Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyciszanie genów za pośrednictwem lentiwirusa w ludzkiej pseudowysepce przygotowanej na płytkach o niskim przyłączeniu

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59578

⸱

14 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center, University of Iowa, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół tworzenia zmodyfikowanych genowo ludzkich pseudowysp trzustkowych z rozproszonych ludzkich komórek wysp trzustkowych, które są transdukowane przez lentiwirusa niosącego krótkie RNA spinki do włosów (shRNA). Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępne naczynia enzymatyczne i hodowlane, może być łatwo wykonywany i wytwarza genetycznie zmodyfikowane ludzkie pseudowysepki odpowiednie do badań funkcjonalnych i morfologicznych.

Streszczenie

Dostępne są różne narzędzia genetyczne do modulowania genów w wyspach trzustkowych gryzoni w celu zbadania funkcji genów wysp trzustkowych do badań nad cukrzycą. Jednak dane uzyskane z wysepek gryzoni często nie są w pełni odtworzone lub nie mają zastosowania do wysepek ludzkich ze względu na dobrze znane różnice w budowie i funkcji wysepek między gatunkami. Obecnie dostępne techniki manipulowania ekspresją genów ludzkich wysp trzustkowych są bardzo ograniczone. Wprowadzenie transgenu do nienaruszonych wysp trzustkowych przez adenowirusa, plazmid i oligonukleotydy często ma niską skuteczność i wysoką toksyczność. Niska wydajność jest szczególnie problematyczna w badaniach obniżania poziomu genów w nienaruszonych wyspach trzustkowych, które wymagają wysokiej wydajności. Wiadomo, że enzymatycznie rozproszone komórki wysp trzustkowych agregują się w kulturze, tworząc sferoidy zwane pseudowyspami. Kontrolowana pod względem wielkości reagregacja ludzkich komórek wysp trzustkowych tworzy pseudowyspy, które utrzymują dynamiczne wydzielanie insuliny w pierwszej fazie po długotrwałej hodowli i zapewniają okno do skutecznego wprowadzania lentiwirusowego krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA) o niskiej toksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół tworzenia ludzkich pseudowysp po transdukcji lentiwirusa przy użyciu dwóch dostępnych na rynku płytek wielodołkowych. Protokół może być łatwo wykonany i pozwala na efektywną regulację w dół genów i ocenę dynamiki wydzielania insuliny za pomocą ludzkich komórek wysp trzustkowych. W ten sposób ludzkie pseudowysepki z modulacją genów za pośrednictwem lentiwirusa stanowią potężny i wszechstronny model do oceny funkcji genów w ludzkich komórkach wysp trzustkowych.

Wprowadzenie

Utrata funkcjonalnej masy komórek beta jest główną patologią zarówno dla cukrzycy typu 1, jak i typu 21. Podczas gdy komórki beta są producentami insuliny w wyspach trzustkowych, komunikacja między komórkami beta a komórkami niebeta odgrywa kluczową rolę w regulacji wydzielania insuliny2. Ponadto rozregulowanie wydzielania glukagonu przyczynia się do hiperglikemii w cukrzycy3. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie modulacją ekspresji genów w komórkach w wyspach trzustkowych w celu zajęcia się mechanizmem stojącym za rozwojem dysfunkcji wysp trzustkowych w cukrzycy. Dostępnych jest wiele podejść, w tym myszy transgeniczne, do modulowania ekspresji genów mysich wysp trzustkowych. Jednak ludzkie i mysie wyspy trzustkowe wykazują wyraźne unerwienie, rozmieszczenie komórek, stosunek komórek beta do alfa oraz odpowiedź na secretagogues4. Dlatego bezpośrednia ocena funkcji genów w ludzkich wyspach trzustkowych jest niezwykle ważna dla zrozumienia patofizjologii ludzkich wysp trzustkowych.

