Nowatorski i translacyjny szczurzy model wstrząsu mózgu łączący siłę i rotację z mikrodializą mózgową in vivo

Podsumowanie

Zmiana neuroprzekaźnika to mechanizm dysfunkcji neuronalnej, który występuje po wstrząśnieniu mózgu i przyczynia się do czasami katastrofalnych długoterminowych konsekwencji. Ten model szczurzy łączy w sobie mikrodializę, umożliwiającą kwantyfikację neuroprzekaźników in vivo, z techniką spadku masy ciała, wywierającą gwałtowne przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia, co jest ważnym czynnikiem urazów czaszkowo-mózgowych u ludzi.

Streszczenie

Uporczywe objawy poznawcze i motoryczne są znanymi konsekwencjami wstrząsów mózgu/łagodnych urazowych uszkodzeń mózgu (mTBI), które mogą być częściowo przypisane zmienionej neurotransmisji. Rzeczywiście, badania mikrodializy mózgowej u gryzoni wykazały nadmierne zewnątrzkomórkowe uwalnianie glutaminianu w hipokampie w ciągu pierwszych 10 minut po urazie. Mikrodializa oferuje wyraźną zaletę ciągłego pobierania próbek neuroprzekaźników in vivo bez konieczności poświęcania zwierzęcia. Oprócz wyżej wymienionej techniki potrzebny jest zamknięty model urazu głowy, który wywiera gwałtowne przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia, ponieważ taki czynnik nie jest dostępny w wielu innych modelach zwierzęcych. Model spadku masy ciała w stanie Wayne'a naśladuje ten istotny składnik ludzkiego urazu czaszkowo-mózgowego, umożliwiając wywołanie uderzenia w głowę nieskrępowanego gryzonia spadającym ciężarem. Nasz nowatorski i translacyjny model szczura łączy mikrodializę mózgową z modelem spadku masy ciała stanu Wayne'a, aby badać, u lekko znieczulonych i nieskrępowanych dorosłych szczurów, ostre zmiany poziomów neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych po wstrząśnieniu mózgu. W tym protokole sonda do mikrodializy została umieszczona w hipokampie jako obszar zainteresowania i pozostała włożona do mózgu w momencie uderzenia. W hipokampie występuje duże zagęszczenie końcówek i receptorów, co czyni go odpowiednim regionem do dokumentowania zmienionej transmisji nerwowej po wstrząśnieniu mózgu. Po zastosowaniu do dorosłych szczurów Sprague-Dawley, nasz połączony model wywołał wzrost stężenia glutaminianu zewnątrzkomórkowego w hipokampie w ciągu pierwszych 10 minut, zgodnie z wcześniej opisanymi objawami po wstrząsie mózgu. Ten połączony model spadku masy ciała stanowi wiarygodne narzędzie dla naukowców do badania wczesnych reakcji terapeutycznych na wstrząsy mózgu oprócz powtarzających się uszkodzeń mózgu, ponieważ protokół ten wywołuje łagodny uraz zamkniętej głowy.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest dostarczenie badaczom niezawodnego narzędzia, które wiernie odtwarza biomechanikę ludzkiego urazu czaszkowo-mózgowego, umożliwiając jednocześnie długotrwałą charakterystykę molekularnych skutków wstrząsów mózgu/łagodnych urazów mózgu (mTBI). Metoda ta łączy mikrodializę mózgową z modelem spadku masy ciała stanu Wayne'a w celu udokumentowania, u lekko znieczulonych i nieskrępowanych dorosłych szczurów, ostrych zmian poziomów neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych po wstrząśnieniu mózgu. Dzięki tej minimalnie inwazyjnej metodzie, neuroprzekaźniki, takie jak glutaminian, GABA, tauryna, glicyna i seryna, mogą być szybko i w sposób ciągły oznaczane ilościowo po urazie, in vivo, bez konieczności poświęcania zwierzęcia.

Wstrząs mózgu/mTBI to patofizjologiczne zaburzenie, które wpływa na funkcjonowanie mózgu, spowodowane mechanizmem siły zewnętrznej. Wstrząśnienie mózgu/mTBI jest najczęstszą formą urazowego uszkodzenia mózgu, stanowiącą 70-90% przypadków¹. Większość ostrych zaburzeń funkcjonalnych po wstrząśnieniu mózgu można przypisać pierwotnemu i wtórnemu uszkodzeniu mózgu^2,3: (1) pierwotne uszkodzenie mózgu jest wywoływane przez gwałtowne przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia, które uszkadza tkanki mózgowe poprzez kompresję, a następnie rozciąganie i ścinanie aksonów podczas luzu^{4, 5,6} i (2) wtórne uszkodzenie mózgu jest pośrednią reakcją komórkową na uraz. Ma miejsce kilka godzin i dni po pierwotnym uszkodzeniu mózgu i odgrywa ważną rolę w obserwowanym z czasem upośledzeniu motorycznym i poznawczym. Wiele objawów można przypisać zmienionemu przekaźnictwu nerwowemu, takim jak wcześniej wykazane nadmierne uwalnianie glutaminianu zewnątrzkomórkowego w ciągu pierwszych 10 minut po urazie^7,8,9. Ze względu na duże zagęszczenie zakończeń i receptorów, hipokamp jest strukturą mózgu szczególnie podatną na tę ekscytotoksyczną reakcję po urazie. Będąc mocno zaangażowanym w funkcje poznawcze^10,11, badania na gryzoniach wykazały, że uszkodzenie hipokampa związane ze wstrząsem mózgu może prowadzić do upośledzenia w warunkowaniu strachu i uczeniu się pamięci przestrzennej^12,13. Głównym celem tej metodologii było opracowanie szczurzego modelu wstrząśnienia mózgu/mTBI, przy użyciu procedury obniżania masy ciała w stanie Wayne w celu wiernego odtworzenia mechanizmów pierwotnego uszkodzenia mózgu oraz włączenie mikrodializy mózgowej do badania in vivo, ostrych zmian neuroprzekaźnika zewnątrzkomórkowego spowodowanych wtórnym uszkodzeniem mózgu po wstrząśnieniu mózgu. Stężenia zewnątrzkomórkowego glutaminianu i GABA zostały zmierzone w hipokampie, aby działały jako reprezentatywne wyniki naszej metody.

