Artykuł metodologiczny

Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59547

⸱

8 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Max Planck Institute of Biology of Ageing

W tym artykule

Podsumowanie

Analiza wielu biomolekuł w całym systemie jest kluczowa dla uzyskania funkcjonalnego i mechanistycznego wglądu w procesy biologiczne. W niniejszym opisano obszerny protokół wysokoprzepustowej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki pobranej z zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas.

Streszczenie

Mikroalgi były przedmiotem badań ze względu na ich zastosowanie w produkcji związków o wysokiej wartości, żywności i paliwa. Co więcej, są cennymi modelami fotosyntetycznymi ułatwiającymi zrozumienie podstawowych procesów komórkowych. Badania obejmujące cały system umożliwiają kompleksowe i dogłębne zrozumienie funkcji molekularnych organizmów. Jednak do badań proteomicznych, lipidomicznych i metabolomicznych wymaganych jest wiele niezależnych próbek i protokołów, które wprowadzają wyższy błąd i zmienność. Przedstawiono tutaj solidną, wysokoprzepustową metodę ekstrakcji do jednoczesnej ekstrakcji chlorofilu, lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii. Ilustrowany układ eksperymentalny jest przeznaczony dla kultur Chlamydomonas zsynchronizowanych w warunkach 12 h/12 h światła/ciemności. Próbki pobierano w ciągu 24-godzinnego cyklu komórkowego, aby wykazać, że dane dotyczące metabolitów, lipidów i skrobi uzyskane przy użyciu różnych platform analitycznych są dobrze zgodne. Ponadto próbki białek pobrane przy użyciu tego samego protokołu ekstrakcji wykorzystano do przeprowadzenia szczegółowej analizy proteomicznej w celu oceny ich jakości i odtwarzalności. Na podstawie uzyskanych danych można wywnioskować, że zilustrowana metoda stanowi solidne i powtarzalne podejście do lepszego zrozumienia różnych szlaków biochemicznych i ich funkcji z większą pewnością zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych.

Wprowadzenie

Mikroalgi są bogatym źródłem naturalnych produktów (np. paliw, żywienia ludzi i zwierząt, kosmetyków i substancji farmakologicznych). Prowadzone są liczne badania mające na celu zwiększenie efektywności produkcji wysokiej jakości produktów z mikroalg1,2,3,4. Zrozumienie metabolizmu na poziomie systemowym jest warunkiem wstępnym poprawy jakości i wydajności produktów naturalnych5,6,7. Wraz z pojawieniem się funkcjonalnych technik genomicznych i ulepszonych metod spektrometrii mas, tysiące genów, transkryptów, białek i metabolitów może być monitorowanych jednocześnie. Jednak do dogłębnych badań proteomicznych, lipidomicznych i metabolomicznych wymaganych jest wiele próbek, co często jest trudne do osiągnięcia w organizmach jednokomórkowych, zwłaszcza jeśli mają być przeprowadzone badania przebiegu w czasie. Co więcej, gromadzenie i przetwarzanie różnych podwielokrotności próbek w połączeniu z różnymi protokołami w celu gromadzenia wysoce złożonych danych omicznych (tj. proteomicznych, lipidomicznych i metabolomicznych) wprowadza zmienność, co sprawia, że integracja danych jest trudnym zadaniem.

Chlamydomonas dostarcza nie tylko doskonały system mikrobiologiczny do badania procesów komórkowych, ale także wygodny model do badania koordynacji cyklu komórkowego i metabolizmu. W związku z tym wykazano silną koordynację ekspresji transkryptów z cyklem komórkowym przy użyciu profilowania transkryptomu o wysokiej rozdzielczości zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas8. Około 80% analizowanych transkryptów wykazywało solidną okresowość w ciągu 24-godzinnego cyklu komórkowego8. Podobnie, wykazano, że sucha masa, białka, chlorofil, aminokwasy i kwasy tłuszczowe dwóch różnych szczepów Chlamydomonas korelują z podziałem komórek w badaniu, w którym pobieranie próbek wykonywano co 4 godziny 9. Niedawno doniesiono, że dynamika metabolitów i lipidów w komórce zmienia się w zależności od określonych faz cyklu komórkowego10. Subtelne zmiany w różnych biomolekułach były możliwe do monitorowania za pomocą solidnego eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE): metanol: metoda ekstrakcji na bazie wody, która stanowi idealny punkt wyjścia do kompleksowej analizy multiomicznej10,11.

