Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Cholangiopatie są nieuleczalnymi, przewlekłymi, postępującymi zaburzeniami, które wpływają na komórki żółciowe zlokalizowane w wewnątrz- i zewnątrzwątrobowych drogach żółciowych (EHBD)¹. Niektóre cholagiopatie, takie jak pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, rak dróg żółciowych, atrezja dróg żółciowych i torbiele żółciowe, wpływają głównie na EHBD. Rozwój terapii cholangiopatii jest ograniczony ze względu na ograniczoną dostępność modeli przedklinicznych. Ponadto wcześniejsze badania koncentrowały się na cholangiopatiach zgrupowanych razem: wątroba, intra- i EHBD. Jednak intra- i EHBD mają wyraźne pochodzenie embrionalne i dlatego powinny być uważane za odrębne patologie molekularne. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe rozwijają się z wewnątrzwątrobowych płytek przewodowych i czaszkowej części uchyłka wątroby, całe EHBD rozwijają się z ogonowej części uchyłka wątroby². Opierają się również na różnych przedziałach komórek progenitorowych dla homeostazy dorosłych, w tym kanałów Heringa w wewnątrzwątrobowych drogach żółciowych i gruczołach okołożółciowych w EHBDs^2,3. Wykorzystanie modeli zwierzęcych w badaniach przedklinicznych jest ograniczone kosztami i powinno być zminimalizowane ze względów etycznych. W związku z tym redukcjonistyczne, powtarzalne, efektywne czasowo i kosztowo modele in vitro są wysoce pożądane.

Większość wcześniejszych badań nad cholangiopatiami wykorzystywała normalne modele raka myszy lub szczurów, lub ludzkie linie komórkowe raka dróg żółciowych pochodzące z wewnątrz- i EHBDs^4,5,6,7. Są to jednak modele transformowanych komórek i nie podsumowują normalnej biologii cholangiocytów w homeostazie lub w stanie zdrowym. Niedawny postęp w rozwoju modeli hodowli organotypowych pozwolił na opracowanie trójwymiarowych struktur z różnych typów tkanek, w tym tkanek wątroby i dróg żółciowych, chociaż nie normalnych mysich EHBDs8^,9,10. Te "narządopodobne" struktury mają na celu naśladowanie tkanki pierwotnej i są hodowane w sztucznej niszy wspierającej samoodnawianie się specyficznych dla narządu komórek macierzystych/progenitorowych¹¹.

"Organoid" to szerokie pojęcie, które najczęściej opisuje trójwymiarowe modele tkanek pochodzące z komórek macierzystych. Organoidy mogą być generowane z przeprogramowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych reprezentowanych przez embrionalne komórki macierzyste i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Mogą być również generowane z dorosłych komórek macierzystych specyficznych dla danego narządu¹². Niektóre modele organoidów cholangiocytów zostały zaproponowane we wcześniejszych badaniach naukowych. W związku z tym zgłoszono organoidy pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych^7,9,13 i stanowią cenne, efektywne czasowo narzędzie, które pozwala na jednoczesne generowanie różnych typów komórek. Jednak te pluripotencjalne organoidy pochodzące z komórek macierzystych nie odzwierciedlają w pełni struktury i funkcjonalności pierwotnych dorosłych cholangiocytów EHBD.

Zaproponowano również organoidy pochodzące z dorosłych komórek macierzystych human⁹ i feline¹⁰ wątroba. Modele kotów nie są powszechnie dostępne i mają ograniczone uzbrojenie narzędzi do celów badawczych. Co więcej, te organoidy pochodzące z dorosłych komórek macierzystych pochodzących z wątroby nie modelują cholangiocytów pozawątrobowych, ale raczej cholangiocyty wewnątrzwątrobowe.

Generowanie organoidów EHBD zostało zgłoszone z normalnych ludzkich EHBD¹⁴ i mysich EHBD cholangiocarcinoma¹⁵. Jednak dostęp do ludzkiej tkanki EHBD jest bardzo ograniczony, a organoidy pochodzące z genetycznego mysiego modelu raka dróg żółciowych ¹⁵ nie reprezentują zdrowej biologii cholangiocytów w homeostazie i pochodzą z komórek zmodyfikowanych genetycznie.

