Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59570

⸱

8 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Streszczenie

Transfekcja komórek, niezbędna dla wielu badań biologicznych, wymaga kontrolowania wielu parametrów dla dokładnego i udanego osiągnięcia. Najczęściej wykonywana przy niskiej przepustowości, jest ponadto czasochłonna i podatna na błędy, tym bardziej w przypadku multipleksowania kilku plazmidów. Opracowaliśmy łatwą, szybką i dokładną metodę transfekcji komórek w układzie płytek 384-dołkowych przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel (ADE). Nanodozownik zastosowany w tym badaniu jest oparty na tej technologii i umożliwia precyzyjne dostarczanie nanoobjętości z dużą prędkością z płytki dołka źródłowego do płytki docelowej. Może dozować i multipleksować DNA i odczynnik do transfekcji zgodnie z wcześniej zaprojektowanym arkuszem kalkulacyjnym. Poniżej przedstawiamy optymalny protokół do wykonywania wysokoprzepustowej transfekcji plazmidowej opartej na ADE, który umożliwia osiągnięcie skuteczności do 90% i prawie 100% kotransfekcji w eksperymentach kotransfekcji. Rozszerzamy początkowe prace, proponując przyjazne dla użytkownika makro oparte na arkuszu kalkulacyjnym, które jest w stanie zarządzać maksymalnie czterema plazmidami/studzienkami z biblioteki zawierającej do 1536 różnych plazmidów, oraz aplikację do pipetowania opartą na tabletkach. Makro projektuje niezbędne szablony płytek źródłowych i generuje gotowe do użycia pliki dla nanodyspensera i aplikacji na tablety. Czteroetapowy protokół transfekcji obejmuje i) dozowanie rozcieńczalnika za pomocą klasycznego płynu, ii) dystrybucję plazmidu i multipleksowanie, iii) dozowanie odczynnika do transfekcji za pomocą nanodozownika oraz iv) posiewanie komórek na wstępnie napełnionych studzienkach. Opisana programowa kontrola multipleksowania i transfekcji plazmidów ADE pozwala nawet laikom w tej dziedzinie na wykonanie niezawodnej transfekcji komórek w szybki i bezpieczny sposób. Metoda ta umożliwia szybką identyfikację optymalnych ustawień dla danego typu ogniwa i może być transponowana do metod na większą skalę i ręcznych. Protokół ułatwia zastosowania, takie jak ekspresja ludzkiego białka ORFeome (zestaw otwartych ramek odczytu [ORF] w genomie) lub walidacja funkcji genów w oparciu o CRISPR-Cas9, w niezbiorczych strategiach przesiewowych.

Wprowadzenie

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu szczegółowo opisuje sposób przeprowadzania multipleksowania plazmidowego DNA oraz transfekcji w komórkach ssaków w wysokiej przepustowości przy użyciu akustycznego nanodozownika cieczy w płytce 384-dołkowej, dostępny nawet dla osób niebędących specjalistami w tej dziedzinie. Ta niedawno opublikowana metoda1 pozwala na przeprowadzenie do 384 niezależnych warunków multipleksowania i transfekcji plazmidowego DNA w jednym eksperymencie w czasie krótszym niż 1 h. Eksperymenty z transfekcją pojedynczą lub kotransfekcją zakończyły się sukcesem, osiągając niemal 10% kotransfekcji w populacji komórek transfekowanych. Niniejszy protokół ułatwia transfekcję, ponieważ większość żmudnych, czasochłonnych i podatnych na błędy etapów jest obecnie sterowana programowo (ogólny przegląd przedstawiono na Rysunku 1). Podjęto dalsze starania w celu opracowania dedykowanych narzędzi, które zwiększą łatwość obsługi, unikając błędów ludzkich podczas całego procesu i promując udaną transfekcję nawet w przypadku osób niebędących specjalistami w tej dziedzinie. Opisany protokół zawiera opracowany przez nas „przyjazny dla użytkownika” arkusz kalkulacyjny z makrem, który służy do zarządzania 384 niezależnymi warunkami transfekcji z możliwością multipleksowania do czterech plazmidów w każdym dołku. Makro automatycznie generuje szablony płytki (płytek) źródłowych w celu pobrania oczekiwanej objętości plazmidu DNA z roztworów stokowych oraz pliki niezbędne do sterowania oprogramowaniem nanodozownika na podstawie wprowadzonych założeń eksperymentalnych. Ponieważ ręczne dozowanie DNA do 384-dołkowej płytki źródłowej jest żmudne i podatne na błędy, opracowaliśmy również dedykowaną aplikację tabletową, która prowadzi użytkownika podczas dozowania roztworu DNA zgodnie z szablonem.

