Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59584

⸱

22 maja 2019

 ,  , 
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy łatwy do zastosowania protokół do oceny stabilności przechowywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, grupy naturalnie występujących nanocząsteczek wytwarzanych przez komórki. Pęcherzyki są obciążone glukuronidazą jako enzymem modelowym i przechowywane w różnych warunkach. Po przechowywaniu oceniane są ich parametry fizykochemiczne oraz aktywność kapsułkowanego enzymu.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są obiecującymi celami w obecnych badaniach, mogą być używane jako leki, nośniki leków i biomarkery. Dla ich rozwoju klinicznego ważna jest nie tylko ich aktywność farmaceutyczna, ale także ocena potrzeb produkcyjnych. W tym kontekście badania koncentrują się na izolacji pojazdów elektrycznych, ich charakterystyce i przechowywaniu. Niniejszy manuskrypt ma na celu zapewnienie łatwej procedury oceny wpływu różnych warunków przechowywania na pojazdy elektryczne, bez manipulacji genetycznych lub specyficznych testów funkcjonalnych. Dzięki temu możliwe jest szybkie uzyskanie pierwszego wrażenia na temat stabilności pojazdów elektrycznych w danych warunkach przechowywania, a pojazdy elektryczne pochodzące z różnych źródeł ogniw można łatwo porównać. Pomiar stabilności opiera się na parametrach fizykochemicznych pojazdów elektrycznych (wielkość, stężenie cząstek i morfologia) oraz zachowaniu aktywności ich ładunku. To ostatnie ocenia się za pośrednictwem saponin, w której enzym beta-glukuronidaza jest wprowadzany do EV. Glukuronidaza działa jako substytut i pozwala na łatwą kwantyfikację poprzez rozszczepienie fluorescencyjnej cząsteczki reporterowej. Obecny protokół może być narzędziem dla naukowców poszukujących warunków przechowywania, które optymalnie zachowują właściwości EV, aby posunąć badania nad EV w kierunku zastosowań klinicznych.

Wprowadzenie

EV to związane z błoną nanocząstki wytwarzane przez prawie wszystkie typy komórek. W przypadku komórek ssaków EV można podzielić na dwie główne grupy o różnych ścieżkach produkcji1,2. Pęcherzyki błonowe o wielkości od około 100 do 1,000 nm są wytwarzane przez bezpośrednie pączkowanie z błony komórkowej. Egzosomy o wielkości 30-200 nm pochodzą z ciał wielopęcherzykowych utworzonych przez pączkowanie do wewnątrz w endosomy, które następnie łączą się z błoną komórkową, uwalniając wiele egzosomów jednocześnie. Główną funkcją tych pęcherzyków jest transport informacji między komórkami3. W tym celu ładunki, takie jak RNA, DNA i białka, są w nich aktywnie sortowane. Pojazdy elektryczne mogą wywierać różnorodny wpływ na swoje cele, co ma wpływ zarówno na zdrowie, jak i stan chorobowy. Z jednej strony pośredniczą w pozytywnych efektach, takich jak regeneracja tkanek, prezentacja antygenu lub działanie antybiotykowe, co czyni je pomyślnymi celami dla ich rozwoju jako terapeutyki4,5. Z drugiej strony, EV mogą sprzyjać unaczynieniu nowotworu6, wywoływać efekty osób postronnych w reakcjach na stres7 i mogą odgrywać rolę w chorobach autoimmunologicznych8 i chorobach zapalnych9. W związku z tym mogą być kluczowym elementem lepszego zrozumienia wielu patologicznych skutków. Jednak obecność zmienionych EV w różnych chorobach, takich jak rak10,11,12 i zaburzenia sercowo-naczyniowe13, oraz ich łatwa dostępność we krwi i moczu sprawiają, że są idealnymi biomarkerami. Wreszcie, ich dobra biokompatybilność14 i ich wrodzona zdolność do celowania sprawiają, że EV są również interesujące dla dostarczania leków15. W tym manuskrypcie opisujemy protokół oceny stabilności przechowywania EV pochodzących z komórek ssaków, ważnej właściwości, która wciąż jest mało zbadana.

