Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Summary

SUMO to niezbędne i wysoce konserwatywne, małe białko modyfikujące podobne do ubikwityny. W tym protokole opisujemy zastosowanie odpornego na stres rekombinowanego białka pułapkującego SUMO (kmUTAG) do wizualizacji natywnych, nieoznakowanych koniugatów SUMO i ich lokalizacji w różnych typach komórek.

Abstract

Tutaj prezentujemy nową metodę badania sumoilacji białek i ich subkomórkowej lokalizacji w komórkach ssaków i oocytach nicieni. Metoda ta wykorzystuje rekombinowany zmodyfikowany fragment białka pułapkującego SUMO, kmUTAG, pochodzący z proteazy Ulp1 SUMO odpornych na stres pączkujących drożdży Kluyveromyces marxianus. Dostosowaliśmy właściwości kmUTAG do celów badania sumoilacji w różnych układach modelowych bez użycia przeciwciał. W przypadku badania SUMO, KmUTAG ma kilka zalet w porównaniu z podejściami opartymi na przeciwciałach. Ten odporny na stres odczynnik wychwytujący SUMO jest wytwarzany rekombinacyjnie, rozpoznaje natywne izoformy SUMO z wielu gatunków i w przeciwieństwie do komercyjnie dostępnych przeciwciał wykazuje zmniejszone powinowactwo do wolnego, niesprzężonego SUMO. Przedstawione tu reprezentatywne wyniki obejmują lokalizację koniugatów SUMO w komórkach hodowli tkankowych ssaków i oocytach nicieni.

Introduction

Celem tej metody jest ułatwienie badania i analizy białek sprzężonych z SUMO za pomocą rekombinowanego białka UTAG (Ulp domain Tag). Jak opisano poniżej, UTAG może być stosowany zamiast innych odczynników i podejść do oczyszczania, wykrywania i wizualizacji białek modyfikowanych przez SUMO. W zależności od warunków wzrostu, komórki mogą zawierać setki lub tysiące białek, które są modyfikowane za pomocą łańcuchów SUMO lub SUMO (przegląd patrz Kerscher et al. 2006¹ i Kerscher 2016²). Stanowi to znaczną trudność dla analiz funkcjonalnych określonych białek modyfikowanych SUMO, zwłaszcza że tylko część określonego celu sumoilacji jest faktycznie modyfikowana³. Oprócz ich ról w podstawowych procesach komórkowych, takich jak regulacja transkrypcji, homeostaza białek, odpowiedź na stres komórkowy i przebudowa chromatyny podczas mitozy i mejozy; teraz stało się wystarczająco jasne, że SUMO, białka modyfikowane SUMO i komponenty szlaku SUMO mają również potencjał jako biomarkery patologii, takich jak rak i zaburzenia neurodegeneracyjne^4,5,6,7. Podkreśla to potrzebę solidnych, niezawodnych i łatwo dostępnych narzędzi oraz innowacyjnych podejść do wykrywania i analizy funkcjonalnej białek modyfikowanych metodą SUMO w różnych komórkach i próbkach.

W wielu systemach, przeciwciała specyficzne dla SUMO są odczynnikami z wyboru do wykrywania, izolacji i analizy funkcjonalnej białek modyfikowanych przez SUMO^8,9. Jednak niektóre komercyjnie dostępne przeciwciała specyficzne dla SUMO są drogie, ograniczone pod względem ilości lub dostępności, podatne na wykazywanie bardzo zmiennego powinowactwa i reaktywności krzyżowej, a w niektórych przypadkach brakuje im odtwarzalności¹⁰. Jednym z alternatywnych podejść jest ekspresja SUMO znakowanego epitopem w transformowanych komórkach i organizmach, ale powiązanie znaczników epitopów z SUMO może sztucznie obniżyć jego koniugację z celami białkowymi¹¹. Ponadto epitopy nie są przydatne, gdy oceniane są nieprzekształcone komórki lub tkanki.

