Celem tego protokołu jest genotyp ukwiału Nematostella vectensis podczas gastrulacji bez poświęcania zarodka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Genotypowanie ukwiałów morskich we wczesnym okresie rozwoju
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisany tutaj jest protokół oparty na PCR, który pozwala na genotypowanie zarodka w stadium gastruli parzydełkowca Nematostella vectensis bez poświęcania życia zwierzęcia. Po zapłodnieniu in vitro i odjęciu galaretki zygoty rozwijają się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, aby osiągnąć wczesną lub środkową fazę gastruli. Zarodki gastruli są następnie umieszczane na złożu żelu agarozowego na szalce Petriego zawierającej wodę morską. Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą wolframowej igły chirurgicznie oddziela się fragment tkanki brzusznej od każdego zarodka. Zarodki po operacji mogą się następnie zagoić i kontynuować rozwój. Genomowe DNA jest ekstrahowane z izolowanego fragmentu tkanki i wykorzystywane jako matryca do PCR specyficznego dla locus. Genotyp można określić na podstawie wielkości produktów PCR lub obecności/braku produktów PCR specyficznych dla alleli. Zarodki pooperacyjne są następnie sortowane według genotypu. Czas trwania całego procesu genotypowania zależy od liczby zarodków do przesiewu, ale wymaga minimum 4–5 godzin. Metoda ta może być stosowana do identyfikacji mutantów nokautujących z genetycznie heterogenicznej populacji zarodków i umożliwia analizę fenotypów w trakcie rozwoju.
Wprowadzenie
Cridarianie reprezentują różnorodną grupę zwierząt, do której należą meduzy, koralowce i ukwiały. Są to diploblasty, składające się z ektodermy i endodermy, które są oddzielone macierzą zewnątrzkomórkową (mezoglea). Cnidaria jest siostrzaną grupą speciose Bilateria, do której należą tradycyjne modele zwierzęce, takie jak Drosophila i Mus1. Ponadto uważa się, że dywergencja Cnidaria-Bilateria miała miejsce w okresie prekambryjskim2. W związku z tym badania porównawcze parzydełkowców i parzydełkowców są niezbędne do uzyskania wglądu w biologię ich ostatniego wspólnego przodka. Niedawno genomika porównawcza ujawniła, że parzydełkowców i bilateralnych mają wiele wspólnych genów zestawu narzędzi rozwojowych, takich jak notch i bHLH, co sugeruje, że ich wspólny przodek miał już te geny3. Jednak rola tych genów z zestawu narzędzi rozwojowych w ostatnim wspólnym przodku Cnidaria i Bilateria jest porównywalnie mniej poznana. Aby rozwiązać ten problem, kluczowe jest zbadanie, w jaki sposób te głęboko konserwatywne geny funkcjonują u parzydełkowców.
Jednym z wyłaniających się modeli genetycznych parzydełkowców jest antozoan Nematostella vectensis. Jego genom został zsekwencjonowany3, a różne narzędzia genetyczne, w tym knockdown genów za pośrednictwem morfoliny, transgeneza za pośrednictwem meganukleazy oraz knockiny i knockouty za pośrednictwem CRISPR-Cas9, są teraz dostępne do użycia u tego zwierzęcia. Ponadto rozwój Nematostella jest stosunkowo dobrze poznany. Podczas embriogenezy gastrulacja następuje przez inwagtion4, a zarodek rozwija się w swobodnie pływającą larwę planuli. Planula następnie przekształca się w siedzący polip z ustami i mackami okołoustnymi. Polip następnie rośnie i osiąga dojrzałość płciową.
