Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

DOI:

10.3791/59570

⸱

8 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfekcja komórek, niezbędna dla wielu badań biologicznych, wymaga kontrolowania wielu parametrów dla dokładnego i udanego osiągnięcia. Najczęściej wykonywana przy niskiej przepustowości, jest ponadto czasochłonna i podatna na błędy, tym bardziej w przypadku multipleksowania kilku plazmidów. Opracowaliśmy łatwą, szybką i dokładną metodę transfekcji komórek w układzie płytek 384-dołkowych przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel (ADE). Nanodozownik zastosowany w tym badaniu jest oparty na tej technologii i umożliwia precyzyjne dostarczanie nanoobjętości z dużą prędkością z płytki dołka źródłowego do płytki docelowej. Może dozować i multipleksować DNA i odczynnik do transfekcji zgodnie z wcześniej zaprojektowanym arkuszem kalkulacyjnym. Poniżej przedstawiamy optymalny protokół do wykonywania wysokoprzepustowej transfekcji plazmidowej opartej na ADE, który umożliwia osiągnięcie skuteczności do 90% i prawie 100% kotransfekcji w eksperymentach kotransfekcji. Rozszerzamy początkowe prace, proponując przyjazne dla użytkownika makro oparte na arkuszu kalkulacyjnym, które jest w stanie zarządzać maksymalnie czterema plazmidami/studzienkami z biblioteki zawierającej do 1536 różnych plazmidów, oraz aplikację do pipetowania opartą na tabletkach. Makro projektuje niezbędne szablony płytek źródłowych i generuje gotowe do użycia pliki dla nanodyspensera i aplikacji na tablety. Czteroetapowy protokół transfekcji obejmuje i) dozowanie rozcieńczalnika za pomocą klasycznego płynu, ii) dystrybucję plazmidu i multipleksowanie, iii) dozowanie odczynnika do transfekcji za pomocą nanodozownika oraz iv) posiewanie komórek na wstępnie napełnionych studzienkach. Opisana programowa kontrola multipleksowania i transfekcji plazmidów ADE pozwala nawet laikom w tej dziedzinie na wykonanie niezawodnej transfekcji komórek w szybki i bezpieczny sposób. Metoda ta umożliwia szybką identyfikację optymalnych ustawień dla danego typu ogniwa i może być transponowana do metod na większą skalę i ręcznych. Protokół ułatwia zastosowania, takie jak ekspresja ludzkiego białka ORFeome (zestaw otwartych ramek odczytu [ORF] w genomie) lub walidacja funkcji genów w oparciu o CRISPR-Cas9, w niezbiorczych strategiach przesiewowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda opisuje szczegółowo, jak przeprowadzić multipleksowanie i transfekcję plazmidu DNA w komórkach ssaków z dużą przepustowością przy użyciu akustycznego płynnego nanodozownika na płytce 384-dołkowej, nawet dla osób niebędących specjalistami w tej dziedzinie. Ta niedawno opublikowana metoda1 pozwala na wykonanie aż 384 niezależnych warunków multipleksowania i transfekcji plazmidowego DNA w jednym eksperymencie, w czasie krótszym niż 1 godzina. Eksperymenty z pojedynczą transfekcją lub kotransfekcją zakończyły się sukcesem, osiągając niemal 100% kotransfekcję w populacji transfekowanych komórek. Protokół ten ułatwia transfekcję, ponieważ większość żmudnych, czasochłonnych i podatnych na błędy kroków jest teraz sterowana przez oprogramowanie (patrz rysunek 1, aby uzyskać ogólny przegląd). Podjęto dalsze wysiłki w celu opracowania specjalnych narzędzi w celu zwiększenia łatwości obsługi przy jednoczesnym uniknięciu błędów ludzkich podczas całego procesu oraz promowania udanej transfekcji nawet dla osób niebędących specjalistami w tej dziedzinie. Opisany protokół zawiera "przyjazny dla użytkownika" arkusz kalkulacyjny makro, który opracowaliśmy w celu zarządzania 384 niezależnymi warunkami transfekcji z możliwością multipleksowania do czterech plazmidów w każdym dołku. Makro automatycznie generuje szablony płytki źródłowej (płytek) w celu załadowania oczekiwanej objętości plazmidu DNA z początkowych roztworów podstawowych i plików wymaganych do kierowania oprogramowaniem nanodozownika na wprowadzony projekt eksperymentalny. Ponieważ ręczne dozowanie DNA na 384-dołkowej płytce źródłowej jest żmudne i podatne na błędy, opracowaliśmy również dedykowaną aplikację opartą na tabletach, która prowadzi użytkownika podczas dozowania roztworu DNA zgodnie z szablonem.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Eksperymentalny przepływ pracy. Schematyczne przedstawienie optymalnego, zautomatyzowanego, wysokoprzepustowego protokołu odwrotnej transfekcji (od projektu eksperymentalnego do niestandardowego testu biologicznego). Kroki ręczne są oznaczone symbolem wskazówki, a przybliżony czas każdego kroku jest zapisany w czerwonym polu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wiele eksperymentów opartych na komórkach zaczyna się od transfekcji plazmidowego DNA, a nawet jeśli wiele dedykowanych odczynników było i nadal jest opracowywanych w celu zwiększenia efektywności transfekcji i/lub ułatwienia procedury, wiele pozostaje do zrobienia2,3,4. Transfekcja komórek plazmidowych DNA obejmuje kilka etapów w celu osiągnięcia wysokiej wydajności, takich jak początkowy wychwyt kompleksu, ucieczka endosomalna i transport cytoplazmatyczny do jądra5,6. Oprócz wytrącania wapnia lub technik fizycznych, takich jak elektroporacja lub mikroiniekcja przy użyciu dedykowanych urządzeń7, nowoczesne metody chemiczne koncentrują się na poprawie dostarczania komórek DNA przy jednoczesnym obniżeniu cytoksyczności komórek8,9. Zastosowanie lipidów lub polimerów kationowych tworzących kompleksy podobne do liposomów, a ostatnio także nieliposomalnych systemów chemii polimerów sprawiło, że transfekcja stała się łatwiejsza i bardziej wydajna10. Pomimo tych osiągnięć, transfekcja komórek nadal wymaga określonych umiejętności, aby można ją było dokładnie wykonać, ponieważ większość tych fizycznych lub chemicznych protokołów transfekcji wymaga od naukowców ręcznego przygotowania każdego warunku reakcji transfekcji DNA, co pogarsza przepustowość. Aby obejść ten problem, opracowano protokoły odwrotnej transfekcji przy użyciu chemicznych odczynników do transfekcji11,12,13, umożliwiając użytkownikowi szybsze testowanie lub łączenie kilku plazmidów. W tych protokołach kompleksy kwasów nukleinowych z odczynnikami do transfekcji są tworzone przed wysiewem komórek na kompleksach. Jednak te odwrotne protokoły są nadal ograniczone przez ręczną obsługę roztworów DNA i przez połączenie każdego z niezależnych warunków. Chociaż możliwe jest wykonanie ich w formacie 96-dołkowej płytki, przygotowanie i dozowanie DNA będzie żmudne i prawdopodobnie wystąpią błędy. Kiedy wymagane są różne ilości kilku plazmidów DNA i multipleksowane ze sobą, transfekcja komórek staje się jeszcze trudniejsza do osiągnięcia i bardziej czasochłonna, a błędy ludzkie stają się całkiem nieuniknione. Skalowanie do formatu płytki 384-dołkowej w podejściu odwrotnej transfekcji, pomimo niewielu warunków transfekcji multipleksowanego DNA, staje się niemożliwym wyzwaniem z następujących powodów. i) Ilości DNA, odczynnika do transfekcji lub objętości mieszaniny reakcyjnej do opanowania są mniejsze niż 1 μl dla każdej studzienki. ii) Multipleksowanie plazmidów dla 384 niezależnych warunków staje się niezwykle skomplikowane. Dostawa do każdego z 384 odwiertów jest również iii) wysoce czasochłonna i iv) podatna na błędy. Rzeczywiście, dozowanie właściwego roztworu do oczekiwanych studzienek jest trudne do opanowania, ponieważ małe objętości już dozowane nie pozwalają na wizualny monitoring między pustymi i już napełnionymi studzienkami. v) Wreszcie, istnieje wysokie ryzyko wysuszenia mieszaniny przez odparowanie przed dodaniem komórek ze względu na czas potrzebny na wykonanie niezbędnych etapów dozowania. Podsumowując, wydaje się, że czynnikiem ograniczającym przeprowadzanie wysokoprzepustowych testów transfekcji plazmidów DNA jest miniaturyzacja testu, co oznacza multipleksowanie i zarządzanie małą objętością, których nie można już obsługiwać ręcznie, ale które są również trudno osiągalne w niezawodny sposób przez klasyczne perystatyczne urządzenia do obsługi cieczy.