Ulp1 to konserwatywna proteaza SUMO z S. cerevisiae, która zarówno przetwarza prekursor SUMO, jak i desumoiluje białka sprzężone z SUMO¹². Opracowaliśmy odczynnik UTAG w oparciu o przypadkową obserwację, że mutacja katalitycznej cysteiny (C580S) w przetwarzaniu SUMO Ulp domain (UD) Ulp1 nie tylko zapobiega rozszczepieniu SUMO, ale także wychwytuje białka sprzężone z SUMO o wysokiej awidności¹². Dla uproszczenia odnieśliśmy się do tego karboksylowo-końcowego fragmentu Ulp1 (C580S) pułapkującego SUMO jako UTAG (skrót od UD TAG). UTAG jest rekombinowanym białkiem pułapkującym pan-SUMO, które stanowi użyteczną alternatywę dla przeciwciał anty-SUMO stosowanych do izolacji i wykrywania białek modyfikowanych SUMO. Co ważne, w szczególności rozpoznaje natywnie złożone, sprzężone SUMO, a nie tylko jeden lub kilka epitopów na SUMO. Aby poprawić zarówno stabilność białka, jak i siłę wiązania SUMO UTAG, wygenerowaliśmy wariant UTAG z odpornych na stres drożdży Kluyveromyces marxianus (Km). KmUTAG ściśle wiąże koniugaty SUMO o powinowactwie nanomolowym¹³. Dodatkowo kmUTAG jest odporny na podwyższone temperatury (42 °C), czynniki redukujące (5 mM TCEP - chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny), denaturanty (do 2 M mocznika), utleniacze (0,6% nadtlenku wodoru) i detergenty niejonowe. Ta tolerancja na stres jest korzystna podczas trudnych warunków oczyszczania i wydłużonego czasu inkubacji, zapewniając jej stabilność i aktywność pułapkowania SUMO. Nic dziwnego jednak, że aktywność wychwytywania SUMO przez KmUTAG jest niekompatybilna z odczynnikami modyfikującymi cysteinę, detergentami jonowymi i całkowicie zdenaturowanymi ekstraktami białkowymi. Niezwykłe powinowactwo i właściwości KmUTAG wskazują, że odczynnik ten może stać się częścią standardowego repertuaru do badania sumoilowanych białek u wielu gatunków.

Tutaj oferujemy prostą metodę wykrywania białek modyfikowanych przez SUMO w komórkach ssaków i nicieni za pomocą rekombinowanego fluorescencyjnego białka fuzyjnego mCherry-KmUTAG (kmUTAG-fl).