Dla klinicznego rozwoju pojazdów elektrycznych, nadal istnieje wiele przeszkód do pokonania16, w tym ocena ich efektów terapeutycznych, produkcja, oczyszczanie i przechowywanie17. Chociaż temperatura -80 °C jest powszechnie postrzegana jako złoty standard w przechowywaniu pojazdów elektrycznych18, wymagane zamrażarki są drogie, a utrzymanie wymaganego łańcucha chłodniczego od produkcji do pacjenta może być wyzwaniem. Co więcej, niektóre raporty wskazują, że przechowywanie w temperaturze -80 °C nadal nie pozwala optymalnie konserwować pojazdów elektrycznych i powoduje utratę funkcjonalności pojazdów elektrycznych19,20. Inne metody, takie jak liofilizacja21,22 lub suszenie rozpyłowe23, zostały zaproponowane jako potencjalne alternatywy dla przechowywania pojazdów elektrycznych w stanie surowym.

Optymalnym sposobem oceny stabilności przechowywania byłoby przetestowanie EV w testach funkcjonalnych lub poprzez ocenę konkretnego markera, na przykład ich aktywności przeciwbakteryjnej19. Jest to możliwe, gdy znany jest pożądany efekt pęcherzyków i gdy ma być badana jedna odrębna grupa EV. Jeśli EV z różnych źródeł komórkowych mają być porównywane (np. w celu kapsułkowania leków) lub jeśli nie jest znany odczyt funkcjonalny, nie jest już możliwa bezpośrednia ocena zmian spowodowanych przechowywaniem.

Z drugiej strony, prosta ocena zmian w ich parametrach fizykochemicznych, takich jak wielkość, odzysk cząstek i stężenie białka, nie zawsze przewiduje zmiany w aktywności EV, jak wykazano w niedawnym patencie20.

Tutaj udostępniamy łatwy do zastosowania protokół pomiaru stabilności przechowywania pojazdów elektrycznych, oceniając ich parametry fizykochemiczne w połączeniu z aktywnością kapsułkowanego enzymu beta-glukuronidazy jako substytutu ładunku pojazdów elektrycznych. Ładowanie enzymu odbywa się za pomocą inkubacji saponin, łagodnej metody opracowanej dla EV z różnych źródeł21,24,25. Saponina tworzy przejściowe pory w błonie EV, co umożliwia wychwyt enzymu do pęcherzyka. Ponieważ enzymy są podatne na utratę swojej aktywności, jeśli zostaną poddane niekorzystnym warunkom przechowywania, są idealnym substytutem do oceny zachowania funkcjonalnych ładunków pojazdów elektrycznych.

Wykazaliśmy, że zastosowanie tego protokołu do EV pochodzących z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i ludzkich komórek nabłonka gruczolakoraka pęcherzyków płucnych (A549) rzeczywiście powoduje duże różnice w stabilności przechowywania między różnymi liniami komórkowymi, co powinno być brane pod uwagę przy wyborze źródła EV21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i produkcja pożywki kondycjonowanej przez komórkę

  1. Ogólnie rzecz biorąc, hoduj komórki w indywidualnych warunkach wymaganych dla danej linii komórkowej.
  2. Hodować komórki przez 24-72 godziny w warunkach bez surowicy lub w pożywce zawierającej płodową surowicę bydlęcą zubożoną w EV (FBS).
    UWAGA: Jeśli używany jest FBS zubożony w EV, należy zastosować metodę o udowodnionej skuteczności wyczerpywania surowicy, aby zapobiec zanieczyszczeniu EVs pochodzących z surowicy bydlęcej26.
  3. Zebrać pożywkę z kolb. Wirować przy 300 x g przez 10 minut, aby granulować komórki. Ostrożnie zebrać pożywkę kondycjonowaną komórkowo (CCM), nie naruszając granulowanych komórek. Zaleca się stosowanie CCM bezpośrednio lub przechowywanie go przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zawsze zaleca się stosowanie świeżo wyprodukowanego CCM. Jeżeli nie można obejść przechowywania przez dłuższy czas, wszystkie istotne parametry należy zapisać zgodnie z wytycznymi MISEV201826, przy czym należy wziąć pod uwagę potencjalne odchylenia uzyskanych wyników.
  4. Przykładowy protokół dla HUVEC
    1. Hodować komórki HUVEC przez 120 godzin w pożywce EGM-2 zawierającej FBS i inne suplementy.
    2. Hodować komórki HUVEC przez 48 godzin w pożywce podstawowej EBM-2 bez żadnych dodatkowych suplementów.
    3. Zebrać pożywkę z kolb i przeprowadzić etap wirowania, jak wskazano powyżej (krok 1.3). Zazwyczaj używa się 100 ml pożywki na jedną izolację EV.