Aby rozwiązać problemy związane z ograniczeniami pluripotencjalnych modeli organoidów cholangiocytów pochodzących z komórek macierzystych i wątroby oraz ograniczonym dostępem do tkanek ludzkich potrzebnych w modelach przedklinicznych, opracowaliśmy mysi model organoidowy EHBD (Rysunek 1A). Niniejszy manuskrypt opisuje rozwój techniki pozyskiwania organoidów pochodzących z mysich tkanek pochodzących z EHBD. Te organoidy EHBD zwane EHBDO będą ważnym narzędziem in vitro do badania mechanizmów leżących u podstaw homeostazy cholangiocytów EHBD i procesów chorobowych, takich jak cholangiopatie.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Przygotowanie sprzętu i materiałów do izolacji myszy EHBD

1. Przygotować podłoże wysiewające i bufor myjący (tabela materiałów) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C lub na lodzie do czasu użycia.
2. Ustaw stół chirurgiczny (Rysunek 1B). Przygotuj wysterylizowane narzędzia chirurgiczne (Rysunek 1C).
3. Umieścić sterylną 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w celu jej wstępnego ogrzania.
4. Umieść podwielokrotność macierzy podstawowej na lodzie. Używaj matrycy piwnicznej tylko wtedy, gdy jest całkowicie upłynniona.

2. Izolacja EHBD i hodowla organoidów żółciowych

1. Izolacja i przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki mysiego EHBD
   1. Poddaj eutanazji dorosłą mysz (starszej niż 2 miesiące) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Umieść mysz w pozycji leżącej. Otwórz jamę brzuszną, stosując podejście w linii środkowej i cofnij wątrobę, aby spoczęła na przeponie.
   2. Zidentyfikuj wspólny przewód żółciowy znajdujący się bezpośrednio pod wnęką wątroby, delikatnie pociągając proksymalną dwunastnicę za pomocą hemostatu. Oddziel EHBD od otaczających tkanek za pomocą ostrza skalpela. Trzymając kleszczami bliższy koniec przewodu żółciowego wspólnego, rozetnij go dystalnie tuż nad jego połączeniem z dwunastnicą, a następnie wypreparuj bliższy koniec przewodu od wątroby (Ryc. 1D). Natychmiast umieść izolowany EHBD (Rysunek 1E) w buforze do mycia na zimno.
   3. Wyjmij EHBD z bufora myjącego i zmiel na kawałki 0,5 mm za pomocą sterylnego ostrza skalpela. Podczas zabiegu umieść chusteczkę na szklanej płytce na lodzie (Ryc. 1B).
   4. Umieścić skrawki EHBD w probówce zawierającej 500 μl buforu dysocjacyjnego. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Zneutralizować bufor dysocjacyjny przez dodanie 500 μl lodowatej pożywki do hodowli komórkowych.
   5. Rozcierać zawiesinę komórkową w górę i w dół, przechodząc przez igły 18 G i 20 G, 20 razy każda. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm i zbierz przepływ do probówki o pojemności 50 ml.
      nuta: Przed filtracją należy wstępnie przygotować sitko 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby ułatwić przejście zawiesiny komórkowej.
2. Ustanawianie organoidów EHBD
   1. Odwirować przepływ z etapu 2.1.5 przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Ostrożnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego sterylnego PBS. Przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 2.2.1.
   3. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z umytych komórek zebranych na dnie probówki. Zawiesić osad komórkowy w 120 μl skroplonej, lodowatej matrycy podstawowej, pipetując w górę iw dół za pomocą końcówek P200.
      nuta: Ponowne zawieszenie osadów komórkowych w matrycy podstawowej musi być przeprowadzone w łaźni lodowej.
   4. Płytka 40 μl resuspensji komórek w matrycy podstawowej do środka studzienki we wstępnie ogrzanej płytce 24-dołkowej.
      nuta: Unikaj zasysania powietrza podczas manipulowania matrycą piwnicy, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
   5. Umieścić płytkę z komórkami zawieszonymi w macierzy podstawowej do inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 15 minut lub do momentu zestalenia się matrycy podstawowej. Do każdej studzienki dodać 600 μl podłoża siewnego podgrzanego do temperatury 37 °C (tabela materiałów). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
   6. Zastąp pożywkę wysiewną 600 μl świeżej pożywki do hodowli organoidów w ciągu 3 dni, a następnie co 3 dni. Monitoruj wzrost organoidów za pomocą odwróconego mikroskopu. Użyj organoidów do dalszej aplikacji lub podziel je co 7 do 9 dni, zanim zaobserwuje się nagromadzenie szczątków śródświetlnych i zapadnięcie się organoidów (Rysunek 2A).

