Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59551

⸱

9 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shonai Regional Industry Promotion Center, 2Tsuruoka Metabolomics Laboratory, National Cancer Center, 3Human Metabolome Technologies, Inc, 4Division of Translational Informatics, Exploratory Oncology Research and Clinical Trial Center, National Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest opisanie protokołu ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek przylegających do analizy metabolomicznej, w szczególności elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas.

Streszczenie

Analiza metabolomiczna to obiecujące podejście omiczne, które nie tylko pozwala zrozumieć specyficzną regulację metaboliczną w komórkach nowotworowych w porównaniu do normalnych komórek, ale także zidentyfikować biomarkery do wczesnego stadium wykrywania raka i przewidywania odpowiedzi na chemioterapię u pacjentów z rakiem. Przygotowanie jednolitych próbek do analizy metabolomicznej jest krytyczną kwestią, która pozostaje do rozwiązania. W tym miejscu przedstawiamy łatwy i niezawodny protokół ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej przy użyciu elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas (CE-MS). Metabolity wodne z hodowanych komórek są analizowane przez hodowlę i mycie komórek, traktowanie komórek metanolem, ekstrakcję metabolitów oraz usuwanie białek i makrocząsteczek za pomocą kolumn wirowych do analizy CE-MS. Reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu linii komórkowych raka płuc traktowanych diamidem, odczynnikiem utleniającym, ilustrują wyraźnie obserwowane przesunięcie metaboliczne komórek pod wpływem stresu oksydacyjnego. Artykuł ten byłby szczególnie cenny dla studentów i badaczy zajmujących się badaniami metabolomicznymi, którzy są nowicjuszami w zbieraniu metabolitów z linii komórkowych do analizy za pomocą CE-MS.

Wprowadzenie

Otto Warburg zaobserwował, że komórki nowotworowe nabywają niezwykłą zdolność do pobierania glukozy i fermentowania jej w celu wytworzenia mleczanu w obecności odpowiedniej ilości tlenu - zjawisko określane jako efekt Warburga lub glikoliza tlenowa1,2. Spekuluje się, że wady oddychania mitochondrialnego są podstawową podstawą glikolizy tlenowej w komórkach nowotworowych3. Rzeczywiście, efekt Warburga jest podstawą obrazowania guza za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej fluorodeoksyglukozy (FDG) (PET), która jest szeroko stosowana w praktyce klinicznej4,5. Wysoki wskaźnik glikolizy tlenowej jest uważany za kluczową cechę raka i został ostatnio przyjęty jako jedna z dobrze znanych "cech charakterystycznych raka", jak opisali D. Hanahan i B. Weinberg6. Mutacje somatyczne w onkogenach i genach supresorowych nowotworów - takich jak HRAS / KRAS / NRAS, EGFR, BRAF, MYC, TP53, dehydrogenaza izocytrynianowa (IDH) i hydrataza fumaranu (FH) - zostały powiązane ze specyficznymi zmianami metabolicznymi w komórkach rakowych, uważanymi za wynik efektu Warburga7.

Analiza metabolomiczna jest obiecującym podejściem nie tylko do zrozumienia regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych, ale także do identyfikacji biomarkerów raka we wczesnym stadium i przewidywania odpowiedzi na chemioterapię. Po leczeniu wrażliwych lub opornych komórek nowotworowych związkami przeciwnowotworowymi, śledzenie ich odpowiedzi metabolicznych ułatwia identyfikację biomarkerów metabolicznych w celu przewidywania skuteczności określonych terapii przeciwnowotworowych u pacjentów z rakiem8,9,10,11. W tym artykule jako modele do analizy metabolomicznej wykorzystano linie komórek nowotworowych pochodzące z gruczolakoraka płuc z mutacją EGFR leczonego diamidem, który powoduje stres oksydacyjny. Zaletą tej metody analitycznej wykorzystującej elektroforezę kapilarną ze spektrometrią mas (CE-MS) jest kompleksowy pomiar naładowanych metabolitów o zakresie mas m/z 50-100012,13. Celem tego artykułu jest dostarczenie nowicjuszom szczegółowego, krokowego protokołu wizualnego przygotowania wodnych metabolitów z hodowanych komórek nowotworowych i późniejszej analizy metabolomicznej, w szczególności za pomocą CE-MS.

