Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59544

⸱

23 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, 2Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Streszczenie

Cholangiopatie, które wpływają na pozawątrobowe drogi żółciowe (EHBD), obejmują atrezję dróg żółciowych, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych i raka dróg żółciowych. Nie mają skutecznych opcji terapeutycznych. Narzędzia do badania EHBD są bardzo ograniczone. Naszym celem było opracowanie specyficznego dla narządu, wszechstronnego, opartego na dorosłych komórkach macierzystych, przedklinicznego modelu cholangiocytów, który można łatwo wygenerować z myszy dzikich i genetycznie zmodyfikowanych. W związku z tym informujemy o nowatorskiej technice opracowywania systemu hodowli organoidów EHBD (EHBDO) z dorosłych myszy EHBD. Model jest ekonomiczny, może być łatwo analizowany i ma wiele dalszych zastosowań. W szczególności opisujemy metodologię izolacji mysiego EHBD i dysocjacji pojedynczych komórek, inicjacji, rozmnażania hodowli organoidów oraz długotrwałego utrzymania i przechowywania. W tym artykule opisano również przetwarzanie EHBDO w immunohistochemii, mikroskopii fluorescencyjnej i kwantyfikacji obfitości mRNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Protokół ten ma znaczące zalety oprócz wytwarzania organoidów specyficznych dla EHBD. Zastosowanie kondycjonowanej pożywki z ogniw L-WRN znacznie obniża koszt tego modelu. Zastosowanie mysich EHBD zapewnia prawie nieograniczoną ilość tkanek do generowania hodowli, w przeciwieństwie do tkanek ludzkich. Wygenerowane mysie EHBDO zawierają czystą populację komórek nabłonkowych z markerami endodermalnych komórek progenitorowych i zróżnicowanych komórek żółciowych. Hodowane organoidy zachowują jednorodną morfologię poprzez wiele pasaży i mogą być odzyskane po długotrwałym okresie przechowywania w ciekłym azocie. Model pozwala na badanie proliferacji komórek progenitorowych dróg żółciowych, może być manipulowany farmakologicznie i może być generowany z genetycznie modyfikowanych myszy. Potrzebne są dalsze badania, aby zoptymalizować warunki hodowli w celu zwiększenia wydajności posiewu, oceny funkcjonalnej dojrzałości komórek i bezpośredniego różnicowania komórek. Pożądane jest również opracowanie modeli kokultur i bardziej neutralnej biologicznie macierzy zewnątrzkomórkowej.

Wprowadzenie

Cholangiopatie są nieuleczalnymi, przewlekłymi, postępującymi zaburzeniami, które wpływają na komórki żółciowe zlokalizowane w wewnątrz- i zewnątrzwątrobowych drogach żółciowych (EHBD)1. Niektóre cholagiopatie, takie jak pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, rak dróg żółciowych, atrezja dróg żółciowych i torbiele żółciowe, wpływają głównie na EHBD. Rozwój terapii cholangiopatii jest ograniczony ze względu na ograniczoną dostępność modeli przedklinicznych. Ponadto wcześniejsze badania koncentrowały się na cholangiopatiach zgrupowanych razem: wątroba, intra- i EHBD. Jednak intra- i EHBD mają wyraźne pochodzenie embrionalne i dlatego powinny być uważane za odrębne patologie molekularne. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe rozwijają się z wewnątrzwątrobowych płytek przewodowych i czaszkowej części uchyłka wątroby, całe EHBD rozwijają się z ogonowej części uchyłka wątroby2. Opierają się również na różnych przedziałach komórek progenitorowych dla homeostazy dorosłych, w tym kanałów Heringa w wewnątrzwątrobowych drogach żółciowych i gruczołach okołożółciowych w EHBDs2,3. Wykorzystanie modeli zwierzęcych w badaniach przedklinicznych jest ograniczone kosztami i powinno być zminimalizowane ze względów etycznych. W związku z tym redukcjonistyczne, powtarzalne, efektywne czasowo i kosztowo modele in vitro są wysoce pożądane.

