Tutaj prezentujemy łatwy do zastosowania protokół do oceny stabilności przechowywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, grupy naturalnie występujących nanocząsteczek wytwarzanych przez komórki. Pęcherzyki są obciążone glukuronidazą jako enzymem modelowym i przechowywane w różnych warunkach. Po przechowywaniu oceniane są ich parametry fizykochemiczne oraz aktywność kapsułkowanego enzymu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są obiecującymi celami w obecnych badaniach, mogą być używane jako leki, nośniki leków i biomarkery. Dla ich rozwoju klinicznego ważna jest nie tylko ich aktywność farmaceutyczna, ale także ocena potrzeb produkcyjnych. W tym kontekście badania koncentrują się na izolacji pojazdów elektrycznych, ich charakterystyce i przechowywaniu. Niniejszy manuskrypt ma na celu zapewnienie łatwej procedury oceny wpływu różnych warunków przechowywania na pojazdy elektryczne, bez manipulacji genetycznych lub specyficznych testów funkcjonalnych. Dzięki temu możliwe jest szybkie uzyskanie pierwszego wrażenia na temat stabilności pojazdów elektrycznych w danych warunkach przechowywania, a pojazdy elektryczne pochodzące z różnych źródeł ogniw można łatwo porównać. Pomiar stabilności opiera się na parametrach fizykochemicznych pojazdów elektrycznych (wielkość, stężenie cząstek i morfologia) oraz zachowaniu aktywności ich ładunku. To ostatnie ocenia się za pośrednictwem saponin, w której enzym beta-glukuronidaza jest wprowadzany do EV. Glukuronidaza działa jako substytut i pozwala na łatwą kwantyfikację poprzez rozszczepienie fluorescencyjnej cząsteczki reporterowej. Obecny protokół może być narzędziem dla naukowców poszukujących warunków przechowywania, które optymalnie zachowują właściwości EV, aby posunąć badania nad EV w kierunku zastosowań klinicznych.
Wprowadzenie
EV to związane z błoną nanocząstki wytwarzane przez prawie wszystkie typy komórek. W przypadku komórek ssaków EV można podzielić na dwie główne grupy o różnych ścieżkach produkcji1,2. Pęcherzyki błonowe o wielkości od około 100 do 1,000 nm są wytwarzane przez bezpośrednie pączkowanie z błony komórkowej. Egzosomy o wielkości 30-200 nm pochodzą z ciał wielopęcherzykowych utworzonych przez pączkowanie do wewnątrz w endosomy, które następnie łączą się z błoną komórkową, uwalniając wiele egzosomów jednocześnie. Główną funkcją tych pęcherzyków jest transport informacji między komórkami3. W ty....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórkowa i produkcja pożywki kondycjonowanej przez komórkę
- Ogólnie rzecz biorąc, hoduj komórki w indywidualnych warunkach wymaganych dla danej linii komórkowej.
- Hodować komórki przez 24-72 godziny w warunkach bez surowicy lub w pożywce zawierającej płodową surowicę bydlęcą zubożoną w EV (FBS).
UWAGA: Jeśli używany jest FBS zubożony w EV, należy zastosować metodę o udowodnionej skuteczności wyczerpywania surowicy, aby zapobiec zanieczyszczeniu EVs pochodzących z surowicy bydlęcej26. - Zebrać pożywkę z kolb. Wirować przy 300 x g przez 10 minut, aby granulować komórki. Ostrożnie zebrać poży....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia charakterystykę przechowywania EV wyizolowanych z HUVEC. EV wyizolowano metodą UC, enkapsulowano glukuronidazę, a następnie po SEC oczyszczone EV oceniono pod kątem właściwości fizykochemicznych za pomocą NTA. Próbkę pęcherzyków poddano następnie oczyszczaniu metodą AF4 i zmierzono aktywność glukuronidazy.