Wektor adenowirusowy jest najczęściej używanym wektorem wirusowym do transdukcji wysp trzustkowych in vitro ze względu na wysoką skuteczność transdukcji w komórkach niedzielących się. Jednak adenowirus nie przenika skutecznie do rdzenia wysp trzustkowych, zwłaszcza u ludzi5, a w dużych dawkach jest cytotoksyczny6. Dla porównania, wektor lentiwirusowy jest mniej cytotoksyczny i dostarcza egzogenne geny na stałe do chromosomu komórek postmitotycznych, co czyni go szeroko testowanym nośnikiem terapii genowej7. Jednak zdolność lentiwirusa do przenikania do rdzenia nienaruszonych ludzkich wysepek jest również ograniczona, co wymaga częściowej dyspersji przez trawienie enzymatyczne w celu zwiększenia wydajności transdukcji8. Zastrzeżenie związane z rozproszeniem nienaruszonych ludzkich wysp trzustkowych polega na przerwaniu komunikacji komórka-komórka i komórka-macierz, co zagraża dynamicznej regulacji wydzielania insuliny, krytycznej dla utrzymania homeostazy glukozy u ludzi9. W związku z tym wyzwaniem była ocena wpływu modulacji genów na dynamiczną regulację funkcji wysp trzustkowych w modelu wysp trzustkowych u ludzi.

Wiadomo, że rozproszone komórki wysp trzustkowych z ludzkich i gryzoni autonomicznie reagregują się w struktury podobne do wysepek zwane "pseudowysepkami". Pseudowysepki wykazują rozkład komórek beta i niebeta podobny do natywnych wysp trzustkowych10,11. Dodatkowo, po długotrwałej hodowli, rodzime wyspy trzustkowe stopniowo tracą silne wydzielanie insuliny w pierwszej fazie5,10,11,12. Jednak pseudowysepki wykazały lepsze zachowanie pierwszej fazy wydzielania insuliny w odpowiedzi na glukozę w porównaniu z rodzimymi wysepkami po tym samym okresie hodowli5. Oprócz lepszego zachowania wydzielania insuliny, kontrolowana wielkość reagregacji ludzkich komórek wysp trzustkowych na płytkach o niskim przyleganiu11 daje możliwość wprowadzenia wektorów lentiwirusowych przed ich ponowną agregacją w pseudowysepki. Kilka badań wykazało przydatność pseudowysp trzustkowych w połączeniu z transdukcją za pośrednictwem lentiwirusa. Caton et al.13 stwierdzili, że wprowadzenie zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) wyrażającego lentiwirusa miało niewielki wpływ na wydzielanie insuliny, podczas gdy osiągnięcie jednorodnej ekspresji GFP w pseudowyspach szczurów w porównaniu z kontrolą bez zakażenia. Wykazali również specyficzny wpływ różnych koneksyn na wydzielanie insuliny poprzez nadekspresję koneksyny 32, 36 i 43 za pośrednictwem lentivirus13. Ludzkie pseudowysepki przygotowane z komercyjnie dostępną 96-dołkową płytką o bardzo niskim przyłączeniu wykazały, że nadekspresja czynnika transkrypcyjnego SIX3 za pośrednictwem lentiwirusa poprawia wydzielanie insuliny oceniane przez inkubację statyczną14. Niedawno, ludzkie pseudowysepki przygotowane z 96-dołkową płytką o bardzo niskim przyłączeniu zostały użyte do obniżenia glukokinazy za pomocą lentiwirusowego krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA) jako dowód zasady, aby pokazać, że wydzielanie insuliny stymulowane glukozą jest zmniejszone, podczas gdy wydzielanie insuliny stymulowane przez KCl zostało zachowane5. Badanie wykazało również, że ludzkie pseudowysepki są podobne do rodzimych wysp trzustkowych pod względem ekspresji genów i profili wydzielniczych, co dodatkowo potwierdza przydatność ludzkich pseudowysepek do analizy regulacji funkcji wysp trzustkowych5. Chociaż nie przeprowadzono peryfuzji, bioinżynieryjna płytka do hodowli mikrostudzienek, która niedawno stała się dostępna na rynku, została również uznana za kompatybilną z transdukcją lentiwirusową i wytworzyła ludzkie pseudowyspy, które wykazywały doskonałe wydzielanie insuliny in vitro i in vivo po przeszczepie11. Reasumując, tworzenie się ludzkich wysp rzekomych w połączeniu z transdukcją lentiwirusową jest prostym i skutecznym podejściem do badania patofizjologii ludzkich wysp trzustkowych, dostarczając cennego narzędzia do prowadzenia badań mechanistycznych na ludzkich wyspach trzustkowych.

