Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59555

⸱

30 kwietnia 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazujemy jednokomórkową hodowlę bakterii wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (GV). GV zawierające komórki bakteryjne przygotowano metodą transferu kropelkowego i unieruchomiono na podpartej membranie na szklanym podłożu w celu bezpośredniej obserwacji wzrostu bakterii. To podejście można również dostosować do innych komórek.

Streszczenie

Opracowaliśmy metodę hodowli komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (GV). Hodowla komórek bakteryjnych jest ważna dla zrozumienia funkcji komórek bakteryjnych w środowisku naturalnym. Dzięki postępowi technologicznemu różne funkcje komórek bakteryjnych mogą zostać ujawnione na poziomie pojedynczej komórki w ograniczonej przestrzeni. GV to kuliste mikrokompartmenty zbudowane z amfifilowych cząsteczek lipidów i mogą zawierać różne materiały, w tym komórki. W tym badaniu pojedynczą komórkę bakteryjną zamknięto w GV o wielkości 10–30 μm metodą przenoszenia kropelk, a GV zawierające komórki bakteryjne unieruchomiono na podpartej membranie na podłożu szklanym. Nasza metoda jest przydatna do obserwacji wzrostu pojedynczych bakterii w czasie rzeczywistym wewnątrz GV. Hodowaliśmy komórki Escherichia coli (E. coli) jako model wewnątrz GV, ale tę metodę można dostosować do innych typów komórek. Nasza metoda może być stosowana w naukach ścisłych i przemysłowych mikrobiologii, biologii, biotechnologii i biologii syntetycznej.

Wprowadzenie

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki cieszy się coraz większym zainteresowaniem. Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki w ograniczonej przestrzeni może wyjaśnić funkcje bakteryjne, takie jak zmienność fenotypowa1,2,3,4, cell behavior5,6,7,8,9, oraz Oporność na antybiotyki10,11. Ze względu na najnowsze postępy w technikach hodowli, hodowla pojedynczych bakterii może być osiągnięta w ograniczonej przestrzeni, np. w studni chipowej4,7,8, gel droplet12,13, and water-in-oil (W/O) droplet5,11. Aby ułatwić zrozumienie lub wykorzystanie pojedynczych komórek bakteryjnych, potrzebny jest dalszy rozwój techniczny technik hodowli.

Pęcherzyki, które naśladują biologiczną błonę komórkową, to kuliste przedziały składające się z amfifilowych cząsteczek i mogą zawierać różne materiały. Pęcherzyki są klasyfikowane według wielkości i obejmują małe pęcherzyki (SVs, średnica < 100 nm), duże pęcherzyki (LV, <1 μm) i gigantyczne pęcherzyki (GV, >1 μm). SV lub LV są powszechnie używane jako nośniki leków ze względu na ich powinowactwo do biologicznej błony komórkowej14. GV były również używane jako system reaktorów do budowy protokomórek15 lub artificial-cells16. Opisano enkapsulację komórek biologicznych w GV17,18, a zatem GV wykazują potencjał jako system hodowli komórkowej w połączeniu z systemem reaktora.

Tutaj, wraz z filmem przedstawiającym procedury eksperymentalne, opisujemy, jak można wykorzystać GV jako nowe naczynia do hodowli komórkowych19. GV zawierające bakterie zostały wytworzone metodą przenoszenia kropel20, a następnie unieruchomione na podpartej membranie na szkle nakrywkowym. Wykorzystaliśmy ten system do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek wewnątrz GV w czasie rzeczywistym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie GV zawierających komórki bakteryjne metodą transferu kropelek