Poprzednie badania na gryzoniach łączyły mikrodializę z innymi modelami urazów, takimi jak spadek masy ciała przy otwartej czaszce i kontrolowane uderzenie w korę mózgową, aby wykazać ostre zmiany w poziomach neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych po urazie o różnym stopniu ciężkości^14,15,16,17. Jednak oprócz wysokiego stopnia zmienności, wartość translacyjna modeli, takich jak spadek masy ciała przy otwartej czaszce i kontrolowane uderzenie w korę mózgową, jest utrudniona przez nieodłączny brak ważności ekologicznej z powodu 2 czynników: (1) modele te wywołują urazy znacznie poważniejsze niż wstrząsy mózgu związane ze sportem u ludzi, związane z bezpośrednim obciążeniem mózgu oraz (2) modele te wymagają kraniektomii lub kraniotomii. Głowa gryzonia jest całkowicie unieruchomiona w stereotaktycznym kadrze, co utrudnia gwałtowne przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia, a tym samym słabo odtwarza biomechanikę wstrząsu mózgu.

Mikrodializa to minimalnie inwazyjna metoda, która oferuje wyraźną zaletę pobierania próbek neuroprzekaźników, takich jak glutaminian, GABA, tauryna, glicyna i seryna, in vivo i ciągle po traumie, bez konieczności poświęcania zwierzęcia. Oprócz zalet oferowanych przez mikrodializę, Uniwersytet Stanowy Wayne opracował model spadku masy ciała z zamkniętą czaszką (w przeciwieństwie do otwartej czaszki z innych modeli), który umożliwia indukcję mTBI u lekko znieczulonego i nieskrępowanego gryzonia, umożliwiając w ten sposób szybkie przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia¹⁸. Jak wspomniano wcześniej, przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia jest podstawową cechą biomechaniczną wstrząsów mózgu związanych ze sportem obserwowanych u ludzi, której poprzednie modele mTBI gryzoni nie rozwiązały. Zabieg odchudzania można wykonać bardzo szybko i nie wymaga żadnej wcześniejszej operacji ani nacięcia skóry głowy. Po wywołaniu wstrząsu gryzonie odzyskują odruch prostowania niemal spontanicznie i nie doświadczają paraliżu, drgawek ani niewydolności oddechowej po pojedynczym uderzeniu. Krwawienia wewnątrzczaszkowe i złamania czaszki są rzadkie, a u gryzoni zgłaszano tylko niewielkie deficyty w koordynacji ruchowej. Ten model szczura jest łatwy w użyciu, niedrogi i ułatwia ilościowe określenie neuroprzekaźników uwalnianych w ostrej fazie po wstrząśnieniu mózgu bez konieczności wyjmowania sondy do mikrodializy podczas uderzenia.

Nasz szczurzy model łączący mikrodializę i wstrząs mózgu jest odpowiedni dla badaczy chcących scharakteryzować podłużnie molekularne skutki wstrząsu mózgu i może być wykorzystany w szerokiej gamie badań terapeutycznych. Rzeczywiście, pomimo kilku lat badań i ogromnej potrzeby, żaden lek zapobiegający długotrwałym skutkom wstrząsów mózgu nie przeszedł fazy badań klinicznych¹⁹. Jedną z potencjalnych przyczyn tych niepowodzeń może być wykorzystanie modeli zwierzęcych, które nie odtwarzają wiernie traumatycznych sił biomechanicznych wstrząsów mózgu, jakich doświadczają ludzie. Przedstawiona tutaj metoda spełnia definicję wstrząśnienia mózgu u człowieka, która określa, że pierwotne uszkodzenie mózgu jest wywołane uderzeniem, a także gwałtownym przyspieszaniem i zwalnianiem głowy i tułowia^2,3.

Ponadto, nasz połączony model jest odpowiedni dla badaczy badających skutki powtarzającego się łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (rmTBI), ponieważ jedną z jego kluczowych cech, która odróżnia go od innych zwierzęcych modeli wstrząsu mózgu, jest to, że umożliwia wywoływanie powtarzających się, łagodnych urazów w tym samym przypadku¹⁸. U ludzi rmTBI wiąże się z poważniejszymi objawami pourazowymi, dłuższym czasem rekonwalescencji oraz nasilonymi zaburzeniami motorycznymi i poznawczymi, które mają tendencję do rozprzestrzeniania się w czasie^20,21. Inne istotne modele zwierzęce umożliwiły również lepsze zrozumienie patofizjologii pourazowej rmTBI^{22,23,24,25,26,27}. Wykazano zwiększoną wrażliwość mózgu u gryzoni po podaniu minimum 5 mTBI w odstępach 24 godzin. Zapalenie nerwów nasila się wraz z liczbą doświadczanych mTBI i pojawiają się markery neurodegeneracji²⁸. Powtarzające się mTBI zapobiegłoby przejściu mikrogleju z trybu prozapalnego do normalnego trybu regeneracji, co spowodowałoby przedłużoną aktywność ekscytotoksyczną i aktywację mechanizmów neurodegeneracyjnych ²⁹. Dzięki naszemu modelowi szczury mogą być narażone na 1 uderzenie dziennie przez okres 1 tygodnia, co daje w sumie 5 ekspozycji. Biorąc pod uwagę prostotę tego modelu zwierzęcego, może to ułatwić scharakteryzowanie skumulowanych skutków ostrego, masowego uwalniania neuroprzekaźnika powstającego natychmiast po mTBI.

Ten model pozwala również zwierzętom na łatwe narażenie na 2 uderzenia dziennie, co umożliwia badanie jeszcze cięższych warunków, takich jak sytuacja, gdy sportowiec otrzymuje kolejny traumatyczny cios w krótkim czasie od pierwszego uderzenia³⁰. Jak wykazano w poprzednim badaniu³¹, czas drugiego uderzenia w głowę może dramatycznie wpłynąć na uszkodzenie naczyń krwionośnych i aksonów. Im bardziej drugi cios jest bliższy pierwszemu, tym bardziej szkodliwe są konsekwencje. Ten model jest odpowiedni do zbadania, w jaki sposób ten konkretny stan wpływa na uwalnianie neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych.

W tej metodzie, hipokamp był używany jako obszar zainteresowania ze względu na jego znaczenie w badaniach nad wstrząsem mózgu, ale próbki mikrodializy mogą być również pobierane z innych interesujących regionów. Jednak każdy inny obszar mózgu musi być brany pod uwagę ze względu na przestrzeń pozostawioną przez miejsce uderzenia z kaniuli prowadzącej, w tym otaczający ją cement dentystyczny, może zajmować znaczną ilość miejsca na głowie szczura. Ponadto parametry mikrodializy przedstawione w tej metodzie, takie jak odcięcie masy cząsteczkowej membrany i długość aktywna, odstępy czasu pobierania próbek i natężenie przepływu, można dostosować w zależności od rodzaju badanej cząsteczki. Na przykład skuteczne gromadzenie cytokin prozapalnych zaangażowanych w wstrząsy mózgu wymagałoby błony o znacznie większym rozmiarze porów.

