Artykuł metodologiczny

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59573

⸱

9 maja 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Pathobiochemistry and Genetics, Institute of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University Vienna, 2School of Medical Engineering and Applied Social Sciences, University of Applied Sciences Upper Austria

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein

.

Streszczenie

Cząsteczki lipoprotein są głównie transporterami lipidów i cholesterolu w krwiobiegu. Ponadto zawierają niewielkie ilości nici niekodującego mikroRNA (miRNA). Ogólnie rzecz biorąc, miRNA zmienia profil ekspresji białka w wyniku interakcji z informacyjnym RNA (mRNA). W związku z tym wiedza na temat względnej i bezwzględnej zawartości miRNA w cząsteczkach lipoprotein jest niezbędna do oszacowania biologicznego efektu wychwytu cząstek komórkowych. W tym miejscu przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) w celu określenia bezwzględnej zawartości miRNA w cząstkach lipoprotein - przykład pokazany dla natywnych i wzbogaconych w miRNA cząstek lipoprotein. Względna zawartość miRNA jest oznaczana ilościowo za pomocą wielodołkowych kart z matrycą mikroprzepływową. Co więcej, protokół ten pozwala naukowcom oszacować komórkowe miRNA, a tym samym tempo wychwytu cząstek lipoproteiny. Znaczny wzrost poziomu komórkowego miRNA można zaobserwować przy użyciu cząstek lipoprotein o dużej gęstości (HDL) sztucznie załadowanych miRNA, podczas gdy inkubacja z natywnymi cząstkami HDL nie daje znaczącego efektu ze względu na ich raczej niską zawartość miRNA. W przeciwieństwie do tego, wychwyt komórkowy cząstek lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) - ani z natywnym miRNA, ani sztucznie nim załadowany - nie zmienił poziomu komórkowego miRNA.

Wprowadzenie

Cząsteczki lipoprotein składają się z monowarstwy amfifilowych lipidów i cholesterolu, otaczającej rdzeń z estrów cholesterolu i tłuszczów trójglicerydowych. Cała cząstka jest stabilizowana przez apolipoproteiny osadzone w błonie, które definiują biologiczną funkcjonalność cząstki. Cząsteczki lipoprotein można rozróżnić ze względu na ich rosnącą gęstość, a tym samym zmniejszający się rozmiar, a mianowicie jako lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoproteiny o średniej gęstości (IDL), LDL i HDL. Pomimo transportu składników nierozpuszczalnych w wodzie w krwiobiegu, wykazano, że cząsteczki HDL przenoszą niekodujące nici miRNA1,2. Mikro-RNA to klasa krótkich (zwykle dwa tuziny nukleotydów) nici RNA, które degradują wewnątrzkomórkowo komplementarne nici mRNA, a tym samym zmieniają profil ekspresji niektórych białek3,4,5,6. Ponadto zmiany profilu miRNA stwierdzono w różnych chorobach, a zatem profil ten ma zastosowanie jako biomarker do diagnozy i rokowania. Zewnątrzkomórkowy transport miRNA między komórkami za pośrednictwem cząstek lipoprotein może służyć jako dodatkowy mechanizm międzykomórkowej modulacji poziomu mRNA. Aby ilościowo oszacować efekt biologiczny, potrzebna jest wiedza dotycząca bezwzględnej i względnej zawartości miRNA w cząsteczkach lipoprotein.

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym jest odpowiednią i stosunkowo szybką metodą uzyskania tych informacji. W związku z tym można obliczyć względną wartość kwantyfikacji (RQ), a względne różnice między różnymi próbkami i frakcjami lipoprotein są możliwe do oszacowania. Wielodołkowe karty macierzy mikroprzepływowej to szybka i łatwa w użyciu metoda określania względnej obecności (równej wartości RQ) miRNA w próbce. Wielodołkowe karty macierzy mikroprzepływowej składają się z 96 lub 384 indywidualnych komór reakcyjnych do indywidualnych reakcji qPCR osadzonych w urządzeniu mikroprzepływowym. Każda komora zawiera wymaganą sondę hydrolizy i specyficzne startery qPCR dla jednego pojedynczego miRNA. Zaletami są krótki czas obsługi wynikający ze standaryzacji, prosty przepływ pracy i zmniejszona liczba etapów pipetowania. Ponadto minimalizowana jest wymagana objętość próbki. W przeciwieństwie do względnej kwantyfikacji, bezwzględna zawartość miRNA wymaga porównania wyników próbki qPCR ze standardowymi krzywymi znanych liczb bezwzględnych nici miRNA. Należy zauważyć, że ze względu na ich stosunkowo niską zawartość miRNA, standardowe, a ponadto nawet czułe na pojedyncze cząsteczki techniki obrazowania nie są wykonalne - sztuczne wzbogacanie cząstek lipoprotein w miRNA jest nieuniknione w celu zbadania interakcji komórkowych cząstek lipoprotein i transferu miRNA. W związku z tym delipidacja cząsteczki HDL, a następnie relipidacja7 umożliwia inkorporację, a tym samym wzbogacenie w nici miRNA. Podobne wzbogacenie cząsteczek LDL w miRNA nie jest możliwe ze względu na hydrofobowość białka apoB-100, które jest głównym składnikiem cząsteczki LDL. Jednak poprzez dodanie polarnego rozpuszczalnika dimetylosulfotlenku (DMSO), który jest w stanie przenikać przez błony lipidowe, cząsteczki LDL mogą być również sztucznie ładowane niciami miRNA.

Szybka mikroskopia sił atomowych (HS-AFM) to potężne narzędzie do charakteryzacji próbek biologicznych, oferujące subnanometrową rozdzielczość przestrzenną i subsekundową czasową8. W związku z tym jest to dobrze dopasowana technika do kontroli jakości zmodyfikowanych cząstek lipoprotein, ponieważ natywne / odtworzone / znakowane cząsteczki lipoprotein mogą być obrazowane w środowisku zbliżonym do fizjologicznego.

Tutaj krok po kroku prezentowany jest protokół oparty na qPCR, który pozwala określić bezwzględną/względną zawartość miRNA w cząsteczkach lipoprotein i próbkach komórek, co pozwala na oszacowanie szybkości pobierania cząsteczek lipoprotein komórkowych. Ponadto przedstawiono metodę wzbogacania cząstek lipoprotein w miRNA. Metoda ta może być dostosowana do ogólnej manipulacji zawartością lipoprotein, a tym samym wykazuje możliwość zastosowania cząsteczek lipoprotein jako celów dostarczania leków.

Protokół

Darowizny krwi zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu (EK-Nr. 51/207, EK-Nr. 1414/2016). Nomenklatura jest zgodna z wytycznymi Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE)9.

1. Izolacja cząsteczek lipoprotein z ludzkiej krwi

  1. Wychłodź ultrawirówkę do 4 °CPobrać krew od zdrowych ochotników po nocnym poście.
    UWAGA: Zazwyczaj wymaganych jest trzech dawców, z których każdy oddaje 80 ml krwi, oraz probówki do pobierania krwi zawierające kwas etylenediaminotetraoctowy (EDTA) jako antykoagulant.
  2. Wiruj w wirówce przy 20 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C następnie zebrać osocze (faza górna); unikać sił ścinających. Wyznaczyć całkowitą objętość V i w razie potrzeby dopasować do wielokrotności objętości probówki do wirowania, używając soli fosforanowo-buforowanej (PBS). Zmierzyć masę 1 ml trzykrotnie i obliczyć średnią gęstość ρ.
  3. Oblicz wymaganą ilość bromku potasu (KBr) do regulacji gęstości, korzystając z następującego równania10 (aby uzyskać pożądaną gęstość w gramach/mililitrze, należy użyć A = 1,019, a w przypadku objętości właściwej KBr należy zastosować Równowaga statyczna, równanie ΣFx=0, schemat edukacyjny, koncepcja fizyczna, analiza stanu równowagi.= 0,364 ml/g). Do osocza dodać KBr i delikatnie mieszać, aby uniknąć sił ścinających, aż KBr całkowicie się rozpuści.
    Wzór na pomiar gęstości; równanie obrazujące zależność matematyczną; narzędzie edukacyjne.
  4. Zmierz gęstość zgodnie z opisem w kroku 1.2 i w razie potrzeby skoryguj ją ponownie, dodając więcej KBr. Napełnij i szczelnie zamknij probówki do wirowania odpowiednie do ultrawirowania, wlewając do nich osocze. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ w przeciwnym razie probówka może ulec zmiażdżeniu. Umieść probówki w rotorze zgodnie z instrukcjami producenta i wiruj przy 214 0 x g g przez 20 h w temperaturze 4 °C.
  5. Otwórz probówki zgodnie z instrukcją producenta i odrzuć górną fazę zawierającą VLDL i IDL. Wyznacz objętość całkowitą V i w razie potrzeby doprowadzić objętość do wielokrotności objętości probówki do wirowania, używając PBS.
  6. Wyznacz gęstość ρ dolnej frakcji. Obliczyć wymaganą ilość KBr do regulacji gęstości (należy zastosować A = 1,063). Mieszaj delikatnie, aby uniknąć sił ścinających, aż KBr zostanie rozpuszczony. Powtórz krok 1.4.
  7. Usunąć i zebrać górną fazę zawierającą cząsteczki LDL. Roztwór cząsteczek LDL przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze 4 °CWyznacz całkowitą objętość V i w razie potrzeby dostosować do wielokrotności objętości probówki do wirowania, używając PBS. Wyznaczyć gęstość ρ dolnej frakcji, zgodnie z opisem w kroku 1.2.
  8. Oblicz wymaganą ilość KBr do regulacji gęstości (użyj A = 1,20) i dodać go. Mieszać delikatnie, aby uniknąć sił ścinających, aż KBr zostanie rozpuszczony. Powtórzyć krok 1.4.
  9. Usunąć i zebrać górną fazę zawierającą cząsteczki HDL. Wyznaczyć jej całkowitą objętość. V i w razie potrzeby doprowadzić do objętości będącej wielokrotnością objętości probówki do wirowania, używając PBS. Wyznaczyć gęstość ρDrugi etap wirowania fazy górnej przy 214 0 x g przez 20 h w temperaturze 4 °C zaleca się usunięcie albuminy. W razie potrzeby powtórzyć krok 1.8. Odseparować i zebrać górną fazę zawierającą cząsteczki HDL.
  10. Przygotować i schłodzić co najmniej 20 l buforu do dializy (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) do 4 °CNamocz rurki do dializy (próg odcięcia masy cząsteczkowej: 12–14 kDa) i dodaj roztwór cząsteczek LDL i HDL zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadź dializę przeciwko 5 L buforu do dializy w 4 °C i wymień bufor po 1, 2 i 4 h.
  11. Po 24 h należy odzyskać roztwory cząsteczek lipoprotein z tub dializacyjnych i oznaczyć stężenie białka za pomocą metody Bradforda.11 lub inny odpowiedni. Roztwory cząsteczek HDL i LDL należy przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze 4 °C.

