Dyfrakcja rentgenowska nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy jako narzędzie do badania strukturalnych podstaw choroby mięśni

Podsumowanie

Przedstawiamy szczegółowe protokoły przeprowadzania eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej pod małym kątem przy użyciu nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy. Dzięki szerokiej dostępności transgenicznych modeli myszy w chorobach ludzkich, ta eksperymentalna platforma może stanowić użyteczne stanowisko testowe do wyjaśnienia strukturalnych podstaw genetycznych chorób mięśni

Streszczenie

Transgeniczne modele myszy były ważnymi narzędziami do badania związku między genotypem a fenotypem w chorobach ludzkich, w tym mięśni szkieletowych. Wykazano, że mięśnie szkieletowe myszy wytwarzają wysokiej jakości wzory dyfrakcji rentgenowskiej na liniach synchrotronowych trzeciej generacji, co daje możliwość powiązania zmian na poziomie genotypu z funkcjonalnymi fenotypami w zdrowiu i chorobie poprzez określenie strukturalnych konsekwencji zmian genetycznych. Przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania próbek, zbierania wzorców rentgenowskich i wyodrębniania odpowiednich parametrów strukturalnych z wzorców rentgenowskich, które mogą pomóc w prowadzeniu eksperymentów chcących przeprowadzić takie eksperymenty dla siebie.

Wprowadzenie

Synchrotronowa dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem jest metodą z wyboru do badania struktury w skali nm aktywnie kurczących się preparatów mięśniowych w warunkach fizjologicznych. Co ważne, informacje strukturalne z żywych lub oskórowanych preparatów mięśniowych można uzyskać w synchronizacji z danymi fizjologicznymi, takimi jak siła mięśni i zmiany długości. Rośnie zainteresowanie zastosowaniem tej techniki do badania strukturalnych podstaw dziedzicznych chorób mięśni, które mają swoje podłoże w mutacjach punktowych w białkach sarkomerowych. Społeczność zajmująca się biofizyką mięśni była bardzo aktywna w tworzeniu transgenicznych modeli myszy dla tych chorób u ludzi, które mogą stanowić idealne stanowiska testowe do badań strukturalnych. Ostatnie publikacje naszej grupy^1,2,3 i inne^4,5 wykazały, że wzorce rentgenowskie z mięśni prostownika długiego palca myszy (EDL) i mięśni płaszczkowatych mogą dostarczyć wszystkich informacji dyfrakcyjnych dostępnych z bardziej tradycyjnych organizmów modelowych, takich jak mięśnie szkieletowe żaby i królika. Zaletą preparatu mięśni szkieletowych myszy jest łatwość preparacji i wykonywania podstawowych eksperymentów fizjologicznych całych mięśni bez naruszonej błony. Wymiary wypreparowanego mięśnia mają wystarczającą masę, aby uzyskać bardzo szczegółowe wzorce mięśni w bardzo krótkich czasach ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie (~milisekundy na klatkę) na liniach rentgenowskich trzeciej generacji.

Wzory dyfrakcji rentgenowskiej mięśni składają się z odbić równikowych, odbić południkowych oraz odbić linii warstwy. Stosunek intensywności równikowej (stosunek intensywności odbić równikowych 1,1 i 1,0, I₁₁/I₁₀) jest ściśle skorelowany z liczbą dołączonych mostków poprzecznych, która jest proporcjonalna do siły generowanej w mięśniach szkieletowych myszy². Odbicia południkowe, które informują o okresowości w obrębie grubych i cienkich włókien, mogą być wykorzystane do oszacowania rozszerzalności włókien^1,3,6,7. Cechy dyfrakcyjne nie znajdujące się na południku i równiku nazywane są liniami warstw, które powstają z w przybliżeniu spiralnie uporządkowanych główek miozyny na powierzchni grubego szkieletu włókien, a także z cienkich włókien w przybliżeniu spiralnie uporządkowanych. Intensywność linii warstw miozyny jest ściśle związana ze stopniem uporządkowania głów miozyny w różnych warunkach^2,8. Wszystkie te informacje można wykorzystać do badania zachowań białek sarkomerowych in situ w zdrowiu i chorobie.