Jako dowód trudności w automatyzacji takich testów i uzyskaniu wysokiej przepustowości, do tej pory opublikowano tylko kilka prób automatyzacji transfekcji: format 96-dołkowej płytki przy użyciu komercyjnego urządzenia do obsługi cieczy i wytrącania fosforanu wapnia14 i, ostatnio, odczynnik lipoplex oraz mikroprzepływowy chip umożliwiający 280 niezależnych transfekcji15 ale wymagające specjalistycznych umiejętności w tej dziedzinie. Inna metoda, akustoforeza, umożliwiająca lewitację cieczy i prowadząca do manipulacji płynami i mieszania, została wykorzystana do przeprowadzenia transfekcji DNA w formatach płytek od 24 do 96 dołków16. Chociaż jest to wykonalne, podejście to ma wyjątkowo niską przepustowość, ponieważ mieszanie komórek z mieszaniną transfekcji DNA wymaga 60-sekundowej inkubacji dla każdego punktu przed wysiewem. Oznacza to czas trwania co najmniej 96 minut dla pełnej płytki 96-dołkowej. Co więcej, protokół ten jest daleki od bycia dostępnym dla ogółu odbiorców biologów, ponieważ praca ta została wykonana za pomocą zaprojektowanego i wyprodukowanego przez nas urządzenia, które nie jest obecnie dostępne na rynku. Wręcz przeciwnie, w ciągu ostatnich kilku lat pojawiła się łatwa w użyciu, oparta na oprogramowaniu technologia dozowania oparta na akustyce, obejmująca dozowniki nanoobjętościowe. Wykorzystując skoncentrowaną energię akustyczną, urządzenia te umożliwiają ściśle kontrolowane wyrzucanie małych objętości cieczy od 2,5 nL do 500 nL z płytki źródłowej do docelowej one17. Ta technologia, zwana akustycznym wyrzucaniem kropel (ADE), ma wiele zalet: jest w pełni zautomatyzowana, bezdotykowa, bezdotykowa, bezkońcówkowa, dokładna, precyzyjna i wysoce powtarzalna, a także ma wysoką przepustowość18. Po raz pierwszy poświęcone dostarczaniu roztworów dimetylosulfotlenku (DMSO), ustawienia zostały ulepszone w celu dozowania wodnych19. Nanodozowniki akustyczne wydają się zatem odpowiednie do protokołów odwrotnej transfekcji komórek i mogą obejść większość wyżej wymienionych ograniczeń ręcznych. Ponieważ wcześniej nie opisano żadnych prób transfekcji plazmidu przy użyciu tej technologii, niedawno oceniliśmy przydatność akustycznego systemu dozującego do wykonywania transfekcji odwrotnej komórki.