Protokół

Protokół dla zwierząt dla tego projektu uzyskał zgodę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Hopital du Sacre-Cœur de Montréal, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

UWAGA: Schematyczny zarys protokołu badawczego jest przedstawiony w Rysunek 1.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Zamów szczury Sprague-Dawley od standardowego dostawcy zwierząt laboratoryjnych z dostawą w wieku od 43 do 50 dni i o wadze od 151 do 200 g.
2. Trzymanie wszystkich szczurów osobno w cyklu 12:12 h światło: ciemność, w temperaturze 24-26 °C z dostępem ad libitum do wody i pożywienia.
3. W ciągu 2 tygodni przed rozpoczęciem protokołu należy obchodzić się ze szczurami przez 5 minut dziennie, aby ułatwić im przyzwyczajenie się do kontaktu z badaczami. Szczury powinny być w wieku około 10 tygodni, a ich waga powinna wynosić od 295 do 351 g w momencie wstrząśnienia mózgu lub indukcji pozorowanego urazu.

2. Przewodnik po mikrodializach Chirurgia implantacji kaniuli

1. Operację należy wykonać w sterylnych warunkach. Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić sterylne rękawiczki, czepek do włosów i maskę chirurgiczną. Wcześniej należy przeprowadzić autoklaw i wysterylizować wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne. Dokładnie oczyścić i zdezynfekować obszar roboczy i aparat stereotaktyczny roztworem etanolu (70%).
2. Znieczulić zwierzęta, wstrzykując dootrzewnowo koktajl ketaminy (70 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Ocenia głębokość znieczulenia, testując odruch na uszczypnięcie palca u nogi.
3. Usuń sierść z głowy zwierzęcia za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia. Ogoloną głowę oczyścić roztworem 2% alkoholu izopropylowego i 2% glukonianu chlorheksydyny (3 razy). Podczas znieczulenia nałóż smarującą maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
4. Zasłonić pole operacyjne tak, aby odsłonięta była tylko głowa zwierzęcia. Umieść głowę szczura w aparacie stereotaktycznym, włóż paski uszne do kanałów słuchowych z dużą ostrożnością, a następnie dokręć zacisk nosowy. Przymocuj kaniulę prowadzącą ze stali nierdzewnej 26 G do ramienia uchwytu w aparacie stereotaktycznym.
5. Miejscowo wstrzyknąć podskórnie w głowę koktajl znieczulający z bupiwakainy (1,5 mg/kg) i lidokainy (1,5 mg/kg) na 10 minut przed nacięciem.
6. Utrzymuj znieczulenie podczas całego zabiegu, podając izofluran sodu (2,5%) przy przepływie tlenu 0,5 l/min za pomocą stożka nosowego.
7. Wykonaj nacięcie w linii środkowej (3 cm) wzdłuż skóry głowy za pomocą skalpela. Pozostaw czaszkę czystą, instalując 4 zaciski wokół nacięcia.
8. Mocno zeskrob okostną z czaszki ostrzem chirurgicznym, aż szwy Bregma i Lambda będą widoczne. Utrzymuj mocny nacisk na czaszkę za pomocą gazika lub aplikatora z bawełnianą końcówką, jeśli występuje krwawienie.
9. Potwierdź, czy czaszka jest prawidłowo ustawiona na aparacie stereotaktycznym, porównując współrzędne grzbietowo-brzuszne szwów Bregma i Lambda. Zidentyfikuj współrzędne przednio-tylne, przyśrodkowo-boczne i grzbietowo-brzuszne szwu Bregma jako punkty odniesienia dla współrzędnych kaniuli prowadzącej.
10. Biorąc współrzędne szwu Bregma jako odniesienie, oblicz współrzędne miejsca implantacji kaniuli prowadzącej w hipokampie.
    nuta: Następujące współrzędne zostały określone zgodnie z atlasem mózgu szczura od Paxinosa i Watsona (przednio-tylny: -0,60 cm; przyśrodkowo-boczny: ±0,58 cm; grzbietowo-brzuszny: -0,16 cm, Ryc. 2A)³².
11. Zaznacz dokładne miejsce implantacji za pomocą markera.
12. Wywierć otwór o średnicy 0,5 mm w czaszce w miejscu docelowym kaniuli prowadzącej. Wywierć 3 inne otwory około 5 mm wokół tego punktu, aby wkręcić 3 kotwiące w czaszkę, które zestalą kaniulę po nałożeniu akrylowego cementu dentystycznego.
13. Włóż kaniulę do hipokampa i przymocuj ją cementem dentystycznym. Kaniula ta zostanie użyta do wprowadzenia sondy do obszaru zainteresowania 7 dni później podczas procedury mikrodializy. Uważaj, aby nie rozlać nadmiaru cementu dentystycznego wokół miejsca, w którym zostanie upuszczony ciężar.
14. Pozostaw cement do wyschnięcia na 2 minuty, a następnie zdejmij ramię uchwytu z kaniuli. Włóż wyjmowany zasłonator ze stali nierdzewnej do kaniuli, aby uniknąć przesiąkania płynu mózgowo-rdzeniowego i ryzyka infekcji.
15. Zdejmij 4 zaciski, odciągnij cofniętą skórę i zszyj ją nicią chirurgiczną do szwów 4-0.
16. Wyjąć szczura z aparatury i wstrzyknąć buprenorfinę podskórnie w celu leczenia bólu (0,05 mg/kg, po zabiegu chirurgicznym, a następnie raz dziennie przez następne 2 dni). Umieść gryzonia z powrotem w klatce z poduszką grzewczą pod nim, aż odzyska przytomność, a następnie zwróć go do placówki opieki nad zwierzętami na 7-dniowy okres rekonwalescencji pod ścisłym nadzorem.