Synchrotronowa dyfrakcja rentgenowska mięśni była historycznie wykonywana przez zespoły wysoce wyspecjalizowanych ekspertów, ale postęp technologiczny i dostępność nowych narzędzi do redukcji danych wskazują, że nie zawsze musi tak być. Linia bioCAT Beamline 18ID w Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory dysponuje dedykowanym personelem i zapleczem pomocniczym do przeprowadzania eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej mięśni, które mogą pomóc nowicjuszom w rozpoczęciu stosowania tych technik. Wielu użytkowników decyduje się na formalną współpracę z personelem BioCAT, ale coraz więcej użytkowników uważa, że mogą samodzielnie przeprowadzać eksperymenty i analizy, zmniejszając obciążenie personelu linii badawczej. Głównym celem tego artykułu jest zapewnienie szkolenia, które dostarczy potencjalnym eksperymentatorom informacji potrzebnych do planowania i przeprowadzania eksperymentów na układzie mięśni szkieletowych myszy na linii badawczej BioCAT lub na innych liniach badawczych o wysokim strumieniu na całym świecie, gdzie takie eksperymenty byłyby możliwe.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentów na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Illinois Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (Protokół 2015-001, data zatwierdzenia: 3 listopada 2015) i były zgodne z NIH "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"⁹.

1. Przygotowanie do eksperymentu

1. Przygotuj 500 ml roztworu Ringera (zawiera: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO₄, 1,0 mM CaCl₂, 10,0 mM HEPES, 11 mM glukozy, pH 7,4) na każdy dzień eksperymentu.
2. Wlej 200 ml roztworu Ringera do butelki ze spryskiwaczem i przechowuj w lodówce o temperaturze 4 °C. Napełnij szalkę Petriego (o średnicy 10 cm) roztworem Ringera i udopełnij ją 100% tlenem, podłączając rurkę z butli tlenowej do kamienia napowietrzającego w akwarium. Szalki Petriego ("szalki preparacyjne") były wcześniej pokryte związkiem elastomerowym, aby umożliwić wprowadzanie szpilek podczas sekcji.
3. Przygotuj metalowe haki montażowe. Wytnij dwa kawałki drutu ze stali nierdzewnej o średnicy 0,5 mm na odpowiednią długość i zegnij drut na obu końcach, aby utworzyć haczyki. Ułóż pod ręką wszystkie narzędzia preparacyjne, nożyczki, kleszcze do wiązania szwów, mikronożyczki do użycia.
   nuta: Część haczykowa powinna mieć około 3 mm długości. Dłuższy przewód (zakończony haczykiem) powinien mieć około 5 cm długości, a krótszy przewód (również zakończony haczykiem) powinien mieć długość około 1 cm, aby pasował do niestandardowych komór stosowanych w BioCAT i pozwalał na wystarczający zakres ruchu ramienia przetwornika.
4. Podłącz i włącz wszystkie urządzenia. Obejmuje to połączony przetwornik silnika/siły, sterownik silnika/przetwornika siły, dwufazowy stymulator prądu o dużej mocy oraz sterowany komputerowo system akwizycji/kontroli danych.
   1. Włącz system akwizycji danych i skalibruj go przed rozpoczęciem eksperymentu¹⁰. W skrócie, kalibracja siły poprzez dodanie zestawu znanych mas, obejmujących do 50% maksymalnej siły mierzonej przez przetwornik siły w przebiegu liniowym, na przetworniku siły i rejestrowanie zmian napięcia wyjściowego. Skalibruj długość, przykładając zestaw znanego napięcia wyjściowego do ramienia dźwigni i zmierz zmianę długości ramienia.
   2. Podłączyć węże z bloku termicznego na uchwycie próbki do chłodzonej łaźni obiegowej i ustawić temperaturę tak, aby utrzymać żądaną temperaturę w komorze w zakresie od 10 °C do 40 °C. Określić to empirycznie z wyprzedzeniem, ustawiając kąpiel obiegową na zakres temperatur i mierząc temperaturę w komorze za pomocą termopary.