Prezentowany protokół prowadzi przez powtarzalną i efektywną strategię10, do jednoczesnej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki podwielokrotności, dla czasu rozwiązanego badania metabolomicznego i lipidomicznego synchronicznego wzrostu kultur Chlamydomonas. Oprócz zilustrowania solidnych i powtarzalnych danych metabolicznych i lipidomicznych10, tutaj pokazano również jakość próbek proteomicznych uzyskanych z tego samego osadu.

Protokół

1. Prekultury Chlamydomonas reinhardtii

  1. Przygotować wstępne hodowle Chlamydomonas reinhardtii (szczep dziki typu CC-1690 mt+), przenosząc komórki z litych płytek pożywki TAP do kolb Erlenmeyera z 200 ml pożywki HSM 12.
  2. Hodować kultury wstępne na wytrząsarce rotacyjnej w temperaturze 24 °C w świetle ciągłym 100 μmol·m-2·s-1, aż gęstość komórek osiągnie ~ 2 x 106 komórek/ml.

2. Synchronizacja płynnych kultur Chlamydomonas w fermentorach

UWAGA: Parametry przedstawione w tym protokole, takie jak temperatura, światło i CO2, są specyficzne dla synchronizacji szczepu CC-1690 mt+. Aby opracować zsynchronizowaną kulturę przy użyciu innego szczepu, konieczne jest przetestowanie optymalnych warunków.

  1. Przenieść kulturę wstępną do systemu fermentora (patrz rysunek uzupełniający 1 dla projektu fermentora wykonanego na zamówienie), podłączonego do chłodnicy recyrkulacyjnej w celu utrzymania temperatury, z bulgotaniem przefiltrowanego CO2 (2%, v/v) i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego na dnie fermentora przy ciągłym mieszaniu.
  2. Aby rozpocząć synchronizację, należy ustawić fermentor w trybie jasno-ciemnym 12:12 h, w temperaturze 34 °C i świetle 200 μmol·m-2·s-1 i upewnić się, że zawiera 500 ml kultury w pożywce HSM o gęstości komórek 1 x 106 komórek/ml.
  3. Pod koniec 24-godzinnego cyklu ponownie rozcieńczyć kulturę do 1 x 106 komórek/ml świeżą pożywką HSM z minimalnymi zakłóceniami przy użyciu systemu probówek w połączeniu z pompami perystaltycznymi, co pozwala najpierw wypompować wyraźną ilość kultury, a następnie przepompować w pożywce sterylizowanej w autoklawie.
    UWAGA: Jako alternatywa dla pomp perystaltycznych, do pobrania kultury można użyć strzykawek zaszczepiających, podczas gdy wymaganą objętość świeżej pożywki można dodać bezpośrednio do fermentora w sterylnych warunkach.
  4. Powtórzyć krok 2.3 trzy razy, aby uzyskać zsynchronizowane kultury w 4dniu inokulacji.
  5. W celu sprawdzenia synchronizacji komórek należy pobierać próbki w odstępach co 2 godziny i mierzyć gęstość komórek oraz objętość komórek za pomocą licznika komórek i analizatora wielkości komórek (patrz tabela materiałów). W zależności od gęstości komórek próbki należy rozcieńczyć w proporcjach od 1:10 do 1:100 i zmierzyć w zakresie wielkości 30 – 1900 μm3.

3. Zbieranie komórek Chlamydomonas

  1. Oznacz stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml i przygotuj dewara wypełnionego ciekłym azotem.
  2. Pobrać próbki za pomocą strzykawki (50cm3) przez wewnętrzną szklaną rurkę fermentora. Rozprowadzić próbkę do stożkowych probówek wirówkowych, które powinny zawierać 10-15 x 106 komórek. Zanotuj objętość przenoszoną do każdej probówki i zmierz gęstość komórek oraz rozmiar komórek w każdym punkcie czasowym za pomocą licznika komórek i analizatora wielkości (patrz Tabela materiałów)
  3. Granulować komórki przez odwirowanie przez 5 minut przy 4000 x g. Następnie wyrzucić supernatant, zamrozić granulki w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Przygotowanie ekstrakcyjnych i ekstrakcji chlorofilu, lipidów i metabolitów

UWAGA: Metanol (MeOH) i MTBE są łatwopalne i mogą powodować podrażnienia dróg oddechowych, oczu lub skóry przy długotrwałym narażeniu i/lub kontakcie. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie tylko w dygestoriach i stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa podczas ekstrakcji (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawice itp.).