Protokół

1. Hodowla komórkowa w dniu 1

UWAGA: Każda próbka do ekstrakcji metabolitów powinna być przygotowana z pojedynczego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm, które jest umiarkowanie, ale nie w pełni zlewające się (zawiera około 2-5 milionów komórek). Oblicz liczbę naczyń potrzebnych do testu i odpowiednio je przygotuj.

  1. Hodowla komórek HCC827 i PC-9 w 5% CO2 w temperaturze 37 °C w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm.
  3. Umyj komórki na każdym naczyniu za pomocą 2 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) bez wapnia i magnezu. Delikatnie kołysz każdym naczyniem tak, aby roztwór PBS całkowicie pokrył powierzchnię naczynia.
  4. Odessać bufor do płukania z naczyń hodowlanych.
  5. Podgrzać 0,25% roztwór trypsyny-EDTA do temperatury 37 °C i dodać 2 ml roztworu trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Delikatnie kołysz każdym naczyniem tak, aby trypsyna całkowicie pokryła powierzchnię naczynia.
  6. Inkubować szalki hodowlane w temperaturze 37 °C przez około 5 minut.
  7. Dodaj 4 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej na danie. Zawiesić komórki w pożywce, delikatnie pipetując kilka razy.
  8. Przenieść zawiesinę każdej komórki do oddzielnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 × g przez 5 minut.
  9. Zawiesić każdą komórkę w 2 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej.
  10. Określ całkowitą liczbę i procentową żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
    1. Wymieszać 10 μl zawiesiny komórkowej i 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
    2. Załadować 10 μl próbki do komory zliczania komórek, prześlizgnąć się przez działanie kapilarne.
    3. Włóż suwak studzienki do automatycznego licznika komórek. Przepuszczane światło zapala się automatycznie, a przyrząd automatycznie ustawia ostrość na komórce.
    4. Naciśnij przycisk przechwytywania, aby przechwycić obraz i wyświetlić wyniki.
    5. W razie potrzeby dodaj kolejną pożywkę wzrostową, aby uzyskać pożądane stężenie komórek.
  11. Wysiewaj około 1–2,5 miliona komórek na 100 mm naczynie do hodowli komórek.
    UWAGA: Stężenia metabolitów określone za pomocą analizy CE-MS zostaną znormalizowane na podstawie liczby żywotnych komórek. Do celów liczenia komórek konieczne jest przygotowanie co najmniej jednego dodatkowego naczynia do hodowli nasion dla każdej grupy.
  12. Inkubować szalki hodowlane w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.

2. Przygotowanie odczynników

  1. Rozcieńczyć handlowy roztwór wzorca wewnętrznego, w tym sulfon L-metioniny i kwas d-kamforo-10-sulfonowy, 1000-krotnie w wodzie ultraczystej.
    UWAGA: W przypadku mniej niż 80 próbek wystarczy zmieszać 50 μl roztworu wzorca wewnętrznego 1 i 45 ml wody ultraczystej w kolbie miarowej o pojemności 50 ml, a następnie doprowadzić roztwór do 50 ml wodą ultraczystą.
  2. Przygotować 0,05 g/ml roztworu mannitolu w ultraczystej wodzie jako bufor do płukania.
    UWAGA: W przypadku mniej niż 30 próbek wystarczy rozpuścić 25 g mannitolu w 500 ml ultraczystej wody. Potrzeba około 15 ml buforu do płukania na 100 mm naczynie hodowlane, dlatego należy przygotować wystarczającą objętość buforu do płukania w zależności od liczby próbek.

3. Filtry odśrodkowe do mycia wstępnego

  1. Odpipetować 250 μl ultraczystej wody do miseczki filtracyjnej każdej odśrodkowej jednostki filtrującej (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Wymagane są dwie jednostki filtrujące na próbkę.
  2. Zespoły filtracyjne szczelnie zamknąć i odwirować w temperaturze 9 100 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  3. Sprawdź objętość każdego filtratu — jeśli podczas pierwszego krótkiego wirowania nagromadziła się znaczna ilość filtratu, jednostka filtrująca może być uszkodzona. W takim przypadku wyrzuć jednostkę filtrującą i zamiast niej użyj nowej jednostki filtrującej.
  4. Szczelnie zamknąć pokrywy jednostek filtrujących i ponownie odwirować w temperaturze 9 100 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  5. Upewnij się, że w żadnym z kubków filtrujących nie pozostała woda ultraczysta; usuń przefiltrowaną wodę ultraczystą z każdej probówki za pomocą pipety i wyrzuć.
    UWAGA: Nie próbuj usuwać resztek wody z kubka filtra za pomocą pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie filtra.
  6. Włóż kubki filtra do probówek zbiorczych.
    UWAGA: Filtry odśrodkowe należy zużyć w ciągu godziny, ponieważ filtry mogą ulec uszkodzeniu po wysuszeniu.