Korzystając z przepustowości nanodozownika i łatwości użycia, zoptymalizowaliśmy protokół odwrotnej transfekcji dla komórek HeLa, przeprowadzając testy krzyżowe kilku parametrów, które mogą wpływać na transfekcję DNA na 384-dołkowej, pojedynczej płytce, a mianowicie: całkowita ilość DNA i początkowe stężenie źródłowego DNA, objętość rozcieńczalnika, odczynnik do transfekcji i liczba komórek rozsiewających. Opracowany protokół omija opisane powyżej ręczne ograniczenia transfekcji komórek i ma kilka zalet w porównaniu z innymi automatycznymi próbami transfekcji. Po pierwsze, jest miniaturyzowany, co pozwala na ekonomiczny odczynnik do transfekcji poprzez oszczędność preparatów plazmidu DNA i odczynnika do transfekcji. Po drugie, jest znacznie bardziej wydajny i powtarzalny niż protokół ręczny (nawet dla początkujących), ponieważ transfekcję całej płytki 384-dołkowej można osiągnąć w czasie krótszym niż 1 godzina. Wreszcie, jest sterowany programowo, co pozwala na kontrolę ilości dozowanego DNA i multipleksowanie kilku plazmidów. Rzeczywiście, dzięki oprogramowaniu nanodozownika (Tabela Materiałów) użytkownik może opracować plan badań, aby kontrolować objętości, które mają być dozowane ze zdefiniowanej płytki dołka źródłowego do płytki docelowej.

Przedstawiony tutaj protokół jest przeznaczony głównie dla tych, którzy mają dostęp do nanodozownika i chcieliby przeprowadzić eksperymenty transfekcyjne z dużą przepustowością, ale także dla tych, którzy chcą szybko zoptymalizować swoje parametry transfekcji dla danego typu komórki, stosując ten protokół do testów krzyżowych kilku parametrów przy wysokiej przepustowości. Rzeczywiście, wykazaliśmy, że zoptymalizowane parametry zidentyfikowane za pomocą tego protokołu w nanoskali można przetransponować do eksperymentów transfekcji na większą skalę i ręcznych. Wreszcie, ponieważ odczynnik do transfekcji stosowany w niniejszym protokole umożliwia transfekcję DNA lub siRNA według producenta, protokół jest również interesujący dla tych, którzy dążą do wykonywania podejść macierzowych w celu nadekspresji lub knockdownu genów. Płytki docelowe wstępnie wypełnione DNA można przechowywać do 7 dni przed użyciem w teście transfekcji bez utraty skuteczności, co jest kolejną zaletą poniższego protokołu dla tego rodzaju aplikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zaawansowane przygotowania

  1. Przygotowanie programów obsługi cieczy perystaltycznych
    UWAGA: Dla etapów dozowania rozcieńczalnika i komórek w protokole należy przygotować dedykowany program, biorąc pod uwagę wysokość głowicy dozującej do użytej płytki i zamierzenie kroku.
    1. W przypadku etapu dozowania rozcieńczalnika 1 μl zamontuj kasetę o pojemności 1 μl i przygotuj program z ustawieniami opisanymi w krokach 1.1.1.1 i 1.1.1.2.
      1. Dostosuj parametr natężenia przepływu na Wysoki, aby uzyskać najlepszą przepustowość, ponieważ na tym etapie nie oczekuje się żadnych uszkodzeń materiału biologicznego. Dostosuj wysokość dozowania do 9,6 mm (zgodnie z użytą płytką do hodowli komórkowych, rysunek uzupełniający 1), aby kropla o pojemności 1 μl dotknęła dna studzienek podczas dozowania.
        UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć zatrzymywania kropelek na głowicy dozującej do momentu osiągnięcia wystarczającej objętości do upuszczenia.
      2. Wyreguluj wysokość płytki w świetle do 14.4 mm, aby umożliwić swobodne przemieszczenie głowicy dozującej nad płytką po dozowaniu każdego rzędu. Kontroluj wzrokowo prawidłowe ustawienia wysokości głowicy do obsługi cieczy perystaltycznej: upewnij się, że podczas dozowania na końcówkach dozujących nie są zatrzymywane żadne krople i sprawdź, czy głowica jest wystarczająco wysoka, aby umożliwić przemieszczenie głowicy po dozowaniu każdego rzędu.
        UWAGA: Unikanie zatrzymywania kropli jest kluczowym parametrem, ponieważ pogorszy to dokładność objętości dozowania.
    2. Aby dozować zawiesinę komórek o pojemności 40 μl, zamontuj kasetę o pojemności 10 μl i przygotuj program z ustawieniami opisanymi w krokach 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Dostosuj parametr natężenia przepływu na Niski, aby dozować ogniwa z niską prędkością, aby uniknąć potencjalnych uszkodzeń komórek przez naprężenia ścinające i duży wpływ na dno studni. Ustawić wysokość dozowania na 11,43 mm (zgodnie z użytą płytką do hodowli komórkowych, rysunek uzupełniający 1), wystarczająco wysoką, aby zmniejszyć wpływ komórek na dno studzienek podczas procesu dozowania, ale wystarczająco niską, aby uniknąć zatrzymywania kropel na głowicy dozującej. Wyreguluj wysokość płytki w świetle do 16 mm, aby umożliwić swobodne przemieszczenie głowicy dozującej nad płytką po dozowaniu każdego rzędu.
      2. Kontroluj wzrokowo prawidłowe ustawienia wysokości głowicy do obsługi cieczy perystaltycznej: upewnij się, że podczas dozowania na końcówkach dozujących nie są zatrzymywane żadne krople i sprawdź, czy głowica jest wystarczająco wysoka, aby umożliwić przemieszczenie głowicy po dozowaniu każdego rzędu.
        UWAGA: Unikanie zatrzymywania kropli jest kluczowym parametrem, ponieważ doprowadzi to do wydania niewiarygodnego numeru ogniwa.
  2. Przygotowanie plazmidu DNA (klasyczny protokół ekstrakcji miniprep)
    1. Wyhodować przekształcony szczep bakterii DH5α w pożywce LB uzupełnionej antybiotykiem selekcyjnej ampicyliny 125 μg/ml (tabela materiałów) przez noc w temperaturze 37 °C i pod delikatnym mieszaniem (200 obr./min) na wytrząsarce orbitalnej (tabela materiałów).
    2. Zebrać 2 ml kultury, otoczkować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 6 000 x g i wyrzucić supernatant.
    3. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 250 μl buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego RNazę A (tabela materiałów). Dodać 250 μl buforu do lizy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Zatrzymać reakcję lizy, dodając 300 μl buforu neutralizującego (tabela materiałów) i krótko wprowadzając vortext. Odwirowywać probówki przez 5 minut przy 11 000 x g.
    5. Umieścić nową minikolumnę plazmidową (tabela materiałów) w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i zdekantować supernatant w kolumnie, wirując przez 1 minutę przy 11 000 x g.
    6. Wyrzuć przepływ i umieść minikolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
    7. Przemyć minikolumnę plazmidową 500 μl opcjonalnego buforu płuczącego (tabela materiałów) i odwirować przez 1 minutę przy 11 000 x g, zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Odrzuć przepływ i umieść minikolumnę plazmidu z powrotem w probówce zbiorczej.
    9. Dodać 700 μl buforu myjącego (tabela materiałów) uzupełnionego etanolem i odwirowywać przez 1 minutę przy 11 000 x g, zgodnie z zaleceniami producenta.
    10. Wyrzuć przepływowy i odwiruj minikolumnę plazmidową i jej probówkę zbiorczą jeszcze 1x przez 2 minuty przy 11 000 x g, aby wysuszyć membranę krzemionkową.
    11. Umieścić wysuszoną minikolumnę plazmidową w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 30 μl wody destylowanej podgrzanej w temperaturze 60 °C, inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowywać przez 1 minutę przy 11 000 x g.
    12. Odrzucić minikolumnę plazmidu i zachować eluat zawierający oczyszczony plazmid DNA.
    13. Zmierzyć stężenie DNA w eluowanym DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego (tabela materiałów).
      1. Włącz spektrofotometr i wybierz ustawienia pomiaru DNA.
      2. Podnieś ramię próbkujące spektrofotometru i odpipetuj 1 μl wody na cokół pomiarowy, aby wykonać ślepą kalibrację.
      3. Opuść ramię do pobierania próbek, rozpocznij ślepy pomiar i poczekaj na zakończenie.
      4. Podnieś ramię do pobierania próbek i wytrzyj próbkę z górnego i dolnego cokołu.
      5. Pobrać pipetę 1 μl roztworu DNA na dolny cokół, aby go zmierzyć.
      6. Opuść ramię do pobierania próbek, rozpocznij pomiar stężenia DNA i poczekaj na zakończenie.
      7. Podnieś ramię do pobierania próbek i wytrzyj próbkę z górnego i dolnego cokołu.
      8. W celu przeprowadzenia dalszych pomiarów stężenia DNA należy powtórzyć kroki 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. Po zakończeniu pomiarów roztwory DNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

