Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki cieszy się coraz większym zainteresowaniem. Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki w ograniczonej przestrzeni może wyjaśnić funkcje bakteryjne, takie jak zmienność fenotypowa^1,2,3,4, cell behavior^5,6,7,8,9, oraz Oporność na antybiotyki10^,11. Ze względu na najnowsze postępy w technikach hodowli, hodowla pojedynczych bakterii może być osiągnięta w ograniczonej przestrzeni, np. w studni chipowej^4,7,8, gel droplet^12,13, and water-in-oil (W/O) droplet^5,11. Aby ułatwić zrozumienie lub wykorzystanie pojedynczych komórek bakteryjnych, potrzebny jest dalszy rozwój techniczny technik hodowli.

Pęcherzyki, które naśladują biologiczną błonę komórkową, to kuliste przedziały składające się z amfifilowych cząsteczek i mogą zawierać różne materiały. Pęcherzyki są klasyfikowane według wielkości i obejmują małe pęcherzyki (SVs, średnica < 100 nm), duże pęcherzyki (LV, <1 μm) i gigantyczne pęcherzyki (gv,>1 μm). SV lub LV są powszechnie używane jako nośniki leków ze względu na ich powinowactwo do biologicznej błony komórkowej¹⁴. GV były również używane jako system reaktorów do budowy protokomórek¹⁵ lub artificial-cells¹⁶. Opisano enkapsulację komórek biologicznych w GV^17,18, a zatem GV wykazują potencjał jako system hodowli komórkowej w połączeniu z systemem reaktora.

Tutaj, wraz z filmem przedstawiającym procedury eksperymentalne, opisujemy, jak można wykorzystać GV jako nowe naczynia do hodowli komórkowych¹⁹. GV zawierające bakterie zostały wytworzone metodą przenoszenia kropel²⁰, a następnie unieruchomione na podpartej membranie na szkle nakrywkowym. Wykorzystaliśmy ten system do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek wewnątrz GV w czasie rzeczywistym.

1. Przygotowanie GV zawierających komórki bakteryjne metodą transferu kropelek

1. Przygotować podstawowe roztwory lipidów 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC, 10 mM, 1 ml) i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[biotynylo(glikol polietylenowy)-2000] (biotyna-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) w roztworze chloroformu/metanolu (2/1, v/v) i przechowywać materiał podstawowy w temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie roztworu oleju zawierającego lipidy
   1. Wlać 20 μl roztworu POPC i 4 μl roztworu biotyny-PEG-DSPE do szklanej probówki (Rysunek 1b (i)).
   2. Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aby utworzyć film lipidowy i umieścić film w eksykatorze na 1 godzinę, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik organiczny (Rysunek 1b (ii)).
      nuta: Konieczne jest odparowanie rozpuszczalnika organicznego w dygestorium.
   3. Dodaj 200 μl oleju mineralnego (0,84 g/ml, tabela materiałów) do szklanej fiolki (Rysunek 1b (iii)).
   4. Owinąć początkową część szklanej fiolki folią i poddać sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej (120 W) przez co najmniej 1 godzinę (Rysunek 1b (iii)). Końcowe stężenia POPC i biotyny-PEG-DSPE wynoszą odpowiednio 1 mM i 0,002 mM.
3. Wstępna hodowla komórek bakteryjnych
   1. Zaszczepić E. coli w 1x pożywce LB (1 g ekstraktu drożdżowego, 2 g baktotryptonu i 2 g chlorku sodu w 200 ml wody dejonizowanej) z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-14 godzin (przez noc).
   2. Po inkubacji zebrać 20 μl roztworu hodowlanego i przenieść do 1,98 ml świeżej pożywki 1x LB i ponownie hodować komórki przez 2 godziny.
   3. Sprawdzić gęstość optyczną roztworu do hodowli wstępnej (przygotowanego w kroku 1.3.2) przy wartości 600 nm (OD₆₀₀). Należy użyć roztworu do hodowli wstępnej o średnicy zewnętrznej₆₀₀ = 1,0–1,5.
4. Przygotowanie zewnętrznych i wewnętrznych roztworów wodnych GV
   1. Rozpuść glukozę w pożywce 1x LB, aby przygotować zewnętrzny wodny roztwór GV. Przygotuj 20 ml podstawowego roztworu glukozy (500 mM).
   2. Rozcieńczyć podstawowy roztwór glukozy w pożywce 1x LB do 200 mM (Tabela 1).
   3. Rozpuść sacharozę w 1x pożywce LB, aby przygotować wewnętrzny wodny roztwór GV. Przygotuj 20 ml podstawowego roztworu sacharozy (500 mM).
   4. Wymieszać roztwór do hodowli wstępnej (OD₆₀₀ = 1,0–1,5), roztwór sacharozy (500 mM) i 1x pożywkę LB (tabela 1). Końcowa wartość OD₆₀₀ roztworu hodowlanego powinna wynosić 0,01–0,015, a końcowe stężenie sacharozy powinno wynosić 200 mM.
      nuta: Uważaj, aby uniknąć ciśnienia osmotycznego. Konieczne jest zrównoważenie stężenia między wewnętrznym i zewnętrznym roztworem wodnym.
5. Przygotowanie kropelek wody w oleju (W/O) zawierających komórki bakteryjne
   1. Dodać 2 μl wewnętrznego wodnego roztworu GV (przygotowanego w kroku 1.4.4) do 50 μl roztworu oleju zawierającego lipidy (olej mineralny z POPC i biotyną-PEG-DSPE) w plastikowej probówce o pojemności 0,6 ml (Rysunek 1b (iv)).
   2. Zemulguj dwa składniki w plastikowej tubie, stukając w rurkę ręcznie (Rysunek 1b (v)).
6. Powstawanie GV zawierających komórki bakteryjne
   1. Dodać 50 μl zewnętrznego wodnego roztworu GV (przygotowanego w kroku 1.4.2) do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml z pokrywką (Rysunek 1b (vi)) i delikatnie nałożyć 150 μl roztworu oleju zawierającego lipidy (olej mineralny z POPC i biotyną-PEG-DSPE) na powierzchnię zewnętrznego roztworu wodnego (Rysunek 1b (vii)). Próbkę należy inkubować w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C) przez 10–15 minut. Sprawdź, czy granica faz oleju i roztworów wodnych jest płaska.
   2. Dodać 50 μl roztworu kropelek W/O (przygotowanego w kroku 1.5.2) na granicy faz oleju i roztworu wodnego za pomocą pipety (Rysunek 1b (viii)).
   3. Odwirować probówkę z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml z pokrywką (od kroku 1.6.2) przez 10 minut przy 1 600 x g w temperaturze pokojowej w wirówce biurkowej (Rysunek 1b (ix)). Po odwirowaniu odessać olej (górna warstwa) z plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml z pokrywką za pomocą pipety i zebrać GV zawierające komórki bakteryjne (Rysunek 1b (x)).