4. Hodowla komórkowa w dniu 2

  1. Wyjmij z inkubatora szalki hodowlane o średnicy 100 mm.
    UWAGA: Zalecany czas trwania hodowli komórkowej to 18 godzin.
  2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej płytki hodowlanej o średnicy 100 mm.
  3. Do każdej potrawy dodać 10 ml pożywki do hodowli komórkowych, która zawiera odpowiednie stężenia związków lub leków, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórkowej.
    UWAGA: W celach demonstracyjnych dodaliśmy w tym eksperymencie 10 μl 250 mM diamidu rozpuszczonego w PBS (końcowe stężenie 250 μM).
  4. Inkubować szalki hodowlane w temperaturze 37 °C przez 30 minut w obecności diamidu lub PBS jako kontroli.
  5. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej płytki hodowlanej o średnicy 100 mm.
  6. Umyj komórki, delikatnie dodając 2 ml 5% roztworu mannitolu do krawędzi każdego naczynia, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek, a następnie lekko przechyl naczynie.
    UWAGA: PBS lub roztwór soli zakłóca analizę metabolomiczną opartą na CE-MS i niekorzystnie wpływa na wyniki pomiarów, dlatego nie powinien być stosowany jako bufor do płukania.
  7. Odessać bufor do płukania z każdej płytki hodowlanej, a następnie ponownie umyć komórki, delikatnie dodając 10 ml buforu do płukania na naczynie i lekko przechylając naczynie.
  8. Całkowicie zassać bufor do płukania od krawędzi każdej płytki hodowlanej.
    UWAGA: Zassać jak najwięcej buforu do płukania, zwracając uwagę, aby nie zasysać komórek. Pozostałości mannitolu mogą zakłócać analizę CE-MS; Aspiracja komórek zmniejszy liczbę komórek, a tym samym stanie się źródłem błędów w normalizacji danych.

5. Ekstrakcja metabolitów z hodowanych komórek

  1. Dodaj 800 μl 99,7% metanolu na szalkę hodowlaną. Delikatnie kołysz każdą miskę kulturową w przód iw tył, aby pokryć całą jej powierzchnię. Pozostaw naczynia w temperaturze pokojowej na 30 sekund.
  2. Powoli dodawać 550 μl rozcieńczonego roztworu wzorca wewnętrznego na każde naczynie, zanurzając końcówkę pipety w metanolu i delikatnie pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
  3. Delikatnie kołysz każdą miskę kulturową w przód iw tył, aby pokryć całą jej powierzchnię.
  4. Pozostaw naczynia w temperaturze pokojowej na 30 sekund.

6. Ultrafiltracja ekstraktów komórkowych

  1. Przenieść wyekstrahowany roztwór z każdej płytki hodowlanej do oddzielnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Odwirować probówki w temperaturze 2 300 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  3. Przenieść 350 μl każdego supernatantu do dwóch filtrów odśrodkowych na próbkę.
    UWAGA: Z każdej szalki hodowlanej przenosi się łącznie 700 μl wyekstrahowanego roztworu do dwóch probówek filtracyjnych (350 μl/probówkę).
  4. Odwirować probówki filtracyjne o stężeniu 9 100 × g w temperaturze 4 °C przez około 2 godziny, aż w kubkach filtracyjnych nie pozostanie żadna ciecz.
  5. Wyjmij kubki filtrujące i szczelnie zamknij pokrywki probówek zbiorczych.

7. Parowanie próbki

  1. Przygotuj parownik odśrodkowy — zazwyczaj składa się on z parownika, wymrażarki i pompy próżniowej.
  2. Umieść probówki zbiorcze w parowniku odśrodkowym.
    UWAGA: Pozostaw pokrywki tubek otwarte.
  3. Odparować wyekstrahowane roztwory próbek w warunkach próżni w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Typowe konfiguracje liczby obrotów i ciśnienia to odpowiednio 1 500 obr./min i 1 000 Pa, a całkowite odparowanie próbek zajmuje zwykle około 3 godzin.
  4. Upewnij się, że w żadnej z probówek zbiorczych nie pozostał żaden płyn i szczelnie zamknij pokrywki probówek.
  5. Probówki należy przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze (-80 °C) do czasu analizy metabolomicznej.

