μl odczynnika do transfekcji (1 mg/ml) (patrz tabela materiałów) w 250 μl pożywki o zredukowanej surowicy, wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Połączyć rozcieńczony bDNA BAC i odczynnik do transfekcji (w stosunku 1:3 odczynnika DNA:transfekcji), dokładnie wymieszać, unikając wirowania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut.
  3. W okresie inkubacji mieszaniny cDNA BAC / odczynnika do transfekcji przemyć komórki Vero pożywką wzrostową bez antybiotyków i pozostawić komórki w 1 ml świeżej pożywki bez antybiotyków.
    nuta: Dodanie antybiotyków podczas procesu transfekcji może zmniejszyć skuteczność transfekcji.
  4. Rozprowadzić kroplami 500 μl mieszaniny cDNA BAC/odczynnika do transfekcji (z kroku 3.2.3) na komórki Vero, wymieszać je, kołysząc płytką w przód i w tył, a następnie inkubować komórki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.
  5. Usunąć pożywkę do transfekcji, dodać 2 ml świeżej pożywki wzrostowej z antybiotykami (100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny), inkubować komórki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C i codziennie sprawdzać pod kątem indukcji efektu cytopatycznego (CPE).
    nuta: ZIKV CPE jest dość wyraźny w komórkach Vero i charakteryzuje się obecnością zaokrąglonych i dwójłomnych komórek, które odłączają się i unoszą w supernatancie hodowli tkankowej.
  6. Zbierać podwielokrotności (100 μl) supernatantów z hodowli tkankowej komórek Vero (krok 3.5) co 24 godziny, aby określić skuteczność odzyskiwania wirusa poprzez ocenę obecności ZIKV przy użyciu standardowego testu płytki nazębnej na świeżych komórkach Vero (Rysunek 4A).
  7. Po czterech do sześciu dniach transfekcji, gdy CPE wynosi około 50%-75% (Rysunek 4B), zbierz supernatanty z kultur tkankowych w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i odwiruj przy 2,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki komórkowe.
  8. Zebrać supernatanty zawierające rZIKV i wyrzucić osadki komórek. Podzielić supernatant na porcje w krioprobówkach i przechowywać je w temperaturze -80 °C, aby dodatkowo potwierdzić obecność uratowanego rZIKV.