3. Procedura mikrodializy

1. Podczas wykonywania zabiegu mikrodializy należy nosić sterylne rękawiczki, czepek do włosów oraz maskę chirurgiczną. Siedem dni po operacji wszczepienia kaniuli należy znieczulić szczura izofluranem sodu (2,5%) przy przepływie tlenu 0,5 l/min.
2. Wyjąć obturator z kaniuli i powoli wprowadzić sondę do mikrodializy, perfuzję ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF) (26 mmol/L NaHCO₃, 3 mmol/L NaH₂PO₄, 1,3 mmol/L MgCl₂, 2,3 mmol/L CaCl₂, 3,0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L kwas L-askorbinowy), przez kaniulę do hipokampa lub innego obszaru zainteresowania.
   nuta: Szczury muszą być znieczulone tylko podczas zdejmowania zasłony i wkładania sondy do mikrodializy oraz podczas indukcji wstrząsu mózgu lub pozorowanego urazu. Zastosowane tutaj sondy są skonstruowane laboratoryjnie, w kształcie litery I i składają się ze stopionych obok siebie przewodów wlotowo-wylotowych krzemionki [średnica wewnętrzna (ID): 50 μm] zamkniętych w rurkach polietylenowych (ID: 0,58-0,38 mm). Koniec kaniuli zabezpieczony jest odcinkiem zregenerowanej membrany z pustej w środku celulozy [granica masy cząsteczkowej: 13 kDa, średnica zewnętrzna (OD): 216 μm; ID: 200 μm] przy użyciu kleju cyjanoakrylowego i końcówki uszczelnionej żywicą epoksydową. Aktywna membrana mierzy 2,5 mm w celu implantacji w hipokampie, ale można ją dostosować w zależności od głębokości obszaru zainteresowania. Połączenie zamieszkania kaniuli szczura z sondą jest zabezpieczone dopasowanym, gwintowanym kołnierzem ze stali nierdzewnej.
3. Przymocuj zespół sondy do sprężyny ze stali nierdzewnej przymocowanej do ramienia dźwigni obrotowej i przeciwwagi cieczowej zawieszonej nad klatką ze stojakiem pierścieniowym i zaciskami, aby zwierzę mogło swobodnie poruszać się w klatce. Szczury na uwięzi spędzają cały czas trwania procedury mikrodializy z dostępem ad libitum do wody i pożywienia.
4. Za pomocą pompy do mikroinfuzji należy wysłać perfuzat do sond i pobrać dialilat z przewodu wylotowego stopionej krzemionki (objętość martwa: 0,79 μl).
5. Co najmniej 1 godzinę i 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu należy podkręcić sondę do roboczego natężenia przepływu (1 μl/min). Sprawdź, czy natężenie przepływu sondy jest stałe, mierząc objętość w czasie za pomocą pipety.
   nuta: Szybkość przepływu może być mniej więcej zależna od pobranych neuroprzekaźników i obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Próbki do dializy pobiera się przed, w trakcie i po indukcji wstrząsu mózgu lub pozorowanego urazu. Interwał pobierania próbek zależy od obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, analizowanych neuroprzekaźników, stężeń dializatu analitu i czułości zastosowanego sprzętu chemii analitycznej. Fazy zbierania wykonane w hipokampie w celu pobrania próbek glutaminianu i GABA są następujące:
   1. Linia bazowa: Na początku eksperymentu należy pobrać próbki do dializy w odstępach 10-minutowych przez 60 min.
   2. Uraz po wstrząśnieniu mózgu lub pozorowany: Po wstrząśnieniu mózgu lub pozorowanym urazie pobieraj próbki przez dodatkowe 90 minut (9 próbek).
6. Pobrać każdą próbkę dializatu do fiolki z frakcją wstępnie załadowaną 1 μl kwasu nadchlorowego o stężeniu 0,25 mol/l, aby zapobiec degradacji analitu. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy.
7. Po pobraniu ostatniej próbki dializatu należy ponownie znieczulić szczura stożkiem nosowym dostarczającym izofluran sodu (2,5%) przy przepływie tlenu 0,5 l/min.
8. Wyjmij sondę do mikrodializy z kaniuli, ponownie włóż obturator, a następnie zwróć szczura do placówki opieki nad zwierzętami.

4. Instalacja aparatu do wstrząsu

mózgu

1. Przed rozpoczęciem zabiegu należy wyrzeźbić ciężarek, który zostanie użyty do zadania wstrząsu mózgu (o średnicy 19 mm) z litego mosiądzu, aby uzyskać masę 450 g. Włóż metalową pętlę w górnej części mosiężnego ciężarka. Wywiercić otwory wstępnie w odległości 1,0 m wewnątrz pionowej rury prowadzącej z polichlorku winylu (PVC).
2. Rozetnij blachę aluminiową ostrą żyletką. Szczelinowa blacha aluminiowa powinna utrzymać ciężar szczura (od 295 do 351 g), nie zakłócając przyspieszenia jego ciała po uderzeniu głową o mosiężny ciężarek.
3. Przyklej szczelnie szczelinową blachę aluminiową do ramy z pleksiglasu w kształcie litery U (38 cm długości x 27 cm szerokości x 30 cm głębokości, rysunek 3A,B), która zawiera piankową poduszkę (37 cm długości x 26 cm szerokości x 12 cm głębokości).
4. Umieść ramę z pleksiglasu pod rurą prowadzącą z PVC (średnica 20 mm x długość 1.5 m).
5. Przytrzymaj rurkę prowadzącą z PVC na miejscu za pomocą clamp stojak 3.5 cm nad szczelinowym aluminium.
6. Przymocuj nylonową żyłkę muchową (pojemność 9,1 kg, średnica 0,46 mm) przez metalową pętlę tak, aby spód ciężarka zwisał 2,5 cm nad aluminiową szczeliną, aby zapobiec wielokrotnym uderzeniom, gdy szczur upada na piankową poduszkę po uderzeniu.
7. Przymocuj nylonową żyłkę muchową do clamp stojak.
8. Podnieś ciężar przez rurkę PVC za pomocą nylonowej żyłki muchowej, a następnie przytrzymaj go na miejscu, wkładając klucz imbusowy przez wstępnie wywiercone otwory na 1,0 m.