  1. Przygotować podstawowe roztwory lipidów 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC, 10 mM, 1 ml) i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[biotynylo(glikol polietylenowy)-2000] (biotyna-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) w roztworze chloroformu/metanolu (2/1, v/v) i przechowywać materiał podstawowy w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotowanie roztworu oleju zawierającego lipidy
    1. Wlać 20 μl roztworu POPC i 4 μl roztworu biotyny-PEG-DSPE do szklanej probówki (Rysunek 1b (i)).
    2. Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aby utworzyć film lipidowy i umieścić film w eksykatorze na 1 godzinę, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik organiczny (Rysunek 1b (ii)).
      nuta: Konieczne jest odparowanie rozpuszczalnika organicznego w dygestorium.
    3. Dodaj 200 μl oleju mineralnego (0,84 g/ml, tabela materiałów) do szklanej fiolki (Rysunek 1b (iii)).
    4. Owinąć początkową część szklanej fiolki folią i poddać sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej (120 W) przez co najmniej 1 godzinę (Rysunek 1b (iii)). Końcowe stężenia POPC i biotyny-PEG-DSPE wynoszą odpowiednio 1 mM i 0,002 mM.
  3. Wstępna hodowla komórek bakteryjnych
    1. Zaszczepić E. coli w 1x pożywce LB (1 g ekstraktu drożdżowego, 2 g baktotryptonu i 2 g chlorku sodu w 200 ml wody dejonizowanej) z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-14 godzin (przez noc).
    2. Po inkubacji zebrać 20 μl roztworu hodowlanego i przenieść do 1,98 ml świeżej pożywki 1x LB i ponownie hodować komórki przez 2 godziny.
    3. Sprawdzić gęstość optyczną roztworu do hodowli wstępnej (przygotowanego w kroku 1.3.2) przy wartości 600 nm (OD600). Należy użyć roztworu do hodowli wstępnej o średnicy zewnętrznej600 = 1,0–1,5.
  4. Przygotowanie zewnętrznych i wewnętrznych roztworów wodnych GV
    1. Rozpuść glukozę w pożywce 1x LB, aby przygotować zewnętrzny wodny roztwór GV. Przygotuj 20 ml podstawowego roztworu glukozy (500 mM).
    2. Rozcieńczyć podstawowy roztwór glukozy w pożywce 1x LB do 200 mM (Tabela 1).
    3. Rozpuść sacharozę w 1x pożywce LB, aby przygotować wewnętrzny wodny roztwór GV. Przygotuj 20 ml podstawowego roztworu sacharozy (500 mM).
    4. Wymieszać roztwór do hodowli wstępnej (OD600 = 1,0–1,5), roztwór sacharozy (500 mM) i 1x pożywkę LB (tabela 1). Końcowa wartość OD600 roztworu hodowlanego powinna wynosić 0,01–0,015, a końcowe stężenie sacharozy powinno wynosić 200 mM.
      nuta: Uważaj, aby uniknąć ciśnienia osmotycznego. Konieczne jest zrównoważenie stężenia między wewnętrznym i zewnętrznym roztworem wodnym.
  5. Przygotowanie kropelek wody w oleju (W/O) zawierających komórki bakteryjne
    1. Dodać 2 μl wewnętrznego wodnego roztworu GV (przygotowanego w kroku 1.4.4) do 50 μl roztworu oleju zawierającego lipidy (olej mineralny z POPC i biotyną-PEG-DSPE) w plastikowej probówce o pojemności 0,6 ml (Rysunek 1b (iv)).
    2. Zemulguj dwa składniki w plastikowej tubie, stukając w rurkę ręcznie (Rysunek 1b (v)).
  6. Powstawanie GV zawierających komórki bakteryjne
    1. Dodać 50 μl zewnętrznego wodnego roztworu GV (przygotowanego w kroku 1.4.2) do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml z pokrywką (Rysunek 1b (vi)) i delikatnie nałożyć 150 μl roztworu oleju zawierającego lipidy (olej mineralny z POPC i biotyną-PEG-DSPE) na powierzchnię zewnętrznego roztworu wodnego (Rysunek 1b (vii)). Próbkę należy inkubować w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C) przez 10–15 minut. Sprawdź, czy granica faz oleju i roztworów wodnych jest płaska.
    2. Dodać 50 μl roztworu kropelek W/O (przygotowanego w kroku 1.5.2) na granicy faz oleju i roztworu wodnego za pomocą pipety (Rysunek 1b (viii)).
    3. Odwirować probówkę z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml z pokrywką (od kroku 1.6.2) przez 10 minut przy 1 600 x g w temperaturze pokojowej w wirówce biurkowej (Rysunek 1b (ix)). Po odwirowaniu odessać olej (górna warstwa) z plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml z pokrywką za pomocą pipety i zebrać GV zawierające komórki bakteryjne (Rysunek 1b (x)).