8. Analiza metabolomiczna CE-MS

  1. Zawiesić filtrat w 50 μl ultraczystej wody bezpośrednio przed analizą CE-MS.
  2. Wykonaj analizę CE-MS metodami opisanymi wcześniej12,13 przy użyciu systemu elektroforezy kapilarnej i systemu spektrometru mas czasu przelotu wyposażonego w pompę izokratyczną, adapter CE-MS i opryskiwacz CE-ESI-MS.
    UWAGA: Oba systemy mogą być sterowane za pomocą oprogramowania dostawców systemów i są połączone kapilarą ze stopionej krzemionki (średnica wewnętrzna 50 μm × długość całkowita 80 cm).
    1. Ustawić przyrządy i fiolki z próbkami, przygotować kapilarnę z kasetą kapilarną, uzupełnić płyny osłonowe i odpowiednie do elektroforezy w zależności od trybu analizy anionów lub kationów, a następnie zastosować napięcia.
      UWAGA: Oprzyrządowanie i warunki analityczne są szczegółowo opisane w innym miejscu12,13.
    2. Otwórz oprogramowanie i przygotuj listę roboczą zawierającą metody pozyskiwania danych oraz przykładowe informacje.
    3. Rozpocznij uruchomienie testowe i sprawdź dane, takie jak intensywność sygnału i kształt piku wzorców wewnętrznych oraz rozdzielczość szczytowa innych związków wzorcowych.
    4. W razie potrzeby należy dostosować warunki analityczne.
    5. Roztwory próbek wstrzykiwać pod ciśnieniem 50 mbar przez 3 s i napięciem 30 kV.
      UWAGA: CE-MS przeprowadzono w trybie jonów dodatnich lub ujemnych. Ustaw spektrometr tak, aby skanował zakres mas m/z 50–1000. Napięcie kapilarne ustalono na 4 kV; natężenie przepływu azotu gazowego (temperatura grzałki 300°C). Dla trybu dodatniego napięcie fragmentora, skimmera i OCT RFV ustawiono odpowiednio na 75, 50 i 125 V. W trybie jonów ujemnych napięcie fragmentora, skimmera i OCT RFV ustawiono odpowiednio na 100, 50 i 200 V.
  3. Analizuj dane dotyczące widma.
    1. Wyodrębnij piki z danych widma mas za pomocą oprogramowania do automatycznej integracji w celu uzyskania informacji o pikach, w tym m/z, powierzchni piku i czasu migracji (MT).
      UWAGA: Metoda jest szczegółowo opisana w innym miejscu14.
    2. Wykluczyć piki sygnału odpowiadające izotopomerom, jonom adduktorowym i innym jonom potomnym znanych metabolitów.
    3. Opisz pozostałe piki informacjami z bazy danych metabolitów HMT zgodnie z wartościami m/z i MTs.
    4. Znormalizuj obszary oznaczonych pików do wewnętrznych poziomów wzorca i liczby komórek w próbce.
    5. Ocenić stężenie każdego metabolitu w hodowanych komórkach (pmol/106 komórek) przy użyciu krzywych wzorcowych przygotowanych dla każdego metabolitu.
    6. Ilościowo określone stężenia metabolitów można wykorzystać do późniejszych analiz statystycznych i interpretacji biologicznych14.

Wyniki

Ponieważ stężenia metabolitów w komórkach nowotworowych (pmol/106 komórek) są normalizowane do liczby żywych komórek, warunki eksperymentalne powinny zostać dobrane z najwyższą starannością, aby zminimalizować różnice w liczbie żywych komórek pomiędzy poszczególnymi grupami. Na przykład traktowanie diamidem przeprowadzono przy stosunkowo wysokim stężeniu (250 μm), lecz przez krótki czas, aby umożliwić wszystkim komórkom równiejszy wzrost, wyrównując tym samym liczbę analizowanych żywych komórek. W tych warunkach eksperymentalnych komórki HCC827 i PC-9 rosły w równym stopniu przez 3 h (Rysunek 1). Analiza CE-MS komórek traktowanych diamidem w porównaniu z komórkami traktowanymi PBS (kontrola) wykazała odpowiednio 175 i 150 metabolitów różniących się stężeniem w komórkach HCC827 i PC-9. Wśród nich kilka produktów pośrednich szlaku pentozofosforanowego (PPP) oraz górnego etapu glikolizy było znacznie wyższych w warunkach traktowania diamidem w obu liniach komórkowych, podczas gdy kilka produktów pośrednich cyklu kwasu trkarboksylowego (TCA) było niższych w warunkach traktowania (Rysunek 2 oraz Rysunek 3).

