Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+ poprzez sekwencyjną konwersję doN2O

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59562

⸱

7 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

W tym artykule

Podsumowanie

Szczegółowo przedstawiono szereg metod do określania potencjalnego wskaźnika DNRA na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+. NH4+ jest przekształcany wN2Ow kilku etapach i analizowany za pomocą kwadrupolowej chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Streszczenie

Znaczenie zrozumienia losu azotanu (NO3−), który jest dominującym gatunkiem N przeniesionym z ekosystemów lądowych do wodnych, wzrasta, ponieważ globalne ładunki azotu dramatycznie wzrosły po industrializacji. Dysymilacyjna redukcja azotanów do amonu (DNRA) i denitryfikacja to procesy mikrobiologiczne, które wykorzystują NO3− do oddychania. W porównaniu z denitryfikacją, ilościowe oznaczenia aktywności DNRA przeprowadzono jedynie w ograniczonym zakresie. Doprowadziło to do niewystarczającego zrozumienia znaczenia DNRA w przemianach NO3− i czynników regulujących ten proces. Celem artykułu jest przedstawienie szczegółowej procedury pomiaru potencjalnego wskaźnika DNRA w próbkach środowiskowych. Krótko mówiąc, potencjalną szybkość DNRA można obliczyć na podstawie szybkości akumulacji 15znakowanych N amonu (15NH4+) w inkubacji 15NO3−. Oznaczanie 14stężeńNH4+ i 15NH4+ opisanych w niniejszej pracy składa się z następujących etapów. Najpierw NH4+ w próbce jest ekstrahowany i zatrzymywany na zakwaszonym szklanym filtrze jako sól amonowa. Po drugie, uwięziony amon jest eluowany i utleniany do NO3− poprzez utlenianie nadsiarczanu. Po trzecie, NO3− jest przekształcany wN2Oza pomocą denitryfikatora z niedoboremN2O. Na koniec przekształcony N2O jest analizowany przy użyciu wcześniej opracowanego systemu kwadrupolowej chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Zastosowaliśmy tę metodę do solnych osadów bagiennych i obliczyliśmy ich potencjalne wskaźniki DNRA, wykazując, że proponowane procedury pozwalają na proste i szybsze określenie w porównaniu z poprzednio opisanymi metodami.

Wprowadzenie

Sztuczna synteza nawozu azotowego i jego powszechne stosowanie znacznie zakłóciły globalny obieg azotu. Szacuje się, że transfer reaktywnego azotu z systemów lądowych do przybrzeżnych podwoił się od czasów przedindustrialnych1. Znaczna część nawozów stosowanych na danym polu jest wypłukiwana z gleby do rzek lub wód gruntowych, przede wszystkim jako NO3− 2. Może to powodować problemy środowiskowe, takie jak zanieczyszczenie wody pitnej, eutrofizacja i powstawanie niedotlenienia. NO3− w środowisku wodnym jest usuwany lub zatrzymywany w ekosystemie poprzez asymilację biologiczną i różne procesy dysymilacji mikrobiologicznej. Wiadomo, że denitryfikacja i anammox są głównymi procesami usuwania mikrobiologicznego NO3−. Denitryfikacja to mikrobiologiczna redukcja NO3− do gazowych produktów N (NO,N2OiN2) w połączeniu z utlenianiem donora elektronów, takiego jak substancje organiczne, zmniejszając w ten sposób ryzyko wystąpienia wyżej wymienionych problemów. Anammox wytwarza również N2 z NO2− i NH4+; w związku z tym usuwa nieorganiczny N z ekosystemu. I odwrotnie, DNRA działa na rzecz zatrzymania N w ekosystemie; ogólnie przyjmuje się, że DNRA jest wykonywana głównie przez bakterie fermentatywne lub bakterie chemolitoautotroficzne i że redukują one dysymilacyjny NO3− do biodostępnego i mniej mobilnegoNH4+.