2. Alikwoty syntetycznego miRNA

UWAGA: Podczas pracy z oligonukleotydami RNA należy zachować warunki wolne od RNaz. Należy używać wyłącznie świeżych, jednorazowych wyrobów z tworzyw sztucznych i zawsze nosić rękawiczki, które należy często zmieniać. Należy stosować wyłącznie roztwory wolne od nukleaz. Wszystkie czynności należy wykonywać w lodzie.

  1. Wirować fiolkę otrzymaną od producenta z maksymalną siłą, aby utworzyć pellet liofilizowanego syntetycznego miRNA. Dodać odpowiednią objętość buforu Tris(hydroksymetyl)aminometanu (TRIS) 10 mM, pH 7.5, aby uzyskać końcowe stężenie miRNA 10 µM (stężenie zapasu).
  2. Delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół kilka razy w celu resuspensji. Przygotować alikwoty po 100 µL każda w sterylnych probówkach. Przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli nie są używane natychmiast. Unikać wielokrotnego rozmrażania i zamrażania.

3. Rekonstytucja cząsteczek HDL

  1. Delipidacja
    1. Przygotować bufor A (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM Tris/HCl [pH 8,0]). Schłodzić wirówkę do -10 °C. Schłodzić 10 mL mieszaniny etanolu i eteru dietylowego (3:2) do -20 °C.
      OSTRZEŻENIE: Podczas pracy z eterem dietylowym należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować w dygestorium, ponieważ substancja ta jest skrajnie łatwopalna i szkodliwa dla skóry.
    2. Objętość odpowiadającą 5 mg cząsteczek HDL zmieszać z 50 mL schłodzonej mieszaniny etanolu i eteru dietylowego (3:2) i inkubować przez 2 h w temperaturze -20 °C. Wirować przy 2 50 x g przez 10 min w temperaturze -10 °C.
    3. Odlać supernatant, a osad resuspender w 50 mL schłodzonej mieszaniny etanolu i eteru dietylowego za pomocą vortexa i inkubować po raz drugi przez 2 h w temperaturze -20 °C. Ponownie wirować przy 2 50 x g przez 10 min w temperaturze -10 °C.
      UWAGA: W razie potrzeby supernatant można liofilizować w celu analizy zawartości miRNA w frakcji lipidowej cząsteczek HDL.
    4. Osad wysuszyć w strumieniu gazu N2 i resuspender w 250 µL buforu A (patrz krok 3.1.1). Określić stężenie białka za pomocą testu Bradforda lub innego odpowiedniego testu i rozcieńczyć do stężenia końcowego 1 mg białka/250 µL buforu A.
      UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę. Roztwór przechowywać przez noc w 4 °C w atmosferze gazu obojętnego.
  2. Rekonstytucja
    1. Przygotować roztwór zapasowy fosfatydylocholiny (PC) w mieszaninie chloroformu i metanolu (2:1) o stężeniu 5,6 mg PC/mL. W analogiczny sposób przygotować roztwory zapasowe oleinianu cholesterolu (5 mg CO/mL) i cholesterolu (5 mg C/mL). Wszystkie roztwory przechowywać w -20 °C.
    2. W czystej probówce szklanej zmieszać 50 µL PC, 10 µL CO i 13,5 µL C. Objętości te odpowiadają przybliżonemu stosunkowi molowemu 10 PC:2 CO:4,8 C. Mieszaninę wysuszyć w strumieniu gazu N2, obracając probówkę, aby uzyskać jednorodną warstwę powierzchniową.
      UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę. Fiolkę szklaną (jeśli jest wymagane tworzenie zapasów) przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w -20 °C.
    3. Przygotować świeży roztwór sperminy 30 mM w buforze A. Jedną porcję (10 µL, 10 µM) syntetycznego miRNA (patrz krok 2.2) zmieszać z 10 µL roztworu sperminy i inkubować przez 30 min w 30 °C.
      UWAGA: W eksperymentach z kontrolą negatywną miRNA i/lub roztwór sperminy zastąpić taką samą objętością buforu A.
    4. Rozpuścić porcję master mixu PC/CO/C w mieszaninie z kroku 3.2.3.
    5. Przygotować roztwór deoksycholan sodu o stężeniu 30 mg/mL w buforze A i dodać 50 µL do roztworu z kroku 3.2.4. Mieszać w 4 °C przez 2 h.
    6. Dodać 250 µL roztworu delipidowanego HDL z kroku 3.1.4. Objętość ta odpowiada przybliżonemu stosunkowi molowemu 10 PC:22 CO:4,8 C:1 białka delipidowanego HDL. Mieszać w 4 °C przez noc.
  3. Dializa
    1. Schłodzić co najmniej 15 L PBS do 4 °C. Dodać 50 g kulek adsorbentu do 80 mL podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i mieszać przez 1 min. Odczekać 15 min, odlać supernatant i powtórzyć procedurę z użyciem PBS.
    2. Namoczyć kasety do dializy (próg odcięcia masy cząsteczkowej: 20 kDa) lub odpowiednie rurki do dializy i nanieść roztwór z kroku 3.2.6 za pomocą strzykawki zgodnie z instrukcją producenta.
    3. Dodać kulki adsorbentu z kroku 3.3.1 do 3 L PBS i przeprowadzić dializę w 4 °C. Wymienić bufor i kulki po 1 h oraz 2 h.
    4. Po 24 h odzyskać roztwór zrekonstytuowanych cząsteczek HDL (rHDL) i określić stężenie białka za pomocą testu Bradforda. Roztwór cząsteczek rHDL przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w 4 °C.

4. Znakowanie cząsteczek LDL

  1. Przygotować bufor LDL 10x (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM glikol etylenowy-bis(β-aminoetylu eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy [EGTA, pH 7,4]) i przechowywać go w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować świeży roztwór sperminy o stężeniu 30 mM w wodzie wolnej od RNaz. Wymieszać alikwot (10 µL, 10 µM) syntetycznego miRNA (patrz krok 2.2) ze 100 µL roztworu sperminy i inkubować przez 30 min w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: W eksperymentach z kontrolą negatywną zastąpić miRNA i/lub roztwór sperminy taką samą objętością buforu LDL 1x.
  3. Dodać 10 µL DMSO do roztworu miRNA/spermine z kroku 4.2 i rozcieńczyć go dalej za pomocą 1,2 mL buforu LDL 1x.
  4. Rozcieńczyć roztwór cząsteczek LDL za pomocą PBS do końcowego stężenia około 4 mg/mL, a następnie zmieszać 450 µL z 50 µL buforu LDL 10x. Inkubować przez 10 min na lodzie.
  5. Połączyć roztwór cząsteczek LDL z poprzedniego kroku z roztworem miRNA/spermine/DMSO (z kroku 4.3) i inkubować przez 2 h w temperaturze 40 °C.
  6. Przeprowadzić dializę analogicznie do opisu w sekcji 3.3 i odpowiednio przechowywać roztwór znakowanych cząsteczek LDL.

