Artykuł metodologiczny

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

DOI:

10.3791/59567

⸱

7 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, Clinicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 2Cancer and Translational Medicine Research Unit, University of Oulu, 3Medical Research Center, Oulu University Horspital, 4Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwuwymiarowe testy oparte na hodowli komórkowych są powszechnie stosowane w badaniach nad rakiem in vitro. Brakuje im jednak kilku podstawowych elementów, które tworzą mikrośrodowisko guza. Aby uzyskać bardziej wiarygodne wyniki in vitro, wprowadzono kilka trójwymiarowych (3D) testów hodowli komórkowych. Testy te umożliwiają komórkom rakowym interakcję z macierzą zewnątrzkomórkową. Ta interakcja wpływa na zachowanie komórek, takie jak proliferacja i inwazja, a także na morfologię komórki. Ponadto interakcja ta może indukować lub hamować ekspresję kilku cząsteczek pro- i przeciwnowotworowych. Test inwazji sferoidalnej został opracowany w celu zapewnienia odpowiedniej metody 3D in vitro do badania inwazji komórek rakowych. Obecnie matryce pochodzenia zwierzęcego, takie jak matryca pochodząca z mięsaka myszy (MSDM) i kolagen typu I z ogona szczura, są głównie stosowane w testach inwazji sferoidów. Biorąc pod uwagę różnice między mikrośrodowiskiem ludzkiego guza a matrycami pochodzącymi od zwierząt, opracowano macierz pochodzącą z mięśniaka ludzkiego (HMDM) z łagodnej tkanki mięśniaka gładkokomórkowego macicy. Wykazano, że HMDM indukuje migrację i inwazję komórek rakowych lepiej niż MSDM. Protokół ten zapewnił prosty, powtarzalny i niezawodny test inwazji sferoidalnej 3D na podstawie ludzkiego guza przy użyciu macierzy HMDM/fibryny. Zawiera również szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania i analizy. Sferoidy rosną w ultra niskiej płytce mocującej w kształcie litery U w matrycy HMDM/fibryny i przenikają przez nią. Inwazja jest codziennie obrazowana, mierzona i analizowana za pomocą oprogramowania ilastik i Fiji ImageJ. Platformę testową zademonstrowano przy użyciu linii komórkowych ludzkiego pierwotnego i przerzutowego raka płaskonabłonkowego krtani. Jednak protokół jest odpowiedni również dla innych linich litych komórek rakowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne dwuwymiarowe (2D) badania nad hodowlą komórek znacząco przyczyniły się do badań nad rakiem. Obecnie naukowcy skłaniają się ku trójwymiarowym (3D) testom hodowli komórkowych, aby lepiej naśladować warunki in vivo1. Hodowla komórek nowotworowych 3D dokładniej odzwierciedla złożone mikrośrodowisko guza pod względem interakcji komórka-komórka i komórka-macierz, profili ekspresji genów, wrażliwości leku i aktywności szlaku sygnałowego2,3.

W badaniach nad rakiem wykorzystuje się kilka modeli hodowli komórek 3D, takich jak eksplantacja tkanki nowotworowej, guz na chipie i sferoidy guza wielokomórkowego3,4. Sferoidy wielokomórkowe guzów są obecnie szeroko stosowane, ponieważ naśladują kilka cech warunków in vivo w ludzkich nowotworach1,5. Gdy średnica sferoidy jest większa niż 500 μm, ma nawet obszary niedotlenione i nekrotyczne centrum, reprezentujące w ten sposób sytuację guza in vivo2.

Wiele syntetycznych (np. polidimetylosiloksan) i zwierzęcych (np. kolagen z ogona szczura typu I i matryca pochodząca z mięsaka myszy, Matrigel, określana jako MSDM) zostało opracowanych do testów hodowli komórkowych 3D3,6,7,8. Do tej pory żadna z dostępnych na rynku matryc nie pochodziła z ludzkiej tkanki nowotworowej. W związku z tym brakuje im cech mikrośrodowiska ludzkiego nowotworu, które ma znaczący wpływ na procesy inwazji komórek nowotworowych8.