4. Miareczkowanie odzyskanego rZIKV

  1. Dzień przed miareczkowaniem wysiewaj nasiona na 12-dołkowych płytkach 2,5 x 105 komórek Vero / dołek w pożywce wzrostowej, aby do czasu miareczkowania wytworzyć 90% zlewających się monowarstw komórek.
    nuta: Zalecamy przeprowadzenie miareczkowania odzyskanego rZIKV w trzech powtórzeniach.
  2. Usunąć podwielokrotność supernatantu z zamrażarki (krok 3.8) i wykonać seryjne 10-krotne rozcieńczenia w pożywce wzrostowej bez FBS.
  3. Przemyć komórki Vero 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodać 200 μl/basenik każdego rozcieńczenia wirusa w trzech powtórzeniach. Umieścić płytki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C i kołysać co 15 minut przez 90-minutowy okres adsorpcji.
  4. Usunąć inokulum wirusa, pokryć komórki 2 ml pożywki wzrostowej zawierającej 2% FBS, 1% DEAE-dextran i 0,6% Agar Noble i inkubować w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 3-4 dni.
    nuta: Możliwe jest użycie agarozy, metylocelulozy lub innych mediów nakładkowych. Czas prawidłowego tworzenia się płytki nazębnej będzie się różnił w zależności od zastosowanej nakładki i szczepu ZIKV.
  5. Napraw komórki zakażone ZIKV za pomocą 1 ml / studzienkę 4% formaldehydu rozcieńczonego w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, usuń nakładkę i uwidocznij blaszki wirusowe, barwiąc je 0,1% fioletem krystalicznym w 20% metanolu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    1. Wyrzuć fiolet krystaliczny, umyj 3x wodą, pozwól płytkom wyschnąć i ręcznie policz tabliczki (Rysunek 4C, lewy panel). Miano wirusa oblicza się w jednostkach tworzących płytkę miażdżycową na mililitr (PFU/ml).
  6. Alternatywnie, blaszki wirusowe można uwidocznić przez barwienie immunologiczne mysim przeciwciałem monoklonalnym (mAb) 4G2 z białkiem panflawiwirusa E (Figura 4C, prawy panel).
    1. Aby ocenić blaszki ZIKV za pomocą barwienia immunologicznego, po utrwaleniu i usunięciu agaru nakładkowego, jak opisano powyżej (w kroku 4.5), przemyj komórki 2x PBS i przeprowadź je przez inkubację z 200 μl/basenik 0,5% Triton-X100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć roztwór permeabilizujący, przemyć komórki 3x PBS i zablokować je 200 μl/studzienkę roztworu blokującego (10% FBS w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      nuta: Na tym etapie można zastosować inne standardowe rozwiązania blokujące (np. 2,5% BSA w PBS).
    3. Usunąć roztwór blokujący i inkubować komórki z 200 μl/basenik białka panflawiwirusa E mAb 4G2 rozcieńczonego w roztworze blokującym (1 μg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      nuta: Inne przeciwciała mAb lub przeciwciała poliklonalne (pAb) mogą być stosowane zamiast 4G2 do barwienia immunologicznego i wykrywania blaszek wirusowych.
    4. Przemyć komórki 3x PBS i inkubować je z 200 μl biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom rozcieńczonego (zgodnie z zaleceniem producenta) w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    5. Usuń przeciwciało wtórne, przemyj komórki 4x PBS i uwidocznij blaszki wirusowe za pomocą zestawu peroksydazy na bazie awidyny/biotyny zgodnie ze specyfikacjami producenta (patrz Tabela materiałów).

5. Potwierdzenie udanego ratowania rZIKV

UWAGA: Aby dodatkowo potwierdzić tożsamość uratowanego wirusa, ekspresja białka ZIKV E jest analizowana metodą immunofluorescencji przy użyciu mysiego mAb 1176-56 specyficznego dla białka ZIKV E (Rysunek 4D). Ten mAb jest specyficzny dla białka ZIKV E, w przeciwieństwie do sytuacji mAb 4G2 białka E panflawiwirusa (krok 4.6.3). Alternatywnie tożsamość wirusa można potwierdzić za pomocą sekwencjonowania.

  1. Dzień przed analizą immunofluorescencyjną nasienne szkiełka nakrywkowe w 24-dołkowych płytkach zawierających 1 x 105 komórek Vero / studzienkę w pożywce wzrostowej, aby wytworzyć 90% zlewających się monowarstw komórek do czasu infekcji.
  2. Przemyć komórki 2x PBS i zainfekować je wielokrotnością infekcji (MOI) 0,5 PFU/komórkę uratowanego wirusa w pożywce wzrostowej bez FBS (100 μL/dołek) w trzech powtórzeniach. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
  3. Po adsorpcji wirusa usunąć inokulum wirusa, dodać 0,5 ml świeżej pożywki wzrostowej z 2% FBS i inkubować komórki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
  4. Usunąć supernatant hodowli tkankowej, utrwalić komórki za pomocą 150 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przepuścić komórki za pomocą 150 μL/basenik 0,5% Triton-X100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Po usunięciu roztworu permeabilizacyjnego i umyciu komórek 3x PBS, zablokuj komórki 150 μl/studzienkę roztworu blokującego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    nuta: Skanowanie komórek może być blokowane za pomocą alternatywnych rozwiązań blokujących (np. 2,5% BSA w PBS).
  6. Usunąć roztwór blokujący i inkubować komórki ze 100 μl/basenik mAb 1176-56, specyficznego dla białka ZIKV E, rozcieńczonego w roztworze blokującym (1 μg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  7. Przemyć komórki 3x PBS, inkubować je w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę ze 100 μl/basenik sprzężonego z Alexa Fluor 488 wtórnego przeciwciała przeciw myszy rozcieńczonego (zgodnie z zaleceniem producenta) w roztworze blokującym, dokładnie przemyć komórki PBS i inkubować je w 150 μl/basenik 4',6'-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI; 1 mg / ml) rozcieńczonego 1:200 w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  8. Przemyć komórki 3x PBS, zamontować szkiełka nakrywkowe na podłożu mocującym zapobiegającym blaknięciu (patrz Tabela Materiałów) i przeanalizować próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    nuta: W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem.