2. Ultrawirowanie CCM

  1. Bezpośrednio przed ultrawirowaniem (UC) należy odwirować CCM przez 15 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i dużych aglomeratów.
  2. Ostrożnie przenieść supernatant do probówek UC. Jeśli używasz wirnika o stałym kącie, zaznacz orientację probówek w wirówce, aby ułatwić pobieranie granulatu EV po UC. Wirować przez 2 godziny przy 120 000 x g, ze współczynnikiem k 259,4.
  3. Po UC ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, aby uniknąć zakłócenia granulowanych EVs.
    UWAGA: Śrut może być niewidoczny.
  4. Dodać 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z filtrem 0,2 μm do pierwszej probówki i użyć PBS oraz pozostałego supernatantu do ponownego zawieszenia osadu przez pipetowanie w górę i w dół. Przenieść otrzymaną zawiesinę EV do następnej probówki odpowiedniej próbki i użyć jej do ponownego zawieszenia. Postępuj w ten sposób, aby ponownie zawiesić wszystkie EV próbki w końcowej objętości około 300-350 μl.
  5. Po ponownym zawieszeniu potwierdzić obecność cząstek za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Użyj ustawień zoptymalizowanych dla danego typu EV, takich jak ustawienia poniżej (krok 2.5.1).
    UWAGA: Artykuły Gardinera i wsp.27 oraz Vestad et al.28 zawierają cenne informacje na temat optymalizacji parametrów pomiaru EV.
    1. Aby odtworzyć wyniki opisane poniżej, użyj przyrządów (np. NanoSight LM14) wyposażonych w zielony laser. Nagraj trzy filmy trwające 30 s z przyrostem ekranu 1,0 i poziomem kamery 13. Do analizy należy użyć wzmocnienia ekranu 1,0 i progu wykrywania 5.
    6. Jeśli
  6. to możliwe, należy natychmiast zużyć granulki, w przeciwnym razie przechowywać je w temperaturze 4 °C przez noc.

3. Kapsułkowanie glukuronidazy do EV

  1. Do zawieszonego osadu dodać beta-glukuronidazę (10 mg/ml w PBS) do końcowego stężenia 1,5 mg/ml i saponinę (10 mg/ml w H2O) do końcowego stężenia 0,1 mg/ml. Dobrze wymieszaj, wirując przez 3 sekundy.
  2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z przerywanym mieszaniem, delikatnie przesuwając probówkę. Po inkubacji oczyścić bezpośrednio metodą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) (patrz sekcja 5).
    UWAGA: Nie zamrażaj ponownie próbek glukuronidazy po rozmrożeniu, aby zapobiec degradacji enzymów w wyniku zamrożenia.

4. Produkcja liposomów

  1. Aby przygotować liposomy do porównania z EV, rozpuścić 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DMPC) i 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC) w stosunku molowym 2:3 w chloroformie do końcowego stężenia 5 mM. Przygotować 1 ml porcji w fiolkach do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i pozostawić do wyschnięcia przez noc, aby utworzyć film lipidowy.
    UWAGA: Chloroform jest toksyczny i podejrzewa się, że jest rakotwórczy. Podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas obchodzenia się z nim.
  2. Ponownie uwodnić warstwę lipidową za pomocą 1 ml PBS zawierającego 1,5 mg/ml glukuronidazy. Podgrzej do 42 °C i wiruj przez 1 minutę. Podgrzej zespół wytłaczarki do 42 °C i wytłacz zawiesinę lipidową 11x przez membranę poliwęglanową o długości fali 200 nm. Oczyszczanie bezpośrednie przez SEC (patrz sekcja 5).