Myogel (matryca pochodząca z ludzkiego mięśniaka, określana jako HMDM) jest pobierana z tkanki guza mięśniaka gładkokomórkowego ludzkiej macicy9. Wykazano, że zawartość białka w HMDM różni się znacznie od zawartości MSDM. W rzeczywistości 66% białek HMDM różni się od białek MSDM. Z drugiej strony, niektóre białka, takie jak lamina, kolagen typu IV, proteoglikany siarczanu heparanu, nidoken i naskórkowy czynnik wzrostu, są obecne w obu matrycach10. Dodatkowo mysz różni się od człowieka zawartością enzymów, przy czym ludzie mają o 78 mniej proteaz niż myszy11.

Fibryna jest powszechnie stosowana samodzielnie lub w połączeniu z innymi materiałami jako materiał na rusztowania12. W testach hodowli komórkowych 3D dostępny na rynku ludzki fibrynogen i trombinę są łączone w celu utworzenia hydrożelu fibrynowego12.

Ten protokół opisuje ulepszenie wcześniej wprowadzonego testu 3D na inwazję sferoidów nowotworów7. Ten nowy protokół stosuje macierz pochodzącą z ludzkiego guza zamiast macierzy nowotworowej pochodzącej od myszy. Obejmuje również techniki obrazowania i analizy z wykorzystaniem oprogramowania ilastik i Fiji ImageJ. Protokół ten może być wykorzystany do oznaczania sferoidalnego kilku różnych litych linii komórek rakowych. Jest to biologicznie istotne narzędzie do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych oraz do badania wpływu określonych cząsteczek na inwazję komórek nowotworowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie sferoidów wielokomórkowych nowotworów

UWAGA: Protokół jest tutaj zademonstrowany z liniami komórkowymi UT-SCC-42A i -42B, ale może być również zastosowany przy użyciu innych linii komórkowych.

  1. Przemyć komórki UT-SCC-42A i -42B 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), dodać 0,05% trypsyny-EDTA (3 ml na kolbę o długości 75cm2) i umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) na 2-5 minut.
  2. Sprawdź, czy komórki odłączyły się pod mikroskopem. Następnie dodać kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco (DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 250 ng/ml amfoterycyny B, 0,4 μg/ml hydrokortyzonu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego) w celu zneutralizowania enzymu (6 ml na kolbę o długości 75 cm2) i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Wybierz pożywkę do hodowli komórkowych, która pasuje do badanych komórek.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut.
  4. Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 2-5 ml kompletnego DMEM.
  5. Policz komórki i rozcieńcz zawiesinę komórek kompletnym DMEM do końcowego stężenia 20 000 komórek/ml.
    nuta: Dla każdej linii komórkowej należy określić optymalną liczbę komórek.
  6. Dozować 50 μl zawiesiny komórek do każdej 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie o bardzo niskim nasadce, aby uzyskać końcowe stężenie 1,000 komórek na studzienkę.
  7. Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). Cztery dni później wizualnie potwierdź tworzenie sferoidów guza za pomocą odwróconego mikroskopu i kontynuuj test. Upewnij się, że na studzienkę przypada tylko jeden sferoid.
    nuta: Czas potrzebny do utworzenia sferoidy różni się w zależności od różnych linii komórkowych.

2. Trójwymiarowy test inwazji sferoidów

UWAGA: Przygotuj 2x roztwór, ponieważ żel zostanie rozcieńczony w stosunku 1:1 po dodaniu do studzienek.