2. Eksperymentalny projekt i generowanie list wyboru do sterowania dozownikami opartymi na ADE

UWAGA: Dedykowane "przyjazne dla użytkownika" makro arkusza kalkulacyjnego zostało opracowane do zarządzania ilością DNA i mieszania do czterech plazmidów w formacie płytki 384-dołkowej. Na podstawie wprowadzonego projektu eksperymentalnego makro generuje pliki niezbędne do sterowania protokołem transfekcji DNA opartym na ADE za pomocą nanodozownika. Aby wygenerować te pliki, należy wypełnić kilka pól w arkuszu szablonów, jak pokazano na Rysunek 2.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Generowanie list wyboru do sterowania dystrybucją ADE za pomocą makra arkusza kalkulacyjnego. Należy spełnić kilka parametrów, a mianowicie: (1) odczynnik do transfekcji (TR) i minimalne/maksymalne objętości, które należy użyć w płytce źródłowej, (2) początkowe stężenia plazmidu, które mają być dozowane na płytce źródłowej, oraz (3) projekt całej płytki, w tym oczekiwane ilości plazmidu i multipleksowanie w każdym z 384-dołków. (4) Aktywacja funkcji Generuj listy wyboru umożliwia weryfikację różnych pól, a po prawidłowym wypełnieniu automatycznie generowane są listy wyboru do dyspensy DNA i TR oraz niezbędny szablon płytki źródłowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wprowadź parametry protokołu nanodyspensera w różowych polach. Ustawić wartość mieszaniny odczynnika do transfekcji (TR) na 500 nL. Ustaw minimalną wartość objętości w studzienkach płytki źródłowej na 4 μl. Ustaw maksymalną objętość w studzienkach płytki źródłowej na 11.25 μL.
    UWAGA: Zastosowany tutaj nanodozownik może przenieść maksymalnie 500 nL w jednym przebiegu ADE. Te różowe pola są wstępnie wypełnione zalecanymi wartościami, ale można je modyfikować zgodnie z potrzebami użytkownika.
  2. Wprowadź początkowe stężenia DNA 100 ng/μl w niebieskich polach odpowiadających leżącemu poniżej DNA.
    UWAGA: Ta wartość jest wcześniej zdefiniowanym optymalnym stężeniem, ale może być jednak modyfikowana w zależności od potrzeb użytkownika.
  3. Wprowadź żądaną ilość DNA w szarych/zielonych polach. Wprowadź ilości i nazwy plazmidów dla 384 dołków, zapewniając tę samą pisownię, jeśli ten sam plazmid jest używany w kilku studzienkach.
  4. Wygeneruj projekt płytki źródłowej, pliki list wyboru i plik przewodnika po pipetowaniu. Kliknij przycisk Generuj listy wyboru, aby umożliwić makrowi wygenerowanie plików DNA-Picklist.csv, T.R.-Picklist.csv i 384-Wells-Pipetting-Guide.csv na podstawie danych zebranych na odpowiednim arkuszu. W razie potrzeby popraw wartości komórek wypełnionych pomarańczą, ponieważ wskazują one błędy lub objętości, których nanodozownik nie może obsłużyć.
  5. Wydrukuj szablon(y) z arkusza płyty źródłowej. Wskazane są nazwy plazmidów i minimalna objętość do wypełnienia studzienek. Podobnie, objętości mieszaniny odczynników do transfekcji, które będą musiały zostać następnie wypełnione w następujących studzienkach, są oznaczone jako TR i podświetlone na zielono.

