Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59608

⸱

26 września 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Center for Molecular Signaling (PZMS), Saarland University, 2Institute for Clinical and Experimental Surgery, Saarland University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Streszczenie

Upośledzone gojenie się ran skórnych jest głównym problemem dla pacjentów cierpiących na cukrzycę i osób starszych, i istnieje potrzeba skutecznego leczenia. Odpowiednie podejścia in vitro i in vivo mają zasadnicze znaczenie dla identyfikacji nowych cząsteczek docelowych do leczenia farmakologicznego w celu poprawy procesu gojenia się ran skóry. Zidentyfikowaliśmy podjednostkę β3 kanałów wapniowych bramkowanych napięciem (Cavβ3) jako potencjalną cząsteczkę docelową wpływającą na gojenie się ran w dwóch niezależnych testach, tj. teście migracji zadrapań in vitro i modelu komory grzbietowego fałdu skórnego in vivo. Pierwotne mysie fibroblasty embrionalne (MEF) ostro wyizolowane od typu dzikiego (WT) i Cavβmyszy z niedoborem 3 (Cavβ3 KO) lub fibroblasty ostro wyizolowane od myszy WT traktowanych siRNA w celu obniżenia ekspresji genu Cacnb3, kodując Cavβ3, zostały użyte. Rysę nałożono na zlewającą się monowarstwę komórkową, a po zamknięciu luki wykonano obrazy mikroskopowe w określonych punktach czasowych, aż do całkowitego ponownego zasiedlenia luki przez migrujące komórki. Obrazy te poddano analizie, a szybkość migracji komórek określono dla każdego warunku. W teście in vivo wszczepiliśmy grzbietową komorę fałdu skórnego myszom WT i Cavβ3 KO, nałożyliśmy zdefiniowaną okrągłą ranę o średnicy 2 mm, przykryliśmy ranę szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby chronić ją przed infekcjami i wysuszeniem oraz monitorowaliśmy makroskopowe zamknięcie rany w czasie. Zamykanie ran było znacznie szybsze u myszy z niedoborem genu Cacnb3. Ponieważ wyniki testów in vivo i in vitro są ze sobą dobrze skorelowane, test in vitro może być przydatny do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przed walidacją trafień in vitro za pomocą modelu gojenia ran in vivo. To, co pokazaliśmy tutaj dla wild-type i Cavβmyszy lub komórki z niedoborem 3 mogą być również stosowane do określonych cząsteczek innych niż Cavβ3.

Wprowadzenie

Gojenie ran skóry rozpoczyna się natychmiast po urazie skóry, aby przywrócić integralność skóry i chronić organizm przed infekcjami. Proces gojenia się ran przebiega przez cztery nakładające się na siebie fazy; Koagulacja, stan zapalny, tworzenie nowych tkanek i przebudowa tkanek1. Migracja komórek ma kluczowe znaczenie w tych fazach. Komórki zapalne, komórki odpornościowe, keratynocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty są aktywowane w różnych punktach czasowych i atakują obszar rany2. Metody badania gojenia się ran in vitro i in vivo cieszą się dużym zainteresowaniem nie tylko w celu zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw choroby, ale także w celu przetestowania nowych leków i opracowania nowych strategii mających na celu poprawę i przyspieszenie gojenia się ran skóry.

Do monitorowania i analizowania migracji komórek można użyć testu migracji zarysowującej. Często określa się to mianem testu gojenia się ran in vitro. Ta metoda wymaga urządzenia do hodowli komórkowej3. Jest to prosta procedura, nie wymaga wysokiej klasy sprzętu, a test można wykonać w większości laboratoriów biologii komórki. W tym teście obszar wolny od komórek powstaje w wyniku mechanicznego rozerwania zlewającej się monowarstwy komórek, najlepiej komórek podobnych do nabłonka lub śródbłonka lub fibroblastów. Komórki na krawędzi rysy będą migrować w celu ponownego wypełnienia utworzonej luki. Kwantyfikacja zmniejszającego się obszaru wolnego od komórek w czasie przypomina szybkość migracji i wskazuje czas, którego komórki potrzebują, aby wypełnić lukę. W tym celu badacze mogą użyć albo ostro wyizolowanych komórek od myszy WT, albo myszy pozbawionych genu zainteresowania4, albo unieśmiertelnionych komórek dostępnych w wiarygodnych repozytoriach komórkowych. Test scratch pozwala na badanie wpływu związków farmakologicznie czynnych lub wpływu transfekowanych cDNA lub siRNA na migrację komórek.

