Artykuł metodologiczny

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59593

⸱

5 września 2019

 , 
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Streszczenie

Prezentujemy podejście cytometryczne do analizy mitochondrialnych ROS w różnych populacjach komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z żywego szpiku kostnego (BM) od zdrowych myszy, jak również myszy z AML napędzanym przez MLL-AF9. W szczególności opisujemy dwuetapowy proces barwienia komórek, w którym zdrowe lub białaczkowe komórki BM są najpierw barwione barwnikiem fluorogennym, który wykrywa nadtlenki mitochondrialne, a następnie barwione przeciwciałami monoklonalnymi związanymi z fluorochromem, które są używane do rozróżniania różnych zdrowych i złośliwych populacji progenitorów układu krwiotwórczego. Zapewniamy również strategię pozyskiwania i analizy próbek za pomocą cytometrii przepływowej. Cały protokół może zostać zrealizowany w czasie zaledwie 3-4 godzin. Podkreślamy również kluczowe zmienne, które należy wziąć pod uwagę, a także zalety i ograniczenia monitorowania produkcji ROS w przedziale mitochondrialnym żywych subpopulacji macierzystych i progenitorowych hematopoetycznych i białaczkowych przy użyciu barwników fluorogennych za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto przedstawiamy dane, że liczebność mitochondrialnych ROS różni się między odrębnymi zdrowymi subpopulacjami HSPC i prekursorami białaczki oraz omawiamy możliwe zastosowania tej techniki w badaniach hematologicznych.

Wprowadzenie

Reaktywne formy tlenu (ROS) są wysoce reaktywnymi cząsteczkami pochodzącymi z tlenu cząsteczkowego. Najbardziej dobrze zdefiniowaną lokalizacją komórkową produkcji ROS są mitochondria, w których elektrony przechodzące przez łańcuch transportu elektronów (ETC) podczas fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) są absorbowane przez tlen cząsteczkowy, co prowadzi do powstania określonego typu ROS zwanego ponadtlenkami1. Poprzez działanie szeregu enzymów, zwanych dysmutazami ponadtlenkowymi lub SOOD, ponadtlenki są przekształcane w nadtlenki wodoru, które są następnie neutralizowane do wody przez enzymy, takie jak katalaza lub peroksydazy glutationowe (GPX). Zaburzenia w mechanizmach regulacyjnych RFS mogą prowadzić do nadmiernej produkcji ROS, często określanej jako stres oksydacyjny, który ma szkodliwe i potencjalnie śmiertelne konsekwencje komórkowe, takie jak uszkodzenie makrocząsteczek (tj. DNA, białka, lipidów). Co więcej, stres oksydacyjny jest związany z kilkoma patologiami, takimi jak cukrzyca, choroby zapalne, starzenie się i nowotwory2,3,4. Aby utrzymać homeostazę redoks i zapobiec stresowi oksydacyjnemu, komórki posiadają różne mechanizmy regulujące ROS5.

Fizjologiczne poziomy niektórych ROS są niezbędne do prawidłowej hematopoezy embrionalnej i dorosłej6. Jednak nadmiar ROS jest związany z uszkodzeniem DNA, różnicowaniem komórkowym i wyczerpaniem puli krwiotwórczej pnia i progenitorów. Istnieją również dowody na to, że zmiany w biologii redoks mogą różnić się między białaczką a zdrowymi komórkami. Na przykład poziomy ROS są zwykle wyższe w komórkach ostrej białaczki szpikowej (AML) w porównaniu z ich zdrowymi odpowiednikami, a inne badania sugerują, że komórki macierzyste białaczki utrzymują niski poziom ROS w stanie stacjonarnym dla przeżycia7,8. Co ważne, strategie terapeutycznego wykorzystania tych różnic redoks okazały się obiecujące w kilku przypadkach raka u ludzi9,10. Dlatego testy, które pozwalają na ocenę poziomów ROS w modelach mysich, mogą poprawić nasze zrozumienie, w jaki sposób te gatunki przyczyniają się do fizjologii komórkowej i patogenezy choroby, a także potencjalnie stanowić platformę do oceny skuteczności nowatorskich terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na redoks.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w tym protokole dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Fox Chase Cancer Center.

UWAGA: Przebieg pracy protokołu jest podzielony na 4 części, jak pokazano w Rysunek 1, a wymagane odczynniki są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja szpiku kostnego (BM)

UWAGA: Myszy z białaczką MLL-AF9 zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem11.

  1. Odzyskaj jednojądrzaste komórki szpiku kostnego, jak opisano wcześniej12,13,14,15, od myszy C57.Bl6 typu dzikiego (które wyrażają marker kongenny CD45.2), a także od myszy C57.Bl6-SJL (które wyrażają marker kongenny CD45.1), którym przeszczepiono komórki białaczkowe z ekspresją MLL-AF9 (CD45.2+).
    nuta: BM można odzyskać od myszy przez crushing12,13 lub przez spłukiwanie bones14,15. W przedstawionych tutaj eksperymentach BM został odzyskany zarówno od myszy zdrowych, jak i myszy chorych na białaczkę poprzez zaczerwienienie.