3. Przygotowanie płytki źródłowej DNA za pomocą aplikacji do pipetowania 384-dołkowego

  1. Rozcieńczyć przechowywany plazmid DNA od kroku 1.2.14 do 100 ng/μl za pomocą wody destylowanej.
  2. Skalibruj siatkę 384-dołkową do wymiarów płytki: otwórz aplikację Przewodnik do pipetowania 384-dołkowego na tablecie (Rysunek 3). Umieść płytkę źródłową na siatce na dolnym ekranie, a w lewym górnym menu kalibracji kliknij + lub - (lub użyj czerwonego kursora), aby zwiększyć lub zmniejszyć rozmiar siatki i dołków, aby dostosować zielone dołki do czterech narożnych dołków płytki.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Korzystanie z aplikacji do pipetowania 384-dołkowego. (1) Kalibracja siatki 384-dołkowej do rozmiaru płytki; (2) ) Montaż uniwersalnego adaptera do płyty drukowanej w 3D do tabletu za pomocą taśmy dwustronnej; (3) Umieszczenie płytki na adapterze; (4) Przemieszczenie siatki w celu wyśrodkowania jej do zamontowanej płyty. (5) Blokada kroku kalibracji. (6) Otwarcie pliku guide.csv pipetowania 384 dołków. (7) Biorąc pod uwagę listę plików, wniosek wskaże oczekiwaną nazwę tabliczki źródłowej, odczynnik (odczynnik DNA lub odczynnik do transfekcji), stężenie i objętość do dozowania do studzienek docelowych, które będą oświetlane jeden po drugim. (8) Przyciski strzałek w lewo i w prawo umożliwiają użytkownikowi postępowanie zgodnie z instrukcją pipetowania w celu łatwego dozowania odczynników zgodnie z szablonem (szablonami) płytki źródłowej makra w arkuszu kalkulacyjnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą taśmy dwustronnej zamontuj adapter płyty wydrukowanej w 3D na ekranie, aby uniknąć ruchów płyty źródłowej podczas dozowania. W razie potrzeby przesuń skalibrowaną siatkę za pomocą strzałek obrotu i przycisków Góra/Dół/Prawo/Lewo, aby dostosować siatkę na ekranie do pozycji płyty. Gdy rozmiary siatki i studni zostaną prawidłowo skalibrowane i zlokalizowane, zaznacz pole Zablokuj kalibrację.
  2. Kliknij PLIK i otwórz plik guide.csv pipetowania 384 dołków. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby ręcznie dozować wskazaną objętość wskazanego plazmidu o wskazanym stężeniu we wskazanym na biało dołku, odpowiadającym właściwemu docelowemu miejscu docelowemu oczekiwanej płytki. Użyj strzałek - lub +, aby cofnąć się lub przejść dalej w procesie dozowania DNA. Przerwij dozowanie po dotarciu do pierwszego roztworu odczynnika do transfekcji, który ma zostać załadowany.
  3. Po zakończeniu dozowania DNA wyjmij płytkę źródłową z adaptera. Jeśli konieczne jest napełnienie kilku płytek źródłowych, umieść nową płytkę źródłową na adapterze i postępuj zgodnie z instrukcjami dozowania. Po zakończeniu dozowania DNA odwirować płytkę (płytki) źródłową wypełnioną DNA (przy 1,500 x g przez 2 minuty), aby zapewnić prawidłowe wyrównanie cieczy i usunąć pęcherzyki prowadzące do niedokładności transferów opartych na ADE.

4. Dozowanie rozcieńczalnika 1 μl na bazie płynu perystaltycznego na płycie docelowej

UWAGA: Wykonaj kroki 4.1-4.5 w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Zdezynfekuj głowicę kasety o pojemności 1 μl, spryskując ją środkiem dezynfekującym w sprayu (tabela materiałów) i pozwól, aby roztwór dostał się do uchwytu końcówki. Wchłonąć resztki środka dezynfekującego na papierze chłonnym. Zamontuj kasetę o pojemności 1 μl na urządzeniu do obsługi cieczy perystaltycznej. Włącz urządzenie i upewnij się, że ustawienie typu kasety jest prawidłowe (1 μL), a także format płyty (384 dołki).
  2. Zdezynfekuj całe światło rurki: włóż organizer probówki (trzymając osiem probówek razem) do sterylnego naczynia i napełnij je 5 ml 70% alkoholu. Korzystając z funkcji zalewania urządzenia do obsługi cieczy perystaltycznej, najpierw przepłucz alkohol w przewodach, a następnie przepłucz go, przepuszczając 5 ml wody destylowanej i 5 ml pożywki bez surowicy (zmodyfikowana pożywka Eagle's [DMEM] firmy Dulbecco uzupełniona 100 U/ml penicyliny-streptomycyny; Tabela materiałów), kolejno napełniając to samo naczynie. Upewnij się, że żadna końcówka nie jest zatkana, sprawdzając wzrokowo przepływ cieczy ze wszystkich z nich.
  3. Zalać rurkę pożywką bez surowicy, napełniając nowe sterylne naczynie 10 ml wstępnie podgrzanego podłoża bez surowicy i zanurzając w nim organizer probówki. Naciśnij przycisk prime na perystaltycznej cieczy i przytrzymaj go przez około 10 sekund. Po raz kolejny upewnij się, że żadna końcówka nie jest zatkana, wizualnie sprawdzając przepływ cieczy ze wszystkich z nich.
  4. Napełnij płytkę 1 μl rozcieńczalnika. Umieścić sterylną 384-dołkową płytkę hodowlaną (miejsce docelowe) na nośniku płytki do obsługi płynów perystaltycznych i zdjąć jej pokrywkę.
  5. Uruchom wstępnie skalibrowany program, aby dozować 1 μl do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Czas dozowania wynosi około 8 s. Następnie załóż pokrywkę płytki 384-dołkowej.
    UWAGA: Alternatywnie ten krok można wykonać ręcznie, w szafie bezpieczeństwa, za pomocą wielokanałowej mikropipety.