Schemat procesu projektowania eksperymentu: generowanie list wyboru, przygotowanie płytek, etapy transfekcji.
Rysunek 1: Schemat badawczy. Schematyczny przedstawienie optymalnego zautomatyzowanego protokołu wysokoprzepustowej transfekcji odwrotnej (od projektu eksperymentalnego do niestandardowego testu biologicznego). Kroki wykonywane ręcznie są oznaczone symbolem dłoni, a przybliżony czas każdego etapu zapisano w czerwonej ramce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wiele eksperymentów opartych na komórkach rozpoczyna się od transfekcji plazmidowego DNA, a mimo że opracowano i wciąż opracowuje się wiele dedykowanych odczynników w celu zwiększenia wydajności transfekcji i/lub ułatwienia procedury, wiele kwestii pozostaje do rozwiązania2,3,4. Transfekcja komórek plazmidowym DNA składa się z kilku etapów niezbędnych do osiągnięcia wysokiej wydajności, takich jak początkowe pobranie kompleksu, ucieczka z endosomów oraz transport cytoplazmatyczny do jądra5,6. Oprócz wytrącania wapniowego lub technik fizycznych, takich jak elektroporacja czy mikroiniekcja przy użyciu specjalistycznych urządzeń7, nowoczesne metody chemiczne koncentrują się na zwiększeniu dostarczania DNA do komórek przy jednoczesnym obniżeniu cytotoksyczności8,9. Zastosowanie lipidów lub polimerów kationowych tworzących kompleksy przypominające liposomy, a w ostatnim czasie nie-liposomalnych polimerowych systemów chemicznych, uczyniło transfekcję łatwiejszą i bardziej wydajną10. Pomimo tych postępów, transfekcja komórek nadal wymaga specyficznych umiejętności, aby została przeprowadzona dokładnie, ponieważ większość tych fizycznych lub chemicznych protokołów transfekcji wymaga od naukowców ręcznego przygotowania każdego warunku reakcji transfekcji DNA, co ogranicza przepustowość. Aby rozwiązać ten problem, opracowano protokoły transfekcji odwróconej z wykorzystaniem chemicznych odczynników do transfekcji1,12,13, co pozwala użytkownikowi na szybsze testowanie lub łączenie kilku plazmidów. W protokołach tych kompleksy kwasów nukleinowych z odczynnikami do transfekcji są tworzone przed wysianiem komórek na te kompleksy. Jednak protokoły odwrócone są nadal ograniczone przez ręczne manipulowanie roztworami DNA oraz konieczność łączenia każdego z niezależnych warunków. Choć możliwe jest ich przeprowadzenie w formacie płytki 96-dołkowej, przygotowanie i dozowanie DNA jest żmudne i prawdopodobnie dojdzie do błędów. Gdy wymagane są różne ilości kilku plazmidów DNA i są one ze sobą multipleksowane, transfekcja komórek staje się jeszcze trudniejsza do osiągnięcia i bardziej czasochłonna, a błędy ludzkie stają się niemal nieuniknione. Skalowanie do formatu płytki 384-dołkowej w podejściu transfekcji odwróconej, mimo niewielkiej liczby multipleksowanych warunków transfekcji DNA, staje się wyzwaniem niemożliwym do pokonania z następujących powodów: i) ilości DNA, odczynnika do transfekcji lub objętości mieszaniny reakcyjnej do zarządzania są mniejsze niż 1 µL dla każdego dołka. ii) Multipleksowanie plazmidów dla 384 niezależnych warunków staje się niezwykle skomplikowane. Dostarczanie do każdego z 384 dołków jest również iii) bardzo czasochłonne i iv) podatne na błędy. W rzeczywistości dozowanie odpowiedniego roztworu do oczekiwanych dołków jest trudne do kontrolowania, ponieważ dozowane niskie objętości nie pozwalają na wizualne monitorowanie różnicy między dołkami pustymi a już wypełnionymi. v) Wreszcie, istnieje wysokie ryzyko wyschnięcia mieszaniny wskutek odparowania przed dodaniem komórek ze względu na czas potrzebny do wykonania niezbędnych kroków dozowania. Podsumowując, czynnikiem ograniczającym ustanowienie wysokoprzepustowych testów transfekcji plazmidowego DNA wydaje się być miniaturyzacja analizy, co wiąże się z multipleksowaniem niskich objętości, którego nie można już obsługiwać ręcznie, a które jest również trudne do wiarygodnego osiągnięcia za pomocą klasycznych perystaltycznych systemów dozowania cieczy.

Dowodem na trudności z automatyzacją takich testów i osiągnięciem wysokiej przepustowości jest fakt, że do tej pory opublikowano jedynie kilka prób automatyzacji transfekcji: format płytki 96-dołkowej z wykorzystaniem komercyjnego urządzenia do obsługi cieczy i wytrącania fosforanu wapnia14, a ostatnio odczynnika lipopleksowego oraz chipu mikroprzepływowego umożliwiającego 280 niezależnych transfekcji15, co jednak wymaga specjalistycznej wiedzy w tej dziedzinie. Inna metoda, akustoforeza, umożliwiająca lewitację cieczy i prowadząca do manipulacji oraz mieszania płynów, została wykorzystana do przeprowadzania transfekcji DNA w formatach płytek od 24 do 96 dołków16. Choć podejście to jest wykonalne, cechuje się ono niezwykle niską przepustowością, ponieważ mieszanie komórek z mieszaniną do transfekcji DNA wymaga 60 s inkubacji dla każdego pojedynczego punktu przed wysianiem. Oznacza to czas trwania wynoszący co najmniej 96 min dla pełnej płytki 96-dołkowej. Co więcej, protokół ten jest daleki od bycia dostępnym dla ogółu biologów, ponieważ prace te wykonano za pomocą urządzenia zaprojektowanego i wyprodukowanego wewnętrznie, które obecnie nie jest dostępne na rynku. Z drugiej strony w ciągu ostatnich kilku lat pojawiła się łatwa w użyciu, sterowana programowo technologia dozowania oparta na akustyce z urządzeniami do dozowania nanobioobjętości. Wykorzystując skupioną energię akustyczną, urządzenia te pozwalają na ściśle kontrolowany wyrzut małych objętości cieczy od 2,5 nL do 50 nL z płytki źródłowej do płytki docelowej17. Technologia ta, zwana akustycznym wyrzutem kropel (ADE), ma liczne zalety: jest w pełni zautomatyzowana, bezkontaktowa, nie wymaga końcówek, jest dokładna, precyzyjna, wysoce powtarzalna i charakteryzuje się wysoką przepustowością18. Pierwotnie przeznaczone do dostarczania roztworów dimetylosulfoksydu (DMSO), ustawienia zostały ulepszone, aby umożliwić dozowanie buforów wodnych19. Akustyczne nanodozowniki wydają się zatem odpowiednie dla protokołów odwrotnej transfekcji komórek i mogłyby ominąć większość wyżej wymienionych ograniczeń manualnych. Ponieważ wcześniej nie opisano prób transfekcji plazmidowej przy użyciu tej technologii, niedawno oceniliśmy przydatność systemu dozowania opartego na akustyce do przeprowadzania odwrotnej transfekcji komórek.