  1. Bufor ekstrakcyjny 1
    1. Do kolby miarowej o pojemności 100 ml dodać 75 ml MTBE, 25 ml MeOH (klasa UHPLC) i homogenizować (3:1, obj./obj.).
    2. Dodać następujący roztwór wzorców wewnętrznych: 50 μl kortykosteronu (1 mg/ml w MeOH), 50 μl 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-fosfocholiny (17:0 PC) (1 mg/ml w chloroformie klasy HPLC), 25 μl ampicyliny (1 mg/ml w wodzie klasy UHPLC) i 50 μl D-Sorbitolu-1-13C (1 mg/ml w wodzie klasy UHPLC).
    3. Przenieść bufor ekstrakcyjny do czystej szklanej butelki i wstępnie schłodzić roztwór w temperaturze -20 °C, 1 godzinę przed użyciem. Do ekstrakcji użyj świeżo przygotowanego roztworu. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  2. Bufor ekstrakcyjny 2
    1. Do kolby miarowej o pojemności 100 ml dodać 75 ml wody klasy UHPLC i 25 ml klasy MeOH UHPLC i homogenizować.
    2. Przenieść bufor ekstrakcyjny do czystej szklanej butelki. Do ekstrakcji użyj świeżego roztworu. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.

5. Ekstrakcja chlorofilu, lipidów i metabolitów

  1. Ułóż probówki z osadem komórkowym (zawierającym 10-15 x 106 komórek) w ciekłym azocie.
  2. Zawiesić osad komórkowy w każdej probówce z 1 ml wstępnie schłodzonego (-20 °C) buforu ekstrakcyjnego 1,
    UWAGA: Wykonaj ten krok szybko, aby uniknąć odparowania buforu ekstrakcyjnego o niskiej lepkości. Po dodaniu buforu ekstrakcyjnego 1 utrzymuj probówki w temperaturze pokojowej.
  3. Wirować, aż komórki będą dobrze homogenizowane w mieszaninie ekstrakcyjnej i podzielić mieszaninę na 2 ml probówki mikrowirówkowej.
  4. Sonikować kultury za pomocą kąpieli sonikacyjnej (patrz Tabela Materiałów) w lodowatej wodzie przez 10 minut.
  5. Inkubować wszystkie próbki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 1000 obr./min przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Aby wywołać separację faz, dodać 650 μl buforu ekstrakcyjnego 2.
  7. Krótko po tym wirować przy 20000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po tym kroku następuje oddzielenie faz ciekłych i stałego osadu na dnie probówki. Z rurkami należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć zmieszania dwóch faz ciekłych. Górna faza MTBE zawiera lipidy i chlorofil, podczas gdy dolna faza zawiera metabolity polarne i półpolarne. Wytrącony osad na dnie zawiera białka, skrobię i inne nierozpuszczalne cząsteczki.

6. Dzielenie ułamków

  1. Przenieś 500 μl górnej fazy MTBE (lipidów) do znakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć próbki za pomocą koncentratora próżniowego (patrz tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu pomiaru.
  2. Usunąć pozostałą fazę MTBE za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  3. Przenieść 650 μl dolnej fazy (metabolity polarne i półpolarne) do nowej, znakowanej probówki. Wysuszyć próbki za pomocą koncentratora próżniowego (patrz tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu pomiaru.
  4. Usunąć pozostałą dolną fazę, odpipetowując nadmiar objętości.
  5. Zawiesić stały osad w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej ekstrakcji.

7. Oznaczanie metabolitów polarnych (metabolity pierwotne)

  1. Zawiesić wysuszony osad fazy polarnej (krok 6.3) w roztworze chlorowodorku metoksyaminy/pirydyny w celu metoksyminacji grup karbonylowych.
  2. Podgrzewać próbki w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
  3. Próbki należy wyprowadzać za pomocą N-metylo-N-trimetylosililotrifloracetamidu (MSTFA) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej13.
  4. Do analizy metabolitów pierwotnych należy użyć chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas czasu przelotu (GC-TOF-MS). Zastosowane parametry gradientu były zgodne z wcześniej opisanym protokołem14.