Badania nad DNRA były głównie prowadzone w ekosystemach morskich lub ujściach rzek, takich jak osady oceaniczne lub ujścia rzek oraz woda, słona lub słonawa gleba bagienna i gleba namorzynowa. Ekosystemy przybrzeżne lub morskie są ważne jako rezerwuary do usuwania NO3− z ekosystemów lądowych, a w poprzednich badaniach wykazano, że DNRA przyczynia się do bardzo szerokiego zakresu usuwania NO3− (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Co więcej, istnienie DNRA zostało zademonstrowane w szerokim zakresie środowisk, w tym w środowiskach słodkowodnych19, glebach ryżowych20 i glebach leśnych21. Chociaż badania te wykazały, że DNRA jest potencjalnie porównywalna z denitryfikacją w celu usunięcia NO3−, badania mierzące aktywność DNRA są nadal bardzo ograniczone w porównaniu z tymi, które mierzą denitryfikację.

Wskaźnik DNRA został oceniony przy użyciu 15technik znakowania N w połączeniu z analizą danych za pomocą modeli analitycznych lub numerycznych. Jedno z rozwiązań analitycznych do obliczania wskaźnika DNRA opiera się na wzroście wzbogacenia puli NH4+ w 15N po dodaniu 15NO3− jako znacznika. 15Znakowany N NO3− dodaje się do próbki i inkubuje, a następnie można obliczyć szybkość DNRA na podstawie zmian stężenia i stosunku izotopów w NH4+ przed i po pewnym czasie. W artykule szczegółowo opisano metodę ilościowego oznaczania stężenia NH4+ i stosunku izotopów, które są wymagane do obliczenia wskaźnika DNRA. Zasadniczo, opisana tutaj metoda jest kombinacją kilku wcześniej zgłoszonych technik22,23,24,25,26 z dodanymi modyfikacjami niektórych procedur. Metoda składa się z szeregu pięciu procedur składowych: (1) inkubacja próbki środowiskowej ze zmianą znacznika stabilnego izotopu, 15NO3−, (2) ekstrakcja i odzysk NH4+ przy użyciu "procedury dyfuzji" z modyfikacjami, (3) utlenianie nadsiarczanu NH4+ w próbce, składającej się z rodzimych NH4+ i 15NH4+ pochodzących z 15NO3− poprzez aktywność DNRA, do NO3− i 15NO3−, (4) późniejsza mikrobiologiczna transformacja izotopomerów NO3− i 15NO3− doN2O metodą zmodyfikowanego denitryfikatora oraz (5) oznaczanie ilościowe N2Izotopomery O przy użyciu chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC/MS). W następnej sekcji najpierw opisano przygotowanie do zabiegów (2) i (4), a następnie szczegółowo opisano wszystkie pięć procedur składowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie otoczki z PTFE do ilościowego wychwytywania gazowego NH3

  1. Umieść 60-milimetrowy kawałek taśmy politetrafluoroetylenowej (PTFE) (o szerokości 25 mm) na małym arkuszu folii aluminiowej (o wymiarach około 300 mm x 450 mm, przetartym etanolem).
  2. Popielić filtr z włókna szklanego (o średnicy 10 mm i wielkości porów 2,7 μm) w temperaturze 450 °C przez 4 godziny w piecu muflowym. Umieść filtr z włókna szklanego nieco powyżej punktu środkowego dłuższej osi taśmy (Rysunek 1a).
  3. Umieść 20 μl 0,9 mol/L H2SO4 na środku filtra GF/D i natychmiast złóż taśmę PTFE za pomocą dwóch pęset: pęsety z płaskim końcem i pęsety z prostym końcem. Poniższe kroki, kroki 1.4–1.7, są pokazane w Rysunek 1 i powinny być wykonane szybko.
  4. Odwróć taśmę PTFE na filtr GF/D na przerywaną linię pokazaną na Rysunek 1a, aby utworzyć kształt pokazany na Rysunek 1b.
  5. Uszczelnij obie strony, składając, a następnie mocno dociskając krawędź pęsetą (Rysunek 1c). Nie naciskaj zbyt mocno i nie rysuj taśmy PTFE.
  6. Złóż otwarty koniec pęsetą, a następnie dociśnij krawędź pęsetą (Rysunek 1d).
  7. Uszczelnij otwarty koniec, mocno dociskając krawędź pęsetą (Rysunek 1e). Podczas tej procedury nie należy wciskać filtra GF/D.