5. Kontrola jakości zrekonstytuowanych/znakowanych cząsteczek lipoprotein

UWAGA: W celu kontroli jakości średnicę i ogólny kształt cząsteczek lipoprotein można określić, na przykład, za pomocą AFM lub mikroskopii elektronowej (EM). W tym przypadku zastosowano HS-AFM do pomiaru rozkładu wielkości natywnych/rekonstytuowanych/znakowanych cząsteczek lipoprotein.

  1. Rozcieńczyć roztwór cząsteczek HDL/LDL w PBS (1:10–1:1 0) i inkubować go na świeżo łupanej miki przez 5 min. Aby łupać mikę12, przycisnąć taśmę klejącą do podłoża i usunąć górne warstwy miki, odrywając taśmę.
    UWAGA: W zależności od konkretnego urządzenia AFM, obszaru obserwacji oraz początkowego stężenia cząsteczek, czynnik rozcieńczenia należy dostosować tak, aby móc obserwować poszczególne cząsteczki.
  2. Po inkubacji opłukać próbkę PBS i przeprowadzić obrazowanie HS-AFM w PBS w trybie stukowym (tapping mode), używając wsporników o stałych sprężystości kcant < 0,2 N/m. Zaleca się stosowanie rozmiarów skanowania <1 µm2 oraz utrzymywanie sił obrazowania na jak najniższym poziomie.
  3. Wyznaczyć wysokość obrazowanych cząsteczek względem powierzchni miki przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.
    1. Wczytać dane do programu Gwyddion (oprogramowanie darmowe), wykryć cząsteczki za pomocą analizy ziaren (Mark grains by threshold) i ustawić próg powyżej tła podłoża. Wypłaszczyć obraz (Remove polynomial background), wybierając opcję Exclude masked region.
    2. Wyeksportować wartości wysokości wykrytych cząsteczek (Distribution of various grain characteristics) i powtórzyć te kroki dla wszystkich zarejestrowanych obrazów. Przeprowadzić analizę statystyczną poprzez utworzenie histogramów lub obliczenie funkcji gęstości prawdopodobieństwa uzyskanych wysokości cząsteczek.
  4. Powtórzyć kroki 5.1–5.3 dla natywnych, a także zrekonstytuowanych/znakowanych cząsteczek lipoprotein i porównać uzyskane wyniki w celu weryfikacji jakości cząsteczek. W przypadku zaobserwowania szczątków i/lub konglomeratów, odrzucić próbkę.

6. Hodowla komórkowa

  1. Hodować komórki adherentne zgodnie z uznanym protokołem (np. ldlA7-SRBI13) aż do osiągnięcia konfluencji.
    UWAGA: Wymagane jest przygotowanie kilku niezależnych komór w zależności od liczby eksperymentów (zalecane są dwie komórki na ustawienie eksperymentalne) oraz eksperymentów z kontrolą negatywną (zalecane są dwie komórki bez dodatku cząsteczek lipoprotein). Dodatkowo wymagane są dwie komórki do oznaczenia liczby komórek.
  2. Delikatnie przemyć komórki 3x podgrzanym wcześniej zrównoważonym roztworem soli Hank'a (HBSS), aby usunąć szczątki komórkowe, a następnie pokryć warstwę komórek odpowiednią objętością bezserumowej pożywki wzrostowej. Dodać odpowiednią objętość roztworu cząsteczek lipoprotein, aby uzyskać końcowe stężenie 50 µg/mL cząsteczek lipoprotein. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 h.
    UWAGA: W zależności od projektu eksperymentalnego i linii komórkowej, czas inkubacji musi zostać dostosowany w celu uzyskania wystarczającego (tj. mierzalnego) wzrostu poziomu komórkowego miRNA.
  3. Delikatnie przemyć komórki 3x podgrzanym (37 °C) HBSS, aby usunąć szczątki komórkowe/cząsteczki lipoprotein, a następnie pokryć warstwę komórek odpowiednią objętością pożywki bezserumowej.
  4. Oznaczyć gęstość komórek przy użyciu odpowiedniej metody (np. komory countingowej, automatycznego licznika komórek) w co najmniej dwóch niezależnych komórach, aby obliczyć liczbę komórek w objętości próbki z kroku 6.3. Liczba ta służy do normalizacji.

7. Ekstrakcja miRNA z próbek komórkowych i cząsteczek lipoprotein

UWAGA: Ekstrakcja miRNA z komórek jest przeprowadzana przy użyciu zestawu do ekstrakcji miRNA z następującymi modyfikacjami.

  1. Próbki komórkowe
    1. Wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C. Do dwóch komór zawierających komórki dodać po 350 µL odczynnika do lizy. W ramach eksperymentu kontrolnego (ujemnego) należy użyć komory bez komórek.
      UWAGA: Podczas pracy z odczynnikiem do lizy należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem, ponieważ odczynnik zawiera fenol i tiocyjanian.
    2. Odczekać 3–5 min (w zależności od linii komórkowej) do czasu odklejenia się komórek. W razie potrzeby sprawdzić odklejenie komórek za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Połączyć zawartość obu komór w probówce 1,5 mL.
    3. Za pomocą igły 20 G i strzykawki 5 mL zhomogenizować/rozbić próbkę 5–10 razy poprzez aspirację i inkubować przez 5 min. Dodać 140 µL chloroformu (CHCl3), energicznie wstrząsać przez 15 s i inkubować przez 3 min.
    4. Wirować przy 12 0 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wyłączyć chłodzenie wirówki.
    5. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki 1,5 mL; unikać mieszania/zanieczyszczenia faz, ponieważ interfaza zawiera DNA, a faza dolna białka. Dodać 1,5-krotność objętości 10% etanolu i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie.
    6. Umieścić kolumienkę wirówkową w probówce zbierającej 2 mL i dodać 700 µL mieszaniny z kroku 7.1.5. Wirować przy 8 0 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Odrzucić filtrat i powtórzyć ten krok dla pozostałej objętości próbki.
    7. Odrzucić filtrat i dodać 70 µL pierwszego buforu do płukania do kolumienki wirówkowej. Wirować przy 8 0 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej.
    8. Odrzucić filtrat i dodać 50 µL drugiego buforu do płukania do kolumienki wirówkowej. Wirować przy 8 0 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Powtórzyć cały ten krok po raz drugi, wydłużając czas wirowania do 2 min.
    9. Umieścić kolumienkę wirówkową w nowej probówce zbierającej 2 mL i wirować z maksymalną prędkością przez 1 min w celu osuszenia membrany.
    10. Umieścić kolumienkę wirówkową w probówce zbierającej 1,5 mL. W celu elucji dodać 30 µL wody wolnej od RNaz na środek membrany i wirować przy 8 00 x g przez 1 min. Powtórzyć cały ten krok po raz drugi, używając pierwszego filtratu jako roztworu elucyjnego. Krok odwrotnej transkrypcji należy przeprowadzić bezpośrednio po ekstrakcji; w przeciwnym razie przechowywać wyekstrahowane próbki miRNA w temperaturze -20 °C.
  2. Cząsteczki lipoprotein
    1. Przyjąć objętość próbki o najniższym stężeniu białka jako 10 µL (= maksymalna objętość próbki). Obliczyć objętości pozostałych próbek zgodnie z tą normalizacją, odwrotnie proporcjonalnie do ich stężenia. W eksperymentach kontrolnych (ujemnych) należy użyć 10 µL wody wolnej od RNaz.
      UWAGA: Normalizacja nie jest wymagana, ale ułatwia bezpośrednie porównanie wyników podczas etapu qPCR i analizy.
    2. Wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C. Do objętości próbki określonej w kroku 7.2.1 dodać 70 µL odczynnika do lizy.
    3. Przeprowadzić ekstrakcję miRNA zgodnie z krokami 7.1.3–7.1.10.

8. Odwrotna transkrypcja

UWAGA: Odwrotna transkrypcja miRNA jest przeprowadzana przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji z następującymi modyfikacjami.