2. Przygotowanie systemu obserwacji GV (System Hodowli Komórek Bakteryjnych)

  1. Przygotowanie małych pęcherzyków (SV) do budowy podpartej membrany dwuwarstwowej
    1. Wlać 20 μl roztworu POPC i 4 μl roztworu biotyny-PEG-DSPE do szklanej probówki (używając tego samego składu lipidowego, jaki zastosowano do przygotowania GV w kroku 1.1).
    2. Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aby utworzyć film lipidowy i umieścić tę próbkę w eksykatorze na 1 godzinę w celu całkowitego odparowania rozpuszczalnika organicznego.
    3. Dodać 200 μl 200 mM glukozy w 1x pożywce LB (zewnętrzny wodny roztwór GV) do szklanej fiolki.
    4. Owinąć otwierającą się część szklanej fiolki folią i poddać sonikacji w łaźni ultradźwiękowej (120 W) przez co najmniej 1 godzinę.
    5. Przygotuj SV metodą ekstruzji21 za pomocą mini-ekstrudera i membrany poliwęglanowej o wielkości porów 100 nm.
  2. Przygotowanie ręcznie robionej komory
    1. Wywierć otwór o średnicy 7 mm za pomocą wydrążonego stempla na dwustronnej uszczelce (10 mm x 10 mm x 1 mm).
    2. Wklej dwustronną uszczelkę z otworem w szkle nakrywkowym (30 mm x 40 mm, grubość 0,25–0,35 mm).
  3. Przygotowanie podpartej dwuwarstwowej membrany na szkle nakrywkowym w otworze studzienki
    1. Dodać 30 μl roztworu SV do otworu komory (przygotowanego w ppkt 2.2) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.
  4. Unieruchomienie GV na podpartej membranie dwuwarstwowej na szkle nakrywkowym w otworze komory
    1. Wprowadzić 10 μl neutrawarydyny z zewnętrznym wodnym roztworem GV (1 mg/ml) do otworu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.
    3. Dodać cały roztwór zawierający GV (przygotowany w kroku 1.6.3) do otworu komory i uszczelnić szkłem nakrywkowym (18 mm x 18 mm, grubość 0,13–0,17 mm) (Rysunek 2b).
  5. Obserwacja mikroskopowa wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV
    1. Ustaw mikroskopijny system ogrzewania z odwróconym mikroskopem wyposażonym w soczewkę obiektywową o aperturze numerycznej (NA) 40x/0,6 o dużej odległości roboczej (Rysunek 2b).
    2. Umieść komorę na mikroskopijnym systemie ogrzewania stage (Rysunek 2b). Inkubować GV zawierające komórki bakteryjne w komorze w stanie statycznym przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Rejestruj i rejestruj obrazy mikroskopowe wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV co 30 minut za pomocą naukowej kamery z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy prostą metodę generowania GVs zawierających pojedyncze komórki bakteryjne z wykorzystaniem metody transferu kropli (Rysunek 1). Rysunek 1a przedstawia schemat wytrącania GVs zawierających bakterie. Krople W/O zawierające bakterie są przenoszone przez granicę fazy olej-woda (monowarstwa lipidowa) za pomocą wirowania w celu utworzenia GVs. Różnica w gęstości między sacharozą (wewnętrzny roztwór wodny) a glukozą (zewnę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metodę hodowli komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz GV. Ta prosta metoda polega na tworzeniu GV zawierających komórki bakteryjne na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu metody przenoszenia kropelk. W porównaniu z innymi podejściami do otrzymywania GV zawierających komórki bakteryjne, metoda ta ma dwie zalety: (i) jest łatwa do opracowania oraz (ii) do przygotowania GV wymagana jest niewielka objętość (2 μL) roztworu próbki. Metoda przenoszenia kropelek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii, Grant-in-Aid for Young Scientist Research (No. 18K18157, 16K21034) od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) dla M.M., oraz Grant-in-Aid od MEXT dla K.K. (No. 17H06417, 17H06413).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BaktotryptonBD Biosciences211705
ChloroformWako Pure Chemicals032-21921
Szkło nakrywkowe (18 i 18 mm)Matsunami Glass Ind.C018181grubość 0,13 i ndash; 0,17 mm
Szkło nakrywkowe (30 i razy; 40 mm)Matsunami Glass Ind.Grubość na zamówienie0,25 dokładki; Wirówka biurkowa 0,35 mm
Hi-Tech Co.ATT101typ wirnika wahadłowego
Dwustronne uszczelnienie (10 &razy; 10 & razy; 1 mm)NitomsT4613
Szklana fiolkaAS ONE6-306-01Rurka fermentacyjna Durham
GlukozaWako Pure Chemicals049-31165
Mikroskop odwróconyOlympusIX-73
MetanolWako Pure Chemicals133-16771
Mikroskopijny system grzewczyTOKAI HITTP-110R-100
Olej mineralnyNacalai Tesque23334-85
Mini-ekstruderAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
Soczewka obiektywowaOlympusLUCPLFLN 40×/0,6 NA
Membrany poliwęglanoweAvanti Polar Lipids610005wielkość porów 100 nm
kamera sCMOSAndorZyla 4.2 plus
Chlorek soduWako Pure Chemicals191-01665
SacharozaWako Pure Chemicals196-00015
Kąpiel ultradźwiękowaAS ONEASU-3D
Ekstrakt drożdżowyBD Biosciences212750
Plastikowa tubka z pokrywką 0,6 mlWatson130-806C
1,5 ml plastikowa tubka z pokrywkąSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfokolinaAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-distearoilo-snglycero-3-fosfoetanoloamina-N-[biotynyl(glikol polietylenowy)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotyna-PEG-DSPE

Bibliografia

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Escherichia colimetoda przenoszenia kroplimembrana wspieraj caobrazowanie mikroskopoweformowanie p cherzyk wenkapsulacja kom rekwzrost w czasie rzeczywistym
Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.