Szlak pentozofosforanowy (PPP) generuje ekwiwalenty redukcyjne w postaci zredukowanego nikotynamido-adenyno-dinukleotydu fosforanu (NADPH), który jest wykorzystywany do utrzymania homeostazy redoks oraz biosyntezy kwasów tłuszczowych15. Po zastosowaniu diamidu poziom kwasu glukonowego – utlenionej formy glukozy – wzrósł 12-krotnie w komórkach HCC827 i 10-krotnie w komórkach PC-9; podobnie po traktowaniu diamidem poziom glukozo-6-fosforanu (G6P) – fosforylowanej glukozy i pierwszego produktu glikolizy katalizowanego przez heksokinazę – wzrósł odpowiednio 6,3- i 3,5-krotnie w komórkach HCC827 i PC-9 (Rycina 4). Ponadto po zastosowaniu diamidu poziomy 6-fosfoglukonianu (6PG) – pierwszego produktu pośredniego w PPP – gwałtownie wzrosły 89-krotnie w komórkach HCC827 i 231-krotnie w komórkach PC-9 w porównaniu do poziomów obserwowanych w kontroli PBS (Rycina 4). W przeciwieństwie do tego, poziomy innych produktów pośrednich glikolizy, takich jak fruktozo-6-fosforan (F6P) i fruktozo-1,6-bisfosforan (F1,6P), nie uległy zmianie w warunkach eksperymentalnych z diamidem (Rycina 4). Całkowite poziomy nikotynamido-adenyno-dinukleotydu fosforanu (NADP+) były niemal równoważne między warunkami traktowania diamidem a kontrolą PBS (Rycina 4), co sugeruje, że glukoza była katabolizowana głównie poprzez PPP.

Wykres słupkowy liczby komórek w liniach HCC827 i PC-9 po zastosowaniu PBS oraz diamidu w czasie.
Rysunek 1. Brak zmian w liczbie komórek po zastosowaniu diamidu. Reakcje wzrostu komórek na 250 μm diamidu zmierzono za pomocą barwienia błękitem trypanu. Przedstawiono liczbę komórek (A) HCC827 oraz (B) PC-9 traktowanych PBS (niebieski) lub diamidem (czerwony; 250 μm) przez 1 lub 3 h. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki chromatografii, wykresy natężenia w funkcji czasu, identyfikacja kwasu glukonowego, G6P, 6PG, NADP+.
Rysunek 2. Reprezentatywne piki MS metabolitów. Elektroferogramy opisane jako (A) kwas glukonowy, (B) glukozo-6-fosforan (G6P), (C) 6-fosfoglukonian (6PG) oraz (D) nikotynamidoadeninodynukleotydofosforan (NADP+) uzyskane w analizie CE-MS. Każda linia wskazuje zastosowaną linię komórkową (ciągła: HCC827; przerywana: PC-9) oraz rodzaj traktowania (niebieska: PBS; czerwona: diamid). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza szlaków metabolicznych; wykres porównawczy; dane log(diamide/PBS) dla HCC827 vs PC-9.
Rycina 3. Profile metabolomiczne metabolitów wewnątrzkomórkowych. Zmiany krotności metabolitej w komórkach (A) HCC827 i (B) PC-9 traktowanych diamidem przedstawiono jako log2(diamide/PBS). Łącznie zidentyfikowano 175 i 150 metabolitów odpowiednio w komórkach HCC827 i PC-9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat metabolizmu glukozy; wykresy słupkowe przedstawiają poziomy metabolitów w komórkach HCC827 i PC-9 z PBS oraz diamidem.
Rysunek 4. Up-regulacja PPP po traktowaniu diamidem. Przedstawiono wewnątrzkomórkowe stężenia (pmol/106 komórek) kluczowych metabolitów uczestniczących w glikolizie oraz szlaku pentoz fosforanowych (PPP) po traktowaniu diamidem. Metabolity wyekstrahowano z komórek HCC827 i PC-9 traktowanych PBS (kolor niebieski) lub diamidem (kolor czerwony, 250 μm) przez 30 min. Przedstawiono reprezentatywne metabolity, takie jak kwas glukonowy, glukozo-6-fosforan (G6P), fruktozo-6-fosforan (F6P), 6-fosfoglukonian (6PG) oraz nikotynamido-adenyno-dinukleotyd fosforanowy (NADP+). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy szeroko dostępną metodologię przygotowania metabolitów z hodowanych komórek nowotworowych do analizy metabolomicznej opartej na CE-MS. Jednym z najbardziej krytycznych punktów w tym protokole jest właściwe przygotowanie komórek rakowych, ponieważ zmierzone stężenia metabolitów są znormalizowane do liczby żywotnych komórek. W celu dokładnego oszacowania liczby komórek konieczne jest przygotowanie co najmniej jednej dodatkowej płytki hodowlanej na grupę doświadczalną w celu policzenia liczby żywotnych komórek równolegle z ekstrakcją metabolitów do analizy metabolomicznej. Ponadto w każdej szalce należy umieścić taką samą liczbę komórek w przypadku powtórzeń i w szalce w celu zliczenia; W przyszłości będzie to wspomagane przez szybki i wolny od stresorów (np. bez trypsyny) protokół liczenia komórek, który pozwala na użycie tego samego naczynia zarówno do liczenia żywych komórek, jak i ekstrakcji metabolitów. Podczas mycia należy zachować ostrożność, aby komórki nie odrywały się od powierzchni naczyń. Surowe testy cytotoksyczności i inne eksperymenty, które zmniejszają adhezję komórek, mogą być nieodpowiednie dla tego protokołu ekstrakcji ze względu na potencjalną utratę komórek podczas procedury mycia.