Wykorzystując wysoką wydajność i łatwość obsługi nanodozownika, zoptymalizowaliśmy protokół odwrotnej transfekcji dla komórek HeLa poprzez testowanie krzyżowe kilku parametrów, które mogą wpływać na transfekcję DNA na jednej płytce 384-dołkowej, a mianowicie: całkowitej ilości DNA i początkowego stężenia DNA źródłowego, objętości rozcieńczalnika, odczynnika do transfekcji oraz liczby rozsianych komórek. Opracowany protokół omija opisane powyżej ograniczenia manualnej transfekcji komórek i wykazuje kilka zalet w porównaniu z innymi próbami automatycznej transfekcji. Po pierwsze, jest on zminiaturyzowany, co pozwala na kosztową efektywność poprzez oszczędność preparatów plazmidów DNA i odczynników do transfekcji. Po drugie, charakteryzuje się znacznie większą przepustowością i powtarzalnością niż protokół manualny (nawet dla osób początkujących), ponieważ transfekcja całej płytki 384-dołkowej może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż 1 h. Wreszcie, proces jest sterowany programowo, co umożliwia kontrolę ilości dozowanego DNA oraz multipleksowanie kilku plazmidów. Rzeczywiście, dzięki oprogramowaniu nanodozownika (Tabela materiałów), użytkownik może opracować plan badania w celu kontrolowania objętości dozowanych z określonej płytki źródłowej do płytki docelowej.

Przedstawiony tutaj protokół jest przeznaczony przede wszystkim dla osób mających dostęp do nanodystrybutora i chcących przeprowadzić eksperymenty transfekcyjne wysokoprzepustowe, ale także dla tych, którzy chcą szybko zoptymalizować parametry transfekcji dla konkretnego typu komórek, stosując ten protokół do wysokoprzepustowego testowania krzyżowego kilku parametrów. Wykazaliśmy, że zoptymalizowane parametry zidentyfikowane za pomocą tego protokołu w nanoskali mogą być przeniesione do manualnych eksperymentów transfekcyjnych na większą skalę. Ponadto, ponieważ odczynnik do transfekcji użyty w niniejszym protokole umożliwia transfekcję DNA lub siRNA zgodnie z informacją producenta, protokół ten jest interesujący również dla osób dążących do zastosowania podejścia macierzowego w celu nadekspresji lub wyciszenia genów. Płytki docelowe wypełnione wcześniej DNA mogą być przechowywane do 7 dni przed użyciem w teście transfekcyjnym bez utraty skuteczności, co stanowi kolejną zaletę następującego protokołu w tego rodzaju zastosowaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowania wstępne

  1. Przygotowanie programów perystaltycznego dozownika cieczy
    UWAGA: Dla etapów dozowania rozcieńczalnika i komórek w protokole należy przygotować dedykowany program, uwzględniając wysokość głowicy dozującej względem używanej płytki oraz cel danego kroku.
    1. Dla etapu dozowania 1 µL rozcieńczalnika zamontuj kasetę 1 µL i przygotuj program z ustawieniami opisanymi w krokach 1.1.1.1 i 1.1.1.2.
      1. Ustaw parametr szybkości przepływu na High, aby uzyskać najwyższą wydajność, ponieważ w tym kroku nie przewiduje się uszkodzenia materiału biologicznego. Ustaw wysokość dozowania na 9,6 mm (zależnie od użytej płytki do hodowli komórek, Supplemental Figure 1), aby kropla 1 µL dotykała dna dołków podczas dozowania.
        UWAGA: Krok ten jest kluczowy, aby uniknąć zatrzymywania się kropli na głowicy dozującej do czasu osiągnięcia objętości wystarczającej do ich upadku.
      2. Ustaw wysokość prześwitu nad płytką na 14,4 mm, aby umożliwić swobodne przemieszczanie się głowicy dozującej nad płytką po dozowaniu każdego rzędu. Wizualnie sprawdź prawidłowe ustawienia wysokości głowicy perystaltycznego dozownika cieczy: upewnij się, że podczas dozowania na końcówkach dozujących nie pozostają żadne krople i sprawdź, czy głowica jest wystarczająco wysoko, aby umożliwić jej przemieszczenie po dozowaniu każdego rzędu.
        UWAGA: Unikanie zatrzymywania się kropli jest kluczowym parametrem, ponieważ w przeciwnym razie dokładność dozowanej objętości zostanie zaburzona.
    2. Do dozowania 40 µL zawiesiny komórkowej zamontuj kasetę 10 µL i przygotuj program z ustawieniami opisanymi w krokach 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Ustaw parametr szybkości przepływu na Low, aby dozować komórki z niską prędkością, co zapobiegnie potencjalnym uszkodzeniom komórek wywołanym naprężeniem ścinającym i silnym uderzeniem o dno dołków. Ustaw wysokość dozowania na 1,43 mm (zależnie od użytej płytki do hodowli komórek, Supplemental Figure 1) – na tyle wysoko, aby zmniejszyć siłę uderzenia komórek o dno dołków podczas procesu dozowania, ale na tyle nisko, aby uniknąć zatrzymywania się kropli na głowicy dozującej. Ustaw wysokość prześwitu nad płytką na 16 mm, aby umożliwić swobodne przemieszczanie się głowicy dozującej nad płytką po dozowaniu każdego rzędu.
      2. Wizualnie sprawdź prawidłowe ustawienia wysokości głowicy perystaltycznego dozownika cieczy: upewnij się, że podczas dozowania na końcówkach dozujących nie pozostają żadne krople i sprawdź, czy głowica jest wystarczająco wysoko, aby umożliwić jej przemieszczenie po dozowaniu każdego rzędu.
        UWAGA: Unikanie zatrzymywania się kropli jest kluczowym parametrem, ponieważ w przeciwnym razie dozowana liczba komórek będzie niewiarygodna.
  2. Przygotowanie plazmidowego DNA (klasyczny protokół ekstrakcji miniprep)
    1. Hoduj transformowany szczep bakterii DH5α w pożywce LB uzupełnionej o antybiotyk selekcyjny ampicylinę w stężeniu 125 µg/mL (Table of Materials) przez noc w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu (200 rpm) na inkubatorze orbitalnym (Table of Materials).
    2. Zabierz 2 mL hodowli, osadź komórki poprzez wirowanie przez 5 min przy 6 0 x g i odlej supernatant.
    3. Resuspenduj osad komórkowy w 250 µL buforu do resuspensji zawierającego RNazę A (Table of Materials). Dodaj 250 µL buforu do lizy i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej, zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Zatrzymaj reakcję lizy, dodając 30 µL buforu neutralizującego (Table of Materials) i krótko mieszając w wstrząsarzu wortex. Wirować probówki przez 5 min przy 1 0 x g.
    5. Umieść nową minikolumnę do plazmidów (Table of Materials) w probówce zbierającej o pojemności 2 mL i przelej supernatant do kolumny, wirowując przez 1 min przy 1 0 x g.
    6. Odlej filtrat i umieść minikolumnę z powrotem w probówce zbierającej.
    7. Przemyj minikolumnę do plazmidów 50 µL opcjonalnego buforu do mycia (Table of Materials) i wirować przez 1 min przy 1 00 x g, zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Odlej filtrat i umieść minikolumnę do plazmidów z powrotem w probówce zbierającej.
    9. Dodaj 70 µL buforu do mycia (Table of Materials) uzupełnionego etanolem i wirować przez 1 min przy 1 0 x g, zgodnie z instrukcjami producenta.
    10. Odlej filtrat i wirować minikolumnę do plazmidów wraz z probówką zbierającą jeszcze raz przez 2 min przy 1 00 x g, aby osuszyć membranę krzemionkową.
    11. Umieść osuszoną minikolumnę do plazmidów w nowej probówce 1,5 mL i dodaj 30 µL wody destylowanej uprzednio podgrzanej do 60 °C, inkubuj przez 2 min w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez 1 min przy 11 0 x g.
    12. Usuń minikolumnę do plazmidów i zachowaj eluat zawierający oczyszczony plazmid DNA.
    13. Zmierz stężenie eluirowanego DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego (Table of Materials).
      1. Włącz spektrofotometr i wybierz ustawienia DNA measurement.
      2. Podnieś ramię pomiarowe spektrofotometru i nanieś pipetą 1 µL wody na podstawkę pomiarową w celu wykonania kalibracji tła (blank).
      3. Opuść ramię pomiarowe, rozpocznij pomiar tła i poczekaj na zakończenie.
      4. Podnieś ramię pomiarowe i zetrzyj próbkę z górnej i dolnej podstawki.
      5. Nanieś pipetą 1 µL roztworu DNA na dolną podstawkę w celu jego pomiaru.
      6. Opuść ramię pomiarowe, rozpocznij pomiar stężenia DNA i poczekaj na zakończenie.
      7. Podnieś ramię pomiarowe i zetrzyj próbkę z górnej i dolnej podstawki.
      8. W celu wykonania kolejnych pomiarów stężenia DNA powtórz kroki 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. Po zakończeniu pomiarów przechowuj roztwory DNA w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Projekt eksperymentalny i generowanie list wyboru dla dozowania w systemie ADE