In vivo, gojenie się ran jest złożonym procesem fizjologicznym, wymagającym różnych typów komórek, w tym keratynocytów, komórek zapalnych, fibroblastów, komórek odpornościowych i komórek śródbłonka, aby przywrócić fizyczną integralność skóry tak szybko, jak to możliwe1. W przeszłości opracowano i stosowano różne metody badania gojenia się ran in vivo5,6,7,8. Opisana w tym artykule grzbietowa komora fałdu skórnego była wcześniej używana do testów gojenia ran9. Jest stosowany jako zmodyfikowany preparat do komory grzbietowego fałdu skórnego dla myszy. Zmodyfikowany model komory fałdów skórnych ma kilka zalet. 1) Minimalizuje skurcze skóry, co uniemożliwia obserwację procesu gojenia się ran i może wpływać na gojenie się ran u myszy. 2) Komora ta wykorzystuje pokrycie rany szklanym szkiełkiem nakrywkowym, zmniejszając infekcje tkanek i wysuszenie, co może opóźnić proces gojenia. 3) Przepływ krwi i unaczynienie mogą być bezpośrednio monitorowane. 4) Umożliwia wielokrotne miejscowe stosowanie farmakologicznie aktywnych związków i odczynników w celu leczenia rany i przyspieszenia gojenia9,10.

Zidentyfikowaliśmy podjednostkę β3 kanałów wapniowych bramkowanych wysokim napięciem (Cavβ3) jako potencjalną cząsteczkę docelową do wpływania na gojenie się ran skóry za pomocą dwóch niezależnych protokołów, tj. testu migracji zadrapań in vitro i modelu komory grzbietowego fałdu skórnego in vivo. Do testu in vitro użyliśmy pierwotnych fibroblastów, komórki te wyrażają gen Cacnb3 kodujący białko Cavβ3, ale nie mają indukowanego depolaryzacją napływu Ca2 + lub zależnych od napięcia prądów Ca2 +. Opisaliśmy nową funkcję Cavβ3 w tych fibroblastach: Cavβ3 wiąże się z receptorem 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3R) i ogranicza uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego. Delecja genu Cacnb3 u myszy prowadzi do zwiększonej wrażliwości IP3R na IP3, zwiększonej migracji komórek i zwiększonej naprawy ran skóry4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z przepisami etycznymi oraz wytycznymi komisji ds. dobrostanu zwierząt Saarlandu i Uniwersytetu w Saarlu.

1 Pierwotna hodowla komórek i transfekcja siRNA

UWAGA: W opisanym protokole wykorzystano pierwotne fibroblasty. Komórki te odgrywają kluczową rolę w gojeniu ran i przebudowie tkanek11. W niniejszym eksperymencie obniżono poziom ekspresji genu Cacnb3, kodującego podjednostkę Cavβ3 wysokonapięciowych kanałów wapniowych12, wykazując tym samym jego rolę w migracji komórek in vitro oraz w naprawie ran skóry in vivo4.

