Artykuł metodologiczny

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

DOI:

10.3791/59606

⸱

11 maja 2019

 ,  ,  ,  , 
1Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry, School of Agriculture, Yangtze University, 2CSIRO Agriculture

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak załadować CFDA do różnych miejsc w dolnych częściach Arabidopsis. Następnie przedstawiamy wynikowy wzór rozmieszczenia mukowiscydozy w pędach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Symplastic tracer 5(6)-dioctan karboksyfluoresceiny (CFDA) jest szeroko stosowany w żywych roślinach, aby zademonstrować połączenie międzykomórkowe, transport łyka i wzór naczyniowy. Protokół ten pokazuje ruch karboksyfluoresceiny (CF) od dołu do góry u Arabidopsis przy użyciu odpowiednio procedury cięcia korzeni i szczypania hipokotylu. Te dwie różne procedury skutkują różną skutecznością ruchu mukowiscydozy: około 91% pojawienia się mukowiscydozy w pędach w przypadku procedury szczypania hipokotylu, podczas gdy tylko około 70% pojawienia się mukowiscydozy w przypadku procedury przycinania korzeni. Prosta zmiana miejsc ładowania, skutkująca znaczącymi zmianami w mobilności tego barwnika symplastycznego, sugeruje, że ruch mukowiscydozy może podlegać regulacji symplastycznej, najprawdopodobniej przez połączenie korzeń-hipokotyl.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele znaczników fluorescencyjnych o różnych właściwościach spektralnych, takich jak 5(6)-karboksyfluoresceina (CF)1, kwas 8-hydroksypyreno-1,3,6-trisulfonowy2, Lucyfer żółty CH (LYCH)3, eskulina i CTER4, zostały opracowane i zastosowane w roślinach do monitorowania ruchu symplastycznego i aktywności łyka. Ogólnie rzecz biorąc, barwnik symplastyczny jest ładowany do nacięcia w tkance docelowej, a sekwencyjne rozproszenie reportera na inne części rośliny wykaże komunikację międzykomórkową. Chociaż mechanizm wchłaniania barwnika nie jest w pełni poznany, zasada leżąca u podstaw ruchu mukowiscydozy w żywych komórkach została powszechnie uznana. Forma estrowa CF (CF dioctane, CFDA) jest niefluorescencyjna, ale przepuszczalna przez błonę. Ta właściwość umożliwia szybką dyfuzję barwnika przez błonę do komórek. Po dostaniu się do żywych komórek esterazy wewnątrzkomórkowe usuwają grupy octanowe w pozycji 3' i 6' CFDA, uwalniając fluorescencyjny i nieprzepuszczalny dla błony CF (Rysunek 1, alternatywnie patrz Wright i wsp.2); CF może następnie przemieszczać się przez plazmodesmaty do innych części roślin.

Dobrze znaną procedurą z CFDA jest to, że może być ładowany do liści źródłowych i używany do monitorowania strumienia łyka i rozładunku łyka w tkankach zlewu wielu gatunków, np. jako rozładunek łyka w korzeniu Arabidopsis 5, rozładunek łyka podczas tuberyzacji ziemniaka6, rozładunek łyka w liściach zlewu Nicotiana class7i tak dalej. Stosując podobne podejścia do ładowania, inne badania przyjęły ten barwnik, aby zademonstrować symplastyczne połączenie między gospodarzem a pasożytem8,9, lub aby ujawnić symbiotyczne relacje10,11.

Innym sposobem na wykorzystanie tego barwnika jest załadowanie go do określonych komórek lub pojedynczej komórki za pomocą mikroiniekcji, aby określić jego wzór dystrybucji. Tak wyrafinowane techniki znacznie ułatwiły nam głębsze zrozumienie komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem plazmodesmatów, szczególnie w rozwoju koncepcji domeny symplastycznej12,13. Na przykład mikrowstrzyknięcie CFDA do komórek liścienia Arabidopsis spowodowało powstanie wzorca sprzężenia barwnika w naskórku hipokotylowym, ale braku sprzężenia w komórkach leżących poniżej lub w naskórku korzenia, dlatego naskórek hipokotylowy tworzy domenę symplastyczną14. Podobne domeny, takie jak komórki ochrony aparatów szparkowych15, komórki towarzyszące elementowi sitowemu16, komórki włosaka korzeniowego14 i root cap17,18 zostały zidentyfikowane za pomocą techniki mikroiniekcji. Najbardziej zaskakujące jest to, że niektóre domeny pozwalają cząsteczkom znacznikowym poruszać się w określonym kierunku. Weźmy na przykład domenę trichomów, mikroiniekcja sondy fluorescencyjnej do podtrzymującej komórki naskórka prowadzi do przepływu znacznika do domeny trichomów, jednak odwrotne wstrzyknięcie nie jest prawdziwe19. Niedawny raport wykazał również podobne sytuacje w domenach symplastycznych Sedum embryo20. Tak więc wszystkie powyższe przypadki sugerują, że zamiana miejsc ładowania może prowadzić do nowego wglądu w komunikację symplastyczną. Nasz poprzedni eksperyment mający na celu przeanalizowanie trasy mobilnego wyciszania od korzenia do pędu zidentyfikował nową domenę symplastyczną lub strefę HEJ (połączenie hipokotylowo-epikotylowe), która została następnie zweryfikowana w eksperymencie CFDA z obciążeniem korzeniowym (niekanonicznym obciążeniem zlewu21. W tym miejscu dalej rozwijamy ruch CF od korzenia do pędu za pomocą prostej metody i odzyskujemy potencjalną domenę symplastyczną poprzez przesunięcie miejsc ładowania. Co więcej, procedura ta może być dostosowana do różnicowania tła genetycznego, które ma zmieniony transport na duże odległości od korzenia do pędu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pionowy wzrost rzodkiewnika w pożywce dla SM