2. Mitochondrialne barwienie barwnikiem fluorogennym ROS

  1. Po odzyskaniu jednojądrzastych komórek szpiku kostnego od zdrowych i/lub myszy chorych na białaczkę, należy wybarwić podwielokrotność komórek błękitem trypanowym i policzyć za pomocą hemocytometru w celu określenia początkowej liczby całkowitych komórek BM.
  2. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w F-PBS (PBS uzupełniony 2% płodową surowicą bydlęcą i 1% koktajlem penicyliny/streptomycyny) do stężenia 2 x 106 komórek/ml.
  3. Porcjować 200 μl zawiesiny komórek na probówkę do 9 jednokolorowych probówek kontrolnych oznaczonych w następujący sposób:
    Bez barwienia, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (tylko dla zdrowych HSPC), CD45.2-APC (tylko dla komórek białaczkowych), CD34-FITC, mitochondrialny barwnik ROS i barwienie żywymi/martwymi komórkami.
    UWAGA: (Opcjonalnie) Pozytywną kontrolę indukcji mitochondrialnych ROS można przygotować, traktując 2 x 105 komórek w 200 μl 20 μM wodorosiarczynu sodu menadionu (MSB) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Drugą kontrolę w celu odwrócenia indukcji mitochondrialnych ROS za pośrednictwem MSB można przygotować, traktując 2 x 105 komórek w 200 μl 20 μM MSB plus 100 μM N-acetylo-L-cysteiny (NAC) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  4. Pozostałe komórki podzielić na porcje w probówce (probówce doświadczalnej) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
  5. Ponownie zawiesić ogniwa w F-PBS z barwieniem żywych/martwych komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Pamiętaj, aby dodać żywą/martwą plamę do jednokolorowej probówki kontrolnej.
  6. Dodaj 1,0 ml f-pbs o temperaturze pokojowej (RT) F-PBS zarówno do probówek jednokolorowych, jak i eksperymentalnych barwionych żywym/martwym barwnikiem. Wirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
  7. Zawiesić 50 μg mitochondrialnego barwnika ROS w 13 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), aby otrzymać 5 mM roztwór podstawowy.
  8. Rozcieńczyć mitochondrialny barwnik ROS do końcowego stężenia 5 μM w RT F-PBS z lub bez Werapamilu (50 μM).
  9. Odessać popłuczkę z plamy z żywych/martwych komórek. Dodaj 200 μl mitochondrialnego barwnika barwnikowego ROS zawierającego Werapamil do każdej probówki eksperymentalnej, a także jednokolorowej probówki kontrolnej mitochondrialnego barwnika ROS.
  10. Wirować do mieszania i inkubacji przez 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  11. Dodaj 1,0 ml RT F-PBS do jednokolorowych probówek kontrolnych i eksperymentalnych barwionych mitochondrialnymi ROS. Wirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
  12. Odessać supernatant i przemyć komórki dodatkowym 1,0 ml RT F-PBS. Wirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.

3. Barwienie przeciwciał rodowych

  1. Przygotować koktajle przeciwciał wymienione w tabeli 1.
    nuta: Te koktajle przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane14,15,16.
  2. Odessać supernatant z końcowego mitochondrialnego płukania barwnikiem ROS z eksperymentalnych probówek zawierających zdrowy BM i dodać 200 μl koktajlu przeciwciał #1 do każdej probówki. Wirować do mieszania. Przygotuj również jednokolorowe probówki kontrolne. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.
  3. Odessać supernatant z końcowego mitochondrialnego płukania barwnikiem ROS z eksperymentalnych probówek zawierających białaczkę BM i dodać 200 μl koktajlu przeciwciał #2 do każdej probówki. Wirować do mieszania. Inkubować przez 60 minut na lodzie w ciemności.
  4. Przemyć 1,0 ml zimnego F-PBS i odwirować 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl zimnego F-PBS i przefiltrować komórki w probówce cytometru przepływowego za pomocą filtra 40 μm w celu wykluczenia agregatów.

4. Akwizycja i analiza cytometrii przepływowej

UWAGA: Kilka podzbiorów krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych jest rzadkich, takich jak długoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste. W związku z tym idealnie byłoby, gdyby podczas akwizycji cytometrii przepływowej zebrano 3-5 milionów zdarzeń dla każdej probówki eksperymentalnej, aby uzyskać wystarczającą analizę mitochondrialnych ROS w różnych podzbiorach HSPC.