5. Indukcja wstrząsu

mózgu

1. Po podstawowej fazie pobierania próbek dializy należy lekko ponownie znieczulić szczura, umieszczając stożek nosowy dostarczający izofluran sodu (2,5% izofluranu przy przepływie tlenu 0,5 l/min) tak długo, aż do momentu, gdy nie będzie on reagował na uszczypnięcie palca u nogi (jak wspomniano w sekcji 3.1).
2. Umieść zwierzę na klatce piersiowej na szczelinowej blasze aluminiowej tak, aby jego głowa znajdowała się bezpośrednio na ścieżce mosiężnego ciężarka (Rysunek 3C,D). Utrzymuj znieczulenie stożkiem nosowym, aby upewnić się, że szczur nie porusza się ani nie budzi, zanim uderzy w niego ciężar.
3. Zdejmij stożek nosowy i pociągnij klucz imbusowy. Ciężar spadnie pionowo przez rurkę PVC i uderzy w głowę szczura. Szczur przejdzie gwałtowny obrót o 180° i wyląduje na grzbiecie (Rysunek 3E).
4. Wyjmij szczura z piankowej poduszki i połóż go na plecach w klatce.
5. Użyj zegara cyfrowego, aby zmierzyć czas odruchu prostującego jako znak powrotu do zdrowia i ciężkości urazu. Czas odruchu prostowania to całkowity czas od uderzenia do momentu, gdy gryzonie obudzą się i spontanicznie wyprostują się do pozycji leżącej z pozycji leżącej lub zaczną chodzić. Zwróć uwagę na wszelkie oznaki śmierci, złamania lub krwawienia.
   nuta: Procedurę można powtórzyć na tym samym temacie w różnych punktach czasowych w przypadku powtarzających się wstrząsów mózgu.

6. Fałszywa indukcja

1. Po podstawowej fazie pobierania próbek dializy należy lekko znieczulić szczura, umieszczając stożek nosowy dostarczający izofluran sodu (2,5%) przy przepływie tlenu 0,5 l/min, aż do momentu, gdy nie będzie on reagował na uszczypnięcie palca u nogi (jak wspomniano w sekcji 3.1).
2. Umieść zwierzę na klatce piersiowej na szczelinowej blasze aluminiowej tak, aby jego głowa leżała bezpośrednio na ścieżce mosiężnego ciężarka. Utrzymuj znieczulenie stożkiem nosowym, aby upewnić się, że szczur się nie porusza ani nie budzi
.
3. Zdejmij stożek nosowy i usuń zwierzę z blachy aluminiowej bez ciągnięcia klucza imbusowego. Szczur nie przejdzie gwałtownego obrotu o 180°.
4. Umieść szczura na plecach w klatce.
5. Użyj cyfrowego timera, aby zmierzyć czas prawowania jako wskaźnik odbudowy neurologicznej.

7. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

1. Określić poziomy neuroprzekaźników (tj. glutaminianu i GABA) przez derywatyzację przedkolumnową przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z szybką detekcją fluorescencji rozdzielającej oraz systemu składającego się z autosamplera do szybkiej separacji i pompy sprzężonej z kolumną analityczną o wymiarach 3,0 x 50 mm i grubości 5 μm.
2. Przygotować fazę ruchomą ze 100 mmol/l dwuzasadowego fosforanu sodu (Na₂HPO₄), 3,5% acetonitrylu i 20% metanolu. W razie potrzeby dostosuj pH do 6,7 za pomocą kwasu fosforowego (85%).
3. Ustaw natężenie przepływu na 0,5 ml/min.
4. Przygotować świeże codzienne odczynniki do derywatyzacji i wzorce robocze (100 ng / ml) z roztworów podstawowych. Załadować je do chłodzonego (10 °C) automatycznego podajnika próbek do szybkiej separacji z próbkami.
5. Wymieszać kolejno każdą frakcję w kolumnie analitycznej z 20 μl kwasu 3-merkaptopropionowego (0,071 mol/l) rozcieńczonego_H2Oi 20 μl o-ftaldehydu (0,0143 mol/l) rozcieńczonego 0,1 mol/l tetraboranu sodu. Odczekaj 10 minut, aż mieszanina zareaguje.
6. Aby zapobiec zanieczyszczeniu kolejnych próbek, po każdym wstrzyknięciu należy przepłukać pętlę wtrysku metanolem (20%).
   nuta: W tym protokole czas retencji glutaminianu wynosiłby w przybliżeniu 1 minutę, co daje całkowity czas pracy wynoszący 30 minut dla każdej próbki.
7. Podczas analizy pików chromatograficznych należy zidentyfikować nieznane piki za pomocą próbek dopasowanych zgodnie z czasem retencji ze znanych wzorców. Wyraż poziomy analitów w μg/ml.

8. Histologia

1. Miesiąc po zabiegu mikrodializy i indukcji wstrząsu mózgu lub pozorowanego urazu, znieczulić zwierzęta, wstrzykując dootrzewnowo koktajl ketaminy (70 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) i poddać je eutanazji za pomocą paraformaldehydu (4%) i perfuzji dosercowej z soli fizjologicznej.
2. Odetnij głowy gryzoniom, a następnie przeprowadź sekcję mózgów.
3. Przechowuj mózgi w paraformaldehydzie (4%), a następnie krioprotektoruj je w roztworze sacharozy (30%).
4. Pokrój mózgi na odcinki koronalne o wielkości 50 μm za pomocą kriostatu.
5. Wybarwić wycinki mózgu fioletem krezylowym w celu histologicznej weryfikacji urazu i umieszczenia sondy (barwienie Nissl).

Wyniki

Korzystając z naszego modelu wstrząsu mózgu, który łączy siłę i rotację z mikrodializą mózgową in vivo, zbadano ostre zewnątrzkomórkowe zmiany glutaminianu i GABA w czasie po wstrząśnieniu mózgu lub pozorowanym urazie u 21 samców, dorosłych, szczurów rasy Sprague-Dawley poprzez wszczepienie kaniuli prowadzącej w obszarze CA1 hipokampa.

Weryfikacja histologiczna umieszczenia sondy i uszkodzenia
Nie stwierdzono zmian morfologicznych, takich jak masywne krwotoki śródmózgowe lub stłuczenia po histologicznej weryfikacji uszkodzenia tkanki hipokampa na odcinkach barwionych fioletem krezylowym. Implantacja kaniuli prowadzącej i wprowadzenie sondy mikrodializy spowodowały drobne i podobne uszkodzenia między przypadkami pourazowymi i pozorowanymi. Co więcej, nieusunięcie sondy tuż przed pozorowanym urazem lub indukcją wstrząsu mózgu nie spowodowało żadnego zauważalnego uszkodzenia tkanki hipokampa, jak widać pod mikroskopem (Rysunek 2B, C, odpowiednio), przy czym membrana sondy pozostała nienaruszona później ( Rysunek 2D, E). Wstrząśnienie mózgu i pozorowane urazy mózgu przekrwione paraformaldehydem (4%) 1 miesiąc po procedurach mikrodializy są nie do odróżnienia po oględzinach (Rysunek 2F, G).