5. Oczyszczanie przez SEC

  1. Przygotuj kolumnę SEC przy użyciu następującego protokołu.
    1. Używaj tylko świeżej oczyszczonej wody i świeżo przygotowanych. Przefiltrować wszystkie przez filtr membranowy 0,2 μm i odgazować je, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w kolumnie.
    2. Do przygotowania kolumny SEC należy użyć matrycy na bazie filtracji w żelu agarozowym (np. Sepharose Cl-2b) lub innej pożywki SEC odpowiedniej do oddzielenia EV i liposomów od zanieczyszczeń białkowych i nadmiaru enzymu. Najpierw usuń 20% roztwór EtOH, w którym przechowywane jest medium, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w kolumnie. W tym celu należy odwirować pożywkę SEC o sile 3 000 x g przez 10 minut, usunąć EtOH i zastąpić go odgazowaną wodą.
    3. Napełnić szklaną kolumnę (o średnicy wewnętrznej 10 mm) podłożem SEC do oznaczenia 15 ml.
      UWAGA: Objętości będą się różnić w przypadku kolumn o różnych wymiarach. Upewnij się, że żel całkowicie osiada
      4. .
    4. Przed uruchomieniem należy zrównoważyć kolumnę z co najmniej dwoma woluminami kolumn PBS. Aby przechowywać kolumnę, najpierw umyj ją jedną objętością kolumny wody, a następnie co najmniej dwiema objętościami kolumny po 20% EtOH. Po przechowywaniu najpierw umyj kolumnę jedną objętością wody, a następnie wyrównaj PBS.
    5. Użyj do 400 μl EV lub zawiesiny liposomowej w jednej separacji. Zbierz frakcje po 1 ml. Po SEC należy przechowywać oczyszczone EV (patrz sekcja 7) lub poddać je testowi glukuronidazy (patrz punkt 6).
  2. Potwierdź oddzielenie EV i liposomów od zanieczyszczających białek i wolnej glukuronidazy. W tym celu należy skorelować stężenia cząstek pobranych frakcji ze stężeniem białka i aktywnością glukuronidazy.
    1. Ocenić stężenie cząstek za pomocą NTA (patrz 2.5)
    2. Ocenić zawartość białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) lub innego odpowiedniego testu ilościowego oznaczania białka. Wykonaj test zgodnie z protokołem producenta.
    3. Ocenić aktywność glukuronidazy za pomocą testu glukuronidazy (patrz punkt 6).
  3. Opcjonalnie można ocenić morfologię EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
    1. W celu przygotowania próbek TEM należy dodać 10 μl zawiesiny EV do siatki TEM, inkubować przez 10 minut, a następnie usunąć nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej. Wykonuj utrwalanie przez 10 minut z 10 μl 4% paraformaldehydu i zetrzyj nadmiar. Umyć 3x wodą. Zabarwić pęcherzyki przez 20-sekundową inkubację z 30 μl 1% hydratu kwasu fosforowo-wolframowego. Po osuszeniu nadmiaru wysusz pęcherzyki przez noc. Wizualizacja za pomocą TEM.
      UWAGA: Kwas fosfowolframowy jest silnie; W ten sposób chroń skórę i oczy.
    2. W przypadku SEM należy umieścić wcześniej przygotowane próbki TEM na krążkach węglowych i napylić je warstwą złota o grubości 50 nm. Wizualizacja za pomocą SEM.

6. Test glukuronidazy

  1. Aby umożliwić porównanie różnych próbek i warunków przechowywania poprzez skorelowanie liczby cząstek i aktywności enzymu, należy najpierw zmierzyć stężenie cząstek w próbce za pomocą NTA (patrz krok 2.5).
  2. Przygotować roztwór roboczy di-β-D-glukuronidu fluoresceiny, dodając 1 μl związku (10 mg/ml wH2O) do 199 μl PBS. Dodaj 25 μl tego roztworu do 125 μl oczyszczonych EV, aby uzyskać końcowe stężenie 8,3 μg/ml. Odpipetować próbkę do czarnej płytki 96-dołkowej. Zmierz punkt czasowy 0 h za pomocą czytnika płytek, używając 480 nm jako wzbudzenia i 516 nm jako długości fali emisji.
  3. Przykryć szczelnie płytkę (np. przezroczystą folią z tworzywa sztucznego używaną do płytek PCR) w celu zminimalizowania parowania i inkubować w ciemności przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. Zmierzyć produkcję fluoresceiny przy użyciu parametrów czytnika płytek wymienionych w kroku 6.2.

7. Przechowywanie EV i liposomów

UWAGA: Do wszystkich celów przechowywania, zaleca się używanie rurek o niskim stopniu wiązania, aby zmniejszyć straty EV spowodowane adsorpcją.

  1. Postępuj zgodnie z parametrami w tej sekcji, aby odtworzyć reprezentatywne wyniki podane poniżej. Należy użyć próbek składających się z 400 μl zawiesiny EV.
    1. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub -80 °C lub postępować zgodnie z poniższymi krokami.
    2. Liofilizacja pojazdów elektrycznych.
      1. Dodać trehalozę (40 mg/ml wH2O) do końcowego stężenia 4 mg/ml do oczyszczonych EVs. Zamrażać próbki w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę.
      2. Liofilizować próbki, stosując następujące parametry. W przypadku suszenia głównego należy ustawić temperaturę półki na 15 °C i ciśnienie na 0,180 mbar i pozostawić próbki do wyschnięcia na 46 godzin. W celu końcowego suszenia należy ustawić temperaturę półki na 25 °C i ciśnienie na 0,0035 mbar i pozostawić próbki do wyschnięcia na 2 godziny. Przechowywać liofilizowane próbki w temperaturze 4 °C.
      3. Aby ponownie uwodnić próbki, dodać H2O, równą ilości zawiesiny EV obecnej na początku (zwykle 400 μL). Nie używaj żadnego buforu do ponownego wypełniania.