8. Oznaczanie metabolitów niepolarnych (lipidów)

  1. Ponownie zawiesić wysuszony osad fazy niepolarnej (krok 6.1) w mieszaninie acetonitrylu:izopropanolu (7:3, v:v).
  2. Odwirować przy 20000 x g i rozdzielić na kolumnie C8 z odwróconymi fazami (cząstki 100 mm×2,1 mm×1,7 μm), stosując system UPLC (patrz tabela materiałów). Dwie fazy ruchome to woda z 1% 1 M octanem amonu, 0,1% kwasem octowym (bufor A) i acetonitryl: izopropanol (7:3) zawierający 1% 1 M octanu amonu, 0,1% kwasu octowego (bufor B).
  3. Użyj parametrów gradientu zgodnie z wcześniej opisanym protokołem14.

9. Oznaczanie zawartości chlorofilu

  1. Zmieszać 100 μl fazy MTBE (etap 6.1) z 900 μl 90% metanolu w celu uzyskania ślepej próby metody oraz próbek doświadczalnych.
  2. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru o długości fali 665 nm i 652 nm w celu rozróżnienia chlorofilu a i chlorofilu b.
    UWAGA: Absorpcja powinna mieścić się w przedziale od 0,1 do 1 dla prawidłowego obliczenia stężenia. W razie potrzeby rozcieńczyć próbki.
  3. Obliczyć zawartość chlorofilu a i b, a także całkowitą zawartość chlorofilu według następujących wzorów.
    Chla = 16,82A665 – 9,28A652
    Chlb = 36,92A652 – 16,54A665
    Chla=b = 0,28A665 + 27,64A652
    UWAGA: Formuły zostały opisane przez Bar-Nun i Ohad15.

10. Ekstrakcja i oznaczanie zawartości białka, trawienie i analiza

UWAGA: Do ponownego zawieszenia białka użyto buforu mocznikowego/tiomocznikowego (6 M mocznik, 2 M tiomocznik oraz inhibitory proteazy i fosfatazy) z modyfikacjami w wcześniej opisanym protokole16. Jednak każdy wybrany bufor może być użyty do ponownego zawieszenia białek.

  1. Przygotować bufor białkowy przy użyciu następujących stężeń: 6 M mocznika i 2 M tiomocznika.
  2. Rozpuścić osad (krok 6.5) w 200 μl buforu białkowego (10.1).
  3. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie odwirowywać przy 20000 x g przez 5 minut.
  4. Przenieść supernatant, który zawiera białka, do nowej probówki.
  5. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda17.
  6. Trawić 50 μg białka w roztworze według wybranego protokołu. W tym przypadku użyj następującego protokołu.
    1. Zredukuj 50 μg próbek białek za pomocą 5 mM DTT przez 30 minut, a następnie alkiluj przy użyciu 10 mM jodoacetamidu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    2. Dodać mieszankę trypsyny/Lys-C w stosunku białko do proteazy 25:1 (w/w), wymieszać i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    3. Rozcieńczyć próbki sześciokrotnie przy użyciu 50 mM TrisHCl (pH 8) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    4. Zakończ trawienie, dodając kwas trifluorooctowy (TFA) do końcowego stężenia 0,5–1%.
  7. Po mineralizacji należy przeprowadzić odsalanie peptydów przed spektrometrią mas przy użyciu końcówek stopnia C18 i wymyć strawione peptydy18.
  8. Zagęścić próbki do stanu zbliżonego do suchego, pozostawiając 2-5 μl roztworu w koncentratorze próżniowym (patrz tabela materiałów) bez podgrzewania.
  9. Zawiesić próbki w buforze ładującym (5% acetonitrylu, 0,5% kwasu mrówkowego) i przeanalizować mieszaniny peptydów za pomocą LC-MS/MS przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości (patrz tabela materiałów) podłączonego do systemu nano-UPLC.
  10. Oddzielić peptydy za pomocą systemu UPLC (patrz tabela materiałów) na 20-centymetrowej kolumnie hybrydowej z odwróconą fazą (CSH) (patrz tabela materiałów) o średnicy wewnętrznej 75 μm i wielkości cząstek 1,7 μm.
  11. Załadować 4 μl próbki i przejść przez 90-minutowy gradient przy natężeniu przepływu 300 nL/min.
  12. Ustaw gradient. Używaj ustawień częściowej pętli offline z gradientem izokratycznym ustawionym na 3% buforu B (99,9% acetonitrylu + 0,1% kwasu mrówkowego) utrzymywanym przez 14 minut przed przesunięciem pętli do pozycji online z kolumną, a następnie gradient jest zwiększany liniowo przez 50 minut, aż do osiągnięcia 20% buforu B.
  13. W ciągu następnych 15 minut zwiększ stężenie buforu B do 30%. Następnie w ciągu następnych 15 minut zwiększ bufor B do 40%, aby osiągnąć 90% buforu B po kolejnych 4 minutach. Wykonać etap mycia, który jest wymagany do oczyszczenia kolumny, przy 400 nL/min i utrzymać przez dodatkowe 10 minut (patrz Tabela 1 w celu uzyskania szczegółowych warunków gradientu).
  14. Na koniec w ciągu 1 minuty należy ponownie ustawić system na natężenie przepływu 300 nL/min i stężenie 3% buforu B. Równoważyć kolumnę przez 15 minut przed wstrzyknięciem następnej próbki.
    UWAGA: Pełna lista zidentyfikowanych białek po analizie LCMS/MS znajduje się w Tabeli 2.