  1. Rozmrozić odczynniki z zestawu oraz primery do odwrotnej transkrypcji na lodzie. Przygotować następującą mieszaninę master mix w probówce reakcyjnej na lodzie: 45,7 µL RNase-free H2O, 16,5 µL 10x buforu do odwrotnej transkrypcji, 1 µL enzymu do odwrotnej transkrypcji, 2,1 µL inhibitora RNazy oraz 1,7 µL mieszaniny dNTP. Wymieszać delikatnie, nie wirować wstrząsarce (vortex).
    UWAGA: Skala zależy od ilości próbek; tutaj została obliczona dla 10 reakcji.
  2. Odpowiednio opisać probówki 0,2 mL i zmieszać 7 µL master mixu z kroku 8.1 z 5 µL wyekstrahowanej próbki z kroku 7.1.10 oraz 3 µL primera do odwrotnej transkrypcji. Wymieszać delikatnie, krótko odwirować i przechowywać mieszaninę na lodzie.
  3. Aby zastosować taką samą liczbę komórek dla każdej linii komórkowej, należy zmniejszyć objętość próbki linii o wyższej całkowitej liczbie komórek; wykorzystać to jako objętość pozostałą, aby osiągnąć całkowitą objętość próbki 5 µL wody RNase-free.
    UWAGA: Próbki cząsteczek lipoprotein są już znormalizowane w kroku 7.2.1. Do przygotowania krzywej wzorcowej należy sekwencyjnie rozcieńczać alikwot miRNA w wodzie RNase-free i obliczyć liczbę nici na objętość próbki. Wymaganych jest co najmniej pięć punktów danych w zakresie wynikowych wartości cyklu kwantyfikacji próbki (cq). Zazwyczaj odpowiednie są całkowite czynniki rozcieńczenia w zakresie od 102 do 106.
  4. Umieścić probówki w termocyklerze i uruchomić następujący program: 30 min w 16 °C (etap przyłączania), 30 min w 42 °C (odwrotna transkrypcja), 5 min w 85 °C (etap denaturacji) i pauza w 4 °C (przechowywanie). Etap qPCR przeprowadzić niezwłocznie po odwrotnej transkrypcji; w przeciwnym razie przechowywać syntetyzowane z próbek miRNA komplementarne DNA (cDNA) w temperaturze -20 °C.

9. qPCR

  1. Przeprowadź reakcję qPCR cDNA (odttranskrybowanego z miRNA) przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu (patrz Tabela materiałów) z następującymi modyfikacjami.
  2. Odly rozmroź wszystkie odczynniki (supermix, H2O wolną od RNaz), próbki cDNA (z kroku 8.4) oraz primery na lodzie. Przygotuj następujący master mix w probówce reakcyjnej na lodzie: 75 µL supermixu, 47,5 µL H2O wolnej od RNaz, 7,56 µL primerów. Wymieszaj delikatnie, nie używaj wirówki typu vortex.
    UWAGA: Skala zależy od liczby próbek; w tym przypadku obliczono ją dla 10 reakcji.
  3. Odpowiednio opisz probówki 0,2 mL, dodaj 2 µL próbki cDNA do 13 µL master mixu i delikatnie wymieszaj. Co do zasady, każdą próbkę należy zmierzyć 2x.
    UWAGA: Dodatkowo wymagane są co najmniej dwie próbki kontrolne negatywne — jako próbkę należy wykorzystać wodę wolną od RNaz. Jeśli krzywa kalibracyjna nie jest wyznaczana w tym samym przebiegu co próbki, wymagana jest również jedna próbka z pomiaru krzywej kalibracyjnej. Służy ona do kalibracji każdego pojedynczego przebiegu do tej samej wydajności reakcji.
  4. Umieść probówki w termocyklerze i uruchom następujący program: 2 min w 50 °C, 10 min w 95 °C, 15 s w 95 °C oraz 60 s w 60 °C. Powtórz dwa ostatnie kroki programu do 50 razy.
  5. Aby przeprowadzić analizę wartości cq za pomocą oprogramowania termocyklera, aktywuj funkcje DynamicTube Normalization (do kompensacji różnych poziomów tła przy użyciu drugiej pochodnej śladu każdej próbki) oraz Noise Slope Correction (normalizacja do poziomu szumu).
    UWAGA: Wartość cq kontroli negatywnej powinna być o kilka cykli wyższa niż najwyższa wartość cq próbki.
    1. W przypadku analizy krzywej kalibracyjnej wyznacz próg obliczania cq dla każdego miRNA z krzywych standardowych każdego miRNA indywidualnie, używając funkcji Auto-find threshold oprogramowania, i utrzymuj go na stałym poziomie dla każdego konkretnego miRNA.
    2. Podczas analizy próbek, jeśli jest to konieczne, skompensuj różnice w wydajności reakcji w przebiegu badawczym, korzystając z punktu danych z próbki krzywej kalibracyjnej. Oprogramowanie oblicza wartości cq próbek na podstawie poziomu progu z odpowiedniego pomiaru krzywej kalibracyjnej.

10. Obliczanie zawartości miRNA

  1. Krzywa kalibracyjna
    1. Oblicz, na podstawie początkowej liczby nici miRNA na jedną porcję (100 µL z 10 µM miRNA, masa cząsteczkowa z karty charakterystyki) oraz kolejne etapy rozcieńczeń seryjnych, liczba nici miRNA w objętości próbki (ta 5 µL objętość próbki z kroku 8.3).
      UWAGA: Przy założeniu wydajności odwrotnej transkrypcji równej 1, liczba ta odpowiada liczbie nici cDNA.
    2. Oblicz liczbę nici cDNA w objętości próbki z 2 µL z kroku 9.3. Należy przy tym uwzględnić dodatkowy czynnik rozcieńczenia wynoszący 7,5 (przypadający na 2 µL objętość próbki z kroku 9.4 z 15 µL objętość próbki z kroku 8.4).
    3. Wykreśl cq wartość z kroku 9.5.1 w zależności od liczby nici nnici obliczone w kroku 10.1.2 na półlogarytmicznym wykresie w skali dziesiętnej, a następnie dopasować punkty danych do następnej krzywej regresji (M = nachylenie krzywej regresji liniowej, B = przesunięcie).
      Równanie do obliczania stężenia opartego na niciach, ca=-M×log(nstrands)+B, w analizie chemicznej.
      Potwierdź, że współczynnik korelacji (R2) dla linii wynosi >0.99.
  2. Cząsteczki lipoprotein
    1. Oblicz liczbę nici miRNA w objętości próbki, korzystając z zmierzonego stężenia próbki cq wartość (krok 9.5.2) oraz następujące równanie (M i B są parametrami krzywej kalibracyjnej dla konkretnego miRNA).
      Równanie służące do obliczania liczby nici, obejmujące zmienne cq, B i M w badaniach naukowych.
    2. Oblicz odpowiadającą liczbę cząsteczek lipoprotein w objętości próbki, zaczynając od objętości określonej w kroku 7.2.1 (100 µL), jego znane stężenie oraz kolejne stopnie rozcieńczenia (100 µL -> 30 µL objętość próbki w kroku 7.1.10 -> 5 µL próbka w rozcieńczeniu 1:6 w 15 µL całkowita objętość w kroku 8.4 -> 2 µL [rozcieńczenie 1:7,5] w kroku 9.4). Przyjąć masę cząsteczkową 250 kDa dla cząsteczek HDL i 3 MDa dla cząsteczek LDL oraz 100% odzysku miRNA podczas etapu ekstrakcji miRNA (pominięcie wpływu lipidów na masę cząsteczkową prowadzi do niewielkiego przeszacowania liczby nici miRNA na cząsteczkę lipoproteiny).
    3. Podziel liczbę nici miRNA z kroku 10.2.1 przez liczbę cząsteczek obliczoną w poprzednim kroku, aby otrzymać liczbę nici miRNA na jedną cząsteczkę lipoprotein.
  3. Komórki
    1. Oblicz liczbę nici miRNA w objętości próbki zgodnie z krokiem 10.2.1.
    2. Obliczyć odpowiadającą liczbę komórek w objętości próbki zgodnie z krokiem 10.2.2, zaczynając od początkowego stężenia liczby komórek zmierzonego w kroku 6.4.
    3. Liczbę nici miRNA z punktu 10.3.1 podziel przez liczbę komórek obliczoną w poprzednim kroku, aby uzyskać liczbę nici miRNA na jedną komórkę.
    4. Obliczyć szybkość pobierania cząsteczek lipoprotein, dzieląc całkowitą ilość nici miRNA z poprzedniego kroku – po skorygowaniu o poziom tła miRNA w komórkach uzyskany z eksperymentu z kontrolą negatywną – przez stosunek miRNA/cząsteczka (krok 10.2.3) oraz czas inkubacji (16 h, patrz krok 6.2).