W bieżącym raporcie, protokół tworzenia ludzkich pseudowysepek transdukowanych lentiwirusem przy użyciu dwóch dostępnych na rynku platform, 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyczepie i płytki do hodowli mikrodołkowej. Oba osiągają efektywną modulację ekspresji genów i tworzą ludzkie pseudowyspy, które są kompatybilne z dalszymi ocenami, w tym inkubacją statyczną i peryfuzją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przed rozpoczęciem badań, Komisja Dyscyplinarna Uniwersytetu Iowa przeprowadziła badania na ludziach, która stwierdziła, że badanie nie spełnia kryteriów badań na ludziach. Przed rozpoczęciem badania należy skonsultować się z lokalną komisją rewizyjną w celu ustalenia, czy źródło wysepek i planowane badanie wymaga uprzedniego zatwierdzenia.

UWAGA: Zazwyczaj, 1,200−1,400 ekwiwalentu wysepek (IEQ) ludzkich wysepek jest wymaganych do utworzenia 192 pseudowysepek o wielkości 3,000 komórek/pseudowysp w 96-dołkowej płytce o bardzo niskim przyłączeniu lub 1,200 pseudowysepek o wielkości 500 komórek/pseudowysepek na płytce do hodowli mikrostudzienek. Wymagany IEQ wysp trzustkowych różni się w zależności od różnych preparatów ludzkich wysp trzustkowych, ponieważ czynniki dawcy (wiek, zdrowie, waga), skuteczność izolacji i warunki hodowli wpływają na wydajność zawiesiny pojedynczej komórki. W tym protokole stosuje się lentiwirusa zawierającego shRNA ukierunkowanego na gen będący przedmiotem zainteresowania. Doniesiono, że wektory lentiwirusowe oparte na wirusie cytomegalii (CMV) i ludzkiej kinazie fosfoglicerynianowej (hPGK) skutecznie obniżają poziom genu w ludzkich pseudowyspach wysepkowych5,15. Stosowanie lentiwirusa wymaga środków ostrożności, ponieważ zagrożenie biologiczne16. Należy skontaktować się z lokalnym komitetem ds. bezpieczeństwa biologicznego przed rozpoczęciem stosowania lentiwirusa.

1. Nocna hodowla ludzkich wysepek w celu odzyskania po wysyłce

  1. Przygotuj pożywkę Connaught Medical Research Laboratories 1066 (CMRL-1066) uzupełnioną 1% albuminą ludzkiej surowicy (HSA) przez połączenie 50 ml CMRL-1066, 0,5 g HSA, 0,5 ml penicyliny-streptomycyny i 0,5 ml 100 mg / ml glutaminy (1% HSA CMRL) w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i przejście przez filtr 0,2 μm w celu sterylizacji.
  2. Delikatnie zakręć butelką transportową, aby utrzymać wysepki w zawieszeniu. Przenieść pożywkę transportową zawierającą wyspy trzasnkowe do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Pozostaw rurkę w BSC na 15 minut, aby wysepki osiadły na dnie rurki.
  3. Delikatnie usunąć podłoże transportowe, nie naruszając osadu wysepki, za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Ponownie zawiesić osad wysepki w 1% HSA CMRL do stężenia 400 IEQ/ml.
  4. Przenieś wysepki do naczynia poddanego działaniu kultury nietkankowej. Jeśli wysepki są podzielone na wiele naczyń, utrzymuj wysepki równomiernie zawieszone w podłożu, delikatnie obracając przed rozłupaniem. Hodowla wysepek w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez noc.
    nuta: Wymagane jest użycie naczynia poddanego hodowli tkankowej, aby zapobiec przyczepianiu się wysepek do płytki.