3. Przejście i przechowywanie organoidów EHBD

1. Pasaż organoidów EHBD w stosunku 1:3 do 1:4 co 7 do 9 dni
   1. Wyjmij pożywkę z dołka i dodaj 400 μl lodowatego PBS. Ponownie zawiesić organoidy, delikatnie pipetując mieszaninę w górę iw dół 10 razy w studzience. Przenieść mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 ml.
   2. Przepuścić mieszaninę przez igłę 25 G 4 razy, aby oddzielić organoidy. Odwirować mieszaninę przy 400 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
   3. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w macierzy podstawowej (1:3 do 1:4) w celu dalszego rozmnażania (etap 2.2.4.) lub umyć komórki lodowatym PBS w celu dalszego przetwarzania.
      nuta: Zazwyczaj 250-300 komórek jest powlekanych w płytce 24-dołkowej do dalszych zastosowań. Wydajność posiewu można ocenić za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu mikroskopu odwróconego w 3-5 dniu po pasażowaniu, licząc liczbę organoidów i obliczając ich procent od początkowej liczby komórek. mRNA można wyizolować z EHBDO przemytych w PBS przy użyciu standardowego protokołu wykorzystującego ekstrakcję tiocyjanianianem guanidyny-fenolem-chloroformem.
2. Długotrwałe przechowywanie organoidów EHBD
   1. Usunąć pożywkę ze studzienki i umyć organoidy PBS o temperaturze pokojowej. Usuń PBS ze studni, nie naruszając spadku matrycy piwnicznej.
   2. Dodać 500 μl lodowatej pożywki do zamrażania komórek do studzienki. Delikatnie zawiesić organoidy w upłynnionej matrycy podstawowej i pożywce do zamrażania komórek, a następnie przenieść mieszaninę do fiolek kriogenicznych.
   3. Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C przez 48 godzin. Przenieść fiolki do zbiornika z azotem w celu długotrwałego przechowywania w fazie gazowej.

4. Przetwarzanie organoidów EHBD do zatapiania parafiny

1. Zawiesić EHBDO w 500 μl lodowatego PBS (4 °C), pipetując w górę i w dół 5 do 10 razy. Zebrać zawieszony EHBDO w skroplonej matrycy podstawowej w probówce o pojemności 1,5 ml.
   nuta: Aby uniknąć pękania organoidów, odetnij dolne 2-3 mm końcówki P1000 i bardzo ostrożnie usuń supernatant.
2. Odwirować organoidy EHBD przy 350 x g przez 5 min. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu organoidowego.
3. Dodać 1 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) do organoidów i inkubować organoidy w 4% PFA przez noc w temperaturze 4°C. Usunąć 4% PFA z organoidów za pomocą końcówki P1000 po całonocnej inkubacji.
4. Dodać 1000 μl PBS o temperaturze pokojowej do probówki z organoidami i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować probówkę z organoidami w PBS przy 350 x g przez 5 minut. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
5. Usuń PBS i dodaj 1 ml 30% etanolu do organoidów. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odwirować probówkę o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 30% etanolu. Dodać 1 ml 70% etanolu i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Odwirować przy 350 x g przez 5 min. Usunąć 70% etanolu. Dodać 1 ml 100% etanolu i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
   nuta: Organoidy można przechowywać w 100% etanolu w temperaturze pokojowej do 48 godzin przed dalszym przetwarzaniem.
8. Podgrzewaj żel do obróbki próbek w kuchence mikrofalowej przez 20 s lub do upłynnienia. Dodać 50 μl żelu do przetwarzania próbek do probówki z organoidami. Umieść probówkę na lodzie, aż żel do obróbki próbki zestali się.
9. Usunąć kroplę żelu do przetwarzania próbki z organoidami z probówki i umieścić między niebieskimi podkładkami z gąbki w kasecie do dalszego przetwarzania w procesorze tkankowym. Proszę poświęcić 15 minut na każdy etap zatapiania parafiny podczas dalszego przetwarzania.
10. Przeciąć organoidy zatopione w parafinie w żelu do przetwarzania próbek w odległości 4 μm. Kontynuować barwienie immunohistochemiczne zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁶.

Nasz protokół opisuje generowanie mysich organoidów EHBD, które są specyficzne tkankowo i pochodzą od dorosłych komórek macierzystych. Po wyhodowaniu organoidów tworzenie się struktury torbielowatej można zaobserwować już 1 dzień po izolacji EHBD. Zanieczyszczenie fibroblastami zwykle nie jest obserwowane podczas tworzenia kultur. Skuteczność posiewu EHBDO wynosi około 2% w przypadku izolacji od noworodków lub dorosłych (starszych niż 2 miesiące) myszy ( Rysunek 2B). Skuteczność posiewu organoidów EHBD pochodzących od dorosłych myszy wzrasta do 11% w pasażu 2 i pozostaje stabilna (Rysunek 2B). Większość organoidów wykazuje torbielowatą morfologię we wszystkich przejściach, z rzadkimi "nieregularnymi" organoidami (Ryc. 2C-E). Organoidy osiągają szczyt wzrostu po 5-7 dniach, po czym zaczynają gromadzić resztki śródświetlne i pogarszają się (Ryc. 2A). Dlatego, w celu utrzymania hodowli organoidów, należy je dzielić co 7-10 dni (Rysunek 2A). Po ustaleniu i odpowiednim obchodzeniu się z organoidami można je przechowywać w kulturze prawie w nieskończoność (kultury obserwowano do 14 miesięcy). Aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli zróżnicowanymi komórkami przeniesionymi z początkowej izolacji komórek, należy użyć organoidów pasażowanych co najmniej dwa razy przed użyciem ich do dalszego zastosowania. Do długotrwałego przechowywania należy stosować organoidy z wcześniejszego pasażu (do przejścia 7), ponieważ mają one wyższą wydajność posiewu po odzyskaniu z przechowywania.