  1. Przygotowanie siRNA: Przed rekonstytucją siRNA krótko odwiruj probówki, aby upewnić się, że zawartość znajduje się na dnie. Rekonstytuuj siRNA w 100 µL beznukleazowego buforu (100 mM octanu potasu, 30 mM HEPES, pH 7,5) dostarczonego przez producenta do stężenia 20 µM. Jest to roztwór zapasowy siRNA.
  2. Podziel ten roztwór zapasowy na aliquoty po 10 µL na probówkę (stężenie 20 µM) i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  3. Za pomocą cienkiego permanentnego markera zaznacz na płytce 6-dołkowej poziomą linię na dnie każdego dołka, aby móc zawsze zidentyfikować ten sam obszar zainteresowania z zadrapaniem i monitorować jego zamykanie.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano płytki hodowlane 6-dołkowe, ponieważ są one wystarczająco duże, aby zapewnić przestrzeń i elastyczność niezbędną do wykonania spójnego, powtarzalnego i pionowego zadrapania w monowarstwie komórek za pomocą końcówki pipety 200 µL. W przypadku ograniczonej liczby komórek alternatywnym i prawdopodobnie bardziej ekonomicznym sposobem byłoby użycie płytek hodowlanych 12- lub 24-dołkowych.
  4. Wysiej pierwotne fibroblasty wyizolowane od myszy typu dzikiego oraz myszy z deficytem β34 na płytkę 6-dołkową w gęstości 5 x 105 komórek/dołek w obecności 2 mL zmodyfikowanej pożywki Eagle'a z dodatkiem Dulbecco (DMEM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FCS).
    UWAGA: Gęstość 5 x 105 komórek na dołek została ustalona dla płytek hodowlanych 6-dołkowych i pierwotnych fibroblastów mysich. W przypadku stosowania płytek do hodowli komórek 12- lub 24-dołkowych lub innych typów komórek, które mogą różnić się wielkością, konieczne mogą być testy optymalizacyjne. Komórki należy hodować w sterylnym środowisku, takim jak komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
  5. Oznacz płytkę 6-dołkową, podając typ komórek, genotyp oraz datę.
  6. Przenieś płytkę 6-dołkową do inkubatora do hodowli komórek i utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h.
  7. Następnego dnia wyjmij płytkę z inkubatora, odessij pożywkę z dołków, usuń ją i zastąp 2,25 mL świeżej pożywki hodowlanej, dodając ją ostrożnie po ściance dołka.
  8. W celu transfekcji fibroblastów siRNA zastosuj odczynnik do transfekcji oparty na lipidach, zgodnie z zaleceniami producenta.
  9. Dla każdej transfekcji przygotuj dwie probówki do mikrocentryfugi. Do pierwszej dodaj 9 µL odczynnika do transfekcji i rozcieńcz go 150 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Do drugiej probówki dodaj 1,5 µL siRNA (siRNA-1 Cacnb3, siRNA-2 Cacnb3 lub scrambled siRNA jako kontrolę negatywną) i rozcieńcz go 150 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy.
  10. Dodaj rozcieńczone siRNA do probówki zawierającej rozcieńczony odczynnik do transfekcji i mieszaj w vorteksie przez 2 s. Inkubuj mieszaninę przez 5 min w temperaturze 21 °C.
  11. Oznacz dołki jako siRNA-1 Cacnb3, siRNA-2 Cacnb3 lub scrambled siRNA. Dodaj kroplami 250 µL mieszaniny siRNA z odczynnikiem do transfekcji do komórek.
  12. Włóż płytkę hodowlaną 6-dołkową z powrotem do inkubatora i utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 h.
  13. Aby sprawdzić wydajność wyciszania genu Cacnb3, zbierz transfektowane komórki i przeprowadź analizę immunoblottingową zgodnie z wcześniejszym opisem4.