8. Analiza po przechowywaniu

  1. Aby ocenić aktywność enzymu, należy najpierw usunąć wolną glukuronidazę, która mogła wycieknąć z EV podczas przechowywania. Osiąga się to poprzez dodatkowy etap oczyszczania, który przeprowadza się albo za pomocą SEC (patrz krok 5), albo frakcjonowania z przepływem asymetrycznym (AF4) (patrz krok 8.1.2).
    UWAGA: Należy pamiętać, że obie metody prowadzą do rozcieńczenia próbki EV; w związku z tym przed przechowywaniem należy stosować wystarczające stężenia EV, aby uniknąć przekroczenia poniżej limitu kwantyfikacji NTA. Spodziewaj się rozcieńczenia cząstek w stosunku 1:10 ze względu na SEC lub AF4.
    1. W celu oczyszczenia SEC postępuj zgodnie z protokołem opisanym powyżej (patrz sekcja 5).
    2. Wykonaj oczyszczanie AF4.
      1. Ustaw instrument za pomocą małego kanału z przekładką 350 μm i membraną celulozową o masie cząsteczkowej 30 kD. Umieść filtr o wielkości porów 0,1 μm między pompą HPLC a kanałem AF4. Użyj świeżo przygotowanego PBS przefiltrowanego przez 0,1 μm jako fazy ruchomej, aby zmniejszyć obciążenie cząstkami i szum w detektorach rozpraszania światła.
      2. Wykrywanie białek za pomocą detektora UV ustawionego na 280 nm. Do wykrywania cząstek należy stosować wielokątowe rozpraszanie światła z laserem ustawionym na 658 nm.
      3. Użyj następującej metody uruchamiania. Wstępne ustawianie ostrości przez 1 minutę z przepływem ostrości 1 ml/min; następnie wstrzyknąć 300 μl próbki z szybkością 0,2 ml/min i utrzymać przepływ ostrości przez 10 minut. Po wstrzyknięciu eluować próbkę z prędkością 1 ml/min, stosując przepływ krzyżowy, który zmniejsza się z 2 ml/min do 0,1 ml/min w ciągu 8 minut. Elucja przez kolejne 10 minut bez przepływu krzyżowego. Zbieraj frakcje po 1 ml, zaczynając po 12,5 min i kontynuując do 27 min.
    3. Wykonać test glukuronidazy zgodnie z powyższym opisem (patrz punkt 6).
  2. Aby ocenić wielkość i stężenie, należy użyć NTA, jak opisano powyżej (patrz krok 2.5).
  3. Opcjonalnie należy przeprowadzić TEM i SEM w celu oceny morfologii EV po przechowywaniu (patrz 5.3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia charakterystykę przechowywania EV wyizolowanych z HUVEC. EV wyizolowano metodą UC, enkapsulowano glukuronidazę, a następnie po SEC oczyszczone EV oceniono pod kątem właściwości fizykochemicznych za pomocą NTA. Próbkę pęcherzyków poddano następnie oczyszczaniu metodą AF4 i zmierzono aktywność glukuronidazy.