5. Przeprowadzenie ankiety w celu kontroli ręcznie dozowanych objętości

UWAGA: Aby uzyskać szczegóły, zobacz Rysunek 4.

  1. Uruchom program nanodozownika, przejdź do zakładki diagnostyka, zaznacz pole Wyjście płytki źródłowej, załaduj płytkę źródłową do uchwytu płytki i zaznacz In, aby wprowadzić płytkę. Po wyświetleniu monitu wybierz 384LDV_AQ_B2, aby ustawić nanodozownik w trybie dozowania buforu wodnego, a następnie naciśnij OK.
  2. Wybierz Ankieta w menu Różne i kliknij Uruchom. Wybierz wstępnie wypełnione studnie do analizy i kliknij przycisk Przejdź. Sprawdź, czy zmierzone objętości są zgodne z oczekiwanymi i upewnij się, że żadne studzienki nie zostały załadowane objętościami większymi niż 12 μl, ponieważ pozwoli to uniknąć transferów.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Definiowanie parametrów oprogramowania do badania ankietowego.(1) Uruchom program nanodozownika. (2) Otwórz kartę Diagnostics (Diagnostyka). (3) Włóż płytkę źródłową, zaznaczając opcję Out (Wyjście) dla płytki źródłowej, a następnie In. (4) Zdefiniuj typ płyty źródłowej w menu, gdy zostaniesz o to poproszony. (5) W polu Różne wybierz opcję Ankieta z menu rozwijanego. (6) Uruchom program ankietowy, klikając przycisk Uruchom. (7) Wybierz wstępnie wypełnione studzienki do pomiaru. (8) Rozpocznij analizę, klikając przycisk Przejdź. (9) Po przeprowadzeniu badania zmierzone objętości są zapisywane w odpowiednich wybranych studzienkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Sterowana ADE dystrybucja DNA do płytki docelowej

  1. Uruchom oprogramowanie listy wyboru, ustaw 384-dołkowe typy płytek źródłowych i docelowych odpowiednio na 384_LDV i Greiner 384PS_781096 (Rysunek 5). Ustaw urządzenie w trybie dozowania buforu wodnego, wybierając 384LDV_AQ_B2, a następnie odznacz "optymalizuj przepustowość transferu".

figure-protocol-4
Rysunek 5: Wydajność dyspensacji opartych na liście wyboru. (1) Uruchom oprogramowanie nanodozownika. W zakładce Protokół wybierz (2) format płytki próbki, (3) typ płytki docelowej i (4) odznacz opcję "optymalizuj przepustowość transferu". (5) Wybierz zakładkę Pick List (Lista wyboru). (6) Kliknij na Import (Importuj) i wybierz odpowiedni plik *.csv (DNA-PickList lub T.R.-Picklist). (7) Po wybraniu kliknij Importuj. (8) Kliknij przycisk Play (Graj) i zapisz protokół. (9) Wykonaj symulację dyspensy, klikając na Symuluj, lub (10) Rozpocznij zaprogramowaną dyspensę, klikając Uruchom. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wybierz zakładkę "Wybierz listę", kliknij Importuj, wybierz plik DNA-Picklist.csv. Kliknij przycisk "Odtwórz" i zapisz protokół. Kliknij przycisk Symulacja, aby przeprowadzić symulację zaprogramowanych zwolnień i upewnić się, że lista wyboru jest zgodna z oczekiwanym projektem eksperymentalnym. Po zakończeniu kliknij Zamknij.
  2. Kliknij przycisk Odtwórz, a następnie Uruchom, aby uruchomić program dozowania: po wyświetleniu monitu włóż żądaną płytkę źródłową (roztwory DNA napełnione ręcznie) i płytkę docelową (wypełnioną rozcieńczalnikiem) do nanodozownika.
    UWAGA: Czas dozowania wynosi około 5-20 minut dla kompletnej płytki 384-dołkowej, w zależności od wybranych objętości i całkowitej liczby dozowników w projekcie eksperymentalnym.
  3. Alternatywnie, wstrzymaj protokół w tym miejscu, ponieważ płytki wypełnione rozcieńczalnikiem i DNA mogą wytrzymać przechowywanie w suchym lub zamrożonym miejscu do 7 dni. Do przechowywania w suchym miejscu pozostaw talerze do wyschnięcia na stole w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je w ten sam sposób. Rozmrozić i odwirować (w ilości 1 500 x g przez 2 minuty) zamrożone przechowywane płytki przed użyciem w etapie transfekcji (sekcja 7).
     