6. Amplifikacja i generowanie zapasów wirusowych

UWAGA: Gdy tożsamość uratowanego wirusa zostanie potwierdzona (sekcja 5), wzmocnij wirusa na komórkach Vero i wygeneruj zapasy wirusa do dalszych badań.

  1. Hoduj komórki Vero na płytkach o wymiarach 100 mm x 21 mm przy 90% konfluencji i zainfekuj je MOI 0,1 PFU/komórkę, jak opisano wcześniej.
  2. Gdy CPE wynosi około 75% (około 48-72 godzin po zakażeniu), zebrać supernatant z hodowli tkankowej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i odwirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki komórkowe.
  3. Zebrać sklarowany osad zawierający rZIKV i wyrzucić osad komórkowy. Porcjować supernatant w krioprobówkach i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  4. Wyjąć podwielokrotność wirusa z zamrażarki i oznaczyć miano wirusa za pomocą testu płytki płytkiowej, jak opisano wcześniej (sekcja 4).

Wyniki

Opisany tutaj protokół umożliwia generowanie stabilnych, pełnowymiarowych klonów infekcyjnych cDNA ZIKV z wykorzystaniem BAC, aby zminimalizować problemy z toksycznością związane z wieloma sekwencjami flawiwirusów. Efektywną regenerację infekcyjnego rZIKV z klonu cDNA BAC można łatwo osiągnąć po transfekcji podatnych komórek Vero (Rysunek 2). Stosując ten protokół, wygenerowaliśmy stabilny, pełnowymiarowy klon cDNA szczepu ZIKV RGN32 poprzez sekwencyjne klonowanie czterech nakładających się fragmentów cDNA do plazmidu BAC pBeloBAC1134, wykorzystując konwencjonalne metody klonowania oraz unikalne miejsca restrykcyjne obecne w genomie wirusa (Rysunek 2). Pełnowymiarowy klon cDNA był flankowany na końcu 5' przez ludzki promotor CMV, aby umożliwić ekspresję vRNA w jądrze transfekowanych komórek, oraz na końcu 3' przez HDV RZ, po którym następowały sekwencje poliadenylacji i terminacji BGH, aby wytworzyć RNA zawierające dokładny koniec 3' genomu wirusowego (Rysunek 2). Stabilność wygenerowanego klonu cDNA BAC w bakteriach, wraz z łatwością jego manipulacji przy użyciu standardowych technologii rekombinowanego DNA, podkreśla potencjał podejścia opartego na cDNA BAC w szybkim i niezawodnym generowaniu stabilnych, pełnowymiarowych klonów cDNA ZIKV oraz innych flawiwirusów lub wirusów RNA o dodatnej polarności z niestabilnymi genomami wirusowymi.