1. Wielodołkowe układy mikroprzepływowe

  1. Ekstrakcja miRNA
    1. Przeprowadzić ekstrakcję miRNA zgodnie z opisem w kroku 7.
  2. Transkrypcja odwrotna
    1. Odrazić na lodzie primery do transkrypcji odwrotnej, komponenty zestawu do transkrypcji odwrotnej oraz MgCl2 (25 mM). Dla ośmiu próbek wymieszać 8 µL primerów do transkrypcji odwrotnej (10x), 2,25 µL dNTP z dTTP (10 mM), 16,8 µL odwrotnej transkryptazy (50 U/µL), 9,0 µL 10x buforu do transkrypcji odwrotnej, 10,12 µL MgCl2, 1,12 µL inhibitora RNazy (20 U/µL) oraz 1 µL wody wolnej od nukleaz.
    2. Delikatnie wymieszać i krótko odwirować. Dodać 4,3 µL mieszaniny reakcyjnej do transkrypcji odwrotnej do 3,5 µL wyekstrahowanego miRNA w probówce, wymieszać, odwirować i inkubować na lodzie przez 5 min. Umieścić probówki w termocyklerze i uruchomić następujący program: 16 °C przez 2 min, 42 °C przez 1 min oraz 50 °C przez 1 s powtórzone łącznie 40x, a następnie, w celu zatrzymania reakcji, 85 °C przez 5 min i utrzymać 4 °C do momentu zatrzymania.
  3. Preamplifikacja
    1. Odrazić primery na lodzie, odwrócić probówki i krótko odwirować. Wymieszać master mix do preamplifikacji (2x), potrząsając butelką. Przygotować mieszaninę reakcyjną do preamplifikacji dla ośmiu próbek zgodnie z następującą instrukcją: 12,5 µL master mixu do preamplifikacji (2x), 2,5 µL primerów do preamplifikacji oraz 67,5 µL wody wolnej od nukleaz. Odwrócić i krótko odwirować.
    2. Wymieszać 2,5 µL produktu reakcji transkrypcji odwrotnej z kroku 1.2.2 z 2,5 µL mieszaniny reakcyjnej do preamplifikacji z poprzedniego kroku, odwrócić i krótko odwirować. Inkubować próbki na lodzie przez 5 min.
    3. Umieścić probówki w termocyklerze i inkubować przy następujących ustawieniach: aktywacja enzymu przy 95 °C przez 10 min, przyłączanie przy 5 °C przez 2 min, elongacja przy 72 °C przez 2 min, powtórzone 12x: denaturacja przy 95 °C przez 15 s oraz przyłączanie/elongacja przy 60 °C przez 4 min, inaktywacja enzymu przy 9,9 °C przez 10 min oraz utrzymywanie 4 °C.
    4. Odwirować, dodać 7,5 µL 1x TE (pH 8,0) i 67,5 µL wody wolnej od nukleaz, odwrócić i krótko odwirować. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 tygodnia.
  4. qPCR
    1. Wymieszać master mix, potrząsając butelką. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR dla jednej płytki: 450 µL master mixu, 41 µL wody wolnej od nukleaz oraz 9 µL próbki po preamplifikacji z kroku 1.3.4. Odwrócić i krótko odwirować.
    2. Napełnić każdy zbiornik wielodołkowej mikrofluidycznej płytce array 10 µL przygotowanej mieszaniny reakcyjnej PCR zgodnie z instrukcjami producenta i odwirować 2x przez 1 min przy 3 0 x g. Przyspieszenie podczas dwóch następujących po sobie etapów wirowania jest istotne dla prawidłowego napełnienia płytki. Uszczelnić płytkę zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Użyć systemu PCR z następującym programem: aktywacja enzymu przy 95 °C przez 10 min, a następnie, powtórzone 40x: denaturacja przy 95 °C przez 15 s oraz przyłączanie/elongacja przy 60 °C przez 1 min.
    4. Zaimportować plik z wynikami z systemu PCR i obliczyć wartości RQ za pomocą oprogramowania systemowego przy następujących ustawieniach analizy: maksymalna dopuszczalna wartość cq wynosząca 40,0, uwzględnienie maksymalnych wartości cq w obliczeniach oraz wykluczenie wartości odstających wśród powtórzeń. Aktywować wskaźnik fałszywych odkryć Benjamini–Hochberg jako opcję korekty wartości p (korekcja występowania wyników fałszywie dodatnich14) oraz normalizację globalną jako metodę normalizacji (stosując medianową wartość progową dla wszystkich próbek15).

Wyniki

Ogólny schemat izolacji cząsteczek lipoprotein
Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat izolacji cząsteczek lipoprotein z krwi pełnej z wykorzystaniem sekwencyjnego ultracentrygowania flotacyjnego16. W razie potrzeby w ramach tego protokołu można wyodrębnić inne frakcje cząsteczek lipoprotein, takie jak cząsteczki VLDL i IDL. Tytanowy rotor o stałym kącie w połączeniu z polipropylenowymi probówkami typu quick-seal jest odpowiedni do wytrzymania sił odśrodkowych. Aby uniknąć zapadnięcia się probówki, ważne jest usunięcie z niej pęcherzyków powietrza. Centryfugację przeprowadza się w temperaturze 4 °C, aby zminimalizować degradację białek. Zazwyczaj, zaczynając od osocza (60-80 mL od jednego dawcy) z połączonych donacji krwi trzech ochotników, można uzyskać objętość roztworów cząsteczek LDL i HDL wynoszącą odpowiednio 3 mL każda, przy stężeniach w zakresie 1-3 mg/mL. Cała procedura, począwszy od pobrania krwi, trwała około 7 dni.

Schemat procesu izolacji lipoprotein z wykorzystaniem wirowania w gradiencie gętości przy różnych prędkościach i temperaturach.
Rycina 1: Schemat izolacji lipoprotein. Odwirować krew od zdrowych ochotników w probówkach próżniowych i pobrać osocze (faza górna). Po dostosowaniu jego gęstości do ρ = 1,019 g/ml przy użyciu KBr, odwiruj roztwór przy 214 0 x g przez 20 h w temperaturze 4 °CPo dostosowaniu gęstości frakcji dolnej do ρ = 1,063 g/ml przy użyciu KBr, ponownie odwiruj roztwór przy 214 0 x g przez 20 h w temperaturze 4 °CPrzechowuj tymczasowo górną frakcję zawierającą cząsteczki LDL w temperaturze 4 °CPo dostosowaniu gęstości frakcji dolnej do ρ = 1,20 g/mL przy użyciu KBr, odwiruj roztwór dwukrotnie przy 214 0 x g przez 20 h w temperaturze 4 °CNależy zebrać górną frakcję zawierającą cząsteczki HDL, poddać dializie roztwory cząsteczek HDL i LDL, a następnie wymienić bufor po 1, 2 i 4 godzinach. Po 24 godzinach należy oznaczyć stężenie białka i przechowywać próbki w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze 4 °C. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rekonstytucja cząsteczek HDL
Rekonstytucję cząsteczek HDL przeprowadzono zgodnie z protokołem opublikowanym wcześniej przez Jonasa7. Pierwszym krokiem była delipidacja cząsteczek HDL, jak pokazano na Rysunku 2A, a następnie drugim krokiem była relipidacja (tzn. rekonstytucja), jak pokazano na Rysunku 2B, z wykorzystaniem lipidów PC, CO i C oraz mieszaniny miRNA i sperminy. Wybrano ludzkie dojrzałe miR-23 oraz miR-15, ponieważ miR-23 występuje w dużym stężeniu, a miR-15 jest rzadki w cząsteczkach lipoprotein17. Zazwyczaj oba etapy wykonuje się w dwa kolejne dni. Podczas rekonstytucji można dodać inne komponenty lipofilowe i/lub amfifilowe według uznania. Kluczowe było całkowite odparowanie etanolu/eteru dietylowego oraz rozpuszczalnika metanol/chloroform dla PC, CO i C. Ostatnim krokiem – jak pokazano na Rysunku 2C – była procedura dializy w celu oddzielenia zrekonstytuowanych cząsteczek HDL (rHDL) od wolnych lipidów, miRNA i detergentu. Zajęło to dodatkowe 1-2 dni. Dodanie kulek absorbujących do roztworu dializacyjnego pozwoliło utrzymać stały gradient gęstości wzdłuż membrany dializacyjnej. Można spodziewać się wydajności rHDL na poziomie 50%.

Schemat przygotowania HDL; przedstawia delipidację, interakcję miRNA, etapy dializy; do celów badawczych.
Rysunek 2: Schemat blokowy rekonstytucji cząsteczek HDL. (A) Delipidacja: Wymieszać roztwór cząsteczek HDL z schłodzonym etanolem/eterem etylowym i inkubować w temperaturze -20 °C przez 2 h. Po odlaniu supernatantu zawiesić ponownie osad i powtórzyć procedurę. Osad wysuszyć za pomocą N2 gaz i resuspender w buforze A. Po oznaczeniu stężenia przechowywać odtłuszczone HDL w atmosferze gazu obojętnego w 4 °C. (B) Rekonstytucja: Po wymieszaniu fosfatydylocholiny (PC), oleinianu cholesterylu (CO) i cholesterolu (C), odparować rozpuszczalnik za pomocą N2 gaz, obracając probówkę. Inkubować alikwot miRNA z roztworem sperminy przez 30 min w temperaturze 30 °C, dodać deoksycholan sodu i resuspender wysuszony film lipidowy. Mieszać próbkę przez 2 h w temperaturze 4 °Cdodaj roztwór odtłuszczonego HDL i ponownie wymieszaj próbkę, tym razem przez noc w temperaturze 4 °C w atmosferze gazu obojętnego. (C) Dializa: Przenieść roztwór z panelu B zawierające zrekonstytuowane cząsteczki HDL (rHDL) do komory membrany dializacyjnej (próg odcięcia masy cząsteczkowej: 20 kDa) i dializować przeciwko PBS oraz koralikom absorbującym w 4 °CWymień bufor oraz kuleczki po 1 h i 2 h. Po 24 h odzyskaj roztwór cząsteczek rHDL, wyznacz stężenie i przechowuj próbkę w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze 4 °C. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Znakowanie cząsteczek LDL
Znakowanie cząsteczek LDL za pomocą miRNA (Rysunek 3), przeprowadzone analogicznie jak w przypadku cząsteczek HDL, nie było możliwe ze względu na hydrofobowość białka apoB-100, które jest głównym składnikiem cząsteczki LDL. Do przenikania przez monowarstwę lipidową cząsteczki LDL użyto DMSO, co umożliwiło asocjację miRNA. Cała procedura trwała 1-2 dni, a wydajność wyniosła blisko 10%.