2. Przygotowanie systemu obserwacji GV (System Hodowli Komórek Bakteryjnych)

1. Przygotowanie małych pęcherzyków (SV) do budowy podpartej membrany dwuwarstwowej
   1. Wlać 20 μl roztworu POPC i 4 μl roztworu biotyny-PEG-DSPE do szklanej probówki (używając tego samego składu lipidowego, jaki zastosowano do przygotowania GV w kroku 1.1).
   2. Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aby utworzyć film lipidowy i umieścić tę próbkę w eksykatorze na 1 godzinę w celu całkowitego odparowania rozpuszczalnika organicznego.
   3. Dodać 200 μl 200 mM glukozy w 1x pożywce LB (zewnętrzny wodny roztwór GV) do szklanej fiolki.
   4. Owinąć otwierającą się część szklanej fiolki folią i poddać sonikacji w łaźni ultradźwiękowej (120 W) przez co najmniej 1 godzinę.
   5. Przygotuj SV metodą ekstruzji²¹ za pomocą mini-ekstrudera i membrany poliwęglanowej o wielkości porów 100 nm.
2. Przygotowanie ręcznie robionej komory
   1. Wywierć otwór o średnicy 7 mm za pomocą wydrążonego stempla na dwustronnej uszczelce (10 mm x 10 mm x 1 mm).
   2. Wklej dwustronną uszczelkę z otworem w szkle nakrywkowym (30 mm x 40 mm, grubość 0,25–0,35 mm).
3. Przygotowanie podpartej dwuwarstwowej membrany na szkle nakrywkowym w otworze studzienki
   1. Dodać 30 μl roztworu SV do otworu komory (przygotowanego w ppkt 2.2) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   2. Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.
4. Unieruchomienie GV na podpartej membranie dwuwarstwowej na szkle nakrywkowym w otworze komory
   1. Wprowadzić 10 μl neutrawarydyny z zewnętrznym wodnym roztworem GV (1 mg/ml) do otworu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   2. Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.
   3. Dodać cały roztwór zawierający GV (przygotowany w kroku 1.6.3) do otworu komory i uszczelnić szkłem nakrywkowym (18 mm x 18 mm, grubość 0,13–0,17 mm) (Rysunek 2b).
5. Obserwacja mikroskopowa wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV
   1. Ustaw mikroskopijny system ogrzewania z odwróconym mikroskopem wyposażonym w soczewkę obiektywową o aperturze numerycznej (NA) 40x/0,6 o dużej odległości roboczej (Rysunek 2b).
   2. Umieść komorę na mikroskopijnym systemie ogrzewania stage (Rysunek 2b). Inkubować GV zawierające komórki bakteryjne w komorze w stanie statycznym przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
   3. Rejestruj i rejestruj obrazy mikroskopowe wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV co 30 minut za pomocą naukowej kamery z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS).