Ważne jest, aby używać 5% roztworu mannitolu jako buforu płuczącego do ekstrakcji metabolitów z hodowanych komórek do analizy metabolomicznej opartej na CE-MS, ponieważ na bazie soli, takie jak PBS, zakłócają analizę metabolomiczną i niekorzystnie wpływają na pomiar.

Dwie lub trzy szalki można połączyć jako pojedynczą próbkę poprzez indywidualne ekstrahowanie metabolitów z każdej płytki, a następnie łączenie próbek; Jednak łączenie wielu szalek często zwiększa pozostałości mannitolu w wyekstrahowanym roztworze metabolitu. Może to również zakłócać analizę metabolomiczną przeprowadzaną przez CE-MS. Dlatego zaleca się, aby nie używać wielu naczyń lub studzienek jako jednej próbki.

Ta metoda analizy metabolomicznej z wykorzystaniem CE-MS została opracowana do kompleksowego pomiaru naładowanych cząsteczek o masie cząsteczkowej od 50 do 1000 Da; W związku z tym protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem ekstrakcji wodnych związków o niskiej masie cząsteczkowej. Dlatego protokół ten nie nadaje się do ekstrakcji metabolitów hydrofobowych, takich jak lipidy lub makrocząsteczki, takie jak białka i kwasy nukleinowe. Ponieważ istnieje rosnące zapotrzebowanie na kompleksowe analizy lipidowe lub lipidomikę próbek hodowanych komórek, konieczne jest opracowanie łatwego i skutecznego protokołu jednoczesnej ekstrakcji metabolitów zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych.