Po zmontowaniu klonu cDNA w BAC (Rysunek 2), zakaźny wirus mógł zostać łatwo odzyskany po bezpośredniej transfekcji podatnych komórek Vero klonem cDNA BAC przy użyciu liposomów kationowych(Rysunek 3). System ten, oparty na cDNA, umożliwił wewnątrzkomórkową ekspresję uncapped vRNA, co pozwoliło na odzyskanie zakaźnych wirusów bez konieczności przeprowadzenia etapu transkrypcji in vitro. Stosując to podejście, udało nam się uzyskać rZIKV-RGN z mianami przekraczającymi 106 PFU/mL w 5. dniu po transfekcji (Rysunek 4A). Ponadto odzyskany wirus wywołał wyraźny efekt cytopatyczny (CPE) (Rysunek 4B), tworzył jednorodnie wielkościowe plaki o średnicy około 2 mm (Rysunek 4C), a jego tożsamość została potwierdzona poprzez sekwencjonowanie (dane niepokazane) oraz analizę immunofluorescencyjną z użyciem przeciwciała mAb specyficznego dla białka E ZIKV, 176-56 (Rysunek 4D). Dane in vitro wskazują, że odzyskany rZIKV-RGN replikował się wydajnie w komórkach Vero na poziomach porównywalnych z naturalnym izolatem ZIKV32 (dane niepokazane). Podsumowując, wyniki te dowodzą, że zakaźny rZIKV może zostać odzyskany z pełnowymiarowych klonów cDNA zmontowanych w BAC.

Schemat struktury białek wirusowych i cięcia proteazowego; przekrój wirionu z opisanymi białkami.
Rycina 1Organizacja genomu i struktura wirionu ZIKV. (A) Organizacja genomu: ZIKV zawiera jednoniciowy RNA o polarności dodatniej, który jest translacyjny jako pojedynczy poliprotein. Powstały poliprotein jest cięty przez proteazy wirusowe (strzałki) i gospodarza (romby), w wyniku czego powstają białka strukturalne: kapsydu (C, niebieski), macierzy (M, brązowy) i otoczki (E, zielony) oraz siedem białek niestrukturalnych (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5). Nietranslacyjne regiony (UTR) 5' i 3' na końcach genomu wirusowego zaznaczono czarnymi liniami. (B) Struktura wirionu: wiriony ZIKV są pokryte białkami E i M, zakotwiczonymi w dwuwarstwie lipidowej o strukturze zbliżonej do ikosaedru. Pod otoczką wirusową znajduje się nukleokapsyd wirusowy, składający się z białka C powiązanego z genomowym RNA wirusa. Rysunek ten został zaadaptowany z pracy Ávila-Pérez i wsp.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapy bakteryjnych sztucznych chromosomów; schematy plazmidów pBeloBAC1 (7 507 bp) i pBAC-ZIKV (18 308 bp).
Rysunek 2Montaż pełnowymiarowego infekcyjnego klonu cDNA ZIKV w wektorze BAC. (A) Schematyczny rysunek BAC pBeloBAC1: Geny regulatorowe parA, parB, parCi repE,miejsce inicjacji replikacji czynnika F (OriS)), gen oporności na chloramfenikol (Cmr), a i lacOznaczone są geny Z. Podkreślono odpowiednie miejsca restrykcyjne wykorzystane do zmontowania infekcyjnego klonu cDNA ZIKV. (B) Montaż pełnej infekcyjnej kopii cDNA ZIKV w BAC pBeloBAC1: Cztery nakładające się fragmenty DNA (Z1-Z4), obejmujące cały genom ZIKV (Rycina 1) i otoczone wskazanymi miejscami restrykcyjnymi, zostały wytworzone drogą syntezy chemicznej i sekwencyjnie sklonowane do wektora pBeloBAC11 w celu otrzymania infekcyjnego klonu cDNA ZIKV pBAC-ZIKV. Pełnowymiarowe infekcyjne cDNA ZIKV zostało zmontowane pod kontrolą ludzkiego promotora wczesnego i natychmiastowego cytomegalowirusa (CMV) oraz otoczone na końcu 3' rybozymem HDV (RZ) oraz sekwencjami terminacji i poliadenylacji hormonu wzrostu bydlęcego (BGH). Akronimy genów wirusowych i elementów regulacyjnych są opisane w Rycina 1. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces amplifikacji ZIKV, transfekcja DNA pBAC-ZIKV, schemat komórek Vero, oś czasu replikacji wirusa.
Rysunek 3Procedura generowania rZIKV z klonu cDNA w BAC. Komórki Vero przy 90% konfluencji transfekowano w monowarstwie pełnym infekcyjnym klonem cDNA ZIKV pBAC-ZIKV (Rysunek 2) przy użyciu liposomów kationowych. W 4–6 dniach po transfekcji, gdy widoczny był efekt cytopatyczny (CPE), pobrano nadnadczyn z hodowli tkankowej zawierający rZIKV i oceniono obecność wirusa (Rysunek 4) i wykorzystywano do amplifikacji wirusa w komórkach Vero. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Krzywa wzrostu wirusa, mikroskopia kontroli (Mock) i rZIKV, barwienie fioletem krystalicznym, analiza immunobarwienia.
Rysunek 4Odzyskiwanie i charakterystyka in vitro rZIKV. (A) Wytworzenie zakaźnego rZIKV z klonu cDNA w BAC: Komórki Vero przy 90% konfluencji (format płytki 6-dołkowej, powtórzenia trzykrotne) poddano transfekcji pozornej lub transfekcji za pomocą 4 µg/well pBAC-ZIKV (Rysunek 3), a we wskazanych dniach po transfekcji miana wirusa w nadsączach hodowli tkankowych określono za pomocą metody płytek wirusowych (PFU/mL). Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe z trzech różnych eksperymentów transfekcyjnych. Czarna przerywana linia oznacza granicę wykrywalności (50 PFU/mL). (B) Wirusowy efekt cytopatyczny (CPE): Komórki Vero przy 90% konfluencji (format płytki 6-dołkowej, w trzech powtórzeniach) poddano infekcji pozorowanej (góra) lub infekcji rZIKV (MOI = 0,5 PFU/komórkę), a po 48 h od infekcji oceniono obecność CPE za pomocą mikroskopii świetlnej. Paski skali = 100 µm. (C) Test plackowy i immunostaining: komórki Vero przy 90% konfluencji (w formacie płytki 12-dołkowej) zainfekowano rZIKV, a po 72 h od infekcji plaki wirusowe zwizualizowano poprzez barwienie fioletem krystalicznym (lewo) lub immunostaining (prawo) przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 4G2 przeciwko białku E pan-flavivirus. Paski skali = 5 mm. (D) Immunofluorescencja: Komórki Vero przy 90% konfluencji (format płytki 24-dołkowej, w trzech powtórzeniach) zainfekowano rZIKV (MOI 0,5 PFU/komórkę), a po 48 h od infekcji poddano analizie immunofluorescencyjnej z użyciem przeciwciała monoklonalnego mAb 176-56, specyficznego dla białka E ZIKV. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywny obraz scalony zainfekowanych ZIKV komórek Vero. Biały kwadrat w prawym górnym rogu przedstawia powiększony obraz zainfekowanych ZIKV komórek Vero. Paski skali = 100 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Dyskusja