  1. Rozmrozić HMDM na lodzie i roztworze podstawowym fibrynogenu w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Nie należy zakłócać działania fibrynogenu, dopóki nie zostanie całkowicie rozpuszczony i nie umieszczać roztworu na lodzie; wystąpią opady.
  2. Wymieszaj ze sobą odpowiednią objętość każdego odczynnika: 1 mg/ml HMDM (stężenie końcowe: 0,5 mg/ml), 0,6 U/ml trombiny (stężenie końcowe: 0,3 U/ml), 66,6 mg/ml aprotyniny (stężenie końcowe: 33,3 ug/ml) i 1 mg/ml fibrynogenu (stężenie końcowe: 0,5 mg/ml).
    nuta: Dodaj fibrynogen tuż przed dozowaniem mieszaniny do studzienek i pracuj szybko; W ciągu kilku minut utworzy żel. Traktuj tylko kilka studzienek na raz.
  3. Do każdej studzienki dodać 50 μl żelu. Skieruj końcówkę w stronę wewnętrznej ścianki studzienki i powoli pipetuj. Unikaj pęcherzyków powietrza (stosując technikę odwróconego pipetowania) i staraj się nie przesuwać sferoidy ze środka studni.
  4. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozwól matrycy HMDM/fibryny zestalić się przez 30 minut, a następnie delikatnie dodaj 100 μl kompletnego DMEM do każdej studzienki na wierzchu żelu.

3. Obrazowanie

  1. Codziennie obrazuj sferoidy za pomocą mikroskopu światła odwróconego. Alternatywnie można skorzystać z automatycznych systemów obrazowania.

4. Segmentacja obrazów za pomocą Ilastik

  1. Otwórz ilastik i wybierz przepływ pracy Pixel Classification (Rysunek 1A). Klasyfikuje piksele na podstawie adnotacji dokonanych przez użytkownika. Zapisz projekt ilastik (.ilp) na komputerze.
  2. Dodawanie obrazów do analiz. Kliknij Dane wejściowe i Dodaj nowy, a następnie wybierz obrazy (Rysunek 1B).
  3. Aby wybrać obiekt, kliknij Wybór funkcji i wybierz cechy (Rysunek 1C, czerwony prostokąt).
    UWAGA: Wybrane funkcje powinny z grubsza odpowiadać właściwościom wizualnym, które oddzielają obiekty od tła i będą używane do trenowania klasyfikatora.
    1. Wybierz obiekty, klikając odpowiednie pola. Wybrane pola zmienią kolor na zielony (Rysunek 1C, niebieski prostokąt).
      nuta: Tutaj użytkownik może wybierać spośród kilku różnych typów obiektów i skal. Kolor/Intensywność należy wybrać w celu oddzielenia obiektów na podstawie koloru lub jasności. Krawędź powinna być wybrana w celu oddzielenia obiektów na podstawie jasności lub gradientów kolorów. Tekstura jest ważną cechą, jeśli obiekty na obrazie mają specjalny wygląd tekstury. Do tego testu używany jest kolor/intensywność (sigma 0) i krawędź (sigma 6).
  4. W przypadku treningu kliknij Szkolenie, a w sekcji Szkolenie znajdują się dwie etykiety: Etykieta 1 i Etykieta 2 (Rysunek 1D, czerwony prostokąt). Jeśli jest tylko jedna etykieta, dodaj nową etykietę, naciskając Dodaj etykietę (Rysunek 1D, niebieski prostokąt).
    1. Zaznacz tło jedną z etykiet (Rysunek 1D, żółty), a komórki drugą etykietą (Rysunek 1D, niebieski).
    2. Przetrenuj oprogramowanie dla pierwszych 10% obrazów. Wybierz następny obraz z bieżącego widoku.
    3. Po zaznaczeniu komórek i tła (pierwszego obrazu) naciśnij Live Update (Rysunek 1D, fioletowy prostokąt).
      UWAGA: Przy następnym obrazie ilastik automatycznie przeprowadzi analizę zgodnie z poprzednimi obrazami.
  5. Po zakończeniu trenowania i przeanalizowaniu wszystkich obrazów przez ilastik kliknij przycisk Prediction Export (Eksport przewidywania). Wybierz prostą segmentację ze źródła; Nie wybieraj prawdopodobieństwa ani niczego innego (Rysunek 1E).
  6. Wybierz żądany format pliku wyjściowego z Wybierz ustawienia eksportu obrazu... w sekcji Eksport przewidywania (Rysunek 1E). Wyeksportuj wyniki etykietowania, klikając Eksportuj wszystko (Rysunek 1F). Pliki zostaną wyeksportowane do tego samego folderu z oryginalnymi obrazami.
    UWAGA: W tym eksperymencie używany jest format .h5.