  1. Użyj rurki kontrolnej bez plam, aby ustawić wykresy punktowe do przodu (FSC-A) i z boku (SSC-A) w oparciu o rozmiar i złożoność analizowanej populacji komórek.
  2. Użyj bezplamnych i jednokolorowych probówek kontrolnych, aby skompensować cytometr przepływowy.
  3. Odsuń obce szczątki od przedniego i bocznego wykresu punktowego (Rysunek 2A,B, pierwszy panel od lewej).
  4. Bramki wyjściowe dublety za pomocą podwójnego dyskryminatora, takiego jak dyskryminator do przodu (Rysunek 2A,B, drugi panel od lewej).
  5. Postępuj zgodnie ze strategią bramkowania zaproponowaną na rysunku 2A, B, aby wybrać żywe komórki, niskie komórki linii i różne podzbiory HSPC i białaczki.
  6. Dla każdej populacji będącej przedmiotem zainteresowania przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji (MFI) kanału TRPE (oś x) na wykresie histogramu, aby ocenić różnice w mitochondrialnym sygnale ROS (Rysunek 3A-C, lewe panele). Poziomy mitochondrialnych ROS można ocenić na poziomie pojedynczej komórki, porównując barwienie mitochondrialnych ROS z określonymi markerami linii na wykresie punktowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono metodę analizy ROS w mitochondriach wielu zdrowych populacji prekursorów białaczki oraz populacji wykazujących ekspresję MLL-AF9. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przebieg procedury, która składa się z 4 głównych etapów: 1) izolacja szpiku kostnego z myszy; 2) barwienie komórek szpiku kostnego barwnikiem fluorogenicznym rozpoznającym mitochondrialne ROS, w szczególności ponadtlenki; 3) barwienie przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym w celu wyodrębnienia różnych zd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Barwniki fluorogenne, które zostały opracowane do wykrywania ROS, są często oceniane w utrwalonych komórkach za pomocą mikroskopii lub w żywych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej22. Ocena cytometryczna mitochondrialnego ROS w komórkach BM przy użyciu mitochondrialnych barwników fluorogenicznych ROS ma dwie główne zalety: 1) jest to szybka i prosta technika, która nadaje się do analizy żywych komórek oraz 2) pozwala na rozróżnianie i analizowanie rzadkich populacji na poziomie pojedynczej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Radę Dyrektorów Fox Chase Cancer Center (DDM), American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) oraz Departament Obrony (Award#: W81XWH-18-1-0472).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inaktywowany termicznie FBSVWR Seradigm LIFE SCIENCE97068-085Nośnik
Penicylina StreptomycynaCorning30-002-CIPodłoże
PBSFisher ScientificBP399-20Bufor
15 ml Probówka stożkowaBD falcon352096Materiały do hodowli tkankowych
50 ml Rurka stożkowaBD falcon352098Tissue Materiały do hodowli
40 μ m Sitka komórkoweFisher Scientific22-363-547Materiały do hodowli tkankowych
Bufor do lizy RBCFisher Scientific50-112-9751Materiały do hodowli tkankowych
Wodorosiarczyn sodu menadionuSigma aldrichM5750Pro-oksydant
NACSigma aldrichA7250Przeciwutleniacz
CD3 PE-Cy5 klon 145-2c11Biolegend100310przeciwciało
Klon CD4 PE-Cy5 RM4-5eBioscience15-0041-81Przeciwciało
CD8 PE-Cy5 klon 53-6.7eBioscience15-0081-81Przeciwciało
CD19 PE-Cy5 6D5PrzeciwciałoBiolegend115510
B220 PE-Cy5 klon RA3-6B2Biolegend103210Przeciwciało
Gr1 PE-Cy5 klon RB6-8C5Przeciwciało Biolegend108410
Klon Ter119 PE-Cy5 Ter-119Biolegend116210Przeciwciało
CD48 PE-Cy5 klon HM48-1Biolegend103420Przeciwciało
CD117  Klon APC-Cy7 2B8Przeciwciało Biolegend105825
Sca1 peacific Niebieski klon D7Biolegend108120Przeciwciało
CD150 Klon APC TC15-12F12.2Biolegend115909Przeciwciało
CD34 FITC Przeciwciało RAM34BD Bioscience553733
CD45.2 Klon APC 104Przeciwciało Biolegend1098313
MitoSOX CzerwonyThermoFisher ScientificM36008Barwnik
Mitotracker ZielonyThermoFisher ScientificM7514Barwnik
żywy/martwy Żółty barwnikThermoFisher ScientificL34967Barwnik

Bibliografia

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776(2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondrialne ROScytometria przep ywowahematopoetyczne kom rki macierzystekom rki bia aczkoweszpik kostnybarwienie kom rekkoktajle przeciwciaanaliza ywych kom rekbarwniki fluorescencyjne

Powiązane artykuły