2. Przygotowanie biomasy denitryfikatora z niedoborem reduktazy podtlenku azotu, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, do metody denitryfikatora

  1. Umieść 20% zapas glicerolu Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 na płytkach agarowych z bulionu sojowego tryptonu (TSB) o sile 1/4. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 2–3 dni.
  2. Przenieść pojedynczą kolonię P. chlororaphis do małej probówki zawierającej 5 ml autoklawowanej pożywki TSB i hodować ją tlenowo (bez wstrząsania) przez jeden dzień w temperaturze 25 °C w ciemności, aż do uzyskania maksymalnego wzrostu; zostanie ona wykorzystana jako hodowla wstępna.
  3. Przenieść 3 ml kultury wstępnej do 1-litrowej butelki z korkiem z gumy silikonowej, zawierającej 1 l świeżo przygotowanego, autoklawowanego, zmodyfikowanego TSB uzupełnionego 10 mmol/L KNO323. Inkubować butelkę, mieszając przy użyciu mieszadła, w ciemnych warunkach w temperaturze 25 °C. Po uprawie przez 8 godzin zastąp korek z gumy silikonowej nakrętką i szczelnie zamknij. Kontynuuj uprawę w anoksji przez noc.
  4. Odwirować kulturę przy 18 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek biomasy.
  5. Przemyć upakowaną biomasę trzykrotnie 30 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (D-PBS(-), pH 7,5), aby całkowicie wyeliminować NO3−. Warunki wirowania są takie same jak w kroku 2.3.
  6. Po umyciu ponownie zawiesić upakowaną biomasę za pomocą 30 ml D-PBS(-). Użyj 1 ml zawiesiny, aby oznaczyć gęstość komórek, mierząc OD600. Odpipetować 1 ml podwielokrotności pozostałej zawiesiny do sterylnych kriowiali zawierających 0,8 ml 45% glicerolu. Przygotowane zapasy glicerolu należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (patrz punkt 6).

3. Eliminacja tlenu, azotynów i azotanów z osadu próbki

  1. Zważyć 3,0 g (mokra masa) osadu do szklanej fiolki o pojemności 20 ml i dodać 9,0 ml wody powierzchniowej w celu zawieszenia (25% w/w zawiesiny).
  2. Zamknąć fiolkę czarnym korkiem z gumy butylowej (umytym wodą jonowymienną i wysterylizowanym w autoklawie) i aluminiowym wieczkiem.
  3. Oczyść zawieszenie i wymień powietrze w przestrzeni nad głową na Ar (>99,99%) w ilości 0,6 l/min przez 20 minut za pomocą kolektora.
  4. Zastąp gaz Ar headspace ultraczystym (>99,99995%) He, odkurzając przez 90 s i ładując He przez 30 s. Powtórz tę procedurę cztery razy. Ustaw ciśnienie gazu w przestrzeni nad głową na 1.5 atm.
  5. Inkubować fiolki w temperaturze 20 °C przez noc z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min w ciemności przy użyciu wytrząsarki o stałej temperaturze w celu wyeliminowania pozostałego tlenu, azotanów i azotynów w zawiesinie osadu i gazie w przestrzeni nadbrzeżnej.