5. Analiza obszaru za pomocą Fiji ImageJ

  1. Ustawienie skali
    1. Otwórz oryginalny obraz z paskiem skali w Fiji ImageJ (Rysunek 2A). Upewnij się, że obraz ma taki sam rozmiar i wymiar jak analizowane obrazy. Użyj narzędzia Zaznaczanie linii, aby narysować linię o znanej długości (Rysunek 2B).
      nuta: Ten protokół jest wykonywany przy użyciu Fiji ImageJ 1.51 (64-bit) i ilastik -1.3.2rc.
    2. Kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę (Rysunek 2C). Ustaw znaną odległość w polu Znana odległość i ustaw odpowiednią jednostkę, a następnie kliknij Globalny (Rysunek 2D).
  2. Instalowanie makra
    1. Jeśli wtyczka ilastik nie jest zainstalowana, wykonaj następujące kroki: kliknij Pomoc, Aktualizuj.... W otwartym oknie ImageJ Updater kliknij Zarządzaj witrynami aktualizacji. W otwartym oknie Manage Update Sites (Zarządzaj witrynami aktualizacji) kliknij obok pozycji ilastik, a następnie kliknij przycisk Zamknij. Następnie kliknij Zastosuj zmiany w oknie ImageJ Updater. Ten proces może zająć trochę czasu. Następnym oknem będą Informacje z tekstem Zaktualizowano pomyślnie. Kliknij przycisk OK i uruchom ponownie program ImageJ.
    2. Kliknij Wtyczki, makra i instalacja (Rysunek 3A). Następnie wybierz plik counter.ijm (patrz Informacje dodatkowe) i kliknij przycisk Otwórz.
      nuta: Makro zostało napisane specjalnie do pomiaru powierzchni. Makro powinno być instalowane za każdym razem, gdy oprogramowanie jest otwierane.
  3. Analiza obszaru
    1. Analizuj obrazy, gdy wszystkie wtyczki są zainstalowane. Kliknij Wtyczki i przewiń w dół do ilastik (Rysunek 3C). Wybierz Importuj HDF5, wybierz plik w formacie .h5, kliknij Otwórz i załaduj i zastosuj LUT (Rysunek 3C,D).
    2. Naciśnij przycisk a na klawiaturze (makro), a obszar pojawi się w oknie Podsumowanie jako Całkowity obszar (Rysunek 3E).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cztery dni po wysiewie komórek UT-SCC-42B (linia komórkowa SCC z przerzutami krtani), matryca (HMDM/fibryna, MSDM lub kolagen) została dodana do utworzonych sferoid (dzień 0) i inwazja była monitorowana przez trzy dni. Obrazy tutaj były uzyskiwane codziennie przy użyciu odwróconego mikroskopu (Ryc. 4).

Po osadzeniu, komórki w matrycy HMDM/fibryny zaczęły szybko atakować po jednym dniu i rozszerzyły się do matrycy (Rysunek 4A). Komórki w MSDM nie wnikały w otaczającą matrycę, zamiast tego tworząc asymetryczną strukturę (Rysunek 4B). Z drugiej strony, komórki w kolagenie nieznacznie się zainfiltrowały, ale ze względu na kurczenie się matrycy analiza była trudna (Rysunek 4C). W niektórych studzienkach kolagenowych sferoidy zniknęły nawet po trzech dniach (Ryc. 4C).

Rysunek 5 ilustruje kwantyfikację inwazji komórek w HMDM/fibrynie pierwotnej linii komórkowej SCC krtani UT-SCC-42A i odpowiadającej jej przerzutowej linii komórkowej UT-SCC-42B. Film (film 1) wykonany przy użyciu systemu analizy żywych komórek sferoidy HMDM/fibryny pokazuje ruch komórek SCC w macierzy, gdzie tworzą one nici, a następnie inne komórki.