znakowanie miRNA za pomocą sperminy, DMSO i buforu LDL; schemat przedstawia kuleczki absorbentne i układ do dializy.
Rysunek 3: Schemat znakowania cząsteczek LDL. Inkubować alikwot miRNA z roztworem sperminy przez 30 min w temperaturze 30 °C następnie dodać DMSO oraz bufor LDL. Inkubować próbkę LDL z buforem LDL przez 10 min na lodzie, a następnie dodać mieszaninę miRNA/sperminy/DMSO. Po inkubacji w 40 °C przez 2 h, przenieść roztwór do komory z membraną dializacyjną (próg odcięcia masy cząsteczkowej: 20 kDa) i dializować przeciwko PBS oraz kulek absorbujących w temperaturze +4 °CWymień bufor i kulki po 1 & 2 h. Po 24 h odzyskać roztwór znakowanych cząsteczek LDL, oznaczyć ich stężenie i przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze +4 °C. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kontrola jakości cząsteczek lipoprotein
HS-AFM może być wykorzystywany do badania wielkości i kształtu natywnych oraz zrekonstytuowanych/znakowanych cząsteczek lipoprotein na miki. Bezpośrednio przed użyciem mika musi zostać świeżo rozszczepiona (używając taśmy klejącej do usunięcia górnych warstw), aby zapewnić czystą i płaską powierzchnię. Podczas inkubacji cząsteczek HDL/LDL na miki należy dostosować czynnik rozcieńczenia (i/lub czas inkubacji), aby umożliwić obserwację pojedynczych cząsteczek. Agregaty uniemożliwiają wyznaczenie wymiarów cząsteczek. Cząsteczki HDL są ruchliwe na miki. Przy zastosowaniu konwencjonalnego AFM zamiast HS-AFM protokół unieruchomienia musi zostać odpowiednio dostosowany (bufor, powłoka powierzchniowa), aby ograniczyć boczna ruchliwość cząsteczek. Podczas skanowania próbki siła obrazowania musi pozostać niska (tryb tapping mode), aby uniknąć deformacji cząsteczek, co w konsekwencji wpłynęłoby na mierzone wartości. Do analizy danych cząsteczki wykrywane były za pomocą algorytmu progowego (np. w programie Gwyddion: Grains > Mark by threshold), a ich wysokość określano względem powierzchni miki. Pomiar wysokości cząsteczek jest najdokładniejszą metodą wyznaczania ich rozmiarów, ponieważ pozorne wymiary boczne są poszerzone przez kształt końcówki (patrz obrazy przykładowe na Ryc. 4). Funkcje gęstości prawdopodobieństwa (pdfs) wysokości cząsteczek obliczono w celu oceny statystycznej i porównania rozkładów wielkości różnych cząsteczek lipoprotein. Porównanie natywnych i znakowanych miRNA cząsteczek LDL, przedstawione na Ryc. 4, pozwala zweryfikować zasadnicze podobieństwo między znakowanymi a nieznakowanymi (tj. natywnymi) cząsteczkami lipoprotein (cząsteczki LDL znakowane bez dodatku mieszanin miRNA/sperminy przedstawiono jako kontrolę samej procedury znakowania). Cała procedura trwała około 1 dnia.

Schemat analizy wysokości AFM; detekcja HDL/LDL na miki; wyniki przedstawione na wykresie histogramu.
Rysunek 4: Schemat blokowy i reprezentatywne wyniki pomiarów HS-AFM. Rozcieńczyć próbkę cząsteczek HDL/LDL w PBS (1:10)2-1:103) i inkubować na świeżo łupanej mice przez 5 min, a następnie ostrożnie wypłukać buforem PBS w celu usunięcia wolnych (niezaadsorbowanych elektrostatycznie) cząsteczek. Wykonać obrazowanie metodą HS-AFM i sprawdzić gęstość cząsteczek na powierzchni. Pomiary należy przeprowadzić w PBS w temperaturze pokojowej. Górny obraz na tej rycinie przedstawia zbyt wysoką gęstość cząsteczek; obraz dolny nadaje się do analizy. Wysokość pojedynczych cząsteczek przeanalizowano po progowaniu, a następnie porównano statystycznie cząsteczki natywne (krzywa czarna) i zrekonstytuowane/znakowane (krzywe czerwona i zielona). Skala = 10 nm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Axmann et al.19. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ekstrakcja miRNA, odwrotna transkrypcja i qPCR
Ekstrakcję miRNA z natywnych/sztucznie wzbogaconych próbek lipoprotein lub komórek przeprowadzono przy użyciu zestawu do ekstrakcji miRNA, jak pokazano na Ryc. 5A. Kluczowe było zapewnienie środowiska wolnego od RNaz. Ten etap trwał około 1 h. Odwrotną transkrypcję wyekstrahowanej próbki miRNA (Ryc. 5B) wykonano zgodnie ze standardowymi procedurami biochemicznymi opisanymi przez producenta. Ten etap trwał około 1,5 h. Na koniec ilość cDNA otrzymanego w poprzednim kroku określono za pomocą qPCR (Ryc. 5C). Krzywa standardowa, wiążąca otrzymane wartości cq z absolutną liczbą nici miRNA, pozwoliła wyznaczyć bezwzględną zawartość miRNA w próbce początkowej. Proces ten trwał około 2,5 h.

proces izolacji miRNA i qPCR; etapy wirowania oraz analiza RT-PCR na schemacie trzystopniowym.
Rysunek 5: Schemat blokowy ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i qPCR. (A) ekstrakcja miRNA: Wymieszać próbkę z odczynnikiem lizującym i poddać ją lizie poprzez aspirację za pomocą strzykawki. Inkubować przez 5 min, a następnie dodać CHCl33Wstrząsać energicznie przez 15 s i inkubować przez 3 min. Po wirowaniu przy 1 20 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C, zebrać fazę górną i zmieszać ją z etanolem. Przenieść roztwór do kolumny wirówkowej (maksymalna objętość <700 µL) i odwirować przy 8 0 x g przez 15 s. Odrzucić eluent i powtórzyć ostatni krok z pozostałą częścią roztworu. Dodać pierwszy bufor piorący i odwirować przy 8 0 x g przez 15 s. Odrzucić eluent, dodać drugi bufor piorący i odwirować przy 8 0 x g przez 15 s. Powtórz ostatni krok, stosując czas wirowania 2 min. Dalsze osuszanie membrany przeprowadź poprzez wirowanie z maksymalną prędkością przez 1 min. Eluuj miRNA za pomocą H2i odwiruj przy 80 0 x g przez 1 min. Próbkę wyekstrahowanego miRNA przechowywać w temperaturze -20 °C. (B) Odwrotna transkrypcja: rozmrozić bufor 10x, H2Odczynnik O, mieszanka dNTP, inhibitor oraz enzym należy utrzymać w lodzie, a następnie przygotować master mix. Należy dodać wyekstrahowane miRNA z panelu A do mieszaniny master mix oraz starteru do odwrotnej transkrypcji i przeprowadź odwrotną transkrypcję przy użyciu termocyklera. Przechowywać próbkę cDNA w temperaturze -20 °C. (C) qPCR: Rozmrozić supermix, H2Umięścić startery na lodzie i przygotować master mix. Dodać cDNA z panelu B do mieszaniny master mix i przeprowadzić qPCR. Przeanalizować dane w celu uzyskania cq wartości i obliczyć bezwzględną zawartość miRNA w próbce (patrz Rysunek 6 oraz reprezentatywne wyniki w celu uzyskania szczegółowych informacji). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Bezwzględna zawartość miRNA i szybkość transferu
Bezwzględną zawartość miRNA w natywnych i sztucznie wzbogaconych cząsteczkach HDL i LDL obliczono na podstawie wartości cq próbek oraz krzywej standardowej dla odpowiedniego miRNA, jak przedstawiono na Rysunku 6. Rysunek 6A przedstawia dane obliczone przez oprogramowanie analityczne (z aktywowaną normalizacją DynamicTube [w celu skompensowania różnych poziomów tła przy użyciu drugiej pochodnej każdego śladu próbki] oraz korekcją nachylenia szumu [normalizacją do poziomu szumu]). Wartości cq krzywych standardowych określono za pomocą funkcji Auto-find threshold pakietu oprogramowania na podstawie znormalizowanego sygnału fluorescencji zmierzonego przez urządzenie qPCR. W ten sposób oprogramowanie zmaksymalizowało wartość R dopasowania krzywej standardowej. Poziom progu (threshold) pozostawał stały dla analizy każdej konkretnej próbki miRNA. Następnie wartości cq naniesiono jako funkcję liczby nici miRNA i obliczono linię regresji. Wartości cq próbek określono przy tym samym poziomie progu, jak pokazano na Rysunku 6B; różnice w wydajności reakcji między różnymi przebiegami qPCR były automatycznie kompensowane przez oprogramowanie przy użyciu jednej dodatkowej próbki krzywej kalibracyjnej zawartej w każdym przebiegu. Korzystając z równania linii regresji, obliczono nieznaną ilość miRNA w próbce. Liczbę cząsteczek lipoprotein oszacowano na podstawie początkowego stężenia białka i jego średniej masy cząsteczkowej (MWHDL ~250 kDa). Przyjęto przy tym brak wpływu lipidów na masę cząsteczkową — w konsekwencji liczba nici miRNA na cząsteczkę lipoprotein była lekko przeszacowana. Ponadto założono 10% odzysku miRNA podczas etapu ekstrakcji miRNA. Ponadto określono zawartość miRNA w komórkach przed i po inkubacji z cząsteczkami HDL i obliczono szybkość transferu miRNA, jak pokazano na Rysunku 6C.