Większość wcześniejszych badań nad cholangiopatiami wykorzystywała normalne modele raka myszy lub szczurów, lub ludzkie linie komórkowe raka dróg żółciowych pochodzące z wewnątrz- i EHBDs4,5,6,7. Są to jednak modele transformowanych komórek i nie podsumowują normalnej biologii cholangiocytów w homeostazie lub w stanie zdrowym. Niedawny postęp w rozwoju modeli hodowli organotypowych pozwolił na opracowanie trójwymiarowych struktur z różnych typów tkanek, w tym tkanek wątroby i dróg żółciowych, chociaż nie normalnych mysich EHBDs8,9,10. Te "narządopodobne" struktury mają na celu naśladowanie tkanki pierwotnej i są hodowane w sztucznej niszy wspierającej samoodnawianie się specyficznych dla narządu komórek macierzystych/progenitorowych11.

"Organoid" to szerokie pojęcie, które najczęściej opisuje trójwymiarowe modele tkanek pochodzące z komórek macierzystych. Organoidy mogą być generowane z przeprogramowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych reprezentowanych przez embrionalne komórki macierzyste i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Mogą być również generowane z dorosłych komórek macierzystych specyficznych dla danego narządu12. Niektóre modele organoidów cholangiocytów zostały zaproponowane we wcześniejszych badaniach naukowych. W związku z tym zgłoszono organoidy pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych7,9,13 i stanowią cenne, efektywne czasowo narzędzie, które pozwala na jednoczesne generowanie różnych typów komórek. Jednak te pluripotencjalne organoidy pochodzące z komórek macierzystych nie odzwierciedlają w pełni struktury i funkcjonalności pierwotnych dorosłych cholangiocytów EHBD.

Zaproponowano również organoidy pochodzące z dorosłych komórek macierzystych human9 i feline10 wątroba. Modele kotów nie są powszechnie dostępne i mają ograniczone uzbrojenie narzędzi do celów badawczych. Co więcej, te organoidy pochodzące z dorosłych komórek macierzystych pochodzących z wątroby nie modelują cholangiocytów pozawątrobowych, ale raczej cholangiocyty wewnątrzwątrobowe.

Generowanie organoidów EHBD zostało zgłoszone z normalnych ludzkich EHBD14 i mysich EHBD cholangiocarcinoma15. Jednak dostęp do ludzkiej tkanki EHBD jest bardzo ograniczony, a organoidy pochodzące z genetycznego mysiego modelu raka dróg żółciowych 15 nie reprezentują zdrowej biologii cholangiocytów w homeostazie i pochodzą z komórek zmodyfikowanych genetycznie.

Aby rozwiązać problemy związane z ograniczeniami pluripotencjalnych modeli organoidów cholangiocytów pochodzących z komórek macierzystych i wątroby oraz ograniczonym dostępem do tkanek ludzkich potrzebnych w modelach przedklinicznych, opracowaliśmy mysi model organoidowy EHBD (Rysunek 1A). Niniejszy manuskrypt opisuje rozwój techniki pozyskiwania organoidów pochodzących z mysich tkanek pochodzących z EHBD. Te organoidy EHBD zwane EHBDO będą ważnym narzędziem in vitro do badania mechanizmów leżących u podstaw homeostazy cholangiocytów EHBD i procesów chorobowych, takich jak cholangiopatie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Przygotowanie sprzętu i materiałów do izolacji myszy EHBD

  1. Przygotować podłoże wysiewające i bufor myjący (tabela materiałów) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C lub na lodzie do czasu użycia.
  2. Ustaw stół chirurgiczny (Rysunek 1B). Przygotuj wysterylizowane narzędzia chirurgiczne (Rysunek 1C).
  3. Umieścić sterylną 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w celu jej wstępnego ogrzania.
  4. Umieść podwielokrotność macierzy podstawowej na lodzie. Używaj matrycy piwnicznej tylko wtedy, gdy jest całkowicie upłynniona.