figure-results-1
Rysunek 1: Segmentacja obrazu. Wybrane kroki segmentacji obrazu za pomocą ilastik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ustawienie skali. Wybrane kroki ustawiania skali za pomocą Fiji ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza inwazji za pomocą ImageJ. Wybrane etapy analizy obrazu z wykorzystaniem Fiji ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Inwazja komórek UT-SCC-42B w trzech różnych matrycach. Reprezentatywne obrazy inwazji komórek SCC w sferoidach 3D. Inwazję obserwowano przez trzy dni, a zdjęcia wykonywano codziennie przy użyciu odwróconego mikroskopu. (A) HMDM/fibryna, (B) MSDM, (C) kolagen. Ostatnia kolumna stanowi wyjaśnienie inwazji dnia 3. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Kwantyfikacja inwazji komórek SCC w HMDM/fibrynie. Pierwotną inwazję linii komórkowej SCC UT-SCC-42A krtani pierwotnej i odpowiadającą jej inwazję linii komórkowej SCC UT-SCC-42B krtani z przerzutami analizowano przy użyciu oprogramowania ilastik i Fiji ImageJ. Wyniki reprezentują średnią ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów, każdy w trzech egzemplarzach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Wideo 1: Ruch komórek SCC w HMDM/fibrynie przez trzy dni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda zapewnia test 3D oparty na ludzkim guzie w celu oceny inwazyjności komórek nowotworowych w matrycy naśladującej mikrośrodowisko ludzkiego guza. Inwazję komórek rakowych można łatwo zmierzyć poprzez codzienne obrazowanie za pomocą standardowego mikroskopu oraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Metoda ta demonstruje inwazję komórek, a nie tylko ich proliferację.

W przeciwieństwie do MSDM, matryca HMDM/fibryna nie wymaga żadnej kontroli temperatury. Ta metoda jest łatwa do wykonania, w szczególności bez konieczności przenoszenia sferoid z jednej płytki na drugą. Ma tylko jeden technicznie wrażliwy krok, dodanie fibrynogenu do matrycy. Ponieważ fibrynogen zaczyna żelować po kilku minutach, dodanie fibrynogenu wymaga solidnego pipetowania i leczenia tylko kilkoma studzienkami na raz. Istnieje również ryzyko zakłócenia sferoidy i przesunięcia jej z centralnego położenia w studzience w kształcie litery U, jeśli pipetowanie odbywa się pod wysokim ciśnieniem. Zwichnięcie sferoidy może skomplikować obrazowanie i ostatecznie analizę.

Test można modyfikować poprzez zmianę stężenia HMDM lub fibrynogenu. Komórki można również utrwalać i barwić do kolejnych badań molekularnych. Mimo że metodę tę można zmodyfikować do w pełni zautomatyzowanej formy, można ją również przeprowadzić za pomocą zwykłego mikroskopu i dwóch programów open source, bez konieczności stosowania kosztownego sprzętu.

W porównaniu z tradycyjnymi testami 3D opartymi na MSDM, ten test może wykazywać lepsze właściwości inwazji komórek. Sferoidy hodowane w macierzy bogatej w lamininę zawierającej błonę podstawną, takie jak MSDM, mogą mieć większą proliferację komórek rakowych niż rzeczywista inwazja, co czyni je nieodpowiednimi do testów inwazji w kilku liniach komórek rakowych ze względu na ich niską zdolność inwazyjną. Inna często stosowana matryca, kolagen typu I, ma tendencję do kurczenia się od krawędzi podczas uprawy 3D, co wpływa na lokalizację sferoidów i obrazowanie studzienek. Ponadto wykazano różnice między wewnętrznymi właściwościami inwazyjnymi linii komórkowych agresywnego raka języka więcej (HSC-3) i mniej (SCC-25) przy użyciu modeli naśladujących mikrośrodowisko ludzkiego guza (krążki mięśniaka i jego rozpuszczalna forma macierzy)10,13.

Test jest również bardziej etyczny niż stosowanie MSDM, ponieważ HMDM jest ekstrahowany z pozostałości ludzkiego guza mięśniaka gładkokomórkowego. Obecnie HMDM jest jedynym dostępnym produktem ECM pochodzącym z ludzkiego nowotworu, który wydaje się być odpowiedni do wielu testów in vitro związanych z rakiem 8,10. W przyszłości matryce pochodzące z tkanek zwierzęcych mogą zostać zastąpione matrycami opartymi na ludzkich nowotworach, aby zmniejszyć potrzebę poświęcania zwierząt w celu produkcji matrycy.