2. Test gojenia ran in vitro (test migracji w „zadrapaniu”)

  1. Wyjmij płytkę z hodowlą komórek z inkubatora i obejrzyj komórki pod mikroskopem, używając obiektywu 10x. Rozpocznij testy zarysowania (scratch assay) dopiero wtedy, gdy komórki osiągną 100% konfluencji.
    UWAGA: Dla zapewnienia dokładności i powtarzalności, osiągnięcie 100% konfluencji jest warunkiem koniecznym do rozpoczęcia testu migracji po zarysowaniu. Dlatego ważne jest zasianie takiej samej liczby komórek do poszczególnych studni, sprawdzenie konfluencji w każdej studni oraz wykonanie zarysowania w tym samym punkcie czasowym (konfluencja w dniu 0). Dłuższe oczekiwanie po osiągnięciu przez komórki 100% konfluencji może wywołać odmienne reakcje.
  2. Gdy komórki osiągną 100% konfluencji, odessać pożywkę hodowlaną ze studni i ją usunąć.
  3. Za pomocą końcówki do pipety (200 µL) ręcznie wykonać zarysowanie prostopadle do linii poziomej zaznaczonej na dnie studni, przecinając konfluencyjną monowarstwę komórek w środkowej części studni.
  4. Każdą studnię przepłukać dwukrotnie 2 mL solą fizjologicznie buforowaną fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4), aby usunąć czynniki uwalniane z uszkodzonych komórek, komórki luźne oraz szczątki z obszaru zarysowania. Dodać 2 mL PBS ostrożnie po ściance studni, aby uniknąć odklejenia komórek od dna.
  5. Do każdej studni ostrożnie dodać 2 mL pożywki hodowlanej zawierającej 10% surowicy lub 1% surowicy.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie testu zarysowania zarówno przy 10% surowicy, jak i przy 1% surowicy, aby potwierdzić, czy obserwowany efekt jest wynikiem proliferacji i migracji komórek, czy wyłącznie ich migracji.
  6. Przenieść płytkę na stolik mikroskopu i wykonać zdjęcia w jasnym polu obszaru wolnego od komórek (dwa obszary na studnię) natychmiast po zarysowaniu (t=0h) przy powiększeniu 10x za pomocą mikroskopu świetlnego. Aby zawsze obrazować ten sam fragment zarysowania, należy wykorzystać linię poziomą przygotowaną w kroku (1.3) i wykonać jedno zdjęcie powyżej tej linii oraz jedno zdjęcie poniżej niej. Zapisać obrazy w formacie TIFF lub JPEG.
  7. Ponieważ stolik mikroskopu nie zapewnia warunków wzrostu komórek, przenieść płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  8. Po 6, 10 i 30 h ponownie przenieść płytkę na stolik mikroskopu i wykonać zdjęcia w sposób opisany w kroku 2.6.
    UWAGA: Te punkty czasowe zostały ustalone dla opisanej procedury i dla pierwotnych fibroblastów. Podczas pierwszego eksperymentu pilotażowego przetestowano więcej punktów czasowych, aby sprawdzić, jak szybko fibroblasty zasiedlają lukę. Chociaż 0, 6, 10 i 30 h są rozsądnymi punktami wyjściowymi, badacze powinni zoptymalizować i ustalić odpowiednie punkty czasowe dla każdego zastosowania i każdego typu komórek. Bardziej precyzyjną alternatywą, jeśli jest dostępna, byłoby zastosowanie mikroskopii poklatkowej (time-lapse microscopy).
  9. Za pomocą programu ImageJ13 określić wielkość początkowego obszaru wolnego od komórek (100%) oraz pozostałego obszaru po 6, 10 i 30 h (Rycina 1). Procent obszaru zarysowania zasiedlonego przez migrujące komórki oblicza się następnie w stosunku do początkowego obszaru zarysowania.

3. Analiza obszaru zadrapania

  1. Otwórz oprogramowanie ImageJ13.
  2. Wgraj pierwszy obraz w formacie JPEG (np. obrazy RGB 24-bitowe 1360x1024), przeciągając plik do paska menu ImageJ.
  3. Wybierz przycisk Freehand selections i zaznacz obszar wolny od komórek
  4. Kliknij Analyze, a następnie wybierz Measure. Pojawi się okno z wynikami zawierające wartość powierzchni.
  5. Przenieś tę wartość do arkusza analizy.
  6. Powtórz kroki 3.2-3.5 dla każdego obrazu z punktu czasowego 0 h, a następnie rozpocznij procedurę ponownie dla kolejnych punktów czasowych: 6, 10 i 30 h.
  7. Oblicz procent powierzchni zadrapania zasiedlonej przez migrujące komórki po 6, 10 i 30 h dla każdego zadrapania, korzystając z następującego równania:
    Równanie testu zadrapania do analizy migracji komórek; wzór przedstawiający procent zasiedlenia, schemat.
    a = obszar wolny od komórek w początkowym zadrapaniu, b = obszar wolny od komórek po 6 h
  8. Oblicz średnią oraz błąd standardowy średniej (S.E.M.) dla procentu powierzchni zadrapania zasiedlonej przez migrujące komórki po 6 h. Przedstaw dane w formie wykresu słupkowego lub wykresu punktowego.