Pęcherzyki przechowywano następnie przez 7 d w temperaturze 4 °C lub -80 °C, a także w 4 °C w formie liofilizowanej, przy czym w tym ostatnim przypadku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym manuskrypcie przedstawiamy kompleksowy protokół badania stabilności pojazdów elektrycznych w różnych warunkach przechowywania. Dzięki połączeniu kapsułkowanej glukuronidazy jako odczytu funkcjonalnego i oceny parametrów fizykochemicznych EV, protokół pozwala na prostą ocenę stabilności przechowywania EV i porównanie EV z różnych linii komórkowych. SEM i TEM jako metody uzupełniające pozwalają na wgląd w zmiany EV na poziomie pojedynczych cząstek. Przedstawione tutaj wyniki wykazały tendencję EV i liposomów do agreg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Program NanoMatFutur Junior Research z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych w Niemczech (grant numer 13XP5029A) wspierał tę pracę. Maximilian Richter otrzymał wsparcie od Studienstiftung des Deutschen Volkes (Niemieckiej Fundacji Stypendiów Akademickich) w ramach stypendium doktoranckiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2 dimyrystoilo-sn glicero-3-fosfocholina (DMPC)Sigma-AldrichP2663-25MG
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfo-cholina (DPPC)Sigma-AldrichP4329-25MG
225 cm² kolby do hodowli komórkowychCorning431082Używany z 25 ml pożywki
30 kDa membrana z regenerowanej celulozyWyatt Technology Europe1854
350 i mikro; m dystansWyatt Technology Europe
Automatyczny kolektor frakcjiThermo Fisher Scientific
Beta-glukuronidazaSigma-AldrichG7646-100KU
ChloroformFisher scientificC/4966/17
Piec kolumnowyHitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehaloza dwuwodnaSigma-AldrichT9531-10G
- DAWN HELEOS II - Wielokątny detektor rozpraszania światła  Wyatt Technology Europe
Filtr membranowy Durapore, PVDF,  0,1  &mikro; m, 47  mmMerckVVLP04700Służy do przygotowania dla AF4
EBM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3156Podłoże podstawowe do wzrostu komórek śródbłonka, stosowane do hodowli komórek HUVEC bez surowicy
Eclipse dualtecWyatt Technology Europe
EGM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3162Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka, stosowana do normalnej hodowli komórek HUVEC
Uszczelniacze płytkowe ELISAR& D SystemsDY992służy do uszczelniania 96-dołkowych płytek do testu glukuronidazy
EtanolFisher scientificE/0665DF/17
Zestaw wytłaczarki z uchwytem/blokiem grzewczymAvanti Polar Lipids610000-1EA
Wspornik filtraAvanti Polar Lipids610014-1EAużywany do otrzymywania liposomów
Di-β-D-glukoronidfluoresceinyThermo Fisher ScientificF2915
Gibco PBS-tabletki+CA10:F36Thermo Fisher Scientific18912014
Hettich Universal 320 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGSłuży do peletek przy 300 g
Hettich Rotina 420 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGSłuży do granulowania większych zanieczyszczeń przy 3000 g
ogniw HUVECLonza Verviers, S.p.r.C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CMKimble420401-1030
Liofilizator ALPHA 2-4
, polipropylenVWR international525-0255rurki używane do wszystkich pojazdów elektrycznych, uznane za korzystniejsze niż porównywalne produkty innych dostawców pod względem odzysku cząstek
Nanosight LM14 wyposażony w zielony laserMalvern Pananalytical
Oprogramowanie Nanosight w wersji 3.1Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm membrany poliwęglanoweWhatman/GE Healthcare110406używane do przygotowania liposomów
PEEK Uchwyt filtra liniowegoWyatt Technology Europe
Hydrat kwasu fosfowolframowegoSigma-Aldrich79690-25G
Butelki poliwęglanowe do ultrawirowaniaBeckman Coulter355622
Zestaw testowy QuantiPro BCASigma-AldrichQPBCA-1KT
SaponinaSigma-Aldrich47036
Skaningowa mikroskopia elektronowa Zeiss EVO HD 15Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2bGE Healthcare17014001
SEM miedź siatki z folią węglowąPlanoS160-4
Mały kanał AF4Wyatt Technology Europe
Napylarka Q150R ESQuorum Technologies
Transmisyjna mikroskopia elektronowa JEOL JEM 2011Oxford Instruments
Wirnik ultrawirówkowy typu 45 TiBeckman Coulter339160
Ultimate 3000 Automatyczny podajnik próbek DionexThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Pompa izokratyczna DionexThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex odgazowywacz próżniowy onlineThermo Fisher Scientific
Ultrawirówka OptimaTM L-90 KBeckman Coulter
Detektor UVThermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 & mikro; m Filtr z mieszanej celulozy o wielkości porówWhatman/GE Healthcare10401712Służy do filtracji wszystkich stosowanych w pojazdach elektrycznych i w SEC
Probówki do mikrowirówek LSC Christ

Bibliografia

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450(2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746(2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356(2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259(2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190(2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465(2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377(2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671(2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Asymetryczna frakcjonacja przepływem polowymchromatografia wykluczaniaenkapsulacja beta-glukuronidazyanaliza śledzenia nanocząstektransmisyjna mikroskopia elektronowaprotokół liofilizacjitest aktywności enzymatycznejpomiar odzysku cząstek
Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.