4. Eksperyment z kursem czasowym do określenia wskaźnika DNRA

  1. Zastąp gaz w przestrzeni nadprożowej świeżym, ultraczystym He, stosując tę samą procedurę, co w kroku 3.5, ale bez czterech powtórzeń.
  2. Dodać oznakowane i nieoznakowane substraty do każdej fiolki zgodnie z Tabelą 1 przez korek z gumy butylowej za pomocą gazoszczelnej strzykawki. Przedtem przygotowane roztwory substratów należy przepłukać szklanymi fiolkami o odpowiedniej wielkości za pomocą ultra-czystego He przy ciśnieniu przestrzeni nad głową ustawionym na 1,5 atm, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza. Należy unikać niezamierzonego wstrzyknięcia jakiejkolwiek ilości powietrza podczas zabiegów wstrzykiwania.
  3. Inkubować fiolki w temperaturze 20 °C, wytrząsając z prędkością 150 obr./min. Dodać substraty do każdej fiolki zgodnie z tabelą 1 i inkubować przez 1 h, 3 h i 5 h. Po zatrzymaniu inkubacji zawiesinę osadu w fiolkach należy poddać następującym procedurom: kroki 4.4–4.9.
  4. Zdjąć aluminiowe wieczko i korek z gumy butylowej z każdej fiolki. Następnie dodać KCl (spopielany w temperaturze 450 °C przez 4 godziny) do zawiesiny osadu do końcowego stężenia około 2 mol/l, aby zapewnić odzyskanie NH4+ z osadu. Zamknąć fiolki korkiem z gumy butylowej i aluminiowym zamknięciem.
  5. Potrząsać osadem z prędkością 150 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemnych warunkach, aby wyekstrahować NH4+.
  6. Przenieść całą zawiesinę osadu z fiolki do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Wypłucz wewnętrzną ściankę świeżo otwartej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml i przymocuj ją do świeżo otwartego jednorazowego filtra membranowego z octanu celulozy (wielkość porów 0,22 μm, średnica 25 mm). Następnie przepłukać filtr membranowy 1 ml supernatantu. Umieść przepłukaną strzykawkę-filtr na 20-mililitrowej butelce polipropylenowej (PP) z szerokim otworem.
  8. Przefiltrować pozostały supernatant przez filtr membranowy octanowy do butelki PP o pojemności 20 ml. Przechowywać ekstrakty ekstraktów w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.

5. Wychwytywanie rozproszonego NH4+ w 2M H2SO4 absorbowanego przez filtr GF/D w powłoce PTFE i utlenianie nadsiarczanu NH4+ do NO3−

  1. Przygotować roztwory wzorcowe 14NH4Cl o gradientach stężeń 0 μmol/l, 10 μmol/l, 40 μmol/l, 100 μmol/l, 200 μmol/l, 400 μmol/l i 500 μmol/l. Do analizy stosunku 15N ustalić całkowite stężenie NH4+ na 200 μmol/l i przygotować proporcje izotopów 100:0, 99,5:0,5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 i 10:90 z czystymi roztworami wzorcowymi 14NH4Cl i 15NH4Cl.
  2. Przenieść 30 mg MgO (spopielanej w temperaturze 450 °C przez 4 godziny) do szklanej fiolki o pojemności 20 ml i umieścić w niej powłokę z PTFE.
  3. Przenieść 5 ml próbki lub wzorca do fiolki zawierającej MgO i powłokę PTFE i natychmiast zamknąć szarym korkiem z gumy butylowej. Uszczelka z aluminiową nasadką. Jeżeli oczekuje się, że stężenie NH4+ przekroczy 500 μmol/l, rozcieńczyć próbkę do poziomu poniżej 500 μmol/l.
  4. Potrząsać fiolkami z prędkością 150 obr./min przez 3 godziny w temperaturze 4 °C w ciemnych warunkach.
  5. Zdejmij aluminiową nasadkę i korek z gumy butylowej. Wyjmij kopertę z PTFE z fiolki za pomocą pęsety z końcówką punktową, dokładnie wypłucz kopertę i pęsetę wodą jonowymienną, przetrzyj je papierem do wycierania, a następnie umieść kopertę na świeżym papierze do wycierania.
  6. Otwórz kopertę z PTFE za pomocą pęsety (zaleca się użycie zarówno pęsety z płaską, jak i spiczastą końcówką) dokładnie w odwrotnej kolejności niż składanie wykonane w krokach 1.4–1.7.
  7. Przytrzymaj peryferyjny obszar filtra GF/D, w którym H2SO4 ma być niewchłonięty, pęsetą z płaskim końcem i przenieś ją do 11-mililitrowej probówki z nakrętką z nakrętką z nasadką wyłożoną PTFE. Opłucz pęsetę wodą jonowymienną i przetrzyj je papierem do wycierania.
  8. Powtórz kroki 5.5–5.7 dla pozostałych kopert.
  9. Dodaj 1 ml wody jonowymiennej do każdej z probówek, zamknij nakrętkę i utrzymuj ją bez wstrząsania przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, aby całkowicie wymyć NH4+ z filtra GF/D. Na tym etapie wykonaj równolegle kolejny krok (krok 5.10).
  10. Przygotuj odczynnik do roztworu utleniającego nadsiarczany (POR)25,26.
    1. Ponieważ nie można go przechowywać, należy przygotować dokładną ilość POR potrzebną do obróbki próbek w ciągu jednego dnia.
    2. Aby przygotować POR do traktowania 50 próbek, wlej 100 ml wody jonowymiennej do butelki z zakrętką o pojemności 200 ml i dodaj 1,52 g NaOH (stopień analizy związków azotu), 3 g kwasu borowego i 5 g K2S2O8 (stopień analizy azotu i fosforu) w tej kolejności. Natychmiast po dodaniu każdego odczynnika wstrząsać roztworem, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Jeśli to konieczne, namocz butelkę w ciepłej wodzie, aby pomóc w rozpuszczeniu chemikaliów; należy jednak zwrócić uwagę na zanieczyszczenie NO3−, ponieważ woda z kranu zwykle zawiera NO3−.
  11. Po kroku 5.8 otwórz nakrętkę, dodaj 2 ml odczynnika POR do probówki i szczelnie zamknij probówkę nakrętką, aby zapobiec stratom lub zanieczyszczeniu podczas kolejnych kroków.
  12. Postaw probówki na stojaku, zawiń je w dwuwarstwową folię aluminiową i sterylizuj w autoklawie przez 1 godzinę w temperaturze 121 °C. Podczas tego etapu utrzymuj probówki w pozycji pionowej i unikaj gwałtownych zmian temperatury po zakończeniu autoklawowania.