4. Test gojenia ran skóry in vivo

UWAGA: W badaniu tym wykorzystano samce myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego (w wieku 8-12 tygodni, o masie ciała 22-26 g) oraz myszy z niedoborem Cavβ3 jako kontrolę.

  1. Na jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu wysterylizować w autoklawie wszystkie narzędzia chirurgiczne, śruby, nakrętki oraz tytanowe ramki, które zostaną użyte do przygotowania komory skórnej.
    UWAGA: Tytanowa ramka składa się z dwóch symetrycznych, komplementarnych połówek i posiada okrągłe okno obserwacyjne, przez które naniesiona zostanie rana, a następnie będzie ona monitorowana za pomocą mikroskopii (patrz Rysunek 2a).
  2. Zanurzyć w narkozie mysz typu dzikiego lub z niedoborem $\beta3$ (masa ciała 22–26 g) poprzez wstrzyknięcie do jamy brzusznej (i.p.) 0,1 ml soli fizjologicznej na 10 g masy ciała, zawierającej mieszaninę ketaminy (75 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (25 mg/kg masy ciała). Głębokość znieczulenia należy sprawdzić, oceniając brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy.
    UWAGA: Iniekcja ta zapewnia około 30 minut znieczulenia chirurgicznego, a głębokość znieczulenia musi być kontrolowana w trakcie zabiegu poprzez sprawdzanie odruchów myszy.
  3. Aby uniknąć przesuszenia lub uszkodzenia oczu, należy nałożyć maść oftalmiczną do obu oczu i w razie potrzeby powtórzyć aplikację.
  4. Starannie ogol grzbiet myszy, używając golarki elektrycznej, a następnie nałóż krem do depilacji na ogoloną powierzchnię, aby usunąć pozostałe włosy. Należy uważać, aby nie uszkodzić skóry myszy. Pozostaw krem do depilacji na około 10 min, aby całkowicie usunąć wszystkie włosy.
  5. Przygotuj komorę tytanową, pobierając jedną część symetrycznej ramy komory tytanowej i mocując śruby łączące nakrętkami po jednej stronie. Nakrętki te będą pełnić funkcję dystansera w celu utrzymania 400-500 µm między dwiema symetrycznymi częściami komory, aby uniknąć ucisku naczyń krwionośnych w skórze.
  6. Usuń krem z grzbietu myszy i oczyść obszar pozbawiony owłosienia ciepłą (35-37 °C) woda z kranu.
  7. Upewnij się, że miejsce przeprowadzania operacji jest czyste i ciepłe (37 °C) i nawilżone.
  8. Zdezynfekuj pozbawiony owłosienia obszar skóry myszy preparatem do dezynfekcji skóry. Chwyć fałd skóry grzbietowej myszy przed źródłem światła i ustaw linię środkową podwójnej warstwy skóry w miejscu, w którym zostanie zaimplantowana komora tytanowa. Następnie przymocuj fałd skóry szwem z polipropylenu w kierunku kranialnym i kaudalnym, a drugą stronę szwu zaciśnij na metalowym stelażu, aby unieść sfałdowaną skórę myszy. Dostosuj wysokość stelaża tak, aby mysz mogła znajdować się w komfortowej pozycji.
  9. Zaimplantuj tytanową komorę w fałd skóry grzbietowej myszy w taki sposób, aby warstwa złożonej skóry grzbietowej znalazła się pomiędzy dwiema symetrycznymi połowami tytanowej ramki. Przymocuj pierwszą połowę tytanowej ramki za pomocą szwów polipropylenowych na jej górnej krawędzi do grzbietowej strony fałdu skóry.
    UWAGA: Na ramie tytanowej, na górnej krawędzi, znajduje się 8 otworów (Rysunek 2a) a złożoną skórę należy dokładnie przymocować szwami polipropylenowymi w każdym z ośmiu otworów.
  10. Przed przejściem do następnego kroku należy sprawdzić odruchy myszy, aby upewnić się, że utrzymano odpowiednią głębokość znieczulenia.
  11. U podstawy fałdu skóry przeprowadź dwie śruby łączące, przymocowane do pierwszej połowy tytanowej komory, tak aby przeniknęły przez fałd skóry od strony tylnej do przedniej. Wykonaj na skórze niewielkie nacięcia (używając precyzyjnych nożyczek), aby ułatwić gładkie wprowadzenie śrub łączących.
  12. Odłącz mysz z klatki i ułóż ją w pozycji bocznej. Umieść drugą, komplementarną połowę tytanowej komory na trzech śrubach łączących (patrz Rysunek 2a) i lekko docisnąć palcami, aby przeprowadzić śruby przez drugą połowę tytanowej ramy. Następnie obie symetryczne części należy przymocować za pomocą nakrętek ze stali nierdzewnej.