Czas refleksu prostowania
Zwierzęta z grupy poszkodowanej miały znacznie wydłużony czas prostowania średnio w porównaniu z przypadkami pozorowanymi (test t-Studenta, p = 0,042801) (Ryc. 4) i wydawały się oszołomione po odzyskaniu przytomności. Spośród 10 przypadków z grupy wstrząśnienia mózgu, jedno zwierzę wykazywało niewielkie oznaki krwawienia pod miejscem uderzenia po spadku wagi. Nie zaobserwowano żadnych innych objawów złamania czaszki lub krwawienia śródczaszkowego.

Mikrodializa mózgowa in vivo
Aby zapewnić reprezentatywne wyniki naszej metody, piętnaście próbek dializatu o objętości 10 μl wyekstrahowano z hipokampa, in vivo, w odstępach 10 minut i przy natężeniu przepływu 1 μl/min. Zewnątrzkomórkowe poziomy glutaminianu i GABA mierzono z 6 próbek w punkcie wyjściowym (60 min) oraz z 9 próbek po indukcji pozorowanego urazu lub wstrząsu mózgu (90 min).

Zewnątrzkomórkowe stężenia glutaminianu
Znaczny wzrost stężenia glutaminianu zewnątrzkomórkowego zaobserwowano w regionie CA1 hipokampa w ciągu pierwszych 10 minut po indukcji urazu w porównaniu z urazem pozorowanym (test U Manna-Whitneya, p = 0,009175) (Ryc. 5). Nie zaobserwowano żadnej innej różnicy w stężeniach glutaminianu między grupami w żadnym innym punkcie czasowym.

Zewnątrzkomórkowe stężenia GABA
Nie zaobserwowano istotnych zmian w stężeniach GABA w regionie CA1 hipokampa w ciągu pierwszych 10 minut po indukcji urazu w porównaniu z urazem pozorowanym (test U Manna-Whitneya, p = 0,943861) (Ryc. 6). Nie stwierdzono żadnej innej istotnej różnicy w stężeniach GABA w żadnym innym punkcie czasowym między przypadkami wstrząsu mózgu a przypadkami pozorowanych urazów.

Rysunek 1: Schematyczny zarys protokołu badawczego. Ta liczba została zmodyfikowana w stosunku do IO Masse 2018. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Weryfikacja histologiczna umieszczenia sondy i uszkodzenia. (A) Widok koronalny sondy do mikrodializy i miejsca umieszczenia kaniuli prowadzącej w hipokampie przy użyciu atlasu stereotaktycznego Paxinosa i Watsona. (B) Reprezentatywna mikrofotografia uszkodzenia tkanki hipokampa (fiolet krezylowy) wykonana za pomocą sondy do mikrodializy i kaniuli prowadzącej z pozorowanego urazu. (C) Reprezentatywna mikrofotografia uszkodzenia tkanki hipokampa (fiolet krezylowy) wykonana przez sondę do mikrodializy i kaniulę prowadzącą z przypadku wstrząsu mózgu. (D) Reprezentatywna mikrofotografia sondy do mikrodializy przed indukcją wstrząsu mózgu. (E) Reprezentatywna mikrofotografia sondy do mikrodializy po indukcji wstrząsu mózgu. Membrana jest nadal nienaruszona. (F-G). Reprezentatywna mikrofotografia pozorowanego (F) i wstrząsu mózgu (G) uszkodzonego po perfuzji z 4% paraformaldehydem po 1 miesiącu od pozorowanego urazu lub zabiegu wstrząsu mózgu. Po oględzinach okazuje się, że 2 mózgi są nie do odróżnienia. Ta liczba została zmodyfikowana w stosunku do IO Masse 2018. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Przedstawienie podstawowych elementów aparatu do wstrząsu mózgu i przyrządów do mikrodializy. (A) Fotografia całego zespołu składającego się z pionowej rurki prowadzącej z polichlorku winylu (PVC) dla spadającego ciężaru, umieszczonej powyżej stadium szczura, ramy z pleksiglasu, poduszki piankowej, sterowanej komputerowo pompy do mikroinfuzji, gazoszczelnych strzykawek, krętlików do cieczy i umieszczonych obok siebie przewodów wlotowo-wylotowych z topionej krzemionki. (B) Schematyczne przedstawienie ramy z pleksiglasu i poduszki piankowej ze wszystkimi istotnymi wymiarami. (C) Fotografia szczelinowego kawałka folii aluminiowej, który służy jako etap dla szczurów powyżej piankowej poduszki. (D) Fotografia przedstawiająca położenie szczura na scenie bezpośrednio przed uderzeniem w głowę przez spadający ciężar. (E) Fotografia przedstawiająca szczura po uderzeniu głową, ilustrująca obrót ciała szczura w poziomie o 180° po uderzeniu głową i wynikające z tego przyspieszenie i obrót. Ta liczba została zmodyfikowana w stosunku do IO Masse 2018. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Czas prostowania. Histogram przedstawiający czas potrzebny szczurom na obudzenie się ze znieczulenia i przewrócenie się z pozycji leżącej na plecach do pozycji leżącej lub rozpoczęcie chodzenia po wstrząśnieniu mózgu (czerwone romby, n = 10) lub pozorowanym urazie (niebieskie kwadraty, n = 11). Szczury z grupy wstrząśnienia mózgu potrzebowały znacznie więcej czasu, aby się wyprostować w porównaniu z grupą z pozorowanymi urazami. Wartości średnie są reprezentowane na każdym wykresie jako linia pozioma. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Ta liczba została zmodyfikowana w stosunku do IO Masse 2018. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Zewnątrzkomórkowe stężenia glutaminianu. Średnie zewnątrzkomórkowe stężenia glutaminianu (μg/ml) mierzone metodą mikrodializy w hipokampie podczas linii wyjściowej (60 min) i po wstrząśnieniu mózgu (czerwone diamenty, n = 10) lub pozorowanym urazie (niebieskie kwadraty, n = 11) (90 min). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Ta liczba została zmodyfikowana w stosunku do IO Masse 2018. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Zewnątrzkomórkowe stężenia GABA. Średnie zewnątrzkomórkowe stężenia GABA (μg/ml) mierzone metodą mikrodializy w hipokampie podczas badania wyjściowego (60 min) i po wstrząśnieniu mózgu (czerwone diamenty, n = 10) lub pozorowanym urazie (niebieskie kwadraty, n = 11) (90 min). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Ta liczba została zmodyfikowana w stosunku do IO Masse 2018. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole
W celu uzyskania wiarygodnych wyników szczególną uwagę należy zwrócić na krytyczne etapy tego protokołu. Podczas zabiegu implantacji kaniuli należy unikać używania większej ilości cementu niż to konieczne, zwłaszcza gdy jest on bardzo płynny, aby zapobiec rozlaniu się na miejsce uderzenia. Aby uniknąć zablokowania miejsca implantacji, należy użyć obturatora o tej samej długości co kaniula. Podczas procedury mikrodializy należy powoli wkładać sondę do kaniuli i upewnić się, że jest ona całkowicie włożona w celu pobrania próbki dializatu. Przed indukcją wstrząsu mózgu upewnij się, że blacha aluminiowa jest prawidłowo nacięta ostrą żyletką. W przeciwnym razie uderzenie mosiężnego ciężarka nie będzie wystarczające, aby rozerwać aluminiową blachę, a szczur pozostanie klatką piersiową w dół, zamiast poddać się obrotowi o 180° i wylądować na plecach. W takim przypadku obrażenia wywołane będą wynikiem uderzenia, podobnie jak w modelach spadku masy ciała z otwartą czaszką i będą znacznie poważniejsze. Podczas indukcji wstrząsu mózgu należy unikać uderzania ciężarkiem w kaniulę, ponieważ spowodowałoby to krytyczne uszkodzenie czaszki szczura. Zdecydowanie zaleca się pracę w zespołach składających się z 2 osób, aby ograniczyć błędy manipulacyjne podczas eksperymentu.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Podczas procedury mikrodializy przepływ powinien być stały i dawać objętość odpowiednią do szybkości perfuzji, po połączeniu sondy z pompą. Mniejsze objętości mogą wskazywać na obecność zatkania membrany sondy lub pęcherzyków powietrza w przewodach. W przypadku zatkania sondę należy wyrzucić i wymienić. Jednak pęcherzyki powietrza mogą być wyrzucane przez cyrkulację ACSF w przewodach. Jeśli nie ma zatkania ani pęcherzyków powietrza i nadal nie ma przepływu, można przeciąć niewielką część rury odpływowej znajdującą się najbliżej końca.