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z ludzkich wysp trzustkowych

  1. Przygotuj następujące elementy: pożywkę CMRL-1066 z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (HiFBS), penicyliną-streptomycyną i glutaminą (10% HiFBS CRML) w temperaturze pokojowej (RT), sitko 40 μm, szalkę Petriego 35 mm, strzykawkę tuberkulinową o pojemności 1 ml i hemocytometr.
  2. Przenieść ludzkie wyspy trzustkowe po całonocnej hodowli do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 190 x g przez 5 minut w wirniku z wahliwym kubełkiem. Zassać pożywkę pipetą o pojemności 5 ml bez naruszania osadu na wyspie trzustkowej.
  3. Przemyć osad, dodając do probówki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), delikatnie wymieszać i odwirować przy 190 x g przez 5 minut. Odsysać PBS bez naruszania osadu wysepkowego.
  4. Ponownie zawiesić osad wysp trzustkowych w 0,5 ml wstępnie podgrzanej mieszaniny enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych i pipetować 5x za pomocą pipety P1000 w celu wymieszania wysp trzustkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół 1−5 razy.
    nuta: Agresywne pipetowanie zwiększa utratę komórek.
  5. Sprawdź zmętnienie (pojedyncze komórki) i liczbę płatków (niestrawione wysepki). Dodać inkubację w temperaturze 2-3 min do 37 °C, w zależności od stopnia trawienia ocenianego na podstawie zmętnienia i liczby płatków. Zatrzymaj trawienie, gdy płatki zostaną zredukowane do ~10% wstępnego trawienia, a roztwór jest mętny.
    nuta: Czas potrzebny na trawienie różni się w zależności od rozkładu wielkości wysepek w każdym preparatu z wysepki ludzkiej.
  6. Umieścić sitko o średnicy 40 μm na szalce Petriego o średnicy 35 mm i zwilżyć sitko, dodając 1 ml 10% CMRL HiFBS i dociskając tłokiem strzykawki o pojemności 1 ml. Przenieść całą zawiesinę komórek na sitko i zebrać przepust do świeżej probówki o pojemności 15 ml.
  7. Przemyć probówkę używaną do trawienia wysp trzustkowych 0,5 ml świeżej pożywki CMRL w celu zebrania resztek komórek i przepuścić płukanie przez sitko. Połączyć przepust w probówce o pojemności 15 ml. Powtórz raz.
  8. Następnie należy oddzielić niestrawione wysepki pozostające na sitku poprzez dociśnięcie sitka umieszczonego w naczyniu o średnicy 35 mm z tłokiem strzykawki o pojemności 1 ml. Ponownie zebrać przepust i umyć sitko świeżym CMRL-1066, aby usunąć wszystkie pozostałe strawione wysepki z sitka i naczynia. Łącznie ~3 ml zawiesiny jednokomórkowej będzie teraz znajdować się w probówce o pojemności 15 ml.
  9. Zapisać całkowitą objętość zawiesiny komórek i pobrać 10 μl podwielokrotności komórek, aby policzyć liczbę komórek na hemocytometrze.
  10. Odwirowywać zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 200 x g. Usuń podłoże bez naruszania osadu. Przejdź do kroku 3.1.1 w przypadku używania 96-dołkowej płytki o bardzo niskim stopniu mocowania lub kroku 3.2.1 w przypadku używania 24-dołkowej płytki do hodowli mikrodołkowej w celu ponownego zagregowania komórek.