11. Ekstrakcja i oznaczanie zawartości skrobi

UWAGA: W celu określenia całkowitej zawartości białka i skrobi, stałe osadki zostały wyekstrahowane w dwuetapowej procedurze, jak opisano wcześniej10.

  1. Dodać 500 μl 80% (v/v) etanolu do osadu komórkowego (krok 6.5) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 80 °C.
  2. Wirować przy 4000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuścić osad w 250 μl sterylnej wody, a następnie dodać 250 μl 100 mM octanu sodu.
  3. Hydrolizować skrobię przez ogrzewanie przez 3 godziny w temperaturze 99 °C. Rozpuszczoną skrobię trawić na monomery glukozy przez noc, dodając mieszaninę enzymów α-amylazy (4,2 jednostki na próbkę) i α-amyloglukozydazy (10 jednostek na próbkę). Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Po inkubacji próbki można zamrażać w temperaturze -20 °C przez kilka dni lub w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy, przed pomiarem stężenia glukozy.
  4. Odwirować strawiony ekstrakt o sile 20000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant. Rozpuścić supernatant (z monomerami glukozy pochodzącymi ze skrobi) w 100 mM buforu HEPES (pH 7), który zawiera 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową (1 jednostka na próbkę).
  5. W celu przeanalizowania zawartości skrobi należy najpierw zmierzyć podstawową absorbancję przy 340 nm. Następnie dodaj heksokinazę (1 jednostka na próbkę), aby rozpocząć reakcję. Na koniec zmierz wzrost NADPH+H+ (wskazujący poziom skrobi strawionej do glukozy) przy 340 nm za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek.
    UWAGA: Różnica między wartością maksymalną przy 340 nm (nie powinna przekraczać liniowego zakresu 1) a linią podstawową jest równoważna stężeniu glukozy w strawionej skrobi. Należy wykonać krzywą glukozy w celu określenia stężenia glukozy w nmol glukozy na ml.

Wyniki

Chlamydomonas reinhardtii Synchronizacja kultur CC-1690
Aby przedstawić reprezentatywne wyniki dla danego protokołu, prezentujemy przykładowe dane multiomiczne uzyskane po zbiorze i ekstrakcji próbek z zsynchronizowanych Chlamydomonas reinhardtii hodowle10Zsynchronizowane kultury Chlamydomonas składają się z komórek znajdujących się w jednorodnej fazie wzrostu w określonym punkcie czasowym. Kultury Chlamydomonas synchronizowano w cyklu światło/ciemność 12 h/12 h. 34 °C przy natężeniu światła wynoszącym 200 µmol·m-2·s-1 or CO2 stężenie 2% obj. opisane jako stężenie optymalne dla szczepu CC-1690 mt+10Warunki te zostały wcześniej zoptymalizowane i zwalidowane z wykorzystaniem różnych parametrów cyklu komórkowego.10. Rysunek 1 przedstawia rozkład wielkości komórek zmierzony za pomocą licznika Coulter w różnych punktach czasowych zsynchronizowanych kultur. Można zaobserwować zmianę objętości komórek w miarę ich wzrostu podczas fazy jasnej, po czym następuje uwalnianie komórek potomnych, rozpoczynające się pod koniec fazy jasnej od 10 godziny. Po uwolnieniu wszystkich komórek potomnych można zaobserwować zmianę objętości komórek, gdy nowo uwolnione komórki potomne przygotowują się do rozpoczęcia kolejnego cyklu 10 (Rysunek 1).