2. Przygotowanie mięśni

1. Eutanazja myszy
   1. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
   2. Spryskaj skórę kończyny tylnej zimnym roztworem Ringera, aby zapobiec wdmuchiwaniu włosów do preparatu. Usuń skórę, odcinając ją wokół uda za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i szybko pociągnij skórę w dół za pomocą kleszczy #5, aby odsłonić mięśnie.
   3. Amputuj tylną kończynę i przenieś ją do naczynia preparacyjnego, które zostało wypełnione natlenionym roztworem Ringera, a następnie umieść pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym
   .
2. Przygotowanie mięśnia płaszczkowatego
   1. Przygwoźdź tylną kończynę w dół w naczyniu preparacyjnym z mięśniem brzuchatym łydki skierowanym do góry. Przetnij dystalne ścięgno grupy mięśni brzuchatego łydki / płaszczkowatego i delikatnie i powoli podnieś mięśnie, odcinając powięź po obu stronach mięśnia brzuchatego łydki za pomocą cienkich nożyczek. Odizoluj grupę mięśni brzuchatego łydki/płaszczkowatego od kończyny po uwolnieniu ścięgna bliższego mięśnia płaszczkowatego.
   2. Przypnij grupę mięśni zawierającą mięsień brzuchaty łydki i dystalne ścięgno w naczyniu preparacyjnym. Delikatnie unieś mięsień płaszczkowaty przez ścięgno proksymalne i oddziel go od mięśnia brzuchatego łydki, pozostawiając jak największą część dystalnego ścięgna płaszczkowatego nienaruszoną.
3. Przygotowanie mięśnia prostownika długiego palca (EDL)
   1. Przygnij tylną kończynę w naczyniu preparacyjnym z mięśniem piszczelowym przednim skierowanym do góry. Przetnij powięź wzdłuż mięśnia piszczelowego przedniego (TA) i wyciągnij ją za pomocą kleszczy. Zidentyfikuj i przetnij dystalne ścięgno mięśnia TA. Podnieś mięsień TA i wytnij go ostrożnie, nie ciągnąc za mięsień EDL.
   2. Rozetnij boczną stronę kolana i odsłoń dwa ścięgna. Przetnij ścięgno proksymalne, pozostawiając jak największą część ścięgna nadal przyczepioną do mięśnia, i unieś mięsień EDL (mięsień przyśrodkowy), delikatnie pociągając ścięgno. Przetnij dystalne ścięgno po jego odsłonięciu.
4. Montaż mięśnia
   1. Przypnij mięsień za pomocą ścięgien i przytnij cały dodatkowy tłuszcz, powięź i ścięgno tak bardzo, jak to możliwe. Włóż jedno ścięgno do wcześniej zawiązanego węzła i mocno zawiąż szew kleszczykami do wiązania szwów. Zawiąż drugi węzeł wokół metalowego haczyka.
   2. Powtórz tę samą procedurę z długim hakiem na drugim końcu ścięgna. Upewnij się, że szwy nie stykają się z żadną częścią mięśnia. Spowoduje to uszkodzenie preparatu.
   3. Przymocuj krótki hak do dna komory doświadczalnej, a długi hak do przetwornika/silnika dwumodowego. Roztwór bąbelkować w komorze doświadczalnej 100% tlenem.
5. Optymalizacja protokołów stymulacji i długości mięśni
   1. Rozciągnij mięsień, regulując mikromanipulatory przymocowane do przetwornika/silnika, aby wygenerować napięcie wyjściowe między 15 a 20 mN przed znalezieniem najlepszych parametrów bodźca. Ustaw napięcie stymulacji na 40 V. Prąd stymulacji jest systematycznie zwiększany, aż do momentu, gdy nie nastąpi dodatkowy wzrost siły drgania. Najwyższy znaleziony prąd jest zwiększany o około 50%, aby zapewnić ponadmaksymalną aktywację.
   2. Znajdź optymalną długość, L₀, zdefiniowaną jako długość mięśnia, która daje maksymalną siłę skurczu, zwiększając długość mięśnia i aktywując mięsień pojedynczym skurczem, aż siła czynna (siła szczytowa minus siła podstawowa) przestanie rosnąć.
   3. Wykonaj krótki skurcz tężcowy (aktywacja 1 s), aby przetestować mocowanie i w razie potrzeby rozciągnąć mięsień z powrotem do optymalnej siły wyjściowej. Zapisz długość mięśnia w mm za pomocą suwmiarki cyfrowej.

3. Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego

UWAGA: Poniższy opis dotyczy eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej przeprowadzonych przy użyciu instrumentu dyfrakcji rentgenowskiej o małym kącie nachylenia na linii badawczej BioCAT 18ID w Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, ale podobne metody mogą być stosowane na innych liniach badawczych, takich jak ID 02 w ESRF (Francja) i BL40XU w SPring8 (Japonia). Linia 18ID pracuje ze stałą energią wiązki promieniowania rentgenowskiego 12 keV (długość fali 0,1033 nm) ze strumieniem padającym ~10¹³ fotonów na sekundę w pełnej wiązce.

1. Wybierz odległość próbki od detektora (długość kamery). Użyj kamery o długości 1,8 m do eksperymentów badających odbicia aktyny 2,7 nm i miozyny wysokiego rzędu, takie jak odbicia południkowe 2,8 nm. Do innych eksperymentów należy używać kamery o długości 4-6 m, w których interesują nas przede wszystkim drobne szczegóły na liniach południka i warstw
2. Optymalizacja położenia próbki w wiązce
   1. Określ pozycję wiązki za pomocą kawałka papieru wrażliwego na promieniowanie rentgenowskie, który wytwarza ciemną plamę w odpowiedzi na promieniowanie rentgenowskie ("oparzenie"). Następnie użyj generatora krzyżyka wideo, aby utworzyć celownik wyrównany ze znakiem wypalenia na papierze lub po prostu zaznacz na ekranie wideo markerem.
   2. Użyj graficznego interfejsu użytkownika dostarczonego przez BioCAT do pozycjonera próbki, aby przesunąć mięsień, który ma być wyśrodkowany w pozycji wiązki. Oscyluj komorą próbki z prędkością ~10-20 mm / s, przesuwając stolik na próbkę w celu rozprowadzenia dawki promieniowania rentgenowskiego po mięśniu podczas ekspozycji. Obserwuj próbkę podczas jej ruchu, aby uniknąć dużych obszarów powięzi (zawiera kolagen, który zanieczyszcza wzory dyfrakcyjne) i upewnić się, że pozostaje oświetlona podczas całej drogi jej przemieszczania się.
      nuta: Dokładne kroki wymagane w sekcjach 3.3 i 3.4 w celu dokonania wymaganych ustawień i działań przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika dostarczonego przez linię badawczą będą specyficzne dla linii badawczej i detektora. Zapytaj obsługę linii, jak wykonać te operacje.
3. Konfiguracja detektora CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem) dla wzorców o wysokiej rozdzielczości z mięśni w zdefiniowanych stanach statycznych (spoczynek lub podczas skurczu izometrycznego)
   1. Ustaw czas ekspozycji i okres ekspozycji w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania sterującego. Zrób ciemne zdjęcie tła przed wykonaniem ekspozycji i powtarzaj tę procedurę co 2 godziny lub po zmianie czasu ekspozycji, aby skorygować wszelkie odchylenia w elektronice odczytu detektora.
   2. Osłabij wiązkę promieniowania rentgenowskiego do żądanej wartości dla ekspozycji. Następnie zrób zdjęcie. Nie jest możliwe wykonywanie sekwencji obrazów za pomocą tego detektora. Detektor CCD potrzebuje również kilku sekund na odczytanie pojedynczego obrazu.
4. Konfigurowanie detektora matryc pikseli na potrzeby eksperymentu z rozdzielczością czasową
   1. Ustaw liczbę obrazów, czas ekspozycji, okres ekspozycji w graficznym interfejsie użytkownika. Zastosowany tutaj detektor pixel array potrzebuje co najmniej 1 ms na odczyt. Maksymalna częstotliwość ramki dla detektora zliczającego fotony wynosi 500 Hz. Użyj sygnału wyjściowego detektora zliczającego fotony, aby sterować migawką rentgenowską.
   2. Osłabij wiązkę do pożądanej intensywności. Uzbrój detektor i poczekaj na wyzwolenie z systemu akwizycji danych. Synchronizuj dane mechaniczne i rentgenowskie, wyzwalając je w tym samym czasie. Wzorce promieniowania rentgenowskiego są zbierane w sposób ciągły przez cały protokół a z czasem ekspozycji 1 ms i okresem ekspozycji 2 ms.
      nuta: Dokładny czas ekspozycji i okres ekspozycji powinny być ustalane indywidualnie dla każdego przypadku dla pożądanych informacji i obserwowanego czasu życia próbki w wiązce. Stłumić wiązkę, aby nie używać więcej wiązki promieniowania rentgenowskiego niż jest to potrzebne do dostarczenia danych możliwych do analizy w wybranym okresie ekspozycji.