Pęcherzyki przechowywano następnie przez 7 d w temperaturze 4 °C lub -80 °C, a także w 4 °C w formie liofilizowanej, przy czym w tym ostatnim przypadku.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie przedstawiamy kompleksowy protokół badania stabilności pojazdów elektrycznych w różnych warunkach przechowywania. Dzięki połączeniu kapsułkowanej glukuronidazy jako odczytu funkcjonalnego i oceny parametrów fizykochemicznych EV, protokół pozwala na prostą ocenę stabilności przechowywania EV i porównanie EV z różnych linii komórkowych. SEM i TEM jako metody uzupełniające pozwalają na wgląd w zmiany EV na poziomie pojedynczych cząstek. Przedstawione tutaj wyniki wykazały tendencję EV i liposomów do agreg.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Program NanoMatFutur Junior Research z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych w Niemczech (grant numer 13XP5029A) wspierał tę pracę. Maximilian Richter otrzymał wsparcie od Studienstiftung des Deutschen Volkes (Niemieckiej Fundacji Stypendiów Akademickich) w ramach stypendium doktoranckiego.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,2 dimyrystoilo-sn glicero-3-fosfocholina (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfo-cholina (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² kolby do hodowli komórkowych | Corning | 431082 | Używany z 25 ml pożywki |
| 30 kDa membrana z regenerowanej celulozy | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 i mikro; m dystans | Wyatt Technology Europe | ||
| Automatyczny kolektor frakcji | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glukuronidaza | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Piec kolumnowy | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehaloza dwuwodna | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| - DAWN HELEOS II - Wielokątny detektor rozpraszania światła | Wyatt Technology Europe | ||
| Filtr membranowy Durapore, PVDF, 0,1 &mikro; m, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Służy do przygotowania dla AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Podłoże podstawowe do wzrostu komórek śródbłonka, stosowane do hodowli komórek HUVEC bez surowicy |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka, stosowana do normalnej hodowli komórek HUVEC |
| Uszczelniacze płytkowe ELISA | R& D Systems | DY992 | służy do uszczelniania 96-dołkowych płytek do testu glukuronidazy |
| Etanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Zestaw wytłaczarki z uchwytem/blokiem grzewczym | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Wspornik filtra | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | używany do otrzymywania liposomów |
| Di-β-D-glukoronid | fluoresceinyThermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tabletki+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Służy do peletek przy 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Służy do granulowania większych zanieczyszczeń przy 3000 g | |
| ogniw HUVEC | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Liofilizator ALPHA 2-4 | |||
| , polipropylen | VWR international | 525-0255 | rurki używane do wszystkich pojazdów elektrycznych, uznane za korzystniejsze niż porównywalne produkty innych dostawców pod względem odzysku cząstek |
| Nanosight LM14 wyposażony w zielony laser | Malvern Pananalytical | ||
| Oprogramowanie Nanosight w wersji 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm membrany poliwęglanowe | Whatman/GE Healthcare | 110406 | używane do przygotowania liposomów |
| PEEK Uchwyt filtra liniowego | Wyatt Technology Europe | ||
| Hydrat kwasu fosfowolframowego | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Butelki poliwęglanowe do ultrawirowania | Beckman Coulter | 355622 | |
| Zestaw testowy QuantiPro BCA | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Skaningowa mikroskopia elektronowa Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM miedź siatki z folią węglową | Plano | S160-4 | |
| Mały kanał AF4 | Wyatt Technology Europe | ||
| Napylarka Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmisyjna mikroskopia elektronowa JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Wirnik ultrawirówkowy typu 45 Ti | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Automatyczny podajnik próbek Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Pompa izokratyczna Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex odgazowywacz próżniowy online | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultrawirówka OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| Detektor UV | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 & mikro; m Filtr z mieszanej celulozy o wielkości porów | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Służy do filtracji wszystkich stosowanych w pojazdach elektrycznych i w SEC |
Bibliografia
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