3. Tworzenie i transdukcja pseudowysp przez lentiwirusa

  1. Protokół z użyciem 96-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie
    1. Określ żądaną liczbę komórek na pseudowysepkę i liczbę pseudowysepek do utworzenia. Zazwyczaj 1,000-3,000 komórek jest używanych dla każdej pseudowysepki dla 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. W przypadku 3,000 komórek na pseudowyspę dostosuj zawiesinę komórek do 1 x 105 komórek/ml, ponownie zawieszając osad wysp trzustkowych z kroku 2.10 w 10% HiFBS CMRL, tak aby 30 μl zawiesiny komórkowej miało 3,000 komórek. Obliczyć całkowitą objętość 1 x 105 komórek/ml wymaganej zawiesiny jednokomórkowej (ml), korzystając z następującego równania:
      Całkowita objętość 1 x 105 komórek/ml zawiesiny pojedynczej komórki (ml) = (liczba komórek na wyspę rzekomą) x (liczba wytwarzanych wysepek rzekomych) / 1 x 105,
      nuta: Dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej w oparciu o pożądaną liczbę komórek na wyspę rzekomą, tak aby 30 μl zawiesiny komórkowej tworzyło jedną wyspę rzekomą.
    2. Przenieść wymaganą objętość (30 μl x liczba pseudowysp w trakcie tworzenia) zawiesiny jednokomórkowej do świeżej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 250 jednostek transdukcji (TU)/komórkę lentiwirusa zawierającego shRNA ukierunkowanego na gen będący przedmiotem zainteresowania lub kontroli.
      ostrożność: Lentiwirus jest sklasyfikowany jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 i może być zintegrowany z DNA zakażonych komórek.
      nuta: Stosować skoncentrowane lentiwirusy, tak aby objętość dodawanego lentiwirusa była minimalna. Miano wymagane na komórkę do skutecznego wyciszenia genów może się różnić w zależności od konstruktu lentiwirusowego.
    3. Wymieszaj zawiesinę komórkową z wirusem, pipetując delikatnie 5x pipetą P1000. Przenieś zmieszane komórki do sterylnego zbiornika na odczynnik o pojemności 50 ml, jeśli używasz pipety 8-kanałowej.
    4. Dozować 30 μl zawiesiny pojedynczej komórki zmieszanej z lentiwirusem do każdej studzienki za pomocą pipety 8-kanałowej lub pipety P200 na studzienkę, w zależności od liczby studzienek.
    5. Odwirować 96-dołkową płytkę w wirówce z obrotowym wiadrem przy 270 x g w temperaturze pokojowej przez 7 minut. Sprawdzić, czy komórki są zebrane w środku każdej studzienki. Jeśli nie, odwiruj ponownie, ponieważ zebranie wszystkich komórek w środku studzienki ma kluczowe znaczenie dla tworzenia pseudowysp. Hodowla w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez noc.
    6. Dodać 100 μl wstępnie podgrzanego 10% HiFBS CMRL do dołka następnego ranka, aby uniknąć wysuszenia komórek podczas kolejnej hodowli. Wirować przy 270 x g, RT przez 7 min. Hodowla w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5 % CO2 . Pseudowysepki zakończą formację w ciągu 5-7 dni.
    7. Podczas zbierania pseudowysepek należy wstępnie podgrzać żądaną objętość 10% HiFBS CMRL (100 μl na wysepkę), przygotować jeden sterylny zbiornik o pojemności 50 ml, jedną sterylną szalkę Petriego o średnicy 10 cm i jedną pipetę 8-kanałową w BSC.