4. Leczenie mięśni po eksperymencie

1. Odzyskaj i zważ mięsień po każdym eksperymencie mechanicznym i rentgenowskim. Oblicz pole przekroju poprzecznego mięśnia, korzystając z zmierzonej długości mięśnia i masy mięśniowej¹¹, przyjmując gęstość mięśni 1,06 g/mL¹².
2. Rozciągnij mięsień do eksperymentalnej długości i umocuj mięsień w 10% formalinie przez 10 minut. Podziel utrwalony mięsień na szereg wiązek włókien wybranych z miejsc w całym przekroju mięśnia³.
3. Zmierz długość sarkomeru za pomocą systemu pomiaru długości sarkomeru wideo.

Wyniki

Izometryczny skurcz tężcowy. Każdy rodzaj klasycznego eksperymentu mechanicznego mięśni, takiego jak skurcze izometryczne lub izotoniczne, może być wykonany z jednoczesnym pozyskiwaniem wzorców rentgenowskich. Rysunek 1A pokazuje konfigurację eksperymentalną dla eksperymentów mechanicznych i rentgenowskich. Przykładowy ślad siły dla izometrycznego skurczu tężcowego jest pokazany w Rysunek 1B. Mięsień był utrzymywany w spoczynku przez 0,5 s, a następnie aktywowany przez 1 s. Zapis mechaniczny zatrzymuje się po 1 s od bodźca. Wzorce promieniowania rentgenowskiego były zbierane w sposób ciągły przez cały protokół przy czasie ekspozycji 1 ms przy 500 Hz.

Wzory dyfrakcji rentgenowskiej. Wzór dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego mięśni może dostarczyć informacji strukturalnych o rozdzielczości nanometrowej ze struktur wewnątrz sarkomeru. Wzory dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego mięśni składają się z czterech równoważnych kwadrantów podzielonych równikiem i południkiem. Wzór równikowy powstaje w wyniku upakowania miofilamentów w sarkomerze prostopadłym do osi włókien, podczas gdy wzory południkowe przekazują informacje strukturalne z miofilamentów wzdłuż osi mięśni. Pozostałe odbicia nie znajdujące się na równiku ani południku nazywane są liniami warstw. Linie warstw (np. cechy oznaczone MLL4 i ALL6 w Rysunek 2A) powstają w wyniku przybliżonego spiralnego układu podjednostek molekularnych w miozynie zawierającej grube włókna i aktynie zawierającej cienkie włókna. Linie warstwowe oparte na miozynie są silne i ostre we wzorach od mięśni spoczynkowych (Rysunek 2A), podczas gdy linie warstw oparte na aktynie są bardziej widoczne we wzorcach z kurczących się mięśni ( Rysunek 2B). Wzorce różnic uzyskane przez odjęcie wzorca spoczynkowego od wzorca skurczu (Rysunek 2C) mogą rzucić światło na zmiany strukturalne podczas rozwoju siły w zdrowych i chorych mięśniach. Śledząc te zmiany strukturalne w milisekundowej skali czasowej zdarzeń molekularnych podczas skurczu mięśni, wzory dyfrakcji rentgenowskiej mogą ujawnić istotne informacje strukturalne (Rysunek 2D).

Analiza danych za pomocą MuscleX. Oto przykład analizy odbić równikowych przy użyciu procedury "równikowej" w pakiecie MuscleX (Rysunek 3). MuscleX to pakiet oprogramowania analitycznego o otwartym kodzie źródłowym opracowany pod adresem BioCAT¹³. Równikowy współczynnik intensywności (I_1,1/I_1,0) jest wskaźnikiem bliskości miozyny do aktyny w mięśniach spoczynkowych (Rysunek 3A), podczas gdy jest ściśle skorelowany z liczbą przyczepionych mostków poprzecznych w skurczu ( Rysunek 3B) mysi mięsień szkieletowy ². Współczynnik intensywności, I_1,1/I_1,0, wynosi około 0,47 w mięśniach spoczynkowych i około 1,2 w mięśniach kurczących się. Odległość między dwoma odbiciami 1,0 (2*S_1,0) jest odwrotnie proporcjonalna do odstępu między włóknami. Szczegółowa dokumentacja i instrukcje obsługi MuscleX są dostępne online¹³.