  13. Należy zwrócić szczególną uwagę na stopień dokręcenia śrub na tym etapie, ponieważ zbyt luźne mocowanie może doprowadzić do odłączenia urządzenia. Z kolei zbyt silne dokręcenie spowoduje uciśnięcie fałdu skóry i ograniczenie przepływu krwi, co może prowadzić do uszkodzenia tkanek i martwicy.
    UWAGA: Nakrętki przygotowane w kroku 4.5 służą jako przekładki do zachowania odległości 400-500 µm pomiędzy dwiema symetrycznymi połowami komory tytanowej. Nakrętki należy dokręcać do momentu poczucia lekkiego oporu.
  14. Odetnij pozostałą część śrub za pomocą kombinerków.
    UWAGA: Na tym etapie konieczne jest stosowanie okularów ochronnych w celu zabezpieczenia oczu na wypadek niewłaściwego wykręcenia śruby.
  15. Zaznaczyć obszar rany za pomocą standaryzowanego trepanu do biopsji (o średnicy 2 mm), w centrum skóry w obrębie okna obserwacyjnego (patrz Rycina 2a) komory fałdu skórnego, aby zapewnić powtarzalność rozmiarów ran.
  16. Za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek należy wykonać koliste rany w zaznaczonym obszarze poprzez całkowite usunięcie skóry wraz z naskórkiem i skórą właściwą. Końcowy obszar rany powinien wynosić około 3,5–4,5 mm.2patrz Rycina 2b. Oczyścić ranę 0,5 ml sterylnej soli fizjologicznej (0,9% NaCl, 37 °C).
  17. Przykryć ranę szkiełkiem podstawowym, a następnie zamocować szkiełko za pomocą pierścienia zaciskowego, używając szczypiec do pierścieni zaciskowych w komorze tytanowej.
  18. Bezpośrednio po zakończeniu procedury chirurgicznej umieść mysz na stole obrazującym stereomikroskopu wyposażonego w kamerę i wykonaj zdjęcia (dzień 0) przy zastosowaniu oświetlenia. Użyj powiększenia 40X i zapisz obrazy do późniejszej analizy off-line.
    UWAGA: Badacz powinien sprawdzić obrazy natychmiast po ich zarejestrowaniu, aby upewnić się, że ich jakość jest wystarczająca do przyszłych analiz offline. Przygotowanie komory fałdu skórnego oraz wykonanie rany skórnej zajmuje około 30 minut.
  19. Podczas wybudzania z narkozy należy trzymać mysz w ciepłym miejscu przez co najmniej 2 h. Następnie myszy należy przenieść w oddzielnych klatkach z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt (12-godzinny cykl światła/ciemności), upewniając się, że zwierzęta mają dostęp do pokarmu i wody.
  20. Trzy dni po zranieniu umieść mysz w stabilizatorze i przymocuj stabilizator do stołu obrazującego.
  21. Umieść preparat na stoliku stereomikroskopu wyposażonego w kamerę. Wykonaj zdjęcia przy powiększeniu 40x, zarejestruj wszystkie obrazy i zapisz je do późniejszych analiz offline.
  22. Powtórz kroki 4.20 i 4.21 ponownie w 6., 10. i 14. dobie po zranieniu.
  23. Użyj obrazów rany do analizy offline w programie ImageJ13Powierzchnię rany w dniu 0 przyjmuje się za 100%, a stopień zamknięcia rany w czasie przedstawia się w odniesieniu do początkowej powierzchni rany. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 2c, d.
  24. Oblicz procentowy (%) obszar rany w każdym punkcie czasowym, korzystając z następującego równania:
    Wzór na gojenie ran: procent powierzchni rany, wyrażenie matematyczne, analiza badawcza.
    Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.punkt czasowy (dzień 0, 3, 10 lub 14), apowierzchnia rany w dniu 0, bpole powierzchni rany w danym punkcie czasowym Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test rany (scratch assay) przeprowadzono na konfluentnej monowarstwie komórek MEF typu dzikiego oraz MEF z niedoborem β3 (Rycina 1c). Po wykonaniu „zadrapania” za pomocą końcówki pipety 200 μL, komórki obu genotypów migrowały do obszaru zadrapania, zamykając lukę. Zdjęcia wykonano po 6, 10 i 30 h (Rycina 1a). Migrację komórek ilościowo określono jako procent (%) obszaru zadrapania zasiedlonego przez migrujące komórki 6 godzin po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym manuskrypcie