2. Izolacja EHBD i hodowla organoidów żółciowych

  1. Izolacja i przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki mysiego EHBD
    1. Poddaj eutanazji dorosłą mysz (starszej niż 2 miesiące) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Umieść mysz w pozycji leżącej. Otwórz jamę brzuszną, stosując podejście w linii środkowej i cofnij wątrobę, aby spoczęła na przeponie.
    2. Zidentyfikuj wspólny przewód żółciowy znajdujący się bezpośrednio pod wnęką wątroby, delikatnie pociągając proksymalną dwunastnicę za pomocą hemostatu. Oddziel EHBD od otaczających tkanek za pomocą ostrza skalpela. Trzymając kleszczami bliższy koniec przewodu żółciowego wspólnego, rozetnij go dystalnie tuż nad jego połączeniem z dwunastnicą, a następnie wypreparuj bliższy koniec przewodu od wątroby (Ryc. 1D). Natychmiast umieść izolowany EHBD (Rysunek 1E) w buforze do mycia na zimno.
    3. Wyjmij EHBD z bufora myjącego i zmiel na kawałki 0,5 mm za pomocą sterylnego ostrza skalpela. Podczas zabiegu umieść chusteczkę na szklanej płytce na lodzie (Ryc. 1B).
    4. Umieścić skrawki EHBD w probówce zawierającej 500 μl buforu dysocjacyjnego. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Zneutralizować bufor dysocjacyjny przez dodanie 500 μl lodowatej pożywki do hodowli komórkowych.
    5. Rozcierać zawiesinę komórkową w górę i w dół, przechodząc przez igły 18 G i 20 G, 20 razy każda. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm i zbierz przepływ do probówki o pojemności 50 ml.
      nuta: Przed filtracją należy wstępnie przygotować sitko 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby ułatwić przejście zawiesiny komórkowej.
  2. Ustanawianie organoidów EHBD
    1. Odwirować przepływ z etapu 2.1.5 przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Ostrożnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego sterylnego PBS. Przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 2.2.1.
    3. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z umytych komórek zebranych na dnie probówki. Zawiesić osad komórkowy w 120 μl skroplonej, lodowatej matrycy podstawowej, pipetując w górę iw dół za pomocą końcówek P200.
      nuta: Ponowne zawieszenie osadów komórkowych w matrycy podstawowej musi być przeprowadzone w łaźni lodowej.
    4. Płytka 40 μl resuspensji komórek w matrycy podstawowej do środka studzienki we wstępnie ogrzanej płytce 24-dołkowej.
      nuta: Unikaj zasysania powietrza podczas manipulowania matrycą piwnicy, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
    5. Umieścić płytkę z komórkami zawieszonymi w macierzy podstawowej do inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 15 minut lub do momentu zestalenia się matrycy podstawowej. Do każdej studzienki dodać 600 μl podłoża siewnego podgrzanego do temperatury 37 °C (tabela materiałów). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
    6. Zastąp pożywkę wysiewną 600 μl świeżej pożywki do hodowli organoidów w ciągu 3 dni, a następnie co 3 dni. Monitoruj wzrost organoidów za pomocą odwróconego mikroskopu. Użyj organoidów do dalszej aplikacji lub podziel je co 7 do 9 dni, zanim zaobserwuje się nagromadzenie szczątków śródświetlnych i zapadnięcie się organoidów (Rysunek 2A).

3. Przejście i przechowywanie organoidów EHBD

  1. Pasaż organoidów EHBD w stosunku 1:3 do 1:4 co 7 do 9 dni
    1. Wyjmij pożywkę z dołka i dodaj 400 μl lodowatego PBS. Ponownie zawiesić organoidy, delikatnie pipetując mieszaninę w górę iw dół 10 razy w studzience. Przenieść mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Przepuścić mieszaninę przez igłę 25 G 4 razy, aby oddzielić organoidy. Odwirować mieszaninę przy 400 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
    3. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w macierzy podstawowej (1:3 do 1:4) w celu dalszego rozmnażania (etap 2.2.4.) lub umyć komórki lodowatym PBS w celu dalszego przetwarzania.
      nuta: Zazwyczaj 250-300 komórek jest powlekanych w płytce 24-dołkowej do dalszych zastosowań. Wydajność posiewu można ocenić za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu mikroskopu odwróconego w 3-5 dniu po pasażowaniu, licząc liczbę organoidów i obliczając ich procent od początkowej liczby komórek. mRNA można wyizolować z EHBDO przemytych w PBS przy użyciu standardowego protokołu wykorzystującego ekstrakcję tiocyjanianianem guanidyny-fenolem-chloroformem.
  2. Długotrwałe przechowywanie organoidów EHBD
    1. Usunąć pożywkę ze studzienki i umyć organoidy PBS o temperaturze pokojowej. Usuń PBS ze studni, nie naruszając spadku matrycy piwnicznej.
    2. Dodać 500 μl lodowatej pożywki do zamrażania komórek do studzienki. Delikatnie zawiesić organoidy w upłynnionej matrycy podstawowej i pożywce do zamrażania komórek, a następnie przenieść mieszaninę do fiolek kriogenicznych.
    3. Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C przez 48 godzin. Przenieść fiolki do zbiornika z azotem w celu długotrwałego przechowywania w fazie gazowej.