    8. Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i umieścić w BSC. Odpipetować 100 μl na wysepkę 10% HiFBS CMRL do zbiornika.
    9. Odpipetować 100 μl na studzienkę 10% HiFBS CMRL ze zbiornika do pseudowysp i delikatnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy w studzience, aby podnieść wysepki do góry. Następnie odessać pożywkę do studzienki zawierającej wysepkę rzekomą i wyrzucić do 10-centymetrowej szalki Petriego. Zastosowanie pipety 8-kanałowej umożliwia przenoszenie 8 pseudowysp jednocześnie.
    10. Sprawdź płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że wszystkie pseudowysepki zostały całkowicie usunięte. Pseudowysepki tworzą zwarte agregaty i pozostają zagregowane po podniesieniu. Pseudowysepki są teraz gotowe do dalszych eksperymentów.
  2. Protokół z użyciem 24-dołkowej płytki do hodowli mikrodołkowej
    1. Podgrzej płyn do płukania zapobiegający przywieraniu (tabela materiałów) do temperatury rzeczywistej, aby zapewnić skuteczne tworzenie sferoidów. Ponadto wstępnie podgrzany zwykły CMRL-1066 i 10% HiFBS CMRL.
    2. Dodać 500 μl roztworu płuczącego zapobiegającego przywieraniu do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli mikrodołkowej, która ma być użyta do pseudowysepek. Wirować przy 1 300 x g przez 5 minut w wirówce z obrotowym kubełkiem.
    3. Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza zostały usunięte z mikrostudzienek. Jeśli pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione w mikrostudzienkach, należy ponownie odwirować przy 1 300 x g przez 5 minut.
    4. Odessać płyn do płukania zapobiegający przywieraniu ze studzienek w BSC. Wypłucz każdą studzienkę 2 ml ciepłego zwykłego CMRL-1066 raz. Zasysacz CMRL-1066. Dodaj 0,5 ml / studzienkę ciepłego 10% HiFBS CMRL do każdego dołka planowanego do użycia. Studnie są teraz gotowe do załadowania rozproszonych ludzkich komórek wysp trzustkowych przygotowanych w kroku 2.10.
    5. Określ całkowitą liczbę komórek potrzebnych do każdej studzienki. Jedna studzienka z 24-dołkową płytką do hodowli mikrostudzienkowej zawiera 1 200 mikrostudzienek i tworzy 1 200 pseudowysepek. 500 komórek na pseudowysepkę x 1200 mikrodołków = 6 x 105 komórek. Ponownie zawieś pojedyncze komórki z kroku 2.10 do 6 x 105 komórek w 0,8 ml 10% HiFBS CMRL w sterylnej probówce 1,5 ml.
      nuta: Maksymalna objętość na studzienkę wynosi 2 ml. Objętość zawiesiny komórek nie powinna przekraczać 1,5 ml. Protokół opisuje etapy tworzenia jednej studzienki z pseudowysepki transdukowanej przez lentiwirusa. Skalowanie w górę w zależności od liczby studzienek, które należy wykonać dla każdego lentiwirusa.
    6. W przypadku transdukcji wirusa dodać 125 TU/komórkę do zawiesiny pojedynczej komórki. Utrzymuj objętość wirusa poniżej 0,2 ml. Inkubować mieszaninę komórek i wirusów w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu delikatnie mieszając przez 1 godzinę, aby umożliwić kontakt komórek z wirusem przed kondensacją komórek w kroku 3.2.8.