Pierwszy etap ekstrakcji metabolitów – aspiracja pożywki i mycie komórek mannitolem – powinien być przeprowadzony tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować zmiany w profilu metabolicznym komórek. Zakłada się, że traktowanie komórek metanolem po umyciu mannitolem denaturuje białka, a tym samym zapobiega katalizowaniu dalszych reakcji metabolicznych przez enzymy. Jednak nawet po traktowaniu metanolem mogą zachodzić nieenzymatyczne reakcje chemiczne, takie jak reakcje redoks, niektóre procesy dekarboksylacji i wiązania tiolowe. W związku z tym wszelkie stężenia metabolitów biorących udział w tych reakcjach, mierzone za pomocą niniejszego protokołu, powinny być interpretowane z ostrożnością. W przeciwieństwie do genomu lub transkryptomu, metabolom składa się z cząsteczek o szerokiej gamie właściwości chemicznych; W związku z tym żaden pojedynczy protokół nie jest w stanie wyekstrahować wszystkich metabolitów bez żadnych strat lub zakłóceń. W celu uzyskania dokładniejszych pomiarów takich wysoce reaktywnych metabolitów należy zapoznać się z protokołem specjalnie zaprojektowanym do ekstrakcji niektórych grup metabolitów, który wymaga frakcjonowania i derywatyzacji. Przedstawiony tutaj protokół opisuje jednak prostą i szybką ekstrakcję wodnych metabolitów z próbek hodowanych komórek do analizy metabolomicznej za pomocą CE-MS. W tym artykule nie mogliśmy szczegółowo opisać, jak skonfigurować CE-MS, ponieważ przedmiot niniejszego manuskryptu jest inny, jednak opisanie szczegółowych kroków do konfiguracji CE-MS może wymagać osobnego dedykowanego artykułu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom Regionalnego Centrum Promocji Przemysłu Shonai za ich pomoc. Praca ta była częściowo wspierana przez fundusze badawcze z prefektury Yamagata i miasta Tsuruoka, przez Fundusz Badawczo-Rozwojowy Narodowego Centrum Raka [numer grantu 28-A-9] oraz przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI [numer grantu 17K07189] dla HM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Automatyczny licznik komórekThermo ScientificAMQAX1000Countess II Automatyczny licznik komórek
Oprogramowanie do automatycznej integracjiAgilent TechnologiesMassHunter G3335-60041wersja B.02.00
System CEAgilent TechnologiesAgilent 7100 CE system
Zestaw adapterów CE/MSAgilent TechnologiesG1603A
CE-ESI-MS Zestaw opryskiwaczaAgilent TechnologiesG1607A Szkiełko
komory zliczania komórekThermo ScientificC10282Szkiełka komory zliczania komórek Countess
Filtr odśrodkowy, 5 kDaHuman Metabolome TechnologiesULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT
Stożkowa sterylna probówka polipropylenowa, 15 mlThermo ScientificN339651
Stożkowa sterylna probówka polipropylenowa, 50 mlThermo ScientificN339653
Costar stripette, 10 mlCorning4488
Costar stripette, 5 mlCorning4487
D(-)-MannitolWako133-00845500 g
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Bufor do elektroforezyHuman Metabolome TechnologiesH3301-1001do analizy kationów
Bufor do elektroforezyHuman Metabolome TechnologiesH3302-1021do analizy anionów
Surowica bydlęcapłodu BiowestS1780
Końcówka filtra, 1000 μ lWatson124P-1000S Końcówka
filtra, 20 μ lWatson124P-20S Końcówka
filtra, 200 μ lWatson1252-703CS
Kapilara z topionej krzemionkiPolymicro TechnologiesTSP05037550 μ m i.d. & czasy; Długość całkowita: 80 cm
HCC827American Type Culture CollectionCRL-2868
Wewnętrzny roztwór wzorcowyHuman Metabolome TechnologiesH3304-1002
Pompa izokratycznaAgilent TechnologiesAgilent 1100 Series Pompa
MetanolWako138-145211 l, mikroprobówka klasy LC/MS
, 1,5 mlWatson131-415C
Oprogramowanie operacyjneAgilent TechnologiesChemStationG2201AA wersja B.03.01 dla CE
PC-9RIKEN Bio Resource CenterRCB4455
RPMI-1640Sigma-AldrichR8758-500ML
Sterylne naczynie do hodowli tkankowych, 100 mmCorning430167
Time-of-flightAgilent TechnologieAgilent G1969A Time-of-Flight LC/MS
Trypan niebieski roztwór, 0,4%Thermo ScientificT10282
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT4049-100ML
Woda ultraczystaMerckMilli-Q woda18,2 MΩ · cm czysta woda
Kolba miarowa, 50 mlIwaki5640FK50ETE-32
izokratyczna Spektrometr masowy

Bibliografia

  1. Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).
  2. Soga, T. Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).
  3. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and Cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
  4. Fukuda, H., et al. Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection. European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).
  5. Miles, K. A., Williams, R. E. Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism. Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).
  6. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  7. Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes. Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).
  8. Makinoshima, H., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).
  9. Makinoshima, H., et al. Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).
  10. Makinoshima, H., et al. Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma. Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).
  11. Sato, Y., et al. Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1129(2018).
  12. Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).
  13. Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).
  14. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
  15. Patra, K. C., Hay, N. The pentose phosphate pathway and cancer. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja metabolitówhodowla komórkowatrypsyna EDTAobróbka metanolemfiltry odśrodkoweanaliza CEMS
Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.