Ograniczenia metody
Inne badania z wykorzystaniem spadku masy ciała Wayne State University oceniły niektóre fundamentalne zmiany strukturalne i molekularne18. Jednak bardziej szczegółowe dochodzenie utrzymałoby legalność tej procedury. Informacje dotyczące zmian biologicznych i neuroanatomicznych, które zachodzą na poziomie epigenetycznym i komórkowym, jeszcze bardziej umocniłyby wiarygodną i translacyjną wartość naszej metody. Co więcej, ocena funkcji poznawczych jest wiarygodną miarą wyników związanych z mTBI w modelach gryzoni³³. Chociaż czas do prawej strony został zmierzony w tym protokole i był znacznie opóźniony w przypadkach urazowych w porównaniu z przypadkami pozorowanymi, badania w przyszłości powinny koncentrować się na metodycznym pomiarze funkcji poznawczych po indukcji urazu u gryzoni.

Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod.
Główne znaczenie tej metody jest dwojakie: po pierwsze, pozwala ona na pomyślne wywołanie wstrząsu mózgu za pomocą procedury Wayne State University, która umożliwia szybkie przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia. Dzięki tej metodzie udało się uniknąć poważnych urazów, takich jak zatrzymanie krążenia i oddychania, złamanie czaszki, wysoka śmiertelność i oznaki widocznych stłuczenia mózgu w miejscu uderzenia. Po drugie, ta technika mikrodializy z powodzeniem powtórzyła wcześniej wykazane ostre i krótkotrwałe zewnątrzkomórkowe uwalnianie glutaminianu zachodzące w ciągu pierwszych 10 minut po indukcji urazu^14,16. Co więcej, utrzymywanie sondy włożonej przez cały czas trwania procedury znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo wywołania uszkodzenia wrażliwej na mTBI bariery krew-mózg w związku z wielokrotnym wprowadzaniem sondy do mikrodializy³⁴.