      nuta: Użyć skoncentrowanego lentiwirusa tak, aby objętość dodanego lentiwirusa była minimalna. W Protokole 2 stosuje się mniejszą liczbę TU na komórkę w porównaniu z Protokołem 1, ponieważ całkowita objętość nośnika na komórkę jest mniejsza. Jednak miano wymagane na komórkę do skutecznego wyciszenia genów może się różnić w zależności od konstruktu lentiwirusa i wymaga optymalizacji.
      ostrożność: Lentiwirus jest sklasyfikowany jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 i może być zintegrowany z DNA zakażonych komórek.
    7. Po 1 godzinie dostosować całkowitą objętość mieszaniny komórek wysp trzustkowych i wirusa do 1 ml, dodając 10% HiFBS CMRL. Jeśli po 1 godzinie inkubacji komórki tworzą grudki, rozproszyć się do zawiesiny pojedynczej komórki przez delikatne i szybkie pipetowanie 2-3 razy. Pipetowanie jest bardzo ważne dla równomiernego rozmieszczenia komórek w mikrostudzienkach. Przenieść zawiesinę komórek do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli mikrodołkowej.
    8. Bezpośrednio po pipetowaniu odwirować przy 100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby wychwycić komórki do wszystkich mikrostudzienek. Obserwuj pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy komórki są równomiernie rozmieszczone we wszystkich mikrostudzienkach.
    9. Wyhodować płytkę do hodowli mikrostudzienkowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Pseudowysepki uformują się w ciągu 24−48 godzin. Pseudowysepki można hodować bez zmiany podłoża przez okres do 7 dni.
    10. Zmieniając pożywkę do hodowli dłużej niż 7 dni, wymień 50%-75% pożywki przy każdej zmianie pożywki w następujący sposób. Powoli usuń 0,5-1 ml pożywki za pomocą pipety P1000 z każdej studzienki. Powoli dodawać 0,5-1 ml świeżego 10% HiFBS CMRL, umieszczając końcówkę do ściany studzienki, aby uniknąć przemieszczenia pseudowysepek z płytki hodowlanej mikrostudzienki.
    11. Aby przygotować się do zbioru pseudowysepek, należy podgrzać 10% podłoże HiFBS CMRL. Pseudowysepki mają tendencję do unoszenia się w surowicy bez CMRL-1066, co utrudnia ich zebranie.
    12. Odessać 0,5 ml pożywki z dołka za pomocą pipety o pojemności 1 ml i mocno dozować pożywkę z powrotem na powierzchnię płytki, aby podnieść pseudowysepki z płytki do hodowli mikrostudzienkowej.
    13. Delikatnie odessać usunięte pseudowyspy za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieść wyspy trzustkowe do 6-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur nietkankowych. Przepuścić przez małe odwracalne sitko o średnicy 37 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pseudowysepki pozostaną na filtrze; Wszystkie niewłączone pojedyncze komórki będą przepływać przez.
      nuta: Aby uniknąć utraty pseudowysepek o mniejszych rozmiarach przez sitko, sitko można pominąć.
    14. Dozować 1 ml 10% HiFBS CMRL na całej powierzchni studzienki, aby usunąć wszelkie pozostałe wysepki rzekome, zassać usunięte wysepki rzekome i przejść przez sitko. Powtórz 3 razy, aby upewnić się, że wszystkie pseudowysepki są całkowicie zebrane ze studni.
    15. Obserwuj płytkę do hodowli mikrostudzienki pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że wszystkie pseudowysepki zostały zebrane. Powtórz mycie jak w kroku 3.2.14, jeśli pozostaną pseudowysepki.