Zbiór, przygotowanie i ekstrakcja próbek
Szybki zbiór próbek przeprowadza się poprzez wirowanie, a po odlaniu supernatantu osady można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji. Zgodnie z powyższym opisem (krok 5), ekstrakcja MTBE prowadzi do powstania trzech oddzielnych faz: a) faza organiczna służy do pomiaru zawartości lipidów oraz poziomu chlorofilu (czynnik normalizacyjny), b) faza polarna jest zbierana w celu analizy metabolitów za pomocą GCMS, natomiast c) osad służy do pomiaru zawartości skrobi i białek. Przegląd rozkładu poszczególnych faz i ich zastosowania przedstawiono na Rysunku 2.

Metabolity polarne i niepolarne
Na podstawie analizy GCMS frakcji polarnej zidentyfikowano 65 metabolitów, obejmujących aminokwasy, kwasy nukleinowe, produkty pośrednie glikolizy, glukoneogenezy, cyklu kwasów trójkarboksylowych, szlaku pentozofosforanowego oraz poliaminy (Rysunek 3A). Analiza LCMS fazy neutralnej zawierającej lipidy doprowadziła do identyfikacji 204 odrębnych gatunków lipidów z różnych klas lipidów, mianowicie fosfatydylogliceryli, fosfatydyloetanolaminy, sulfokinowozylodiacylogliceryli, monogalaktozylodiacylogliceryli, digalaktozylodiacylogliceryli, diacyloglicerylotrymetylohomoseryny, kwasów tłuszczowych, diacyloglicerydów i triacyloglicerydów. Aby zwizualizować globalne zmiany w metabolitach i lipidach w trakcie cyklu komórkowego, zastosowano analizę głównych składowych (PCA). PCA wykazuje rozdzielenie fazy jasnej i ciemnej zarówno dla danych metabolomicznych, jak i lipidomicznych. Ponadto dla obu zestawów danych można zauważyć układ półcykliczny (częściowo otwarty okrąg) (Rysunek 3C,D). Częściowa przerwa w wzorcu kolistym jest przypisana temu faktowi, że próbki pobrane w 24 h cyklu komórkowego zostały zebrane w ciemności, w przeciwieństwie do próbek pobranych na początku cyklu komórkowego po 0,25 h ekspozycji na światło (Rysunek 3C,D).

Analiza białek i skrobi
W celu oceny jakości osadu białkowego uzyskanego w wyniku ekstrakcji MTBE, do analizy proteomicznej wykorzystano 6 próbek. Jakość danych proteomicznych uzyskanych po trawieniu 50 µg białka/próbka została sprawdzona za pomocą komputerowego narzędzia do kontroli jakości – Proteomics quality control (PTXQC)19, co wykazało wysoką i powtarzalną jakość danych proteomicznych we wszystkich powtórzeniach (Rysunek uzupełniający 1). Zakres funkcjonalny białek analizowano za pomocą programu REVIGO20. Przegląd wzbogacenia funkcjonalnego 2463 zidentyfikowanych białek (patrz Tabela 2) przedstawiono na Rysunku 4A. Pozostały po ekstrakcji białek osad wykorzystano do powtarzalnego oznaczania ilości skrobi, co potwierdzono niskim odchyleniem standardowym pomiędzy poszczególnymi powtórzeniami (Rysunek 4B).

Rozkład objętości komórek w czasie; wiele wykresów przedstawiających analizę komórek w odstępach czasowych w różnych godzinach.
Rycina 1: Ilustracyjny przykład zmian objętości komórki w różnych fazach cyklu komórkowego u Chlamydomonas reinhardtii. Oś X reprezentuje objętość komórki, natomiast oś Y reprezentuje liczbę komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu ekstrakcji metabolitów; analiza chlorofilu, lipidów, metabolitów, białek i skrobi.
Rycina 2: Ilustracja schematu wykorzystania różnych faz podczas multiomicznej ekstrakcji z pelletów komórkowych. Rycina została powtórnie wykorzystana z pracy Juppner, J.et al.10. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagramy analiz GCMS i LCMS; identyfikacja metabolitów i lipidów, wykresy PCA, analiza komponentów.
Rysunek 3: Reprezentatywny przykład metabolitów i lipidów zidentyfikowanych przy użyciu opisanego protokołu. (A) Klasy metabolitów zidentyfikowane za pomocą analizy GCMS. (B) Gatunki lipidów należące do różnych klas zidentyfikowane za pomocą analizy LCMS. (C) Analiza głównych komponentów poziomów metabolitów w 24-godzinnym cyklu komórkowym. (D) Analiza głównych komponentów lipidów w 24-godzinnym cyklu komórkowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapa ciepła analizy LCMS wzbogacenia funkcji białek; metabolizm skrobi w czasie; wykres; badania.
Rysunek 4: Reprezentatywny przykład danych dotyczących białek i skrobi. A) Molekularne wzbogacenie funkcjonalne białek zidentyfikowanych za pomocą analizy LCMS, mapa drzewa (treemap) wykonana przy użyciu REVIGO 20 B) reprezentatywne dane dotyczące skrobi wykazujące powtarzalność protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Spersonalizowany projekt systemu fermentora do synchronicznego wzrostu kultur Chlamydomonas z kontrolą temperatury i napowietrzania.Rycina została wykorzystana ponownie z Juppner, J.et al.10. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywny wynik jakości danych proteomicznych. Mapa ciepła wygenerowana przy użyciu narzędzia obliczeniowego PTXQC19. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Czas (min)% Buforu B do Buforu A
od 0 do 15 minGradient liniowy od 0 do 3%Bufor A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie klasy UPLC
od 15 do 75 minGradient liniowy od 3% do 30%Bufor B: 0,1% kwasu mrówkowego w 60% acetonitrylu klasy UPLC
75–90 minGradient liniowy od 30% do 40%Szybkość przepływu 300 nL/min
90–94 minGradient liniowy od 40% do 90%Objętość iniekcji 4 µL
94–104 minprzemyć kolumnę 90% roztworem
105 do 120 minRównoważyć kolumnę przez 15 min przy 3%