Protocol

1. Wykrywanie SUMO w stałych komórkach hodowli tkankowej przy użyciu rekombinowanego białka pułapkującego KmUTAG-FL SUMO

1. Hoduj wybrane komórki hodowli tkankowej na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 22 mm w 6-dołkowych płytkach TC, aż do uzyskania 70%–80% zlewu. Wykonaj kroki 1.2–1.8 na płytce 6-dołkowej.
2. Krótko umyć komórki 1 ml DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco)
3. Do utrwalenia należy przygotować świeży roztwór 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) (rozcieńczony w DPBS). Aby utrwalić komórki, dodaj 2 ml 4% PFA w DPBS do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Wszystkie czynności związane z użyciem PFA należy wykonywać w laboratoryjnym kapturze ochronnym, a PFA należy odpowiednio zutylizować.
4. Umyj utrwalone komórki 3x w 1 ml DPBS podczas nutowania płytki, 5 minut przy każdym myciu.
5. Aby przepuszczalność komórek, inkubować przez 15 minut z 0,1% Triton X-100 w DPBS
6. Umyj komórki 3x w 1 ml DPBS podczas nutowania płytki, po 5 minut każde mycie
7. Inkubować komórki z 500 μl 0,1 M Glycine-HCL (pH 2,0) przez 10 s, a następnie natychmiast zneutralizować pH za pomocą 500 μL 10x buforu proteazy SUMO (SPB).
8. Umyj komórki 3x w 1 ml DPBS podczas nutowania płytki, 5 min każde mycie
9. Usuń szkiełka nakrywkowe ze studzienki i umieść je w komorze wilgotnościowej. Następnie należy przystąpić do inkubacji na szkiełku nakrywkowym w następujący sposób:
   1. Tylko do barwienia UTAG-fl: zmieszać 1 μg UTAG-fl ze 100 μl 1x SPB zawierającego 5 mM TCEP w probówce, odpipetować mieszaninę na komórki na szkiełku nakrywkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w komorze wilgotnościowej.
   2. Opcjonalnie, w przypadku współbarwienia przeciwciałami UTAG-FL i anty SUMO1, należy wykonać następujące czynności:
      1. Wymieszać w probówce 1 μg UTAG-FL i 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (otrzymane do badań rozwojowych Hybridoma Bank⁹) ze 100 μl buforu blokującego, pipetować mieszaninę na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      2. Umyj komórki na szkiełku nakrywkowym 3 razy 200 μl DPBS, po 5 minut każde mycie.
      3. Wymieszać w probówce 0,5 μl sprzężonego przeciwciała przeciw myszom Alexa Fluor 488 ze 100 μl buforem blokującym, odpipetować mieszaninę na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
10. Aby umyć szkiełka nakrywkowe, odpipetuj 200 μl DPBS na każde szkiełko nakrywkowe i pozostaw na miejscu na 10 minut. Powtórz pranie jeszcze 2 razy.
11. Usuń szkiełko nakrywkowe z ostatniego prania i odwróć je na wstępnie oczyszczone szkiełko mikroskopowe z kroplą podłoża mocującego (patrz Tabela materiałów).
12. Przechowywać przez noc w zamrażarce w temperaturze -20°C przed obejrzeniem pod mikroskopem. Wizualizacja przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów dla DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl) i Alexa Fluor 488 (jeśli wykonywane jest opcjonalne współbarwienie SUMO2/3).

2. Wykrywanie SUMO w stałych gonadach nicieni za pomocą UTAG-fl

1. Przenieś dorosłe hermafrodyty do kropli 8 μl bufora jajowego¹⁴ na dodatnio naładowanym szkiełku, które zostało pokryte poli-L-lizyną. Uwolnij gonady z robaków za pomocą igieł 27,5 G. Kontynuuj znakowanie przeciwciałami lub znakowanie UTAG-fl.
2. W przypadku próbek znakowanych przeciwciałami należy postępować w następujący sposób:
   1. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie, a następnie utrwalić przez noc w metanolu o temperaturze -20 °C w słoiku z koplinu.
   2. Również w słoikach Coplin umyj szkiełka 3 razy w 1x PBS, a następnie zablokuj na 20 minut w PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,1% Tween 20.
   3. Dodać 30 μl przeciwciała anty-SUMO 6F2 (1:10) do każdego szkiełka pokrywającego próbki. Inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: SUMO 6F2 uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank¹⁵.
   4. W słoikach Coplin myć szkiełka przez 2 minuty w 1x PBS, a następnie przykryć i inkubować próbki z 30 μl koziego przeciwciała wtórnego przeciwko myszom DyLight 488 (1:200) przez 1,5 godziny w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej.
   5. W słoikach Coplin myć szkiełka przez 2 minuty w 1x PBS, wykonać szybkie zanurzenie w dH₂0, a następnie zamontować szkiełka z medium montażowym (patrz Tabela Materiałów).
3. W przypadku etykietowania KmUTAG-fl należy postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami:
   1. Aby utrwalić komórki, dodaj 1 objętość 8% PF do próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 4% PF. Utrwalaj przez 10 minut w komorze wilgotnościowej, a następnie wygaszaj reakcję, przenosząc szkiełka do słoika Coplin zawierającego 1x PBS z 0,1 M glicyną przez co najmniej 5 minut.
   2. W słoikach Coplin myć komórki przez 5 minut w 1x PBS, a następnie przepuszczać próbki w 1x PBS zawierającym 0,1% Triton-X przez 10 minut.
   3. Myć w słoiku Coplin przez co najmniej 5 minut w 1x PBS, a następnie dodać 200 μl 0,1 M Glycine-HCl (pH = 2,0) do próbek na szkiełku przez 10 sekund. Natychmiast dodaj 200 μl 10x SPB, aby zneutralizować pH.
   4. Myj szkiełko w 1x PBS w słoiku Coplin przez 5 minut.
   5. Wyjmij szkiełko z płukania i odpipetuj 100 μL 1x SPB + 5mM TCEP zawierającego 2 μg UTAG-fl do nicieni na szkiełkach i inkubuj w komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę bez kołysania.
   6. Włóż szkiełko z powrotem do słoika Coplin i myj przez 15 minut w 1x PBS
   7. Wyjmij szkiełko z pralni, użyj chusteczki laboratoryjnej do wysuszenia wokół próbki, a następnie zamontuj szkiełka za pomocą 5 μl medium montażowego (patrz tabela materiałów). Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C. Wizualizuj za pomocą odpowiednich zestawów filtrów dla DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl) i DyLight 488 (SUMO2/3).