Analiza ilościowej PCR, obejmująca wykresy cykli fluorescencji, automatyczne wyznaczanie progu (autofind threshold) oraz tabele danych.
Rysunek 6: Schemat obliczania bezwzględnej zawartości miRNA oraz szybkości przeniesienia. (A) Krzywa wzorcowa dla miR-15: Alikwot miR-15 (100 µL, 10 µM) poddano rozcieńczeniom seryjnym za pomocą wody wolnej od RNA zgodnie z opisem. qPCR pozwolił uzyskać cq wartości dla każdej próbki z rozcieńczenia seryjnego (zmierzone dwukrotnie) przy użyciu Automatyczne wyznaczanie progu funkcję pakietu oprogramowania. Eksperymenty z kontrolą negatywną (bez dodatku miRNA) dały cq wartości >35. Punkty danych cq wartości w funkcji liczby nici miRNA na objętość próbki (obliczonej na podstawie stężenia początkowego i rozcieńczeń seryjnych) dopasowano do przedstawionego równania (czerwona linia, prawy obraz), co pozwoliło uzyskać M = -3,36 i B = 42,12. Wyznaczona wydajność PCR wyniosła 0,98. Słupki błędów obliczono na podstawie wyników powtórzeń doświadczalnych i były one mniejsze niż średnica punktu danych. (B) cq wartości natywnych/sztucznie wzbogaconych cząsteczek HDL określono przy użyciu tego samego poziomu progu, który ustalono w panelu A i przeliczono na liczbę nici miRNA w objętości próbki qPCR. Bezwzględny stosunek miRNA w oryginalnej próbce obliczono na podstawie liczby (stężenia) cząsteczek HDL w objętości próbki (3,2 x 1011 cząsteczki). (C) Próbki komórek (linia komórkowa ldlA7-SRBI) inkubowano przez 16 h z cząsteczkami HDL wzbogacanymi sztucznie (50 µg/mL) i przeanalizowano w analogiczny sposób. Wyznaczony cq wartości wynosiły odpowiednio 22,5 dla samych komórek, 22,5 dla komórek inkubowanych z natywną HDL oraz 19,3 dla komórek inkubowanych z roztworem cząsteczek rHDL (obie 50 µg/mL), odpowiednio. Wartości te przeliczono na liczbę nici miRNA, zgodnie z procedurą przedstawioną na panelu BLiczba nici miRNA po inkubacji (7,3 x 106) skorygowano poprzez odjęcie liczby nici miRNA przed inkubacją (8,6 x 105). Wynik podzielono przez liczbę komórek w objętości próbki (3 10), stosunek miRNA do cząsteczek (1,5 x 10-4), oraz czas inkubacji (16 h). Pozwoliło to wyznaczyć szybkość transferu cząsteczek lipoprotein poprzez pobieranie miRNA (240 zdarzeń pobrania cząsteczek HDL na komórkę i sekundę). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Axmann et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wielodołkowa macierz mikroprzepływowa
Ze względu na niską wydajność ekstrakcji miRNA, po odwrotnej transkrypcji wyizolowanego miRNA przeprowadzono etap preamplifikacji. Na koniec wykonano qPCR, przedstawiony na Rysunku 6. We wszystkich etapach zastosowano standardowe procedury biochemiczne zgodnie z opisem producenta. Przedstawiono tutaj część globalnego profilu miRNA w cząsteczkach HDL pacjentów z mocznicą, zakwalifikowanych do badania nad wpływem CRF na odpływ cholesterolu z makrofagów18. W badaniu tym zmierzono zdolność akceptacji cholesterolu przez HDL lub surowicę u 17 młodych dorosłych pacjentów z mocznicą (stadium CKD 3-5) oraz 14 młodych dorosłych pacjentów poddawanych hemodializie bez chorób towarzyszących, a także w dopasowanej grupie kontrolnej. Do analizy danych wykorzystano ustawienia domyślne (maksymalna dopuszczalna wartość CT: 40,0, wliczając maksymalne wartości CT do obliczeń i wykluczając wartości odstające wśród powtórzeń). Wartości P skorygowano za pomocą metody Benjamini-Hochberg (false discovery rate) (korekcja występowania wyników fałszywie dodatnich), a jako metodę normalizacji wybrano Global Normalization (normalizację globalną), która wyszukuje wspólne testy we wszystkich próbkach i wykorzystuje ich medianę CT do normalizacji. Na reprezentatywnych wynikach przedstawiono niektóre wartości RQ dla miRNA wyizolowanych z HDL pacjentów z mocznicą (RQ grupy kontrolnej wynosi 1). Wyraźnie widać, że miR-12 i miR-24 wykazują wysoką ekspresję w HDL pacjentów z mocznicą. Cały ten etap zajął około 1 dnia.

Schemat procesu PCR z transkrypcją odwrotną, termocyklerem i wykresem wyników.
Rysunek 7: Schemat blokowy i reprezentatywne wyniki dla wielodołkowej macierzy mikroprzepływowej. Po ekstrakcji miRNA, przeprowadzonej zgodnie z instrukcją przedstawioną w Rycina 5Awymieszać próbkę miRNA z primerem do odwrotnej transkrypcji oraz mieszaniną master mix zawierającą 10x bufor, H2O, mieszanina dNTP, inhibitor, MgCl22or enzym. Po 5-minutowej inkubacji na lodzie przeprowadzić odwrotną transkrypcję przy użyciu termocyklera. Dodać mieszaninę master mix do preamplifikacji, inkubować przez 5 min na lodzie, a następnie przeprowadzić preamplifikację przy użyciu termocyklera. Dodać 0,1x bufor TE (pH 8,0), a następnie zmieszać alikwot z PCR master mix i H2O. Pipetować mieszaninę reakcyjną PCR do otworu wlewowego wielodołkowej matrycy mikroprzepływowej, a następnie wirować dwukrotnie przy 3 0 x g. g przez 1 min each. Przeprowadź reakcję qPCR przy użyciu systemu PCR i przeanalizuj dane w celu uzyskania wartości RQ (na poniższym wykresie przedstawiono wartości RQ dla cząsteczek HDL pacjentów z mocznicą w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych)18).  Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Tutaj krok po kroku opisano izolację frakcji cząstek lipoprotein z ludzkiej krwi i określenie ich indywidualnej zawartości miRNA. Bardzo ważne jest, aby pracować w środowisku wolnym od RNaz podczas pracy z izolowanym i zsyntetyzowanym miRNA - miRNA osadzone w cząstkach jest oczywiście chronione przed degradacją enzymatyczną. Ponieważ stosunek miRNA do cząstek natywnych cząstek lipoprotein jest raczej niski, konieczne jest sztuczne wzbogacenie miRNA w celu zbadania wychwytu cząstek holologicznych przez komórki. W ten sposób rekonstytucja cząstek HDL, jakopisano wcześniej7 , jest modyfikowana w celu włączenia nici miRNA. Dodatkowo, oddzielenie frakcji lipidowej i białkowej podczas tej procedury pozwala naukowcom na zbadanie składników związanych z lipidami i białkami cząsteczki lipoproteiny19. W podobny sposób dostosowana jest procedura znakowania cząstek LDL. Co ciekawe, dodanie sperminy – naturalnego stabilizatora nukleotydów – nie wpłynęło na stosunek miRNA do cząstek. Należy zauważyć, że w zasadzie metoda pozwala na fałdowanie innych substancji niż miRNA w cząsteczce lipoproteiny. Oczywiście istnieje ograniczenie dotyczące fizycznej wielkości substancji w oparciu o całkowitą wielkość cząstek HDL (średnica: 5-12 nm) i LDL (średnica: 18-25 nm).