4. Ekstrakcja RNA do oceny skuteczności wyciszania genów

  1. Pobrać pseudowysepki do PBS wolnego od RNaz w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć PBS bez naruszania osadu wysepki i przemyć raz PBS, a następnie odwirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  2. Odessać większość PBS za pomocą pipety P1000. Następnie zmień pipetę na pipetę P10, aby usunąć resztę PBS bez naruszania osadu z wysepki.
  3. Dodać 0,5 ml odczynnika do ekstrakcji RNA tiocyjanianu guanidyny (tabela materiałów) na probówkę. Homogenizuj pseudowysepki za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem 2-3 razy. Homogenat w odczynniku do ekstrakcji RNA tiocyjanianu guanidyny może być teraz przechowywany w temperaturze -80 °C lub przetwarzany w celu oczyszczenia RNA.
    UWAGA: 24 z 3,000 pseudowysp komórkowych utworzonych na 96-dołkowej płytce lub 48 z 500 pseudowysepek komórkowych utworzonych na płytce do hodowli mikrodołkowej są wystarczające do uzyskania 0,5-1 μg RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 ilustruje kluczowe etapy wytwarzania pseudowysepek z wykorzystaniem płytki 96-dołkowej o ultraniskiej adhezji oraz płytki do hodowli w mikrodofkach. Rycina 2a przedstawia sekwencyjne zmiany morfologiczne podczas tworzenia pseudowysepek z 3 x 103 ludzkie komórki wysepek trzustkowych w 96-dołkowej płytce o ultra niskiej adhezji. Monowarstwa lub luźne skupiska komórek obserwowane w 1. dniu zmieniły się do 5.–7. d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół generowania ludzkich pseudowysp trzustkowych, które są transdukowane przez lentiwirusa przy użyciu 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyczepie lub płytki do hodowli mikrodołkowej. Doniesiono, że pseudowysepki wykazują morfologię i funkcje wydzielnicze podobne do rodzimych ludzkich wysepek i mogą być hodowane przez dłuższy czas in vitro 5,11,18. W przeciwieństwie do rodzimych lud...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez National Institutes of Health dla Y.I. (R01-DK090490) i American Diabetes Association dla Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. i Y.I. są wspierani przez Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center. A.B. jest wspierany przez National Institutes of Health training grant (T32NS45549). Autorzy wykorzystali ludzkie wyspy trzustkowe dostarczone przez finansowany przez NIDDK Zintegrowany Program Dystrybucji Wysp Trzustkowych (IIDP) w City of Hope (2UC4DK098085).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płyn do płukania zapobiegający przywieraniuTechnologie komórek macierzystych7919
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermo ScientificSeria 1300 Typ A2
Sitko do komórek, 40 mikrometrówCorning431750
CMRL-106611530037
Inkubator CO2Thermo ScientificHeracell VIOS 160i
Stożkowa probówka wirówkowa, 15 mlVWR89039-666
Stożkowa probówka wirówkowa, 50 mlVWR89039-658
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher26140079
Odczynnik do ekstrakcji RNA tiocyjanianu guanidynyThermoFisher15596026Trizol
GlutaminaThermoFisher25030164
HemocytometrMarienFeld Neubauer-Improved Bright line
Albumina surowicy ludzkiejSigmaA1653
Mikroskop odwróconymarki Fisher11-350-119
MikrowirówkaBeckman CoulterMicrofuge 20
Probówka do mikrowirówek, 1,5 mlUSA Scientific1615-5500
Płytka do hodowli mikrodołkówTechnologie komórek macierzystych34411Aggrewell 400, 24-dołkowy
tłuczek napędzany silnikiemGAMUT
Naczynie niepoddane hodowli tkankowej, 10 cmFisher ScientificFB0875713
PBSThermoFisher14190250
Penicylina-streptomycynaThermoFisher10378016
szalka Petriego,Pipeta 229638
mlDOT Scientific,667205B
, Pipeta 8-kanałowaVWR#613-5253
10 mlVWR667210B
, Pipeta P10DenvilleUEZ-P-10
, Pipeta P200DenvilleUEZ-P-200
, P1000DenvilleUEZ-P-1000
Mieszanina enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznychSigmaA6965Accutase
, 50 mlVWR89094-680
Odwracalne sitko, 37 mikrometrówTechnologie stemcell27251
Wirówka z kubełkiem obrotowymBeckman CoulterAllegra X-14R
Rotor kubełkowywahadłowy Beckman CoulterSX4750A
Strzykawka tuberkulinowa, 1 mlBD309659
Mikropłytka o bardzo niskim nasadce, 96dołków Corning4515
#399X644 Celltreat 35 mm, Pipeta 5 , Pipeta Zbiornik odczynnika

Bibliografia

  1. Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
  2. Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711(2013).
  3. Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
  4. Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
  5. Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907(2018).
  6. Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
  7. Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
  8. Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
  9. Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
  10. Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
  11. Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
  12. Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
  13. Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
  14. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  15. Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855(2018).
  16. Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  17. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  18. Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
  19. Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
  20. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  21. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
  22. Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Lentiwirusowe wyciszanie genówludzkie pseudowysepkiizolacja komórek wysepektransdukcja shRNAtest wydzielania insulinyanaliza Western blotprotokół wirowaniapoziom bezpieczeństwa biologicznego 2downregulation genu
Wyciszanie genów za pośrednictwem lentiwirusa w ludzkiej pseudowysepce przygotowanej na płytkach o niskim przyłączeniu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.