4. Przetwarzanie organoidów EHBD do zatapiania parafiny

  1. Zawiesić EHBDO w 500 μl lodowatego PBS (4 °C), pipetując w górę i w dół 5 do 10 razy. Zebrać zawieszony EHBDO w skroplonej matrycy podstawowej w probówce o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Aby uniknąć pękania organoidów, odetnij dolne 2-3 mm końcówki P1000 i bardzo ostrożnie usuń supernatant.
  2. Odwirować organoidy EHBD przy 350 x g przez 5 min. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu organoidowego.
  3. Dodać 1 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) do organoidów i inkubować organoidy w 4% PFA przez noc w temperaturze 4°C. Usunąć 4% PFA z organoidów za pomocą końcówki P1000 po całonocnej inkubacji.
  4. Dodać 1000 μl PBS o temperaturze pokojowej do probówki z organoidami i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować probówkę z organoidami w PBS przy 350 x g przez 5 minut. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
  5. Usuń PBS i dodaj 1 ml 30% etanolu do organoidów. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odwirować probówkę o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 30% etanolu. Dodać 1 ml 70% etanolu i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Odwirować przy 350 x g przez 5 min. Usunąć 70% etanolu. Dodać 1 ml 100% etanolu i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
    nuta: Organoidy można przechowywać w 100% etanolu w temperaturze pokojowej do 48 godzin przed dalszym przetwarzaniem.
  8. Podgrzewaj żel do obróbki próbek w kuchence mikrofalowej przez 20 s lub do upłynnienia. Dodać 50 μl żelu do przetwarzania próbek do probówki z organoidami. Umieść probówkę na lodzie, aż żel do obróbki próbki zestali się.
  9. Usunąć kroplę żelu do przetwarzania próbki z organoidami z probówki i umieścić między niebieskimi podkładkami z gąbki w kasecie do dalszego przetwarzania w procesorze tkankowym. Proszę poświęcić 15 minut na każdy etap zatapiania parafiny podczas dalszego przetwarzania.
  10. Przeciąć organoidy zatopione w parafinie w żelu do przetwarzania próbek w odległości 4 μm. Kontynuować barwienie immunohistochemiczne zgodnie z wcześniejszym opisem16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasz protokół opisuje generowanie organoidów EHBD myszy, które są specyficzne tkankowo i pochodzą z dorosłych komórek macierzystych. Po wyhodowaniu organoidów, formowanie struktur torbielowatych można zaobserwować już 1 dzień po izolacji EHBD. Podczas generowania hodowli zazwyczaj nie obserwuje się zanieczyszczenia fibroblastami. Wydajność wysiewu EHBDO wynosi około 2%, niezależnie od tego, czy są one izolowane z myszy noworodkowych czy dorosłych (starszych niż 2 miesiące) (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy opisano wygenerowanie organotypowego trójwymiarowego modelu mysich cholangiocytów EHBD. Ważne kroki w generowaniu hodowli EHBDO obejmują skrupulatne wypreparowanie EHBD w celu uniknięcia zanieczyszczenia komórek trzustki, utrzymanie sterylnych warunków w celu zapobieżenia skażeniu bakteryjnemu i grzybiczemu oraz staranną manipulację po odwirowaniu w celu uniknięcia utraty materiału komórkowego. Wymagane jest ścisłe przestrzeganie opisanych warunków temperaturowych. Istnieją pewne ograniczenia tej techniki. EHBD d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez American Association for the Study of Liver Diseases Pinnacle award (dla N.R.) oraz National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (nagrody P30 DK34933 dla N.R., P01 DK062041 dla J.L.M.). Dziękujemy dr Ramonowi Ocadiz-Ruizowi (University of Michigan) za pomoc w opracowaniu tej metodologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
L-WRN pożywka do hodowli komórkowych
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Płodowa surowica bydlęca (FBS)1%Life Technologies10437-028