  1. Wnętrze komory z przepływem laminarnym należy przed użyciem poddać działaniu 30-minutowego światła UV i 15-minutowego przepływu powietrza. Pamiętaj, aby zamknąć szklane drzwi, gdy włączone jest światło UV. Spryskaj wszystkie narzędzia i talerze 70% etanolem przed umieszczeniem ich w szafce.
  2. Przygotować pożywkę Murashige i Skoog (MS) na standardowej szalce Petriego o średnicy 90 mm w komorze laminarnej.
    UWAGA: Pożywka MS zawiera następujące składniki: 20,6 mM NH4NO3, 18,8 mM KNO3, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgSO4·7H2O, 3 mM CaCl2·2H2O, 0,1 mM MnSO4·H2O, 1,03 μM Na2MoO4·2H2O, 0,1 mM H3BO3, 30 μM ZnSO4·7H2O, 0,1 μM CuSO4·5H2O, 0,1 μM CoCl2·6H2O, 1,39 μM KI, 97 μM FeSO4·7H2O, 114,5 μM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 4,07 μM kwas nikotynowy, 2,44 μM chlorowodorek pirydoksyny, 0,15 μM chlorowodorek tiaminy, 2,68 mM glicyny, 555 μM mio-inozytol, 87,7 mM sacharozy i 10 g/L agaru.
  3. Nawilż wysterylizowane końcówki lub wykałaczki, dotykając końcówki lub wykałaczek pożywką MS, a następnie zanurz wysterylizowane nasiona jeden po drugim w ustalonej pozycji każdej szalki Petriego wskazanej w karcie wysiewu.
  4. Uszczelnij szalkę Petriego folią parafinową i taśmą klejącą i umieść ją pionowo na przezroczystym stojaku w pomieszczeniu do wzrostu (22 °C, 70% wilgotności) z cyklem dziennym 16 godzin światła i 8 godzin ciemności (oświetlenie od 6 rano do 22 wieczorem). Roślina Arabidopsis jest gotowa do załadunku CFDA w dniach 9-13 po siewie.
    UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana w godzinach popołudniowych od 14 do 17
    5. .

2. Ładowanie CFDA z procedurą wycinania korzeni

  1. Przygotować świeży roztwór roboczy CFDA bezpośrednio przed użyciem. Rozcieńczyć 1 mM roztwór podstawowy CFDA przechowywany w zamrażarce o temperaturze -20 °C sterylną wodą ultraczystą do stężenia roboczego 5 μM.
  2. Pokrój mikroporowatą folię membrany parafinowej (patrz tabela materiałów) na małe kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm.
  3. Odsłoń rosnące rośliny w pomieszczeniu w temperaturze 22 °C i usuń nadmiar wilgoci ręcznikiem papierowym. Umieść małe kawałki folii poniżej każdego korzenia.
    UWAGA: Od tego do kroku 2.6 cały proces powinien zostać zakończony w ciągu 15 minut.
  4. Podnieś rośliny na pokrywę szalki Petriego. Odetnij korzenie w pozycji około 5-10 mm poniżej połączenia korzeń-hipokotyl. Umieść część zdjęciową z powrotem na filmie na podłożu.
  5. Ostrożnie nałóż 0,25 μl CFDA na odcięty koniec każdego korzenia pod mikroskopem preparacyjnym. Unikaj rozpryskiwania się na inne części rośliny.
  6. Przykryj płytkę i pozostaw rośliny pod światłem na 2-3 godziny (22 °C) w pomieszczeniu do wzrostu.
  7. Wybarwione rośliny opłucz trzy razy sekwencyjnie w trzech oddzielnych zlewkach wypełnionych wodą destylowaną, a następnie obserwuj rośliny pod mikroskopem stereofluorescencyjnym z zoomem od 1,4x do 3,3x (patrz Tabela materiałów). Do detekcji fluorescencji należy użyć kostki filtrującej o wysokiej wydajności (wzbudzenie 470/20 nm, podział 495 nm i emisja 525/50 nm) zamontowanej do przesyłania sygnału fluorescencji.