Przedstawiamy prostą metodę generowania GV zawierających pojedyncze komórki bakteryjne za pomocą metody transferu kropelek (Rysunek 1). Rysunek 1a pokazuje schematyczny obraz wytrącania się GV zawierających bakterie. Kropelki W/O zawierające bakterie są przenoszone przez granicę faz olej-woda (monowarstwa lipidowa) przez wirowanie w celu utworzenia GV. Różnica w gęstości między sacharozą (wewnętrzny roztwór wodny) a glukozą (zewnętrzny roztwór wodny) również pomaga w przekraczaniu granicy faz olej-woda kropelek W/O. Konieczne jest monitorowanie ciśnienia osmotycznego w wewnętrznym i zewnętrznym roztworze wodnym, ponieważ niewielka różnica w stężeniu między tymi roztworami może wywołać deformację i zapadnięcie się GV. Schemat blokowy przygotowania GV zawierających komórki bakteryjne metodą przenoszenia kropelek jest pokazany na Rysunek 1b. Postępując zgodnie z tą procedurą, można łatwo uzyskać GV zawierające pojedyncze komórki bakteryjne.

Aby zaobserwować wzrost komórek bakteryjnych w GV, skonstruowano oryginalny system hodowli do obserwacji mikroskopowej (Rysunek 2). GV zawierające bakterie zostały unieruchomione na podpartej powierzchni membrany pokrytej neutrawaryną na szkle nakrywkowym (Ryc. 2a). Ta technika unieruchomienia umożliwiła długotrwałą obserwację GV.

Typowe obrazy mikroskopii z kontrastem fazowym różnych rozmiarów GV zawierających pojedyncze komórki bakteryjne są pokazane w Rysunek 3. W tym eksperymencie uzyskaliśmy również GV zawierające komórki bakteryjne o rozmiarach od 10 μm do 30 μm. Rysunek 3 pokazuje wzrost bakterii na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz GV o różnych rozmiarach 10,7 μm ( Rysunek 3a) i 28 μm ( Rysunek 3b). W przypadku obu rozmiarów komórek E. coli komórki E. coli ulegały procesom wydłużania i podziału, przy czym jedna lub dwie komórki E. coli rosły do bardzo dużej liczby komórek w ciągu 6 godzin. W ten sposób komórki E. coli rosły stabilnie wewnątrz GV.

Względna częstość występowania komórek bakteryjnych zawierających określoną liczbę komórek bakteryjnych jest pokazana w Rysunek 4. W naszych warunkach eksperymentalnych (OD600 = 0,01–0,015) komórki bakteryjne otoczono na poziomie pojedynczej komórki w około 10% uzyskanych GV (puste GV wynosiły około 80%). GV zamknięte na poziomie pojedynczej komórki stanowiły około 50% GV zawierających komórki bakteryjne, jak oszacowano na podstawie wstawki Rysunek 4.

Rysunek 1: Procedury eksperymentalne GV zawierających bakterie. a) Schemat GV zawierających bakterie przygotowane metodą przenoszenia kropelkowego. Mikrokropelki bez ciepła zawierające bakterie przechodzą przez jednowarstwowy interfejs lipidowy za pomocą siły odśrodkowej, a następnie tworzą dwuwarstwową błonę lipidową. b) Przebieg syntezy GV zawierających bakterie. (i) Rozpuszczalnik organiczny zawierający lipidy (POPC i biotyna-PEG-DSPE, stosunek molowy 100:0,2). (ii) Folia lipidowa na dnie szklanej fiolki. (iii) Roztwór oleju zawierający lipidy. (iv) Mieszanina 50 μl roztworu oleju i 2 μl wewnętrznego roztworu wodnego (200 mM sacharozy i 1x pożywka LB) zawierającej komórki bakteryjne. (v) Emulgowanie przez ręczne stukanie (ponad 50 razy). (vi) 50 μl zewnętrznego roztworu wodnego (200 mM glukozy w pożywce 1x LB). (vii) Nałożenie 150 μl roztworu oleju na zewnętrzny roztwór wodny. (viii) Nakładanie warstw roztworu kropelek W/O. (ix) Odwirowanie probówki. (x) Wytrącone GV zawierające komórki bakteryjne po aspiracji oleju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: Systemkonserwacji hodowli komórek bakteryjnych wewnątrz GV. (a) GV są unieruchomione na podpartej membranie poprzez wiązanie biotyny i neutrawidyny na szkle nakrywkowym. GV są inkubowane przez system grzewczy. b) Zdjęcie systemu obserwacyjnego wraz z ręcznie wykonaną komorą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Obrazy z mikroskopu z kontrastem fazowym GV zawierających pojedyncze komórki bakteryjne (oznaczone czarnymi strzałkami). Zdjęcia przedstawiające wzrost komórek bakteryjnych w GV o różnych rozmiarach. (a) Rozmiar pęcherzyków = 10,7 μm. (b) Rozmiar pęcherzyków = 28 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza statystyczna liczby zamkniętych w kapsułkach komórek bakteryjnych na GV. Względne częstości GV zostały wykreślone jako histogramy. Wstawka: Powiększenie względnych częstości GV zawierających komórki bakteryjne od pojedynczych do 10< komórek. Łącznie przeanalizowano 235 GV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład i objętości zewnętrznych i wewnętrznych roztworów wodnych GV.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.