UWAGA: Opracowano dedykowane, „przyjazne dla użytkownika” makro arkusza kalkulacyjnego do zarządzania ilościami DNA i mieszania do czterech plazmidów w formacie płytki 384-dołkowej. Na podstawie wprowadzonego planu eksperymentalnego makro to generuje pliki niezbędne do przeprowadzenia protokołu transfekcji DNA w systemie ADE za pomocą nanodozownika. Aby wygenerować te pliki, należy wypełnić kilka pól w Arkusz szablonu jak pokazano w Rysunek 2.

szablon transfekcji dla płyt 384-dołkowych, schemat w programie Excel, instrukcja pipetowania, przenoszenie DNA, etapy obliczania objętości.
Rysunek 2Generowanie list wyborczych (picklists) do sterowania dozowaniem ADE przy użyciu makra w arkuszu kalkulacyjnym. Należy uzupełnić kilka parametrów, a mianowicie (1) odczynnik do transfekcji (TR) oraz minimalne/maksymalne objętości do zastosowania w płytce źródłowej, (2) początkowe stężenia plazmidów do odpipowania do płytki źródłowej oraz (3) projekt całej płytki, w tym przewidywane ilości plazmidu oraz multipleksowanie w każdej z 384 studzienek. (4) Generowanie list wyboru aktywacja umożliwia weryfikację poszczególnych pól, a po ich prawidłowym wypełnieniu automatycznie generowane są listy wyboru dla dozowania DNA i TR oraz niezbędny szablon płytki źródłowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wprowadź parametry protokołu nanodozownika w różowych polach. Ustaw wartość mieszaniny odczynnika do transfekcji (TR) na 50 nL. Ustaw minimalną wartość objętości w studzienkach płytki źródłowej na 4 µL. Ustaw maksymalną objętość w studzienkach płytki źródłowej na 1,25 µL.
    UWAGA: Użyty tutaj nanodozownik może przenieść maksymalnie 50 nL w jednym cyklu ADE. Różowe pola są wypełnione zalecanymi wartościami, ale mogą one zostać zmodyfikowane zgodnie z potrzebami użytkownika.
  2. Wprowadź początkowe stężenia DNA 10 ng/µL w niebieskich polach odpowiadających danemu DNA.
    UWAGA: Wartość ta jest wcześniej zdefiniowanym optymalnym stężeniem, jednak może zostać zmodyfikowana w zależności od potrzeb użytkownika.
  3. Wprowadź pożądaną ilość DNA w szarych/zielonych polach. Wprowadź ilości i nazwy plazmidów dla 384 studzienek, dbając o identyczną pisownię w przypadku użycia tego samego plazmidu w kilku studzienkach.
  4. Wygeneruj projekt płytki źródłowej, pliki list pobierania (picklists) oraz plik instrukcji pipetowania. Kliknij Generate Picklists, aby makro mogło wygenerować pliki DNA-Picklist.csv, T.R.-Picklist.csv oraz 384-Wells-Pipetting-Guide.csv na podstawie danych zebranych w odpowiednim arkuszu. Jeśli zostaniesz poproszony, popraw wartości w komórkach wypełnionych kolorem pomarańczowym, ponieważ wskazuje to na błędy lub objętości, których nanodozownik nie może obsłużyć.
  5. Wydrukuj szablon(y) z arkusza Source Plate. Wskazane są nazwy plazmidów oraz minimalna objętość do napełnienia studzienek. Analogicznie, objętości mieszaniny odczynnika do transfekcji, które będą następnie napełniane w kolejnych studzienkach, są oznaczone jako TR i wyróżnione na zielono.