opisujemy test gojenia się ran in vitro i in vivo i korelujemy uzyskane wyniki. Do testu in vitro użyliśmy pierwotnych mysich fibroblastów 4,14,15, które odgrywają ważną rolę w gojeniu się ran i przebudowie tkanek11. Można również stosować inne przylegające typy komórek rosnące jako monowarstwy (np. komórki nabłonkowe, komórki śródbłonka, keratynocyty). Posiewanie tej samej liczby żywot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Petrze Weissgerber i Jednostce Transgenów w ośrodku dla zwierząt SPF (projekt P2 SFB 894) na Wydziale Medycznym oraz zakładowi dla zwierząt w Instytucie Chirurgii Klinicznej i Doświadczalnej na Wydziale Medycznym Uniwersytetu Kraju Saary w Homburgu. Dziękujemy dr. Andreasowi Beckowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Badanie zostało sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projekt A3 do A.B. i V.F.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9 % NaCl
1 ml strzykawkiBD Plastipak303172
płytka 6-dołkowaCorning3516
Dziurkacz do biopsjiKai Industries482012 mm
Cacnb3 Mysie siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)OrigeneSR415626
Kremdowolna depilacja krem
Dekspantenol 5% (BEPANTHEN)Bayer3400935940179.00(BEPANTHEN)
Chlorowodorek dihydroksylidynotiazyny (ksylazyna)Bayer Health CareRompun 2%
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)Gibco firmy life technologies41966-029
Surowica bydlęcapłodu Gibco firmy life technologies10270-106
Sześciokątna pełna nakrętka
Chlorowodorek ketaminyZoetisKETASET
Mikroskop świetlnyKeyence, Osaka, JaponiaBZ-8000Można użyć podobnych mikroskopów Odczynnik
do transfekcji Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778075
Mikrokleszcze
Mikronożyczki
Ogranicznik myszyDomowe
normalne nożyczki
ObiektywNikonplan apo 10x/0.45
Opti-MEMGibco firmy life technologies51985-026
Nici
Śrubokręt
Skin środek dezynfekujący (octeniderm)Schü lke & Mayr GmbH118212
Śruba
Pierścień
Szczypce
osadczych Mikroskop chirurgiczny z kamerąLeicaLeica M651
Tytanowe ramki do komory fałdu skórnegoIROLA160001Halteblech M
Szczypce
do depilacji polipropylenowez walcowym z rowkiemosadczydo pierścieni druciane

Bibliografia

  1. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  2. Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
  3. Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
  4. Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
  5. Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
  6. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
  7. Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
  8. Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
  9. Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
  10. Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
  11. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
  12. Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  14. Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
  15. Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
  16. Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
  17. Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825(2018).
  18. Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583(2016).
  19. Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
  20. Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389(2013).
  21. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
  22. Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
  23. Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
  24. Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
  25. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265(2013).
  26. Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza gojenia ranszybkość migracji komórekpierwotne fibroblasty zarodkowe myszymyszy z niedoborem Cavbeta3transfekcja siRNAanaliza obrazów mikroskopowychtworzenie okrągłych ranobrazowanie stereomikroskopowe
Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.