Zakaźne klony cDNA stanowią niezbędne narzędzia molekularne do podstawowych badań nad wirusami RNA oraz opracowywania szczepionek i/lub identyfikacji strategii przeciwwirusowych. Jednak w przypadku wielu wirusów RNA o dodatniej nici, w tym flawiwirusów, generowanie zakaźnych klonów cDNA jest trudne ze względu na niestabilność sklonowanych cDNA podczas namnażania się w bakteriach przy użyciu standardowych plazmidów o wysokiej liczbie kopii. W przypadku ZIKV i innych flawiwirusów niestabilność ta wynika głównie z nieszczelnej ekspresji toksycznych białek wirusowych z tajemniczych promotorów bakteryjnych obecnych w genomie wirusa 14,15,16,17. Tutaj opisujemy alternatywny i potężny protokół generowania stabilnego zakaźnego klonu cDNA o pełnej długości ZIKV jako pojedynczego plazmidu, w oparciu o zastosowanie plazmidu BAC pBeloBAC1134 (Figura 2A) w celu przezwyciężenia problemu toksyczności, zastosowanie promotora CMV w celu umożliwienia ekspresji vRNA w jądrze transfekowanych komórek, oraz HDV RZ do generowania vRNA z dokładnymi końcami 3' (Rysunek 2B). Korzystając z tej metody, udało nam się wygenerować w pełni stabilny zakaźny klon szczepu ZIKV RGN, który umożliwia skuteczne i niezawodne odzyskiwanie zakaźnego rZIKV po bezpośredniej transfekcji podatnych komórek Vero (Figura 3 i Figura 4).