Zastąpienie testów hodowli komórkowych 2D metodami 3D zapewnia dokładniejsze informacje na temat zachowania komórek nowotworowych. Obecnie istnieje kilka modeli 3D i komercyjnych matryc, ale niestety żaden nie jest odpowiedni dla wszystkich linii komórek rakowych. Badacze powinni wybrać najbardziej odpowiednią matrycę dla swojego konkretnego testu. Optymalne dopasowanie testu i matrycy może być wyzwaniem, ale może znacznie zwiększyć wiarygodność wyników.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują fundatorom tego badania: Fundacji Sigrid Jusélius, Fińskie Towarzystwo Walki z Rakiem oraz fundusze badawcze Centralnego Szpitala Uniwersytetu w Helsinkach. Autorzy dziękują Zakładowi Obrazowania Biomedicum na Uniwersytecie w Helsinkach za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór amfoterycyny BMerckA2942
Aprotynina z płuc bydlęcychMerckA6279Zmierz stężenie białka przed użyciem.
Kwas askorbinowyApplichemA1052
Kolby poddane hodowli komórkowej BioLiteThermo Scientific130190
DMEM/F-12Gibco firmy Life Technologies31330-038
Aparat cyfrowy DS-Fi2Nikon Instruments
DS-U3 Kontroler aparatu cyfrowegoNikon Instruments
Eclipse TS100 Mikroskop odwróconyNikon Instrumenty
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco firmy Life Technologies10270106Ciepło dezaktywować przez 30 minut w temperaturze 56 &; C w łaźni wodnej przed użyciem.
Fibrynogen, zubożone w plazminogen, osocze ludzkieMerck341578Rozpuszczalność: 25 mg/ml w H2O. Ogrzej H2O i fibrynogen do 37 ° C przed rozwiązaniem. Nie przeszkadzać, dopóki fibrynogen nie zostanie całkowicie rozpuszczony. Roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -70 stopni C należy rozmrażać w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C.
Fiji ImageJ 1.51 program do przetwarzania obrazówFreeware, NIH
HydrokortyzonMerckH0888
Ilastik oprogramowanie do klasyfikacji i segmentacji obrazówFreeware
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis SystemEssen BioScience
MyogelLab made
Penicylina-StreptomycynaGibco firmy Life Technologies15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Laboratoryjnie wyprodukowane
Licznik komórek Scepter 2.0MerckPHCC20040
Scepter Czujniki licznika komórek, 60 i mikro; mMerckPHCC60050
Trombina z ludzkiego osoczaMerckT6884-100UN
Trypsyna-EDTA (0,5%) 10x, bez czerwieni fenolowejGibco firmy Life Technologies15400054
96-dołkowa płytka Ultra-Low AttachmentLinie
UT-SCC-42A i UT-SCC-42-BLinie komórkowe zostały założone na Oddziale Otorynolaryngologii-Chirurgii Głowy i Szyi Szpitala Uniwersyteckiego w Turku (Turku, Finlandia).
komórkowe Corning 7007

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., et al. Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo. Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).
  2. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).
  4. Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport. Nature Communications. 4, 2718(2013).
  5. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).
  6. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).
  7. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. Journal of Visualized Experiments. (99), e52686(2015).
  8. Salo, T., et al. A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies. BMC Cancer. 15, 981(2015).
  9. Nurmenniemi, S., et al. A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment. The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).
  10. Salo, T., et al. Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482(2018).
  11. Overall, C. M., Blobel, C. P. In search of partners: linking extracellular proteases to substrates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).
  12. Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).
  13. Hoornstra, D., et al. Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin. In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Macierz guza ludzkiegotr jwymiarowa hodowla kom rekmacierz pochodz ca z mi niakael fibrynowyanaliza Ilastikoprogramowanie ImageJinwazja kom rek nowotworowychultra niska adhezjaobrazowanie ywych kom rek

Powiązane artykuły