Przyszłe zastosowania lub kierunki metody.
Biorąc pod uwagę łatwe w użyciu aspekty procedury zmniejszania masy ciała na Uniwersytecie Stanowym Wayne oraz ostre zmiany poziomu neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych mierzone za pomocą mikrodializy, nasz model szczurzy łączący mikrodializę i wstrząs mózgu zapewnia naukowcom niezawodne narzędzie do wiernego odtworzenia biomechaniki ludzkiego urazu czaszkowo-mózgowego i podłużnego scharakteryzowania molekularnych skutków wstrząsów mózgu. Nasz model szczurzy może być również wykorzystany w wielu różnych badaniach terapeutycznych, ponieważ oferuje cenną możliwość badania mechanizmu i skuteczności środków farmakologicznych in vivo, w sposób ciągły i bez konieczności poświęcania zwierzęcia. Co więcej, dostępność modelu szczurzego, takiego jak ten przedstawiony tutaj, może znacznie ułatwić lepsze zrozumienie związku między nierównowagą neuroprzekaźników a behawioralnymi konsekwencjami wstrząsów mózgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Preparat dla zwierząt
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przewodnik po mikrodializie Implantacja kaniuli Chirurgia
Chlorowodorek ketaminy (100 mg/ml)
(100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Roztwór glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%	Carefusion	260100C
Chlorowodorek lidokainy	Alveda Pharma	0122AG01
Chlorowodorek bupiwakainy	Hospira	1559
Maść oftalmiczna	Baussh and Lomb inc.
Rama stereotaktyczna	Stoelting	51600
Stereotaktyczny uchwyt kaniuli Ramię	Aparat Harvard	72-4837
Wiertło	Dremel	8050-N/18
Nici szwowe powlekane Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dentystyczny cement akrylowy	Aparat Harvard	72-6906
	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Kaniula Gauge 20 10,55 mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Atrapa-kaniula 10,55 mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>Procedura mikrodializy
CMA 402 Aparat	Harvard Canada	CMA-8003110
Mikrostrzykawka 2,5 ml Szklany	aparat Harvard Canada	CMA-8309021
Klips do strzykawki średni do 1-2,5 ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Dwukanałowy krętlik wyłożony kwarcem o niskim momencie obrotowym	Instech Laboratories Inc.	375 / D / 22QM
Żeliwny stojak na pierścień nośny GSC	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Zaciski o regulowanym kącie	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
MgCl2 Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
NaCl Chlorek sodu	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
KCl Chlorek potasu	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
NaH2PO4 Monobasic Fosforan sodu	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
CaCl2 Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Zapalniczka	kanadyjska opona		do sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
Klej epoksydowy	Kanadyjska opona		Do sond skonstruowanych laboratoryjnie / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
Super Glue Gel	Kanadyjska opona		do sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
Rurka termokurczliwa 0,063 "Średnica wewnętrzna Gardner Bender	Kanadyjska opona		do sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów z narzędziami
Koła do cięcia Dremel #409	Opona		kanadyjskaDo sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
BD Needle 26 Gauge 0,5 cala PrecisionGlide Sterylne 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Do sond laboratoryjnych
Igła BD 21 Gauge 1,5 cala PrecisionGlide sterylna 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Do sond laboratoryjnych
26G Rurka ze stali nierdzewnej One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	Do sond laboratoryjnych
Rurki polietylenowe PE / 20 .024 "OD X .015" ID	HRS	Scientific C315CT	Do sond laboratoryjnych
Rurki polietylenowe PE / 10 .024 "OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Do sond laboratoryjnych
Rurka polietylenowa PE / 50 .038 "OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	Do sond laboratoryjnych
30S WIRE ST. ST 0,008X 1' Long	HRS Scientific	008BSH / 30S	do sond laboratoryjnych
Polymicro Technologies Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Średnica wewnętrzna 50 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	Do sond laboratoryjnych
Spectra Por 132294 Membrany z mikrodializy z pustych włókien 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	Do sond laboratoryjnych
Kołnierz ze stali nierdzewnej	Sirnay In.c	304	Do sond laboratoryjnych / Custome made
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Aparat wstrząsowy
Brass Weight	Rapido Mé tal Inc.		Przymocuj metalową pętlę do podstawy
Metal Loop	Rona Inc.		Dostępne w większości sklepów z narzędziami
, rura prowadząca PVC	Rona Inc.		Dostępne w większości sklepów z narzędziami
Folia aluminiowa	Alcan		Dostępne w większości sklepów spożywczych
Taśma			Dostępna w handlu
GSC Żeliwny pierścień nośny Stojak	Fisher Scientifique	S13748
Rama z pleksiglasu w kształcie litery U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.		Wykonana na zamówienie
piankowa poduszka piankowa	Mousse D& R Pianka Inc.		Żyletki wykonane na zamówienie
	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 funtów Berkley	Canadian Tire		Dostępne w większości sklepów z narzędziami
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop			Dostępny w większości sklepów z artykułami sportowymi
Preparat dla zwierząt
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przewodnik po mikrodializie Chirurgia implantacji kaniuli
Chlorowodorek ketaminy (100 mg/ml)
(100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Roztwór glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%	Carefusion	260100C
Chlorowodorek lidokainy	Alveda Pharma	0122AG01
Bupiwakaina Chlorowodorek	Hospira	1559
Maść oftalmiczna	Baussh and Lomb inc.
Rama stereotaktyczna	Stoelting	51600
Stereotaktyczny uchwyt kaniuli Ramię	Aparat Harvard	72-4837
Wiertło	Dremel	8050-N/18
Nici szwowe powlekane Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dentystyczny cement akrylowy	Aparat Harvard	72-6906
	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Kaniula Gauge 20 10,55 mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Atrapa-kaniula 10,55 mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>Procedura mikrodializy
CMA 402 Aparat	Harvard Canada	CMA-8003110
Mikrostrzykawka 2,5 ml Szklany	aparat Harvard Canada	CMA-8309021
Klips do strzykawki średni do 1-2,5 ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Dwukanałowy krętlik wyłożony kwarcem o niskim momencie obrotowym	Instech Laboratories Inc.	375 / D / 22QM
Żeliwny stojak na pierścień nośny GSC	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Zaciski o regulowanym kącie	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
MgCl2 Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
NaCl Chlorek sodu	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
KCl Chlorek potasu	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
NaH2PO4 Monobasic Fosforan sodu	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	Do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
CaCl2 Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Zapalniczka	kanadyjska opona		do sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
Klej epoksydowy	Kanadyjska opona		Do sond skonstruowanych laboratoryjnie / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
Super Glue Gel	Kanadyjska opona		do sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
Rurka termokurczliwa 0,063 "Średnica wewnętrzna Gardner Bender	Kanadyjska opona		do sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów z narzędziami
Koła do cięcia Dremel #409	Opona		kanadyjskaDo sond laboratoryjnych / Dostępne w większości sklepów ze sprzętem
BD Needle 26 Gauge 0,5 cala PrecisionGlide Sterylne 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Do sond laboratoryjnych
Igła BD 21 Gauge 1,5 cala PrecisionGlide sterylna 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Do sond laboratoryjnych
26G Rurka ze stali nierdzewnej One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	Do sond laboratoryjnych
Rurki polietylenowe PE / 20 .024 "OD X .015" ID	HRS	Scientific C315CT	Do sond laboratoryjnych
Rurki polietylenowe PE / 10 .024 "OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Do sond laboratoryjnych
Rurka polietylenowa PE / 50 .038 "OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	Do sond laboratoryjnych
30S WIRE ST. ST 0,008X 1' Long	HRS Scientific	008BSH / 30S	do sond laboratoryjnych
Polymicro Technologies Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Średnica wewnętrzna 50 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	Do sond laboratoryjnych
Spectra Por 132294 Membrany z mikrodializy z pustych włókien 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	Do sond laboratoryjnych
Kołnierz ze stali nierdzewnej	Sirnay In.c	304	Do sond laboratoryjnych / Custome made
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Aparat wstrząsowy
Brass Weight	Rapido Mé tal Inc.		Przymocuj metalową pętlę do podstawy
Metal Loop	Rona Inc.		Dostępne w większości sklepów z narzędziami
, rura prowadząca PVC	Rona Inc.		Dostępne w większości sklepów z narzędziami
Folia aluminiowa	Alcan		Dostępne w większości sklepów spożywczych
Taśma			Dostępna w handlu
GSC Żeliwny pierścień nośny Stojak	Fisher Scientifique	S13748
Rama z pleksiglasu w kształcie litery U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.		Wykonana na zamówienie
piankowa poduszka piankowa	Mousse D& R Pianka Inc.		Żyletki wykonane na zamówienie
	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Dostępne w większości sklepów z narzędziami
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop			Dostępne w większości sklepów z artykułami sportowymi