3. Ładowanie CFDA z procedurą szczypania hipokotylu

  1. Przygotować świeży roztwór roboczy CFDA bezpośrednio przed użyciem. Rozcieńczyć 1 mM roztwór podstawowy CFDA przechowywany w zamrażarce o temperaturze -20 °C sterylną ultraczystą wodą (patrz tabela materiałów) do stężenia roboczego 5 μM.
  2. Pokrój mikroporowatą folię membrany parafinowej (patrz tabela materiałów) na małe kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm.
  3. Odsłoń rosnące rośliny w pomieszczeniu w temperaturze 22 °C i usuń nadmiar wilgoci ręcznikiem papierowym.
    UWAGA: Od tego do kroku 3.7 cały proces powinien zostać zakończony w ciągu 15 minut.
  4. Połóż mały kawałek folii pod połączeniem korzeń-hipokotyl każdej rośliny.
  5. Użyj kleszczy, aby delikatnie uszczypnąć hipokotyl w pobliżu połączenia korzeń-hipokotyl pod mikroskopem preparacyjnym
    6. .
  6. Ostrożnie nanieść 0,1 μl CFDA na miejsce rany pod mikroskopem preparacyjnym. Unikaj rozpryskiwania się na inne części rośliny.
  7. Przykryj talerz i pozostaw rośliny pod światłem (22 °C) na 2-3 godziny.
  8. Wybarwione rośliny opłucz trzy razy sekwencyjnie w trzech oddzielnych zlewkach wypełnionych wodą destylowaną, a następnie obserwuj rośliny pod mikroskopem stereofluorescencyjnym z zoomem od 1,4x do 3,3x (patrz Tabela materiałów). W celu detekcji fluorescencji zamontuj kostkę filtrującą o wysokiej wydajności (wzbudzenie 470/20 nm, podział 495 nm i emisja 525/50 nm) w celu przesyłania sygnału fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruch symplastyczny często podlega fluktuacjom środowiskowym. Zaburzenia stanu wzrostu rośliny, a nawet proces przygotowania tkanek wpłyną na limit wykluczenia wielkości plazmodesmatów, wpływając tym samym na transport symplastyczny22. Aby poprawić skuteczność barwienia, ograniczamy naszą operację do pomieszczenia wzrostowego, gdzie temperatura i wilgotność są ściśle kontrolowane, a także wykonujemy całą procedurę tak szybko, jak to możliwe (najlepiej w ciągu 10-15 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowe badania wykazały, że rośliny mogą szybko reagować na bodźce zewnętrzne23, w tym manipulacje wprowadzone do procedur eksperymentalnych22. W naszym początkowym eksperymencie nasze przeoczenie tej wiedzy często prowadzi do niepowodzenia barwienia. Dzięki tym lekcjom sugerujemy, że podczas wykonywania tego eksperymentu należy pamiętać o następujących środkach ostrożności: (1) nasiona po zbiorach powinny być przechowywane w szafce do przechowywania ustawionej na niską tempe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31671257) oraz Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry (LXT-16-18).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KNO3   Odczynnik chemiczny Sinopharm10017218
KH2PO4 Odczynnik chemiczny Sinopharm10017608
MgSO4· 7H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm10013018
CaCl2· 2H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm20011160
MnSO4· H2O Odczynnik chemiczny Sinopharm10013418
Na2MoO4· 2H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm10019818
Kwas borowyOdczynnik chemiczny Sinopharm10004818
ZnSO4· 7H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm10024018
CuSO4· 5H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm10008218
CoCl2· 6H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm10007216
KIOdczynnik chemiczny Sinopharm10017160
FeSO4· 7H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm10012118
EDTA Odczynnik chemiczny Sinopharm10009717
Odczynnikchemiczny NaOH Sinopharm10019718
Odczynnikchemiczny KOH Sinopharm10017018
SacharozaOdczynnik chemiczny Sinopharm10021418
Myo-inozytol   MACKLINI811835
Kwas nikotynowy MACKLINN814565
Pirydoksyna HClMACKLINV820447
Tiamina HClMACKLINT818865
GlicynaMACKLING800880
Agar w proszkuNovonZZ14022
Mikroskop fluorescencyjnyZeissAxio Zoom V16
SDPTOPSRE-1030
200μ l pipetaInstrumenty laboratoryjne Dragon713111110000-20-200ul
2,5 i mu; l pipetaEppendorf3120000011
Drobne kleszczyki PĘSETAST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Ostrze dwustronne ze stali nierdzewnejGillettePlatinum-Plus Ostrze
Dwustronne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis? Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

transport symplastycznytransport w floemieodci cie korzeniauszczypni cie podlistowiaro liny Arabidopsissonda fluorescencyjnatransport przez plazmodesmatybarwienie tkanek przewodz cych

Powiązane artykuły