W ciągu ostatnich kilku lat podjęto ogromny wysiłek w celu przezwyciężenia problemów związanych z niestabilnością związanych z zakaźnymi klonami cDNA ZIKV i z powodzeniem wdrożono kilka podejść18, w tym ligację in vitro fragmentów cDNA24,25, plazmidy o niskiej kopii19,20, inaktywację tajemniczych promotorów bakteryjnych poprzez wprowadzenie cichych mutacji26, 27, insercja 21,22,23, metoda montażu Gibsona 30, metoda ISA28,29 oraz zastosowanie CPER31. Chociaż podejścia te rozwiązują problem toksyczności i są przydatne do generowania zakaźnych klonów cDNA ZIKV, niektóre z nich są pracochłonne i mają kilka wad, w tym potrzebę etapów ligacji i transkrypcji in vitro, które zmniejszają wydajność odzyskiwania wirusa lub wprowadzenie dużej liczby cichych mutacji w celu inaktywacji tajemniczego promotora bakteryjnego, który może wpływać na sprawność wirusa. między innymi. Podejście opisane w tym protokole ma następujące zalety. i) Plazmid BAC pBeloBAC1134 ma ściśle kontrolowaną replikację, utrzymując jedną lub dwie kopie plazmidu na komórkę, co minimalizuje toksyczność i umożliwia stabilne utrzymanie w bakteriach niestabilnych cDNA. ii) Propagacja i modyfikacja plazmidów BAC jest prawie podobna do tych w konwencjonalnych plazmidach, biorąc pod uwagę niewielkie modyfikacje opisane w tym protokole w celu manipulowania dużymi fragmentami BAC-DNA i plazmidami o niskiej kopii. Warto zauważyć, że klon cDNA BAC może być również modyfikowany do E. coli przez rekombinację homologiczną przy użyciu systemu rekombinacji czerwonej 42,43,44. iii) Zastosowanie promotora CMV umożliwia wewnątrzkomórkową ekspresję zamkniętego ZIKV vRNA i odzyskiwanie zakaźnych wirusów bez konieczności etapu transkrypcji in vitro. iv) Zakaźny rZIKV jest generowany po bezpośredniej transfekcji wrażliwych komórek (np. Vero) klonem cDNA BAC. Ponieważ transfekcja DNA w komórkach ssaków jest bardziej wydajna niż transfekcja RNA, skuteczność odzyskiwania wirusa przy użyciu podejścia BAC jest wyższa niż obserwowana przy użyciu transkryptów RNA, co zmniejsza liczbę pasaży w komórkach hodowlanych w celu wytworzenia stada wirusa, a w konsekwencji ogranicza wprowadzanie niepożądanych mutacji przez adaptację hodowli komórkowej.

Wreszcie, potencjał podejścia BAC jest wspierany przez udane zastosowanie tej metody (z niewielkimi modyfikacjami) do inżynierii zakaźnych klonów cDNA innych flawiwirusów, w tym wirusa dengi36 i kilku koronawirusów o dużym wpływie na zdrowie ludzi i zwierząt, takich jak koronawirus pasażalnego zapalenia żołądkai jelit 37 (TGEV), wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów38 (FIPV), ludzki koronawirus OC4339 (HCoV-OC43), koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej40 (SARS-CoV) i koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego41 (MERS-CoV).