Tabela 1: Chromatografia cieczowa próbek peptydów, parametry gradientu.

Tabela 2: Lista białek zidentyfikowanych po analizie LCMS/MS. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym artykule zilustrowaliśmy solidny i wysoce przydatny protokół ekstrakcji do kompleksowej analizy lipidomicznej, metabolomicznej, skrobi i proteomiki z pojedynczej osadki 10-15 x 106 komórek. Metoda została z powodzeniem wdrożona w kilku badaniach dla szerokiego zakresu komórek i tkanek 10,14,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. W tym miejscu przedstawiliśmy etapowy proces analizy multiomicznej różnych biomolekuł z pojedynczej próbki pobranej z hodowli Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt+).

Protokół zapewnia solidne i powtarzalne podejście do przetwarzania wielu próbek jednocześnie w celu analizy różnych biomolekuł. Należy jednak zwrócić uwagę na kilka krytycznych kroków, aby zminimalizować różnice techniczne. Po pierwsze, pobieranie komórek powinno odbywać się tak szybko, jak to możliwe, przy jednoczesnym zachowaniu jednolitych warunków dla wszystkich pobranych próbek w celu zachowania stanu biologicznego komórek. Chociaż do zbierania komórek użyliśmy wirowania, do zbierania próbek można zastosować alternatywne strategie zbierania. Należy jednak zauważyć, że wiadomo, iż różne strategie pozyskiwania wpływają na stan metaboliczny komórek37 , dlatego w odniesieniu do wszystkich próbek doświadczalnych należy stosować spójne podejście do zbierania. Po drugie, ważne jest, aby unikać wysuszania górnej fazy niepolarnej zawierającej chlorofil, ponieważ może to wpływać na poziomy rozpuszczonego chlorofilu w rozpuszczalniku, wpływając na współczynnik normalizacji próbek. Na koniec należy zachować ostrożność podczas usuwania pozostałej fazy polarnej w celu uzyskania granulek białka i skrobi, aby uniknąć zakłócenia granulki, która może wpływać na zawartość skrobi i białka.

Przedstawiony w ten sposób protokół ekstrakcji oferuje szereg korzyści w zakresie analizy danych multi-omicznych. Oprócz zminimalizowania liczby wymaganych podwielokrotności próbki, zmniejsza również różnice między wynikami analitycznymi uzyskanymi dla różnych biomolekuł. Pozwala to na bezpośrednie porównanie wyników uzyskanych z pierwotnych metabolitów, lipidów i danych proteomicznych. Podobnie, jednoczesna ekstrakcja wielu klas związków umożliwia spójną i jednolitą strategię normalizacji różnych zestawów danych. Jest to szczególnie przydatne, jeśli normalizacja jest trudna do osiągnięcia przy użyciu suchej lub świeżej masy38 lub numeru komórki.