7. Dozowanie odczynnika transfekcyjnego sterowanego przez ADE

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć doraźnie odczynnik do transfekcji lipopoliplexu w podłożu bez surowicy do 1x końcowego stężenia. Odwirować i natychmiast dozować tę mieszaninę odczynników do transfekcji zgodnie z predefiniowaną płytką źródłową (płytkami) zaprojektowaną przez makro i przy użyciu wstępnie skalibrowanej 384-dołkowej aplikacji do pipetowania, jak opisano w kroku 3.4.
    UWAGA: Nie należy odwirowywać płytki źródłowej po załadowaniu odczynnikiem, ponieważ po odwirowaniu nie zauważy się transfekcji.
  2. Uruchomić program nanodozownika, aby przeprowadzić "badanie" zgodnie z opisem w sekcji 5, w celu kontrolowania objętości wszystkich ręcznie napełnianych studzienek TR płytki źródłowej (płytek) źródłowej, aby uniknąć błędów dozowania spowodowanych objętościami przekraczającymi 12 μl.
  3. Kliknij przycisk Resetuj, aby wyczyścić listę próbek z listy wyboru DNA w oprogramowaniu listy wyboru i sprawdź, czy parametry urządzenia są nadal ustawione na wodne oraz na używane płytki źródłowe i docelowe, jak w kroku 6.1.
  4. Kliknij Importuj i wybierz plik TR-Picklist.csv. Kliknij przycisk Odtwórz i zapisz protokół, jeśli zostaniesz o to poproszony, a następnie (jest to opcjonalnie, ale zdecydowanie zalecane) przeprowadź symulację zaprogramowanych dozowania mieszaniny odczynników do transfekcji, aby zapewnić prawidłowe zaprojektowanie dozowników, klikając przycisk Symuluj. Po zakończeniu kliknij Zamknij.
  5. Kliknij przycisk Odtwórz, a następnie Uruchom, aby uruchomić program dozowania: zgodnie z życzeniem umieść płytkę źródłową (płytkę źródłową) (wypełnioną mieszaniną TR) i płytkę docelową (wypełnioną rozcieńczalnikiem i DNA) w nanodozowniku.
    UWAGA: Czas dozowania jest krótszy niż 20 minut dla kompletnej płytki 384-dołkowej przy dozowaniu 500 nL mieszaniny TR.
  6. Inkubować 15-30 minut w temperaturze pokojowej po dodaniu TR do DNA, jak wskazano w protokole producenta.

8. Dozowanie komórek opartych na płynie perystaltycznym

  1. Przygotuj manipulator cieczy perystaltycznej do dozowania komórek. Zdezynfekuj głowicę kasetową o pojemności 10 μl, spryskując ją środkiem dezynfekującym Aniospray Surf 29 i wchłaniając resztki na papierze. Zamontuj kasetę na urządzeniu do obsługi cieczy perystaltycznej, zmień ustawienie typu kasety na 10 μl i upewnij się, że format płytki jest ustawiony na 384 dołki.
  2. Zdezynfekuj rurkę kasety o pojemności 10 μl zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4.2. Zanurz organizer probówek w sterylnym naczyniu i przepłucz rurkę 5 ml 70% alkoholu, następnie 5 ml wody destylowanej, a na koniec 5 ml pożywki bez surowicy, kolejno napełniaj w tym samym naczyniu i aż do opróżnienia każdej probówki.
  3. Przygotować zawiesinę komórek do dozowania. Z konfluentującego się naczynia do hodowli komórek HeLa B10 przemyć komórki 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), a następnie dysocjować komórki trypsyną/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Sprawdzić dysocjację komórek pod mikroskopem i zatrzymać działanie trypsyny/EDTA, dodając 10 ml kompletnej pożywki (DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny; patrz tabela materiałów) do naczynia hodowlanego. Zbierz komórki do probówki o pojemności 50 ml i policz komórki pod mikroskopem, używając kuwety Malasseza lub automatycznego licznika komórek.
  5. Przygotować co najmniej 25 ml zawiesiny komórek HeLa o stężeniu 37 500 komórek/ml w kompletnym pożywce (tj. 1500 komórek/40 μl) na kompletną płytkę 384-dołkową, aby zapewnić zalewanie probówki i dozowanie 40 μl/studzienkę.
  6. Aby dozować komórki, napełnij nowe sterylne naczynie przygotowaną zawiesiną komórek i wymieszaj ją, aby uniknąć sedymentacji prowadzącej do niedokładności gęstości komórek w dozowaniu. Włóż organizer probówek do tego roztworu i naciskaj przycisk Prime, aż zawiesina ogniwa zacznie się spłukiwać z głowicy dozującej. Upewnij się, że żadna końcówka nie jest zatkana, wizualnie sprawdzając przepływ cieczy ze wszystkich z nich i upewnij się, że każda rurka jest załadowana zawiesiną komórek.
  7. Załaduj 384-dołkową płytkę docelową wypełnioną DNA i TR na płytkę nośnika do obsługi cieczy perystaltycznej i zdejmij jej pokrywę. Uruchom wstępnie skalibrowany program, aby dozować 40 μl zawiesiny komórek na kompletną płytkę 384-dołkową (tj. 1,500 komórek/dołek). Czas dozowania wynosi około 8 s. Załóż pokrywkę płytki 384-dołkowej.
    UWAGA: Alternatywnie, zawiesinę komórek o pojemności 40 μl można dozować ręcznie za pomocą wielokanałowej mikropipety.

9. Niestandardowy test biologiczny (monitorowanie wydajności transfekcji komórek)

UWAGA: Zgodnie z ustawieniami eksperymentu i celem eksperymentu, użyj wymaganych metod dla luminescencji, fluorescencji, badań przesiewowych o wysokiej zawartości i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). W tej części protokołu skuteczność transfekcji komórek jest oceniana za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu.