Ukierunkowana mutageneza za pośrednictwem CRISPR-Cas9 jest teraz rutynowo stosowana do badania funkcji genów u Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Aby wygenerować mutanty nokautujące w Nematostella, koktajl zawierający specyficzne dla locus jednoprzewodnikowe RNA i białko endonukleazy Cas9 jest najpierw wstrzykiwany do niezapłodnionych lub zapłodnionych jaj w celu wytworzenia zwierząt założycielskich F0, które zwykle wykazują mozaickowatość. Zwierzęta F0 są następnie hodowane do dojrzałości płciowej i krzyżowane ze sobą w celu wytworzenia populacji F1, której podzbiorem mogą być mutanty nokautujące6. Alternatywnie, dojrzałe płciowo zwierzęta F0 mogą być krzyżowane ze zwierzętami typu dzikiego, aby uzyskać zwierzęta heterozygotyczne F1, a heterozygoty F1, które mają allel nokautujący w miejscu zainteresowania, mogą być następnie krzyżowane ze sobą, aby uzyskać potomstwo F2, z których jedna czwarta ma być mutantami nokautującymi5. Oba podejścia wymagają metody identyfikacji mutantów nokautujących z genetycznie niejednorodnej populacji. Macki polipów mogą być używane do ekstrakcji genomowego DNA w celu genotypowania6,7. Jednak w przypadkach, gdy badana jest funkcja rozwojowa genu będącego przedmiotem zainteresowania, a zmutowane zarodki nie osiągają stadium polipa (tj. z powodu śmiertelności larw związanej z mutacją), mutanty nokautujące muszą zostać zidentyfikowane na wczesnym etapie ontogenezy. Opisano tutaj protokół oparty na PCR do genotypowania poszczególnych zwierząt w stadium gastruli bez poświęcania zwierzęcia, który umożliwia identyfikację mutantów nokautujących z genetycznie heterogenicznej populacji zarodków. Czas trwania całego procesu genotypowania zależy od liczby zarodków do przebadania, ale wymaga minimum 4-5 godzin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Indukcja tarła, zapłodnienie in vitro i usuwanie galaretki
- Utrzymuj Nematostella vectensis w wodzie morskiej o zasoleniu 12 części na tysiąc (ppt) w ciemności w temperaturze 16 °C, codziennie karmiąc Artemię.
- W dniu poprzedzającym indukcję tarła umieść zwierzęta w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze i świetle. Zaprogramować inkubator w taki sposób, aby zwierzęta były wystawione na działanie światła przez 8 godzin w temperaturze 25 °C. Opcjonalnie: Przed umieszczeniem w inkubatorze należy podać poszczególnym zwierzętom mały kawałek (<1 mm3) ostrygi, aby usprawnić tarło.
- Pozostawić zwierzęta w inkubatorze na 1 godzinę w temperaturze 16 °C.
- Wyjmij zwierzęta z inkubatora i pozostaw je na blacie ze światłem o temperaturze pokojowej (RT), aby umożliwić tarło. Tarło następuje zwykle w ciągu następnych 1,5–2 godzin.
- Jeśli samce i samice znajdują się w oddzielnych pojemnikach, należy umieścić opakowania jaj z pojemnika żeńskiego do pojemnika dla mężczyzn zawierającego plemniki za pomocą pipety do przenoszenia, której końcówka jest nacięta w celu powiększenia otworu, tak aby jaja nie zostały uszkodzone przez naprężenia mechaniczne podczas przenoszenia. Pozwól na zapłodnienie jaj, pozostawiając je w męskim pojemniku na co najmniej 15 minut.
- Opakowania jaj należy usunąć z galaretki w wodzie morskiej zawierającej 3% cysteiny (pH 7,4) na szalce Petriego lub w probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie mieszać na wytrząsarce przez 12 minut.
- Użyj plastikowej pipety, aby rozbić grudki i kontynuuj mieszanie przez kolejne 2-3 minuty, aż do całkowitego usunięcia galaretki.
- Usuń cysteinę, zastępując podłoże świeżą wodą morską przez co najmniej 5 razy.
- Przechowywać zapłodnione jaja na szklanej szalce Petriego w temperaturze 16 °C lub RT.