Rysunek 1: Konfiguracja i protokół eksperymentu mechanicznego i rentgenowskiego. (A) Mięsień jest zamontowany na jednym końcu do haka wewnątrz komory doświadczalnej, a na drugim końcu do dwutrybowego przetwornika silnika/siły. Jest trzymany między dwoma oknami z folii kaptonowej, aby umożliwić przejście promieni rentgenowskich. Komora jest wypełniona roztworem Ringera przesyconym 100% tlenem przez cały czas trwania eksperymentu. (B) Mechaniczny protokół eksperymentów rentgenowskich na mięśniu podczas skurczu tężca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wzory dyfrakcji rentgenowskiej EDL. Wzór dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego mięśni EDL z mięśnia spoczynkowego (A) i kurczącego się (B). (C) Wzorzec różnicy między wzorcem spoczynku a wzorcem kurczenia się. Niebieski obszar oznacza wysoką intensywność wzorca spoczynku, podczas gdy żółty obszar reprezentuje wysoką intensywność wzorca kurczenia się. (D) Wzór dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego z ekspozycji 1 ms z mięśniem EDL. MLL1 = linia warstwy miozyny pierwszego rzędu; MLL4 = linia warstwy miozyny czwartego rzędu; ALL1 = linia warstwy aktyny pierwszego rzędu ALL6 = linia warstwy aktyny szóstego rzędu; ALL7 = linia warstwy aktyny siódmego rzędu; Tm = odbicie tropomiozyny (oznaczone białą ramką); M3 = odbicie południkowe trzeciego rzędu; M6 = odbicie południkowe szóstego rzędu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza danych wzorców równikowych za pomocą MuscleX. Odjęty profil współczynnika intensywności równikowej (podczas obszaru) i pierwszych pięciu rzędów (zielone linie) nadawały się do obliczenia intensywności każdego szczytu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ostatnie publikacje naszej grupy wykazały, że wzorce rentgenowskie z mięśni szkieletowych myszy mogą być wykorzystane do rzucenia światła na sarkomeryczną informację strukturalną z mięśni w zdrowiu i chorobie ^1,2,3, zwłaszcza przy zwiększonej dostępności genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy dla różnych miopatii. Badania mechaniczne w wysokiej rozdzielczości pojedynczych włókien lub małych wiązek w połączeniu z dyfrakcją promieniowania rentgenowskiego najlepiej wykonują eksperci. Jeśli jednak do Twoich celów wystarczą skromniejsze informacje mechaniczne, całe przygotowanie mięśni pozwala na zebranie szczegółowych wzorów rentgenowskich z prostego preparatu.

Czysta sekcja jest kluczem do udanego połączonego eksperymentu mechanicznego i rentgenowskiego. Bardzo ważne jest, aby podczas rozwarstwiania nie ciągnąć za mięsień docelowy, a także innych mięśni związanych z mięśniami płaszczkowatymi lub EDL, ponieważ może to rozerwać części mięśnia i prowadzić do zmniejszenia siły. Może to również prowadzić do uszkodzenia struktury wewnętrznej, która spowoduje degradację wzorców promieniowania rentgenowskiego. Ponieważ wszystko rozproszy się w wiązce promieniowania rentgenowskiego, ważne jest, aby usunąć nadmiar tłuszczu, kolagen w powięzi, a także wszelkie włosy lub luźne kawałki tkanki podczas wykonywania poniższego protokołu. Aby zmniejszyć dodatkową podatność w przygotowaniu mięśni, ważne jest również, aby bezpiecznie przywiązać ścięgna do haków, jak najbliżej ciała mięśnia, nie uszkadzając go.