Podczas analizy immunofluorescencyjnej, EHBDO składają się z czystej populacji komórek nabłonkowych oznaczonych E-kadheryną (Rysunek 3A-C). Komórki organoidowe wykazują markery komórek progenitorowych dróg żółciowych (Homeobox 1 trzustki i dwunastnicy (PDX1); Rysunek 3A) a także markery różnicowania dróg żółciowych (cytokeratyna 19 (CK19) i region determinujący płeć Y-Box 9 (SOX9); Rysunek 3B, C). Co ważne, wysoki odsetek komórek organoidowych posiada pierwotną rzęskę oznaczoną acetylowaną α-tubuliną (a-AT; Rysunek 3D), która jest cechą normalnych cholangiocytów i sugeruje odpowiednią polaryzację komórek organoidowych. Ekspresję markerów komórek progenitorowych (Pdx1) i komórek zróżnicowanych dróg żółciowych [Ck19, Sox9, Akwaporyna 1 (Aqp1)], Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (Cftr)] można również potwierdzić za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) (Tabela 1). Kombinacja tych markerów jest charakterystyczna dla cholangiocytów w EHBDs14,17,18.

Podsumowując, ten protokół opisuje generowanie modelu hodowli organoidowej spolaryzowanych komórek nabłonka żółciowego wykazujących ekspresję markerów progenitorowych i zróżnicowanych. System ten może być utrzymywany w hodowli przez dłuższy czas bez zmian w morfologii, przechowywany przez długi czas i analizowany za pomocą immunohistochemii i qRT-PCR.

Rysunek 1: Schemat generowania hodowli organoidów EHBD i konfiguracji chirurgicznej. (A). Schemat generacji organoidów EHBD. (B). Obszar operacyjny został przygotowany do izolacji EHBD i zawierał szklaną płytkę (przerywaną linię) trzymaną przez cały czas na tacy na lód. (C). Sterylny sprzęt chirurgiczny obejmował ostre nożyczki, prostą i zakrzywioną pęsetę ząbkowaną, hemostat i skalpel. (D i E) EHBD izoluje się z otaczającej tkanki łącznej i trzustki, a następnie ostrożnie preparuje proksymalnie od wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych i wątroby (D, strzałka) oraz dystalnie od dwunastnicy (D, strzałka). Znaki linijki = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kultura EHBDO. (A). Obrazy mikroskopowe EHBDO w ciągu 12-dniowego kursu. (B). Skuteczność posiewu organoidów pochodzących od noworodków (2 myszy na hodowlę, n = 3 kultury) i dorosłych (>2 miesiące, 1 mysz na hodowlę, n = 3 kultury) myszy po posianiu 300 komórek na basenik na płytce 24-dołkowej i zliczeniu ustalonych organoidów w 5. dniu hodowli. (C i D) Morfologię torbielowatą i nieregularną EHBDO analizowano za pomocą mikroskopii. (E). Procent organoidów torbielowatych i o nieregularnych kształtach analizowano we wczesnych (<10) i późnych (≥10) pasażach organoidowych. Podziałka = 500 μm. Dane ilościowe wykazały jako średni +/- błąd standardowy średniej (SEM), test t. NS = nieistotne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: EHBDO wyrażają markery komórek progenitorowych i dojrzałych komórek żółciowych. (A-C). EHBDO analizowano metodą barwienia immunofluorescencyjnego pod kątem markerów nabłonkowych (A, B. E-kadheryna, czerwona), progenitorowych (A. PDX1, zielony) i zróżnicowany (B. CK19, zielony; oraz C. a-AT, czerwone) komórki żółciowe. Podziałka = 25 μm. *, lumen. (D). EHBDO analizowano pod kątem obfitości mRNA Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1 i Cftr metodą qRT-PCR (średnia +/- SEM w stosunku do ekspresji Hprt). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Elementary.

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.