  1. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w atmosferze nasyconej wodą i aż do uzyskania odpowiedniej ekspresji białka.
    UWAGA: W tym przypadku 48-godzinny czas inkubacji jest używany dla komórek HeLa do monitorowania wydajności transfekcji, przy użyciu plazmidów eksprymujących tdTomato i mVenus.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną 48 godzin po transfekcji poprzez odwrócenie płytki, dodać 30 μl/studzienkę 10% formaliny za pomocą płynu perystaltycznego (kaseta 10 μl) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć formalinę, odwracając płytkę, a następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej z 0,1 ng/ml Hoechst rozcieńczonym w 1 roztworze PBS.
  4. Płukać komórki 3x przez 15 minut 80 μl 1x PBS dostosowanej do pH = 8 w celu odzyskania sygnału o wysokiej fluorescencji utraconego przez pH 6,9 na etapie inkubacji roztworu formaliny.
  5. Za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego uzyskaj obrazy dwóch lub trzech kanałów fluorescencyjnych (Hoechst, tdTomato i mVenus) sekwencyjnie za pomocą obiektywów 10x i odpowiedniego zestawu filtrów emisyjnych (odpowiednio 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol [DAPI], dsRed i izotiocyjanian fluoresceiny [FITC]).
  6. Aby ocenić wydajność transfekcji, użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić wydajność transfekcji za pomocą analizy skryptowej opartej na barwieniu jąder.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fW celu ustalenia, czy technologia ADE może być wykorzystana do automatycznego protokołu odwrotnej transfekcji, monitorowaliśmy efektywność transfekcji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając czerwonego fluorescencyjnego plazmidu eksprymującego tdTomato. W pierwszej kolejności, mając na celu określenie najlepszych parametrów transfekcji, poddano testom krzyżowym różne objętości rozcieńczalnika i całkowite ilości DNA. Objętość rozcieńczalnika użyto, aby kropelki DNA, po do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie i optymalizacja dokładnej, wysokoprzepustowej metody transfekcji dla danej linii komórkowej wymaga od naukowców przestrzegania kilku kluczowych parametrów opisanych w tej sekcji. Zdecydowanie zalecamy rozpoczęcie od zalecanych wartości w całym protokole, ponieważ te ustawienia zoptymalizowane pod kątem komórek HeLa okazały się również skuteczne w przypadku komórek HEK. Ponieważ jednak najlepsze parametry mogą zależeć od linii komórkowych i odczynników do transfekcji, optymalne warunki można określić, zmieniaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ujawnili otrzymanie następującego wsparcia finansowego na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu: Inserm, Uniwersytet w Lille, Instytut Pasteura w Lille, Conseil Régional du Nord, oraz PRIM-HCV1 i 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) i Wspólnota Europejska (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). Autorzy pragną podziękować dr S. Moureu, dr B. Villemagne, dr R. Ferru-Clémentowi i dr H. Groultowi za krytyczną recenzję i poprawki manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
384LDV MicroplateLabcyteLP-0200
384-dołkowa mikropłytka μ PrzezroczystyGreiner781906
AmpicilinSigmaA9393-5GSelection antybiotyk na bakterie transformowane za pomocą wektora ekspresji ampiciliny
Tablet z systemem Android SamsungGalaxy Note 8służy do prowadzenia użytkownika podczas ręcznego dozowania płytki źródłowej
Aniospray Surf 29Anios2421073środek dezynfekujący do czyszczenia głowicy MicroFlo
Columbus oprogramowaniePerkin Elmeroprogramowanie do analizy obrazu
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronianPożywka do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific10566032
Oprogramowanie Echo Cherry Pick 1.5.3Oprogramowanie Labcyteumożliwiające dozowanie oparte na ADE przez urządzenie Echo550 z pliku *.csv; oprogramowanie nanodozownika
Echo550LabcyteDozownik na bazie ADE
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000044do dodawania do pożywki do hodowli komórkowych
Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Ldo utrwalania
komórek HeLaATCCHeLa (ATCC® CCL-2&handel ;)
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodnyThermo Fisher ScientificH357010 mg/ml roztwór w wodzie
INCell Analyzer 6000GE Healthcare29043323zautomatyzowana laserowa platforma obrazowania konfokalnego
LB mediumThermoischer Scientific
LB Bulion Base (Lennox L Broth Base)®, proszek		12780052pożywka hodowlana do rozwoju
bakteriiBufor do lizy (A2) Macherey-Nagel740912.1Bufor z zestawu NucleoSpin Plasmid służący do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
MicroFlo 10µ Kaseta LBiotek Instruments Inc7170013do użytku z dozownikiem Microflo
MicroFlo 1μ Kaseta LBiotek Instruments Inc7170012do użytku z dozownikiem
Microflo Dozownik MicroFloBiotek Instruments Inc7171000do obsługi cieczy oparte na pompie perystaltycznej
Spektrofotometr mikroobjętościowy SpektrofotometrDenovixDS-11Zmierz stężenie DNA w próbkach
plazmidumVenuscDNA mVenus sklonowano przez enzymatyczne trawienie restrykcyjne i ligację w miejscach Age1/BsrG1 plazmidu tdTomato-N1Typ wektora: Ekspresja ssaków, Białko fuzyjne:
Macherey-Nagel740913.1Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
Zestaw plazmidu NucleoSpinMacherey-Nagel740588.50służy do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) ThermoFisher Scientific31985070
opcjonalnie bufor do płukaniaBufor do płukania (A4)Macherey-Nagel740914.1Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z wytrząsarki orbitalnej z hodowli bakteryjnej
 inkubowana wytrząsarka o dużej pojemności444-7084Służy do hodowli bakterii pod delikatnym mieszaniem i 37° C
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific1514012210 000 U/ml
soli fizjologicznej buforowanej fosforanamiThermo Fisher Scientific10010001
Minikolumny plazmidoweMacherey-Nagel740499.250Minikolumna membrany krzemionkowej do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej
Bufor do ponownego zawieszania (A1) Macherey-Nagel740911.1Bufor z zestawu plazmidowego NucleoSpin służący do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej
RNAzy AEnzym Macherey-Nagel740505z zestawu plazmidowego NucleoSpin używany do przygotowania plazmidu z hodowli bakteryjnej
plazmid tdTomato-N1AddgenePlasmid #54642Typ wektora: Ekspresja ssaków, Białko fuzyjne: tdPomidor 
TransIT-X2 Dynamic Delivery SystemMirus BioMIR 6000
Wash Buffer (AW)Macherey-Nagel740916.1Bufor z zestawu NucleoSpin Plasmid służący do przygotowania plazmidu z kultury bakteryjnej
Drukarka 3DCrealityCR10Ssłużąca do drukowania adaptera płyty
Blender Software   https://www.blender.org/
Wolne oprogramowanie na licencji GNU General Public License (GPL).		Wersja 2.79bsłużąca do projektowania adaptera płyty
urządzenie Bufor neutralizacyjny mVenus (A3) 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36(2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4(2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1(2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937(2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023(2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wysokoprzepustowa transfekcjatechnologia ADEp ytka 384 do kowamakro arkusza kalkulacyjnegoprotok nanodozownikatransfekcja kom rekdystrybucja plazmid wodczynnik do transfekcji

Powiązane artykuły