Różne czasy ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie mogą dostarczać różnego rodzaju informacji z tego samego mięśnia. Korzystając z wiązki światła pełnego na 18ID, można uzyskać możliwy do analizy wzór równikowy w ciągu 1 ms ekspozycji (patrz rysunek 2D). W przypadku możliwego do analizy odbicia linii pierwszej warstwy miozyny zwykle wymagany jest całkowity czas ekspozycji wynoszący 10 ms. Aby zebrać odbicia południkowe wyższego rzędu, takie jak M15 (odbicie południkowe miozyny 2,8 nm) i odbicie południkowe aktyny 2,7 nm, zazwyczaj wymagana jest całkowita ekspozycja wynosząca co najmniej 1 s, ale w przypadku pomiarów o wysokiej dokładności zaleca się całkowitą ekspozycję większą niż 2 s.

Ważny jest wybór optymalnego detektora promieniowania rentgenowskiego do eksperymentu. W przypadku najbardziej szczegółowych wzorców promieniowania rentgenowskiego niestandardowy detektor CCD, taki jak ten w BioCAT z pikselami ok. 40 μm i funkcjami rozproszenia punktowego ~65 μm w luminoforze, może zapewnić wzorce o wysokim zakresie dynamiki i dobrej rozdzielczości przestrzennej, ale może rejestrować tylko jedną klatkę na raz. W przypadku eksperymentów z rozdzielczością czasową, detektor matrycy pikselowej zliczający fotony w BioCAT może zbierać wzorce promieniowania rentgenowskiego przy 500 Hz. Rozmiar piksela 172 μm w tym detektorze nie zapewnia jednak wystarczającej rozdzielczości przestrzennej do szczegółowych badań wewnętrznej części południka, ale jest wystarczający do większości innych celów. BioCAT nabył detektor zliczający fotony o wysokiej rozdzielczości, zapewniający rzeczywistą rozdzielczość 75 μm przy maksymalnej częstotliwości odświeżania 9 000 Hz. Oczekuje się, że podobne detektory tego typu zastąpią obecne detektory do badań mięśni w ciągu najbliższych kilku lat.

Przy bardzo wysokich strumieniach promieniowania rentgenowskiego w synchrotronach trzeciej generacji, uszkodzenia spowodowane promieniowaniem są poważnym problemem. Zawsze dobrym wyborem jest tłumienie wiązki, aby nie dostarczać więcej wiązki niż jest to potrzebne do obserwacji pożądanych cech dyfrakcyjnych. Taką samą całkowitą ekspozycję na promieniowanie rentgenowskie można osiągnąć, wydłużając czas ekspozycji z wiązki tłumionej. Zaletą detektorów pikselowych zliczających fotony jest to, że poszczególne klatki można sumować ze sobą bez utraty szumów. Nawet wtedy możliwe jest uszkodzenie przez promieniowanie. Oznaki uszkodzenia popromiennego obejmują spadek maksymalnej siły skurczu, rozmazywanie odbić linii warstwy, a nawet zmianę koloru mięśni.

Jednym z ograniczeń preparatu nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy jest trudność w uzyskaniu długości sarkomeru z nienaruszonego mięśnia podczas eksperymentów. Mięśnie są zbyt grube do mikroskopii wideo i dyfrakcji laserowej. Podczas gdy w przyszłości możliwe będzie oszacowanie długości sarkomeru bezpośrednio na podstawie wzorów dyfrakcyjnych¹⁴, w najbliższym czasie jedyną opcją jest zmierzenie jej po eksperymencie, jak opisano tutaj.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#5 kleszczyki	WPI	500342
/0 szew chirurgiczny	Braintree Sci	SUT-S 108
Kamień napowietrzający do akwarium	uxcell		zwykły kamień napowietrzający ze sklepu zoologicznego byłby w porządku
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Detektor CCD	Rayonix Inc	MAR 165 Dane CCD
system akwizycji	Aurora Scientific Inc	610A
Związek elastomerowy	Dow Corning	Sylgard 184
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Detektor zliczania fotonów o wysokiej rozdzielczości	Dectris Inc	EIGER X 500K
Dwufazowy stymulator prądu o dużej mocy	Aurora Scientific Inc	701
Nożyczki do irysa	WPI	501263-G
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Mikro nożycowy	WPI	503365
Przetwornik siły/siły	Aurora Scientific Inc	300C-LR
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
szalka Petriego	Sigma-Aldrich	CLS430167
Detektor zliczania fotonów	Dectris Inc	Pilatus 3 1M
	McMaster-carr	8908K21
Kleszcze do wiązania szwów	WPI	504498
System pomiaru długości sarkomeru wideo	Aurora Scientific Inc	900 mld