3. Przygotowanie płytki źródłowej z DNA przy użyciu aplikacji przewodnika pipetowania dla płytek 384-dołkowych

  1. Rozcieńczyć przechowywany plazmid DNA z kroku 1.2.14 do stężenia 10 ng/µL, używając wody destylowanej.
  2. Kalisrować siatkę dla płytki 384-dołkowej zgodnie z wymiarami płytki: uruchomić aplikację przewodnika pipetowania dla płytek 384-dołkowych na tablecie (Rycina 3). Umieścić płytkę źródłową na siatce na dolnym ekranie, a następnie w lewym górnym menu kalibracji kliknąć + lub - (lub użyć czerwonego kursora), aby zwiększyć lub zmniejszyć rozmiar siatki i dołków w celu dopasowania zielonych dołków do czterech narożnych dołków płytki.

przewodnik po pipetowaniu w płytkach 384-dołkowych; konfiguracja oparta na tabletach; proces pipetowania krok po kroku; automatyzacja laboratoryjna.
Rysunek 3Stosowanie aplikacji przewodnika do pipetowania w płytkach 384-dołkowych. (1) kalibracja siatki 384 doległowej do rozmiaru płytki; (2Montaż uniwersalnej płytki wydrukowanej w technologii 3D adapter do tabletu przy użyciu taśmy dwustronnej; (3) Umieszczenie płytki w adapterze; (4) Przesunięcie siatki w celu jej wycentrowania względem zamontowanej płytki. (5) Blokada etapu kalibracji. (6) Otwieranie pliku 384 wells pipetting guide.csv. (7Po otrzymaniu listy plików aplikacja wskaże oczekiwaną nazwę płytki źródłowej, odczynnik (DNA lub odczynnik do transfekcji), stężenie oraz objętość do dozowania do docelowych studzienek, które będą podświetlane jedna po drugiej.8Przyciski strzałek lewej i prawej pozwalają użytkownikowi postępować zgodnie z przewodnikiem pipetowania, aby łatwo dozować odczynniki zgodnie z szablonem płyty źródłowej makra arkusza kalkulacyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Za pomocą dwustronnej taśmy przymocuj wydrukowany w technologii 3D adapter do płytek na ekranie, aby zapobiec przesunięciom płytki źródłowej podczas dozowania. W razie potrzeby przesuń skalibrowaną siatkę za pomocą strzałek obrotu oraz przycisków Góra/ Dół/ Prawo/ Lewo, aby dopasować siatkę na ekranie do pozycji płytki. Po prawidłowej kalibracji i zlokalizowaniu siatki oraz rozmiarów studzienek, zaznacz pole Zablokuj kalibrację.
  2. Kliknij PLIK i otwórz plik 384 wells pipetting guide.csv. Postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby ręcznie dozować wskazaną objętość wskazanego plazmidu o wskazanej koncentracji do podświetlonej na biało studzienki odpowiadającej właściwemu miejscu docelowemu w danej płytce. Używaj strzałek – lub +, aby cofnąć się lub przejść dalej w procesie dozowania DNA. Przerwij dozowanie po dotarciu do pierwszego roztworu Odczynnika do transfekcji do załadowania.
  3. Po zakończeniu dozowania DNA usuń płytkę źródłową z adaptera. Jeśli należy napełnić kilka płytek źródłowych, umieść nową płytkę źródłową w adapterze i postępuj zgodnie z instrukcjami dozowania. Po zakończeniu dozowania DNA odwiruj napełnione płytki źródłowe (przy 1,50 × g przez 2 min), aby zapewnić odpowiedni poziom cieczy i usunąć pęcherzyki powietrza, które mogłyby prowadzić do niedokładności w transferach opartych na ADE.

4. dozowanie 1 µL rozcieńczalnika do płytki docelowej za pomocą dozownika cieczy z pompą perystaltyczną

UWAGA: Kroki 4.1-4.5 należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Zdezynfekuj głowicę kasety 1 µL, rozpylając na niej środek dezynfekcyjny w sprayu (Tabela materiałów), i pozwól, aby roztwór ten wpłynął do uchwytu końcówek. Resztki środka dezynfekującego usuń za pomocą papieru chłonnego. Zamontuj kasetę 1 µL w perystaltycznym dozowniku cieczy. Włącz urządzenie i upewnij się, że ustawienie typu kasety jest prawidłowe (1 µL), a także format płytki (384 dołki).
  2. Zdezynfekuj całe światło rurek: umieść organizer rurek (trzymający razem osiem rurek) w sterylnym naczyniu i wypełnij je 5 mL 70% alkoholu. Korzystając z funkcji przygotowania (priming) perystaltycznego dozownika cieczy, najpierw przepuść alkohol przez rurki, a następnie wypłucz je, przepuszczając 5 mL wody destylowanej i 5 mL pożywki bezsurowiczej (pożywka DMEM uzupełniona o 10 U/mL penicyliny-streptomycyny; Tabela materiałów), kolejno napełniając to samo naczynie. Upewnij się, że żadna z końcówek nie jest zapchana, wizualnie kontrolując przepływ cieczy z każdej z nich.
  3. Napełnij rurki pożywką bezsurowiczą, wlewając 10 mL podgrzanej wcześniej pożywki bezsurowiczej do nowego sterylnego naczynia i zanurzając w niej organizer rurek. Naciśnij przycisk przygotowania (prime) w perystaltycznym dozowniku cieczy przez około 10 s. Ponownie upewnij się, że żadna końcówka nie jest zapchana, wizualnie kontrolując przepływ cieczy z każdej z nich.
  4. Napełnij płytkę 1 µL rozcieńczalnika. Umieść sterylną płytkę hodowlaną z 384 dołkami (docelową) na uchwycie do płytek perystaltycznego dozownika cieczy i zdejmij z niej pokrywkę.
  5. Uruchom skalibrowany program, aby dozować 1 µL do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Czas dozowania wynosi około 8 s. Następnie załóż pokrywkę na płytkę 384-dołkową.
    UWAGA: Alternatywnie ten krok można wykonać ręcznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając wielokanałowej mikropipety.