6. Oznaczanie NO3− przekształconego z NH4+ metodą denitryfikacyjną przy użyciu kwadrupola GC/MS

  1. Wymieszaj 100 ml sterylnego buforu fosforanowego 40 mmol/l (pH 7,2) i 100 ml sterylnej glukozy 30 mmol/l w asepcie (20 mmol/l fosforanu i 15 mmol/l glukozy; końcowy).
  2. Dodać 1/7,2 objętości glicerolu P. chlororaphis do 200 ml buforowanego fosforanem roztworu glukozy w 300-mililitrowej kolbie Erlenmeyera i przeczywać ultraczystym strumieniem He (>99,995%) przez 1 godzinę.
  3. Dozować 2,0 ml zawiesiny denitryfikatora do każdej fiolki o pojemności 5 ml. Zakręć fiolki szarym korkiem z gumy butylowej i aluminiowym zamknięciem.
  4. Zastąp powietrze w przestrzeni nad głową ultra czystym He, odkurzając przez 3 minuty i ładując He przez 1 minutę. Ustaw dodatnie ciśnienie gazu w przestrzeni nad głową na 1.3 atm, aby uniknąć niezamierzonego zanieczyszczenia powietrza.
  5. Wstrzyknąć 1 ml próbki lub wzorca przez korek z gumy butylowej za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml. Zanotuj dokładną ilość faktycznie wstrzykniętej próbki.
  6. Fiolki należy inkubować przez noc w temperaturze 25 °C w ciemności.
  7. Wstrzyknąć 0,3 ml 6-mol/LL NaOH, aby zatrzymać denitryfikację i wchłonąć CO2 w przestrzeni nadpowierzchniowej, co w przeciwnym razie poważnie zakłóci analizęN2Ometodą GC/MS, ponieważCO2 iN2Omają tę samą masę cząsteczkową.
  8. Określić ilości 44N2O, 45N2O i 46N2O w gazie w przestrzeni nad powierzchnią za pomocą kwadrupola GC/MS ze zmodyfikowanym portem wtrysku25. Warunki pracy stosowane do analizy GC/MS przedstawiono w tabeli 2.