Jeśli chodzi o kontrolę jakości odtworzonych/znakowanych cząstek lipoprotein, HS-AFM jest odpowiednią metodą do charakteryzowania cząstek HDL/LDL na poziomie pojedynczych cząstek. W porównaniu do EM pozwala na krótszy czas przygotowania i warunki zbliżone do fizjologicznych (mokra, temperatura pokojowa).

Ze względu na swoją nieodłączną czułość i amplifikację, qPCR jest metodą z wyboru do wykrywania niskich stężeń miRNA. Alternatywnie, mikroskopia fluorescencyjna czuła na pojedyncze cząsteczki, która jest w stanie wykryć nawet pojedyncze cząsteczki, nie byłaby odpowiednia ze względu na niskie stężenia, na przykład, znakowanych fluorescencyjnie nici miRNA na cząsteczkę. W związku z tym stwierdzono, że stosunek nici miRNA na natywną cząstkę lipoproteiny wynosi 10-8. Sztuczne wzbogacenie zwiększa współczynnik 10 000, co ułatwia oszacowanie szybkości wychwytu lipoprotein komórkowych (nie wykrywa się znaczącej różnicy przy użyciu natywnych cząstek lipoprotein 19). Wysoka czułość qPCR umożliwia określenie tej szybkości wychwytu poprzez pomiar liczby nici miRNA po czasie inkubacji oraz stosunku miRNA do cząstek. Należy zauważyć, że obliczona wartość ignoruje komórkową degradację i uwalnianie miRNA, a zatem stanowi co najmniej dolną granicę współczynnika wychwytu cząstek lipoprotein.

W przyszłości metoda może zostać dostosowana do przenoszenia substancji farmaceutycznych (w szczególności również lipofilowych) w komórkach i korelowania ich efektu biologicznego ze stężeniem wewnątrzkomórkowym (określonym na podstawie szybkości wychwytu cząstek lipoprotein).

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Projekt Austriackiego Funduszu Naukowego P29110-B21, projekt "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft" H-3065/2011, Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRE, IWB2020), kraj związkowy Górna Austria oraz "Land OÖ Basisfinanzierung".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
UltrawirówkaBeckmanOptima L-100 XPIzolacja lipoprotein
Wirnik ultrawirówkiBeckmanTI 55.2Izolacja lipoprotein
Vacutainer (EDTA)Becton Dickinson366643Izolacja lipoprotein
KaliumbromidSigma Aldrich2110Izolacja lipoprotein
ProbówkiultrawirówkoweBeckman342414Izolacja lipoprotein
Zgrzewarka do probówek ultrawirówekBeckman342428Izolacja lipoprotein
Chlorek soduCarl Roth GmbHP029.2Izolacja lipoprotein
EDTAFisher ScientificD/0650/50Izolacja lipoprotein
Rurki do dializy, MWCO 12 - 14kSpectra132700Izolacja lipoprotein
syntetyczny miRNAmicroSynth-syntetycznymiRNA
TRIS pH 7AmbionAM9850Gsyntetyczny miRNA
TRIS bufor pH 8AmbionAM9855G
syntetyczne sterylne probówkimiRNA Carl Roth GmbHENE8.1syntetyczny fotometr miRNA
EppendorfBiofotometr EppendorfTest Bradforda
KuwetaCarl Roth GmbHXK20Test Bradford
Coomassie G-250 StainBioRad GmbH161-0786Test Bradford
Chlorek soduCarl Roth GmbH3957.1Delipitacja
EDTAFluka Analytical03690-100MLDelipitation
TRIS Bufor pH 8,0AmbionAM9855GDelipitation
Etanol 100%AustrAlcoEtanol Absolut 99.9%Delipitacja
Eter dietylowyCarl Roth GmbH3942.1Wirówka do odcieńczania
Thermo ScientificMultifuge X3ROdcieńczanie
ChloroformCarl Roth GmbH3313.1Rekonstytucja
MetanolCarl Roth GmbH4627.1Rekonstytucja
FosfatydylocholinaSigma Aldrich GmbHP3556-25mgRekonstytucja
Oleinian cholesteroluSigma Aldrich GmbHC-9253-250mgRekonstytucja
cholesteroluSigma Aldrich GmbHC8667-500mg
Szklane probówkiCarl Roth GmbHK226.1Rekonstytucja
sperminySigma Aldrich GmbHS3256-1GRekonstytucji
ThermomixerEppendorfThermomixer comfortRekonstytucja
Deoksycholan soduSigma Aldrich GmbH3097-25GRekonstytucja
Mieszadło magnetyczneCarl Roth GmbH0955.2Rekonstytucja
100µ L MikropipetyCarl Roth GmbHA762.1Rekonstytucja
PBSCarl Roth GmbH9143.2do dializy
Amberlite XAD-2Sigma Aldrich GmbH10357do dializy
Slide-A-Lyzer (odcięcie 20 kDa)Thermo Scientific66003
StrzykawkaBraun9161406V
Strzykawka do dializy igłaBraun465 76 83Dializa
EGTACarl Roth GmbH3054.2Znakowanie cząstek LDL
DMSOlife technologiesD12345Znakowanie cząstek LDL
Mikroskop sił atomowychRIBMSS-NEXKontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein
Mika moskiewska (klasa V-1)Christine Grö plG250-1/V1Kontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein
AFM CantileverNanoworldUSC-F1.2-k0.15Kontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein
Gwyddion 2.49Czeski Instytut Metrologiihttp://gwyddion.netKontrola jakości odtwarzanych/znakowanych cząstek lipoprotein
Szkiełka komorowe, Nunc Lab-TekVWR734-2122Hodowla komórkowa
HBSSCarl Roth GmbH9117.1Hodowla komórkowa
Licznik komórekOmni Life Science GmbHCasy Hodowlakomórkowa
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004ekstrakcja miRNA
WirówkaEppendorf5415RmiRNA
20G IgłaBraunSterican 465 75 19miRNA ekstrakcja
strzykawka 5 mlBecton Dickinson309050Ekstrakcja miRNA
Szafka PCREscoPCR-3A1Odwrotna transkrypcja
Zestaw do odwrotnej transkrypcji TaqManThermo Scientific4366596Odwrotna transkrypcja
Woda bez rnazyCarl Roth GmbHT143Odwrotna
transkrypcja 0,2 ml probówki Marka781305Wirówka z odwrotną transkrypcją
Carl Roth GmbHMikrowirówka ALTermocykler z odwrotną transkrypcją
SensoquestLabcyclerOdwrotna transkrypcja
TaqMan PrimerThermoScientific-qPCR
iTaq Uniwersalna sonda supermixBioRad GmbH1725131Maszyna
qPCR PCRCorbettRotor-Gene RG-6000qPCR
Zestaw do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNAApplied Biosystems4366596TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1Applied Biosystems4399966TaqMan
Array TaqMan PreAmp Master MixApplied Biosystems4391128TaqMan Array
Megaplex PreAmp Prirs, Human Pool A v2.1Zastosowane Biosystems4399933TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, bez UNGApplied Biosystems4440040TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A CardsApplied BiosystemsA31805TaqMan Array
Woda wolna od nukleazThermo ScientificR0581TaqMan
Array MgCl2 (25mM)Thermo ScientificR0971TaqMan Array
TE, pH 8.0InvitrogenAM9849TaqMan Array
7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems4351405TaqMan Array
TaqMan Array UszczelniaczApplied Biosystems-TaqManArray
bufor do rekonstytucji Koraliki Kaseta do dializy ekstrakcja kart

Bibliografia

  1. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).
  2. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, (2014).
  3. Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).
  4. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  5. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs. Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).
  6. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight? Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  7. Jonas, A. Reconstitution of High-Density Lipoproteins. Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).
  8. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).
  9. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  10. Patsch, J. R., Patsch, W. Zonal ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  12. Yamamoto, D., et al. High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes. Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).
  13. Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).
  14. Hochberg, B. Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).
  15. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biology. 10 (6), (2009).
  16. Schumaker, V. N., Puppione, D. L. 6] Sequential Flotation Ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).
  17. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).
  18. Meier, S. M., et al. Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux. Life Sciences. 136, 1-6 (2015).
  19. Axmann, M., et al. Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients. Genes. 9 (11), 533(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzbogacanie mikroRNAznakowanie cz steczek HDLznakowanie cz steczek LDLdelipidacjarelipidacjaszybka analiza AFMoznaczenie bia ek metod Bradfordaprocedura dializysyntetyczne mikroRNAszybko pobierania cz steczek
Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.