2. Chirurgiczne usunięcie tkanki brzusznej z zarodka gastruli
- Przygotować bufor do ekstrakcji DNA składający się z 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 i 1 μg/μL proteinazy K. Użyć 20 μl buforu ekstrakcyjnego na zarodek. Dobrze wymieszać przez wirowanie i podzielić bufor na probówki do PCR.
- Rozpuść 1% agarozy w wodzie morskiej i wlej ją na szalkę Petriego, aby przykryła dno. Schłodzić na blacie, aby zrobić łóżko żelowe. Wlej świeżą wodę morską, aby przykryć złoże żelowe na szalce Petriego.
- W ciągu 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) zarodki (od wczesnego do środkowego stadium gastruli) przenieść na szalkę Petriego zawierającą złoże żelu agarozowego.
- Włóż igłę wolframową do uchwytu igły i wysterylizuj, zanurzając końcówkę igły w alkoholu (70% lub wyższym) i umieszczając ją w płomieniu w celu spalenia alkoholu.
- Pod mikroskopem preparacyjnym (przy powiększeniu od 20x do 40x) użyj igły wolframowej, aby wykonać wgłębienie na łóżku agarozy, usuwając kawałek powierzchni agarozy o wielkości zarodka, który ma być manipulowany, i umieść zarodek na zagłębieniu boczną stroną skierowaną w dół, aby ograniczyć ruch zarodka do mikrochirurgii.
- Użyj igły wolframowej, aby chirurgicznie wyciąć kawałek tkanki brzusznej znajdującej się naprzeciwko otworu jamy ustnej. Zwykle wystarcza jedna trzecia do jednej czwartej tkanki embrionalnej wzdłuż osi ustno-aboralnej.
- Za pomocą pipety P20 przenieś wyizolowaną tkankę jamy brzusznej (w <2 μl) do probówki PCR zawierającej 20 μl buforu do ekstrakcji DNA.
- Przenieść zarodek pooperacyjny do studzienki zawierającej co najmniej 500 μl słodkiej wody morskiej na płytce 24- lub 96-dołkowej.
- Powtórz kroki 2.4–2.8 dla liczby zarodków w razie potrzeby.
- Umieścić płytkę studzienki zawierającą zarodki pooperacyjne w inkubatorze w temperaturze 16 °C lub RT do czasu zakończenia genotypowania.
3. Ekstrakcja genomowego DNA i genotypowanie PCR
- Za pomocą miniwirówki (np. przy 2,680 x g przez 10 s) należy krótko odwirować probówki do PCR zawierające bufor do ekstrakcji DNA i wyizolowane tkanki zarodkowe.
- Aby wyekstrahować genomowe DNA z pojedynczych zarodków, należy inkubować probówki PCR w temperaturze 55 °C przez 3 godziny. Wirować przez 30 s co 30 minut, aby zapewnić rozpad grudek komórek i zwiększyć lizę komórek.
- Inkubować probówki do PCR w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu inaktywacji proteinazy K.
- Ekstrakty gDNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie i natychmiast przystąpić do PCR.
UWAGA: Protokół można wstrzymać w tym miejscu, umieszczając ekstrakty gDNA w zamrażarce o temperaturze -20 °C. - Ustaw reakcję PCR, używając wyekstrahowanego gDNA jako matrycy w celu amplifikacji interesującego miejsca genomu.
- Jeśli różne allele w miejscu zainteresowania różnią się wielkością, tak że różnicę wielkości można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, zaprojektuj pojedynczy zestaw starterów, aby amplifikować całe locus.
- Alternatywnie, należy użyć starterów specyficznych dla alleli, które generują produkty PCR tylko w obecności specyficznego allelu; na przykład poprzez zaprojektowanie startera, który wiąże się z regionem zawierającym mutacje insercji/delecji.