Protokół może być wdrożony do rutynowych badań przesiewowych złożonej próbki biologicznej. Te holistyczne zestawy danych metabolomicznych, lipidomicznych i proteomicznych mogą dostarczyć wyczerpujących informacji na temat systematycznych zmian w metabolizmie. Dodatkowo, dane uzyskane z analizy proteomicznej, dostarczają wglądu w ilościowe (liczebność) i jakościowe (modyfikacje) zmiany białek w stosunku do metabolitów. W związku z tym integracja danych omicznych może dostarczyć szczegółowych informacji na temat zmian wywołanych przez genetyczne, biotyczne i/lub abiotyczne perturbacje systemu biologicznego. W ten sposób wyjaśnianie zmian molekularnych określonych szlaków metabolicznych lub procesów komórkowych. Podobnie, te wysokoprzepustowe dane mogą pozwolić na identyfikację celów inżynierii metabolicznej oraz udoskonalenie lub przetestowanie prognoz z modeli metabolicznych w skali genomu37,39.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni Gudrun Wolter i Änne Michaelis za doskonałą pomoc techniczną. Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Giavalisco za udzieloną pomoc. Jesteśmy wdzięczni Towarzystwu Maxa Plancka za sfinansowanie badań oraz FAPESP za stypendium L.A. Giraldiego

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki i wzorce
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)Avanti Polar Lipids850360PWewnętrzny wzorzec lipidów
13C SorbitolSigma Aldrich605514Wzorzec wewnętrzny metabolitów, ISOTEC® Stabilne izotopy
AmpicylinaSigma AldrichA9393-5GWzorzec wewnętrzny dla metabolitów
KortykosteronSigma Aldrich27840-500MGWzorzec wewnętrzny dla metabolitów, klasa HPLC
Metanol (MeOH)Biosolve Chemikalia13684102klasy ULC-MS
Eter metylowo-tert-butylowy (MTBE)Biosolve Chemikalia13890602klasy HPLC
Mieszanka trypsyny/Lys-CPromegaV5072Enzymatyczne trawienie białek
WodaBiosolve Chemikalia23214102ULC-MS grade
Equipment
1,5 ml Probówki do mikrowirówek Safe-lockEppendorf30120086Stosowany do frakcji
2 ml Probówki do mikrowirówek Safe-lockEppendorf30120094Używany do ekstracji próbek
BalanceSartorius Corporation14 557 572
System fermentacyjnyGlasblä serei Mü ller, Berlin, Niemcywykonany na zamówienie fermentor o pojemności 800 ml
Q-exactive HF Orbitrap Mass SpectrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMBFZ
Mikrowirówka z chłodzeniemEppendorf, model 5427R22620701
Kolumna C8 z odwróconą fazą (RP) z mostkiem hybrydowym (BEH) (100 mm i razy; 2,1 mm zawierające 1,7 μ m średnica cząstek)Waters, Machester, Wielka Brytania186002878Analiza lipidów Kolumna
RP Charged Surface Hybrid (CSH) (Waters) o średnicy wewnętrznej 75 μ m i wielkości cząstek 1,7 μ mWaters, Machester, Wielka Brytania186007477Analiza białek
RP Krzemionka o wysokiej wytrzymałości (HSS) Kolumna T3 (100 mm i razy; 2,1 mm zawierające 1,8 & mu; m średnica cząstek)Waters, Machester, Wielka Brytania186003539Analiza metabolitów
ShakerEppendorf Thermomixer 54362050-100-05
SonicatorUSC 300 TH142-0084standardowa wstępnie ustawiona moc sonikacji przy 45kHz
system UPLCSystem Waters Acquity UPLC (Waters, Machester, Wielka Brytania)
Koncentratorpróżniowy Scan Speed Maxi Vac Parowniki alfa7.008.500.002
Mieszalnik wirowyVortex-Genie 2, model G560SI-0236
Z2 Analizator liczby i wielkości cząstek redlicBeckman Coulter6605700analizator objętości i liczby cząstek (komórek)

Bibliografia

  1. Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
  2. Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
  3. Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
  4. Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
  5. Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
  6. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518(2011).
  7. Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5(2011).
  8. Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
  9. Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
  10. Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
  11. Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45(2016).
  12. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
  13. Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
  14. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  15. Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
  16. Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  19. Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159(2017).
  20. Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800(2011).
  21. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  22. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
  23. Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
  24. Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54(2011).
  25. Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
  26. Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
  27. Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
  28. Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
  29. Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
  30. Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053(2015).
  31. Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
  32. Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
  33. Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  34. Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
  35. Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584(2014).
  36. Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871(2014).
  37. Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
  38. Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
  39. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Jednoczesna ekstrakcjaoznaczenie chlorofiluanaliza lipidomicznaprofilowanie metabolit wekstrakcja bia ekilo ciowe oznaczenie skrobichromatografia gazowachromatografia cieczowa
Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.