7. Analiza danych

  1. Wyprowadzić krzywą kalibracyjną dla stężenia NH4+ z liniowej zależności między znanym stężeniem 14NH4+ a zmierzonymi intensywnościami sygnału całkowitego wytworzonego 44N2O + 45N2O + 46N2O. Wyprowadzić krzywą kalibracyjną dla zawartości 15N z liniowej zależności między znanym atomem % (tj. 15N/14N+15N) i obliczony atom% przy użyciu wcześniej podanego równania27. Obliczyć stężenie 15NH4+, mnożąc całkowity NH4+ przez stosunek 15N NH4+.
  2. Oblicz potencjalną szybkość DNRA, korzystając z równań podanych w innym miejscu28,29,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszej pracy uzyskano w eksperymentach z wykorzystaniem znacznika 15N w osadach solnisk. Próbkowane solnisko zostało utworzone po trzęsieniu ziemi w Wielkim Wschodnim Japonii w 2011 roku w obszarze Moune w mieście Kesen-numa w prefekturze Miyagi w Japonii. We wrześniu 2017 roku pobrano osady powierzchniowe (0–3 cm) z dwóch stanowisk w strefach subtidalnej i intertidalnej. Najpierw, bezpośrednio po pobraniu, osad przesiano przez sito o ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stężenie i stosunek izotopów NH4+ do analizy DNRA określono ilościowo przy użyciu kilku metod. Stężenia i stosunki izotopów NH4+ są na ogół mierzone oddzielnie. Stężenie NH4 + jest zwykle mierzone metodami kolorymetrycznymi, w tym autoanalizatorem 4,10,15,16,17. Pomiar stosunku izotopów ma duże ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Naoto Tanace za pomoc w zbieraniu danych i rozwijaniu protokołu. Pobranie próbek zostało wsparte przez JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
Butelka PP 20 mlSANPLATEC61-3210-18Nakrętka
aluminiowaszerokokątna Maruemu1307-13nr 20, z otworem
KwasborowyWako021-02195
WirówkaHITACHIHimac CR21G II
Ciśnienie i ciśnienie gazu odtlenionego Wymień wtryskiwaczSANSIN INDUSTRIALIP-12
Jednorazowy filtr membranowy z octanu celulozyADVANTEC25CS020ASWielkość porów 0,22 i mikro; m, średnica 25 mm
Strzykawka jednorazowaTermoSS-10SZ10 mL
Strzykawka jednorazowaTermoSS-01T1 ml
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Strzykawka gazoszczelnaVICI Valco Instruments4075-15010Seria A-2, 100 i mikro; L
GC/MSshimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-010o średnicy 10 mm Szklana
fiolkaMaruemu0501-0620 mL
Szary korek z gumy butylowejMaruemu1306-03No.20-S
H2SO4Wako192-04696Gwarantowany odczynnik
K2S2O8Wako169-11891Klasa do analizy azotu i fosforu
KClWako163-03545Gwarantowany odczynnik
KNO3Wako160-04035Gwarantowany odczynnik
NaOHWako191-08625Klasa analizy związków azotu
NH4ClWako017-02995Gwarantowany odczynnik
Plastikowa probówka wirówkowaASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Liofilizowany, typ szczepu Pseudomonas aureofaciens
Taśma uszczelniająca PTFESigma-Aldrich Z221880szerokości 25 mm
Wytrząsarka posuwisto-zwrotnaTAITEC0000207-000NR-10
Probówka z nakrętkąIWAKI84-025211 ml
Nasadka wyłożona PTFE do probówkiIWAKI84-0262
Tryptyczny bulion sojowyDifco Laboratories211825

Bibliografia

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419(2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338(2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830(2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460(2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164(2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar szybko ci procesu DNRAakumulacja amonuutlenianie nadsiarczanemkonwersja N2Okwadrupolowy GC MSosady s onawych mokradeledzenie izotopowepr bki rodowiskowe
Pomiar potencjalnych szybkości dysymilacyjnej redukcji azotanów do amonu na podstawie 14analiz NH4+/15NH4+ poprzez sekwencyjną konwersję doN2O
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.