- Użyj typowej mieszaniny reakcyjnej 20 μL PCR w następujący sposób: 5 μL ekstraktów gDNA, 8 μL wody wolnej od nukleaz, 4 μL buforu PCR, 0,2 μL 10mM dNTP, 0,6 μL DMSO, 1 μL 10 μM startera do przodu, 1 μL 10 μM startera odwrotnego, i 0,2 μl polimerazy DNA (patrz tabela materiałów).
UWAGA: W reakcji PCR można użyć wielu starterów. Na przykład, jeden uniwersalny starter do przodu i dwa startery odwrotne specyficzne dla alleli mogą być połączone, o ile dwa startery odwrotne są zaprojektowane do generowania produktów PCR o różnych rozmiarach, tak aby obecność/brak dwóch alleli można jednoznacznie określić za pomocą elektroforezy żelowej (patrz sekcja dotycząca wyników reprezentatywnych).
- Przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym, aby określić wielkość i obecność/brak produktów PCR. Dostosuj stan elektroforezy w żelu agarozowym (np. procent żelu agarozowego, V/cm i czas trwania) w zależności od oczekiwanej wielkości produktów PCR.
- Wykorzystaj wyniki PCR dotyczące wielkości i obecności/braku produktów PCR, aby przypisać genotyp do każdego zarodka po operacji. Na przykład, jeśli oczekuje się, że różne allele wygenerują produkty PCR o różnych rozmiarach, użyj informacji o wielkości, aby przypisać genotyp dla każdego zarodka. Jeżeli stosuje się startery specyficzne dla alleli, dane dotyczące obecności/braku produktów PCR powinny być wykorzystane do przypisania genotypu do każdego zarodka.
- Sortuj zarodki według genotypu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Genom Nematostella posiada pojedyncze locus kodujące białko prekursor neuropeptydu GLWamide. Wcześniej opisano trzy allele mutantów z nokautem w tym locus (glw-a, glw-b oraz glw-c)5. Cztery heterozygotyczne samce posiadające allel typu dzikiego (+) i allel z nokautem glw-c w locus GLWamide (genotyp: +/glw-c) skrzyżowano z heterozygotyczną samicą posiadającą allel t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano tutaj protokół oparty na PCR do genotypowania pojedynczego zarodka ukwiału bez poświęcania zwierzęcia. Po tarle i odgalaretowi zapłodnione jaja mogą przekształcić się w gastrulae. Obszar brzuszny każdego zarodka gastruli jest usuwany chirurgicznie, a wyizolowana tkanka brzuszna jest wykorzystywana do późniejszej ekstrakcji genomowego DNA, podczas gdy pozostałe zarodki po operacji goją się i kontynuują rozwój. Ekstrakty gDNA są następnie wykorzystywane do testu PCR w celu określenia genotypu każdego zarodka. Metod...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor nie ma nic do zdradzienia.
Podziękowania
Dziękujemy anonimowym recenzentom za komentarze do wcześniejszej wersji manuskryptu, które poprawiły manuskrypt. Prace te były wspierane przez fundusze z University of Arkansas.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inkubator z chłodzeniem Drosophila Peltier | Shellab | SRI6PF | Służy do indukcji tarła |
| Natychmiastowa sól morska oceaniczna | Instant ocean | 138510 | |
| Cysty krewetek solankowych | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| Chlorowodorek L-cysteiny | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standardowa wytrząsarka orbitalna, model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | JAKOŚĆ BIOLOGICZNA | 351-007-01 | |
| Chlorek potasu | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substytut | US Biologiczny | N3500 | |
| (20 mg / ml), klasa RNA | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agaroza | VWR | 710 | |
| Mikro uchwyt igły preparacyjnej | Roboz | RS-6060 | |
| Igła preparcyjna wolframowa | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamidowy uniwersalny podkład | 5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3' | ||
| Odwrócony starter specyficzny dla glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3' | ||
| Odwrócony starter specyficzny dla glw-c | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3' |
Bibliografia
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742(2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377(2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486(2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694(2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734(2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555(2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