5. Przeprowadzenie badania w celu kontroli objętości dozowanych ręcznie

UWAGA: Szczegóły znajdują się na Rysunku 4.

  1. Uruchom program nanodozownika, przejdź do karty diagnostycznej, zaznacz pole Out płyty źródłowej, umieść płytę źródłową w uchwycie i zaznacz pole In, aby wprowadzić płytę. Po wyświetleniu monitu wybierz opcję 384LDV_AQ_B2, aby ustawić nanodozownik w trybie dozowania buforu wodnego, a następnie naciśnij Ok.
  2. Wybierz opcję Survey w menu Miscellaneous i kliknij Launch. Wybierz wypełnione dopełnienia do analizy i kliknij przycisk Go. Zweryfikuj, czy zmierzone objętości są zgodne z oczekiwanymi i upewnij się, że żadne dopełnienia nie zostały napełnione objętością przekraczającą 12 µL, aby uniknąć problemów z transferem.

Interfejs oprogramowania do analizy danych; schemat procesu krok po kroku; ustawienia sterowania i wprowadzanie parametrów.
Rysunek 4Definiowanie parametrów oprogramowania do ankiet. (1) Uruchom program nanodystrybutora. (2) Otwórz Diagnostyka tab. (3) Włóż płytkę źródłową, zaznaczając odpowiednią opcję Na zewnątrz dla płytki źródłowej, a następnie W. (4) Zdefiniuj typ płytki źródłowej w menu po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu. (5) W polu Różne wybierz Badanie ankietowe w menu rozwijanym. (6) Uruchom program ankiety, klikając w Uruchomienie. (7) Wybrać wypełnione wcześniej studzienki do pomiaru. (8) Rozpocznij analizę, klikając przycisk Go. (9Po przeprowadzeniu pomiaru zmierzone objętości wpisuje się do odpowiednich wybranych studzienek. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Dozowanie DNA do płytki docelowej za pomocą ADE

  1. Uruchom oprogramowanie picklist, ustawiając typy płytek źródłowych i docelowych 384-dołkowych odpowiednio na 384_LDV oraz Greiner 384PS_781096 (Rysunek 5). Ustaw urządzenie w trybie dozowania buforu wodnego, wybierając 384LDV_AQ_B2, i odznacz opcję „optymalizuj przepustowość transferu”.

Przebieg analizy danych, ekrany konfiguracji oprogramowania do eksportu danych z mikropłytek, przewodnik po interfejsie użytkownika.
Rysunek 5Wydajność dozowania w oparciu o listę wyboru. (1) Uruchom oprogramowanie nanodozownika. W karcie Protokół wybierz (2) format płyty z próbkami, (3) typ płytki docelowej i (4) odznacza opcję „optymalizuj przepustowość transferu” (5) Wybierz Lista wyboru tab. (6Kliknij w Import i wybierz odpowiedni plik *.csv (DNA-PickList lub T.R.-Picklist). (7) Po wybraniu kliknij w Import. (8Kliknij w Odtwórz i zapisz protokół. (9) Przeprowadź symulację dozowania, klikając w Symuluj, lub (10) Rozpocznij zaprogramowane dozowanie, klikając w Uruchomienie. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Wybierz kartę „Pick List”, kliknij Import, a następnie wybierz plik DNA-Picklist.csv. Kliknij Play i zapisz protokół. Kliknij Simulate, aby przeprowadzić symulację zaprogramowanego dozowania i upewnić się, że lista wyboru jest zgodna z planem eksperymentalnym. Po zakończeniu kliknij Close.
  2. Kliknij Play, a następnie Run, aby uruchomić program dozowania: gdy pojawi się prośba, włóż do nanodozownika wymaganą płytkę źródłową (z ręcznie napełnionymi roztworami DNA) oraz płytkę docelową (napełnioną rozcieńczalnikiem).
    UWAGA: Czas dozowania dla pełnej płytki 384-dołkowej wynosi około 5-20 min, w zależności od wybranych objętości i całkowitej liczby dozowań w planie eksperymentalnym.
  3. Alternatywnie można w tym miejscu wstrzymać protokół, ponieważ płytki wypełnione rozcieńczalnikiem i DNA mogą być przechowywane w stanie suchym lub zamrożonym do 7 dni. W przypadku przechowywania na sucho należy pozostawić płytki do wyschnięcia na blacie w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je w ten sam sposób. Przed użyciem w kroku transfekcji (sekcja 7) płytki przechowywane w zamrożeniu należy rozmrozić i odwirować (przy 1,50 × g przez 2 min).
     