Penicylina-Streptomycyna100 U/mlLife Technologies15140-122
Bufor myjący
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)50 mlLife Technologies10010-023
Penicylina-Streptomycyna125 U/mlLife Technologies15140-122
Amfoterycyna B 6,25 &mikro; g/mLLife Technologies15290-018
Pożywka do hodowli organoidów
L-WRN Pożywka kondycjonowana 1:1ATCCCRL-3276
Zaawansowany DMEM/F121:1Life Technologies12634-010
Penicylina-Streptomycyna100 U/mlLife Technologies15140-122
N-glutamina10 &mikro; l/mLLife Technologies35050-061
Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy, HEPES10 mMLife Technologies15630-080
B2710 µ l/mLGibco17504-044
N210 &mikro; l/mLGibco17502-048
Pożywka do wysiewu organoidów
Pożywka do hodowli organoidów 
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)50 ng / mlInvitrogenPMG8041
Czynnik wzrostu fibroblastów-10 (FGF10)100 ng / mlPeproTech100-26
Przeciwciała pierwszorzędowe< / strong>
Przeciwciało anty-cytokeratyny 19 (CK19), Królik1:250Abcamab53119
Region determinujący płeć Przeciwciało Y-Box 9 (SOX9), Królik1:200Santa Cruzsc-20095
Przeciwciało Homeobox 1 (PDX1) trzustki dwunastnicy, Królik1:2000DSRBF109-D12
Przeciwciało E-kadheryny, Koza1:500Santa Cruzsc-31020
Przeciwciało acetylowane i alfa;-tubulinowe, Mysz1:500Sigma-AldrichT6793
Przeciwciała
488 oznakowany anty-królik, osioł IgG1:1000InvitrogenA-21206
594 oznakowany anty-koza, osioł IgG1:1000InvitrogenA-11058
568 oznaczony anty-mysz, Koza IgG2b1:500InvitrogenA-21144
Test
TopFlash HEK293 linia komórkowaATCCCRL-1573
Zestaw do oznaczania lucyferazyBiotium30003-2
0,05% Trypsyna-EDTALife Technologies25300054
0,4% Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Dodatkowe materiały i odczynniki
Matryca podstawowa, bez fenolu MatrigelCORNING356237
Bufor dysocjacyjny, AccutaseGibcoA1110501
Pożywka do zamrażania kultur komórkowych, RecoveryLife Technologies12648010
Sitko komórkowe (70 &mikro; m, sterylizowane)Fisherbrand22363548
Ekstrakcja RNA z tiocyjanianianu guanidynianu, TRIzolInvitrogen15596026
Żel do przetwarzania próbek, HistoGelThermo Fisher ScientificHG-4000-012
Uniwersalny zestawATCC30-1012K
1,5 ml probówkaFisherbrand05-408-129
24-dołkowaUSA ScientificCC7682-7524
Stożkowa probówka wirówkowa 50 mlFisher scientific14-432-22
drugorzędowe reporterowy TopFlash Wnt do wykrywania mykoplazmy do mikrowirówki Płytka Mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse E800 Mikroskop odwrócony Biotium 30003-2 Taca do sekcji zwłok Fisherbrand 13-814-61

Bibliografia

  1. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  2. Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).
  3. DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  4. Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
  5. Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
  6. Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
  7. De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
  8. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  10. Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  11. Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
  12. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  13. Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113(2018).
  14. Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
  15. Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
  16. Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
  17. Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
  18. Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
  19. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  20. Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

pozawątrobowy przewód żółciowyhodowla organoidówizolacja EHBD myszypropagacja organoidówprzechowywanie organoidówanaliza immunohistochemicznaoznaczanie qRT-PCRmacierz podstawnapasażowanie organoidówprzechowywanie kriogeniczne
Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.