W opisanym tutaj protokole istnieją dwa krytyczne kroki, które należy wziąć pod uwagę. Jedną z ważnych kwestii jest identyfikacja odpowiednich unikalnych miejsc restrykcyjnych w genomie wirusa, które są nieobecne w plazmidzie BAC. Jeśli nie są dostępne odpowiednie miejsca ograniczenia, nowe miejsca restrykcyjne mogą zostać wygenerowane podczas projektowania klonowania poprzez wprowadzenie cichych mutacji nukleotydowych. Inną ważną kwestią jest to, że plazmidy BAC są obecne tylko w jednej lub dwóch kopiach na komórkę, a zatem niską wydajność plazmidów BAC z wysokim zanieczyszczeniem bakteryjnego genomowego DNA uzyskuje się przy użyciu standardowych protokołów zaprojektowanych dla plazmidów o wysokiej i średniej liczbie kopii. Ten potencjalny problem można łatwo przezwyciężyć za pomocą dużych objętości hodowli i oczyszczania plazmidu BAC za pomocą komercyjnego zestawu opracowanego specjalnie do oczyszczania BAC.

Podsumowując, opracowaliśmy potężne podejście do odwróconej genetyki ZIKV oparte na wykorzystaniu BAC, które można dostosować do generowania stabilnych i w pełni funkcjonalnych zakaźnych klonów cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, aby ułatwić badanie biologii tych wirusów i opracowanie szczepionek i/lub ułatwić identyfikację leków przeciwwirusowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Carli Gómez za jej pomoc techniczną w generowaniu klonów cDNA BAC oraz Snezhanie Dimitrovej za pomoc w przygotowaniu filmu. Prace te były częściowo wspierane przez dotacje z hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności (MINECO, numer grantu BFU2016-79127-R) dla F.A.T. oraz National Institutes of Health (NIH, numer grantu 1R21AI120500) dla L.M.S. i F.A.T.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Odczynniki do biologii molekularnej
Afe INew England BioLabsR0652S10 000 jednostek/ml
AmpliTaq DNA Polimeraza ThermoFisherScientific (Applied Biosystems)N80801615 000 jednostek/ml
ApaL INew England BioLabsR0507S10 000 jednostek/ml
Asc INowa Anglia BioLabsR0558S10 000 jednostek/ mL
BamH INew England BioLabsR0136S10 000 jednostek/mL
BstB INew England BioLabsR0519S20 000 jednostek/ml
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378
ElectroMAX DH10B Cells ThermoFisher Scientific (Invitrogen)18290015Elektrokompetentne ogniwa DH10B
Kuwety elektroporacyjne, 0,2 cmBio-Rad165-2086
EtanolMerck100983Łatwopalny
izopropanolMerck109634Łatwopalny
zestaw do dużych konstrukcji (10)QIAGEN12462Do preparatu BAC o wysokiej czystości
LB RosółThermoFisher Scientific (Invitrogen 12780029Może być również domowej roboty
LB z agaremThermoFisher Scientific (Invitrogen)22700041Może być również domowej roboty
MetanolMerck106009Łatwopalny
Mlu INew England BioLabsR0198S10 000 jednostek/ml
OligonukleotydyIDTN/A
Plazmid pBeloBAC11New England BioLabsER2420S (E4154S)
Zestaw Midi do plazmidu (25)QIAGEN12143Do przygotowania plazmidów BAC w średniej skali
Pml INew England BioLabsR0532S20 000 jednostek/ml
Probówki polipropylenowe (10 ml)DeltaLab175724Inne źródła komercyjne są dopuszczalne Zestaw
ekstrakcji żelu QIAEX II (150)QIAGEN20021Zestaw do czyszczenia żelu zoptymalizowany pod kątem fragmentów DNA większych niż 10 kb
Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP)New England BioLabsM0371S1,000 jednostek/ml
SOC MediumThermoFisher Scientific (Invitrogen)15544034Może być również domowej roboty
Synteza fragmentów cDNABio BasicN/A
T4 DNA LigazaSigma-Aldrich (Roche)104812200011,000 jednostek/ml
2. Odczynniki do hodowli komórkowych
6-dołkowe płytkiThermoFisher Scientific (Nunc)140675
12-dołkowe ThermoFisherScientific (Nunc)150628
Płytki 24-dołkoweThermoFisher Scientific (Nunc)142485
Agar NobleVWR214230
Alexa Fluor 488 Sprzężona mrówka-mysz przeciwciało wtórneZmieniasię Nie dotyczy
Biotynylowane przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom wtórnymzmienia sięN/A
Szalki do hodowli komórkowych (100 mm x 21 mm)ThermoFisher Scientific (Nunc)172931
Probówki stożkowe (15 ml)VWR525-0150
Probówki stożkowe (50 ml)VWR525-0155
Kryształowy fioletSigma-AldrichC6158
DAPISigma-AldrichD9542Toksyczny i rakotwórczy
DEAE-DextranSigma-AldrichD9885
DMEMThermoFisher Scientific (Gibco)11995065
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ThermoFisher Scientific (HyClone))SV30160.03
FormaldehydSigma-AldrichF8775Toksyczna i rakotwórcza
L-glutaminaThermoFisher Scientific (Gibco)25030081
Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific (Invitrogen)11668019Odczynnik do transfekcji
Aminokwasy endogenneThermoFisher Scientific (Gibco)11140035
Opti-MEM I Obniżona surowicaThermoFisher Scientific (Gibco)31985070Pożywka transfekcyjna
Białko E panflawiwirusa E mAb 4G2BEI ZasobyNR-50327
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences15710-SToksyczny i rakotwórczy
PBSThermoFisher Scientific (Gibco)14190144
Penicylina/StreptomycynaThermoFisher Scientific (Gibco)15140122
Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong GoldThermoFisher Scientific (Invitrogen)P10144
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
Zestaw ABC Vectatain VectorLaboratories IncPK-4010Zestaw peroksydazy na bazie awidyny/biotyny
Vero CellsATCCCCL-81
ZIKV E Białko mAb 1176-56BioFront TechnologiesBF-1176-56
3. Sprzęt
System elektroforezy w żelu agarozowymBio-Rad1704468Inne źródła komercyjne są dopuszczalne
Klasa II Bezpieczeństwo biologiczne Szafka CO2Różni sięNie dotyczyInne źródła komercyjne są dopuszczalne
Wirówka chłodnicza na biurkuRóżni sięNie dotyczy
MikroskopfluorescencyjnyRóżnisię Nie dotyczy
Szybkoobrotowa wirówka chłodniczaZmienia sięNie dotyczy
Elektroporator MicroPulserBio-Rad1652100Inne maszyny są dopuszczalne
Termocykler SimpliAmpThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)A24811Inne maszyny są dopuszczalne
Vortexerzmieniasię nie dotyczy
do

Bibliografia

  1. Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246(2017).
  2. Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
  3. Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer | Lippincott Williams & Wilkins. 712-748 (2013).
  4. Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112(2016).
  5. Simpson, D. I. Zika virus infection in man. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  6. Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
  7. Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  8. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  9. Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
  10. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  11. do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
  12. Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  13. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  14. Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197(2011).
  15. Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
  16. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  17. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
  18. Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
  19. Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
  20. Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
  21. Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
  22. Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
  23. Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
  24. Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
  25. Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
  26. Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
  27. Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491(2018).
  28. Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384(2016).
  29. Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
  30. Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
  31. Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
  32. Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
  33. Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  34. Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
  35. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  36. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
  37. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  38. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  39. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  40. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  41. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  42. Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
  43. Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
  44. Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odzyskiwanie klonu zakaźnegotransfekcja komórek Veroanaliza efektu cytopatycznegomiareczkowanie metodą płyteksystem promotora CMVklonowanie w miejscu restrykcyjnymoczyszczanie DNA z BACrybosom wirusa zapalenia wątroby typu delta
Uratowanie rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.