7. Dozowanie odczynnika do transfekcji sterowane przez ADE

  1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przygotować doraźne rozcieńczenie odczynnika do transfekcji lipopoliplexów w medium bezsurowiczym do końcowego stężenia 1x. Mieszaninę odczynnika do transfekcji należy wymieszać w wortexie, a następnie niezwłocznie nanieść na wcześniej zdefiniowaną płytkę (płytki) źródłową zaprojektowaną przez makro, korzystając z uprzednio skalibrowanej aplikacji prowadzącej pipetowanie do płytek 384-dołkowych, zgodnie z opisem w kroku 3.4.
    UWAGA: Nie należy wirować płytki źródłowej po nałożeniu odczynnika, ponieważ po wirowaniu nie zaobserwowano transfekcji.
  2. Uruchom program nanodozownika, aby przeprowadzić „przegląd” opisany w sekcji 5, w celu kontrolowania objętości wszystkich próbek napełnianych ręcznie. TR dołka płyty (płyt) źródłowych, aby uniknąć błędów dozowania wynikających z przekroczenia objętości 12 µL.
  3. Kliknij w Resetuj należy wyczyścić listę próbek w oknie wyboru DNA (DNA picklist) w oprogramowaniu do tworzenia list pobrań oraz zweryfikować, czy parametry urządzenia są nadal ustawione na bufory wodne oraz na odpowiednie typy płytek źródłowych i docelowych, zgodnie z krokiem 6.1.
  4. Kliknij w Import następnie wybierz plik TR-Picklist.csv. Kliknij Odtwórz i zapisz protokół, jeśli pojawi się taka prośba, a następnie (jest to opcjonalne, lecz zdecydowanie zalecane) przeprowadź symulację zaprogramowanego dozowania mieszaniny odczynników do transfekcji, aby upewnić się, że projekt dozowania jest prawidłowy, klikając w Symuluj przycisk. Po zakończeniu kliknij Zamknij.
  5. Kliknij w Odtwórzi następnie Uruchom przycisk uruchamiający program dozowania: zgodnie z instrukcją należy umieścić płytkę źródłową (wypełnioną mieszaniną TR) oraz płytkę docelową (wypełnioną rozcieńczalnikiem i DNA) w nanodozowniku.
    UWAGA: Czas dozowania dla pełnej płytki 384-dołkowej wynosi mniej niż 20 min przy dozowaniu 50 nL mieszaniny TR.
  6. Inkubować przez 15–30 min w temperaturze pokojowej po dodaniu TR do DNA, zgodnie z protokołem producenta.

8. Rozdawanie komórek za pomocą dozownika cieczy z pompą perystaltyczną

  1. Przygotuj perystaltyczny dozownik cieczy do rozlewania komórek. Zdezynfekuj głowicę kasety 10 µL, spryskując ją środkiem dezynfekcyjnym Aniospray Surf 29 i osuszając pozostałości za pomocą papieru. Zamontuj kasetę w urządzeniu perystaltycznego dozownika cieczy, zmień ustawienie typu kasety na 10 µL i upewnij się, że format płytki jest ustawiony na 384 dołki.
  2. Zdezynfekuj rurki kasety 10 µL zgodnie z opisem w kroku 4.2. Zanurz organizer rurek w sterylnym naczyniu i przepłucz rurki 5 mL 70% alkoholu, następnie 5 mL wody destylowanej, a na koniec 5 mL medium bez serum, wypełniając naczynie kolejno tymi cieczami, aż każda rurka zostanie opróżniona.
  3. Przygotuj zawiesinę komórkową do rozlewania. Z konfluentnej płytki hodowlaną z komórkami HeLa B10 wypłucz komórki 1x roztworem 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), a następnie zdysocjuj komórki za pomocą trypsyny/EDTA przez 5 min w 37 °C.
  4. Zweryfikuj dysocjację komórek pod mikroskopem i zatrzymaj działanie trypsyny/EDTA, dodając do płytki hodowlanej 10 mL medium kompletnego (DMEM uzupełniony o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 100 U/mL penicyliny-streptomycyny; patrz Tabela materiałów). Zbierz komórki do probówki 50 mL i policz je pod mikroskopem, używając komory Malasseza lub automatycznego licznika komórek.
  5. Przygotuj co najmniej 25 mL zawiesiny komórek HeLa o stężeniu 37 500 komórek/mL w medium kompletnym (tj. 1 50 komórek/40 µL) dla pełnej płytki 384-dołkowej, aby zapewnić odpowietrzenie rurek oraz dozowanie 40 µL/dołek.
  6. Aby rozlać komórki, napełnij nowe sterylną naczynie przygotowaną zawiesiną komórkową i wymieszaj ją, aby zapobiec sedymentacji, która mogłaby prowadzić do nieścisłości w gęstości komórek podczas dozowania. Włóż organizer rurek do tego roztworu i naciśnij przycisk Prime, aż zawiesina komórkowa zacznie wypływać z głowicy dozującej. Sprawdzając wizualnie przepływ cieczy ze wszystkich końcówek, upewnij się, że żadna z nich nie jest zapchana i że każda rurka jest wypełniona zawiesiną komórkową.
  7. Umieść docelową płytkę 384-dołkową wypełnioną DNA i TR na uchwycie płyt perystaltycznego dozownika cieczy i zdejmij jej pokrywkę. Uruchom skalibrowany program w celu dozowania 40 µL zawiesiny komórkowej na całą płytkę 384-dołkową (tj. 1 50 komórek/dołek). Czas dozowania wynosi około 8 s. Załóż pokrywkę płytki 384-dołkowej.
    UWAGA: Alternatywnie 40 µL zawiesiny komórkowej można rozlać ręcznie za pomocą mikropipety wielokanałowej.

9. Własny test biologiczny (monitorowanie wydajności transfekcji komórek)

UWAGA: Zgodnie z ustawieniami i celem eksperymentu, należy zastosować wymagane metody luminescencji, fluorescencji, wysokoprzepustowego skanowania (high-content screening) oraz ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). W tej części protokołu wydajność transfekcji komórek jest oceniana za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu.