Results

KmUTAG-fl to rekombinowane, oznaczone mCherry białko pułapkujące SUMO. Aby wyprodukować kmUTAG-fl, sklonowaliśmy zoptymalizowany pod kątem kodonu mCherry-kmUTAG do plazmidu nadekspresji bakterii pSPOT1 (Rysunek 1). Po indukcji białko kmUTAG-fl oczyszczono na Spot-TRAP, wymyto i zamrożono do dalszego wykorzystania. Aby zapewnić aktywność wychwytywania SUMO przez KmUTAG-fl, potwierdziliśmy wiązanie z kulkami sprzężonymi z SUMO1 i wytrącanie białka fuzyjnego SUMO-CAT (dan...

Discussion

W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie kmUTAG-fl, białka rekombinowanego, do badań funkcjonalnych SUMO w utrwalonych komórkach ssaków i wypreparowanych gonadach nicieni. KmUTAG-fl to odporny na stres odczynnik specyficzny dla pan-SUMO, który rozpoznaje i wychwytuje natywne białka sprzężone z SUMO i łańcuchy SUMO. Ponieważ trzeciorzędowa struktura SUMO jest wysoce konserwatywna, jest bardzo prawdopodobne, że warianty SUMO z dodatkowych systemów modelowych i niemodelowych mogą być analizowane za pomocą odczynnika kmUTAG-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% wodny roztwór paraformaldehydu (formaldehydu)	Mikroskopia elektronowa Nauki	30525-89-4
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe dla mysiego przeciwciała monoklonalnego
DPBS, bez wapnia, nie magnez	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 sprzężony AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe dla mysiego przeciwciała monoklonalnego
Fisherbrand Coverglass do okularów nakrywkowych	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II z DAPI	Mikroskopia elektronowa Sciences	50-246-93)	Nośnik montażowy w kroku 1.11
FLUORO-GEL z DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	Z DAPI dodanym do 1 µ g/ml; media montażowe w kroku 2.2.5
Glicyna-HCl	Odczynniki	BP3815
Glicyna-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Odczynniki Kerafast		KmUTAG są dostępne na Kerafast.com
bufor blokujący Oneblock Western-CL	Prometheus	20-313
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10X roztwór	Fisher BioReagents	BP3994
PNT2 linia komórkowa	Sigma-Aldrich	95012613	Normalny nabłonek prostaty unieśmiertelniony SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 został zdeponowany w DSHB przez Pelisch, F. / Hay, RT (dshb Hybridoma Product SUMO 6F2)
Bufor proteazy SUMO [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2% NP-40, 1,5 M NaCl
SUMO-2 Przeciwciało 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2 został zdeponowany w DSHB przez Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Stosowany jako środek redukujący w stężeniu 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Używany do permeablacji w stężeniu 0,1% w DPBS/PBS (dla robaków)