Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Junya Shiota; Nureen  H. Mohamad Zaki; Juanita  L. Merchant; Linda  C. Samuelson; Nataliya Razumilava

doi:10.3791/59544

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59544

⸱

23 kwietnia 2019

Junya Shiota¹ , Nureen H. Mohamad Zaki¹ , Juanita L. Merchant¹^,² , Linda C. Samuelson¹^,² , Nataliya Razumilava¹

¹Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, ²Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Streszczenie

Cholangiopatie, które wpływają na pozawątrobowe drogi żółciowe (EHBD), obejmują atrezję dróg żółciowych, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych i raka dróg żółciowych. Nie mają skutecznych opcji terapeutycznych. Narzędzia do badania EHBD są bardzo ograniczone. Naszym celem było opracowanie specyficznego dla narządu, wszechstronnego, opartego na dorosłych komórkach macierzystych, przedklinicznego modelu cholangiocytów, który można łatwo wygenerować z myszy dzikich i genetycznie zmodyfikowanych. W związku z tym informujemy o nowatorskiej technice opracowywania systemu hodowli organoidów EHBD (EHBDO) z dorosłych myszy EHBD. Model jest ekonomiczny, może być łatwo analizowany i ma wiele dalszych zastosowań. W szczególności opisujemy metodologię izolacji mysiego EHBD i dysocjacji pojedynczych komórek, inicjacji, rozmnażania hodowli organoidów oraz długotrwałego utrzymania i przechowywania. W tym artykule opisano również przetwarzanie EHBDO w immunohistochemii, mikroskopii fluorescencyjnej i kwantyfikacji obfitości mRNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Protokół ten ma znaczące zalety oprócz wytwarzania organoidów specyficznych dla EHBD. Zastosowanie kondycjonowanej pożywki z ogniw L-WRN znacznie obniża koszt tego modelu. Zastosowanie mysich EHBD zapewnia prawie nieograniczoną ilość tkanek do generowania hodowli, w przeciwieństwie do tkanek ludzkich. Wygenerowane mysie EHBDO zawierają czystą populację komórek nabłonkowych z markerami endodermalnych komórek progenitorowych i zróżnicowanych komórek żółciowych. Hodowane organoidy zachowują jednorodną morfologię poprzez wiele pasaży i mogą być odzyskane po długotrwałym okresie przechowywania w ciekłym azocie. Model pozwala na badanie proliferacji komórek progenitorowych dróg żółciowych, może być manipulowany farmakologicznie i może być generowany z genetycznie modyfikowanych myszy. Potrzebne są dalsze badania, aby zoptymalizować warunki hodowli w celu zwiększenia wydajności posiewu, oceny funkcjonalnej dojrzałości komórek i bezpośredniego różnicowania komórek. Pożądane jest również opracowanie modeli kokultur i bardziej neutralnej biologicznie macierzy zewnątrzkomórkowej.

Wprowadzenie

Cholangiopatie są nieuleczalnymi, przewlekłymi, postępującymi zaburzeniami, które wpływają na komórki żółciowe zlokalizowane w wewnątrz- i zewnątrzwątrobowych drogach żółciowych (EHBD)¹. Niektóre cholagiopatie, takie jak pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, rak dróg żółciowych, atrezja dróg żółciowych i torbiele żółciowe, wpływają głównie na EHBD. Rozwój terapii cholangiopatii jest ograniczony ze względu na ograniczoną dostępność modeli przedklinicznych. Ponadto wcześniejsze badania koncentrowały się na cholangiopatiach zgrupowanych razem: wątroba, intra- i EHBD. Jednak intra- i EHBD mają wyraźne pochodzenie embrionalne i dlatego ....