  1. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w atmosferze nasyconej wodą do momentu uzyskania odpowiedniej ekspresji białek.
    UWAGA: W przypadku komórek HeLa, w celu monitorowania wydajności transfekcji z użyciem plazmidów wykazujących ekspresję tdTomato i mVenus, zastosowano czas inkubacji wynoszący 48 h.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną 48 h po transfekcji poprzez odwrócenie płytki, dodać 30 µL/dołek 10% formaliny za pomocą perystaltycznego dozownika cieczy (kaseta 10 µL) i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć formalinę poprzez odwrócenie płytki, a następnie inkubować komórki przez 15 min w temperaturze pokojowej z Hoechst w stężeniu 0,1 ng/mL rozpuszczonym w roztworze 1x PBS.
  4. Przemyć komórki 3x przez 15 min 80 µL 1x PBS z pH = 8, aby odzyskać wysoki sygnał fluorescencji utracony z powodu pH = 6,9 podczas etapu inkubacji w roztworze formaliny.
  5. Za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego pozyskać obrazy z dwóch lub trzech kanałów fluorescencyjnych (Hoechst, tdTomato i mVenus) sekwencyjnie, używając obiektywów 10x oraz odpowiedniego zestawu filtrów emisyjnych (odpowiednio: 4′,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], dsRed i fluorescein isothiocyanate [FITC]).
  6. W celu oceny wydajności transfekcji wykorzystać oprogramowanie do analizy obrazu, aby określić wydajność transfekcji za pomocą analizy skryptowej opartej na barwieniu jąder.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ustalić, czy technologia ADE może być wykorzystana w zautomatyzowanym protokole transfekcji odwrotnej, monitorowaliśmy wydajność transfekcji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając plazmidu ekspresującego czerwoną fluorescencyjną białkę tdTomato. W pierwszej kolejności, w celu wyznaczenia optymalnych parametrów transfekcji, przeprowadzono testy krzyżowe różnych objętości rozcieńczalnika oraz całkowitych ilości DNA. Zastosowano objętość rozcieńczalnika, aby krople DNA ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowanie i optymalizacja dokładnej, wysokoprzepustowej metody transfekcji dla danej linii komórkowej wymaga od naukowców przestrzegania kilku kluczowych parametrów opisanych w tej sekcji. Zdecydowanie zalecamy rozpoczęcie od zalecanych wartości w całym protokole, ponieważ te ustawienia zoptymalizowane pod kątem komórek HeLa okazały się również skuteczne w przypadku komórek HEK. Ponieważ jednak najlepsze parametry mogą zależeć od linii komórkowych i odczynników do transfekcji, optymalne warunki można określić, zmieniaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy ujawnili otrzymanie następującego wsparcia finansowego na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu: Inserm, Uniwersytet w Lille, Instytut Pasteura w Lille, Conseil Régional du Nord, oraz PRIM-HCV1 i 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) i Wspólnota Europejska (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). Autorzy pragną podziękować dr S. Moureu, dr B. Villemagne, dr R. Ferru-Clémentowi i dr H. Groultowi za krytyczną recenzję i poprawki manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
384LDV MicroplateLabcyteLP-0200
384-dołkowa mikropłytka μ PrzezroczystyGreiner781906
AmpicilinSigmaA9393-5GSelection antybiotyk na bakterie transformowane za pomocą wektora ekspresji ampiciliny
Tablet z systemem Android SamsungGalaxy Note 8służy do prowadzenia użytkownika podczas ręcznego dozowania płytki źródłowej
Aniospray Surf 29Anios2421073środek dezynfekujący do czyszczenia głowicy MicroFlo
Columbus oprogramowaniePerkin Elmeroprogramowanie do analizy obrazu
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronianPożywka do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific10566032
Oprogramowanie Echo Cherry Pick 1.5.3Oprogramowanie Labcyteumożliwiające dozowanie oparte na ADE przez urządzenie Echo550 z pliku *.csv; oprogramowanie nanodozownika
Echo550LabcyteDozownik na bazie ADE
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000044do dodawania do pożywki do hodowli komórkowych
Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Ldo utrwalania
komórek HeLaATCCHeLa (ATCC® CCL-2&handel ;)
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodnyThermo Fisher ScientificH357010 mg/ml roztwór w wodzie
INCell Analyzer 6000GE Healthcare29043323zautomatyzowana laserowa platforma obrazowania konfokalnego
LB mediumThermoischer Scientific
LB Bulion Base (Lennox L Broth Base)®, proszek		12780052pożywka hodowlana do rozwoju
bakteriiBufor do lizy (A2) Macherey-Nagel740912.1Bufor z zestawu NucleoSpin Plasmid służący do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
MicroFlo 10µ Kaseta LBiotek Instruments Inc7170013do użytku z dozownikiem Microflo
MicroFlo 1μ Kaseta LBiotek Instruments Inc7170012do użytku z dozownikiem
Microflo Dozownik MicroFloBiotek Instruments Inc7171000do obsługi cieczy oparte na pompie perystaltycznej
Spektrofotometr mikroobjętościowy SpektrofotometrDenovixDS-11Zmierz stężenie DNA w próbkach
plazmidumVenuscDNA mVenus sklonowano przez enzymatyczne trawienie restrykcyjne i ligację w miejscach Age1/BsrG1 plazmidu tdTomato-N1Typ wektora: Ekspresja ssaków, Białko fuzyjne:
Macherey-Nagel740913.1Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
Zestaw plazmidu NucleoSpinMacherey-Nagel740588.50służy do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) ThermoFisher Scientific31985070
opcjonalnie bufor do płukaniaBufor do płukania (A4)Macherey-Nagel740914.1Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z wytrząsarki orbitalnej z hodowli bakteryjnej
 inkubowana wytrząsarka o dużej pojemności444-7084Służy do hodowli bakterii pod delikatnym mieszaniem i 37° C
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific1514012210 000 U/ml
soli fizjologicznej buforowanej fosforanamiThermo Fisher Scientific10010001
Minikolumny plazmidoweMacherey-Nagel740499.250Minikolumna membrany krzemionkowej do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej
Bufor do ponownego zawieszania (A1) Macherey-Nagel740911.1Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej
RNAzy AEnzym Macherey-Nagel740505z zestawu plazmidowego NucleoSpin używany do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
plazmid tdTomato-N1AddgenePlasmid #54642Typ wektora: Ekspresja ssaków, Białko fuzyjne: tdPomidor 
TransIT-X2 Dynamic Delivery SystemMirus BioMIR 6000
Wash Buffer (AW)Macherey-Nagel740916.1Bufor z zestawu NucleoSpin Plasmid służący do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej
Drukarka 3DCrealityCR10Ssłużąca do drukowania adaptera płyty
Blender Software   https://www.blender.org/
Wolne oprogramowanie na licencji GNU General Public License (GPL).		Wersja 2.79bsłużąca do projektowania adaptera płyty
urządzenie Bufor neutralizacyjny mVenus (A3) 

Bibliografia

  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36(2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4(2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1(2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937(2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023(2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wysokoprzepustowa transfekcjatechnologia ADEpłytka 384-dołkowamakro arkusza kalkulacyjnegoprotokół nanodozownikatransfekcja komórekdystrybucja plazmidówodczynnik do transfekcji
Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.