Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Podsumowanie

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Streszczenie

Na etapie inicjacji translacji białek, rybosom wiąże się z regionem inicjacji mRNA. Inicjacja translacji może zostać zablokowana przez wiązanie białka wiążącego RNA (RBP) z regionem inicjacji mRNA, który zakłóca wiązanie rybosomów. W prezentowanej metodzie wykorzystujemy to zjawisko blokowania do ilościowego określenia powinowactwa wiązania RBP do ich pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania. Aby to zrobić, wprowadzamy miejsce wiązania testu w regionie inicjacji reporterowego mRNA i indukujemy ekspresję testowego RBP. W przypadku wiązania RBP-RNA zaobserwowaliśmy sigmoidalne tłumienie ekspresji reporterowej w funkcji stężenia RBP. W przypadku braku powinowactwa lub bardzo niskiego powinowactwa między miejscem wiązania a RBP nie zaobserwowano istotnej represji. Metoda jest przeprowadzana w żywych komórkach bakteryjnych i nie wymaga drogich ani wyrafinowanych maszyn. Jest to przydatne do ilościowego określania i porównywania powinowactwa wiązania różnych RBP, które funkcjonują w bakteriach, do zestawu zaprojektowanych miejsc wiązania. Ta metoda może być nieodpowiednia w przypadku miejsc wiązania o dużej złożoności strukturalnej. Wynika to z możliwości zahamowania inicjacji rybosomalnej przez złożoną strukturę mRNA przy braku RBP, co skutkowałoby niższą podstawową ekspresją genu reporterowego, a tym samym mniej obserwowalną represją reporterową przy wiązaniu RBP.

Wprowadzenie

Regulacja potranskrypcyjna oparta na białku wiążącym RNA (RBP), a konkretnie charakterystyka interakcji między RBP a RNA, była intensywnie badana w ostatnich dziesięcioleciach. Istnieje wiele przykładów translacyjnej regulacji w dół u bakterii pochodzących z RBP hamujących lub bezpośrednio konkurujących z wiązaniem rybosomów^1,2,3. W dziedzinie biologii syntetycznej interakcje RBP-RNA stają się znaczącym narzędziem do projektowania obwodów genetycznych opartych na transkrypcji^4,5. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na charakterystykę takich oddziaływań RBP-RNA w kontekście komórkowym.

Najczęstszymi metodami badania interakcji białko-RNA są test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA)⁶, który jest ograniczony do ustawień in vitro, oraz różne testy pull-down⁷, w tym metoda CLIP^8,9. Chociaż takie metody umożliwiają odkrycie miejsc wiązania RNA de novo, mają wady, takie jak pracochłonne protokoły i kosztowne reakcje głębokiego sekwencjonowania, a także mogą wymagać specyficznego przeciwciała do ściągania RBP. Ze względu na podatność RNA na środowisko, wiele czynników może wpływać na interakcje RBP-RNA, podkreślając znaczenie badania wiązania RBP-RNA w kontekście komórkowym. Na przykład, my i inni wykazaliśmy znaczące różnice między strukturami RNA in vivo i in vitro^10,11.

Na podstawie podejścia poprzedniego badania¹², niedawno wykazaliśmy^10, że podczas umieszczania wstępnie zaprojektowanych miejsc wiązania dla kapsydów RBP z bakteriofagów GA¹³, MS2¹⁴, PP7¹⁵, oraz Qβ¹⁶ w regionie inicjacji translacji reporterowego mRNA ekspresja reporterowa jest silnie stłumiona. Przedstawiamy stosunkowo prostą i ilościową metodę, opartą na tym zjawisku represji, do pomiaru powinowactwa między RBP a odpowiadającymi immiejscami wiązania RNA in vivo.

Protokół

1. Przygotowanie systemu

1. Projektowanie plazmidów w miejscu wiązania
   1. Zaprojektuj kasetę z miejscem wiązania, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Każdy minigen zawiera następujące części (od 5' do 3'): miejsce restrykcji Eagl, ∼40 zasad końca 5' genu oporności na kanamycynę (Kan), promotor pLac-Ara, miejsce wiązania rybosomów (RBS), AUG genu mCherry, dystans (δ), miejsce wiązania RBP, 80 zasad końca 5' genu mCherry, oraz strona z ograniczeniami ApaLI.
      nuta: Aby zwiększyć wskaźnik powodzenia testu, zaprojektuj trzy kasety z miejscem wiązania dla każdego miejsca wiązania, z przekładkami składającymi się z co najmniej jednej, dwóch i trzech podstaw. Więcej informacji na temat wyników można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki.
2. Klonowanie plazmidów w miejscu wiązania
   1. Uporządkuj kasety miejsca wiązania jako minigeny dwuniciowego DNA (dsDNA). Każdy minigen ma długość ∼500 pz i zawiera miejsce restrykcji Eagl i miejsce restrykcyjne ApaLI odpowiednio na końcach 5' i 3' (patrz krok 1.1.1).
      nuta: W tym eksperymencie mini-geny z połową genu kanamycyny zostały uporządkowane, aby ułatwić badania przesiewowe w kierunku dodatnich kolonii. Jednak Gibson assembly¹⁷ jest również odpowiedni tutaj, w którym to przypadku miejsce wiązania można uporządkować jako dwa krótsze komplementarne jednoniciowe oligonukleotydy DNA.
   2. Podwójnie trawij zarówno mini-geny, jak i wektor docelowy za pomocą Eagl-HF i ApaLI za pomocą protokołu restrykcji¹⁸ i kolumny purify¹⁹.
   3. Zwiąż strawione minigeny ze szkieletem miejsca wiązania zawierającym resztę genu reporterowego mCherry, terminatora i genu oporności na kanamycynę²⁰.
   4. Przekształć roztwór do ligacji w komórki Escherichia coli TOP10²¹.
   5. Identyfikacja dodatnich transformantów za pomocą sekwencjonowania Sangera.
      1. Zaprojektuj starter 100 zasad przed obszarem zainteresowania (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sekwencjami starterów).
      2. Miniprzygotuj kilka kolonii bakterii²².
      3. Przygotować 5 μl 5 mM roztworu startera i 10 μl DNA o stężeniu 80 ng/μl.
      4. Wyślij dwa roztwory do wygodnego obiektu do sekwencjonowania Sanger²³.
   6. Oczyszczone plazmidy należy przechowywać w temperaturze -20 °C, a szczepy bakteryjne jako zapasy glicerolu²⁴, oba w formacie 96-dołkowym. DNA zostanie następnie wykorzystane do transformacji w komórki TOP10 E. coli zawierające jeden z czterech plazmidów fuzyjnych RBP (patrz krok 1.3.5).
3. Projektowanie i budowa plazmidu RBP
   nuta: Sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe białek płaszcza użytych w tym badaniu wymieniono w tabeli 2.
   1. Uporządkuj wymaganą sekwencję RBP bez kodonu stop jako niestandardowo uporządkowany minigen dsDNA bez kodonu stop z miejscami restrykcyjnymi na końcach (Rysunek 1).
   2. Sklonuj badany RBP pozbawiony kodonu stop bezpośrednio za indukowalnym promotorem i przed białkiem fluorescencyjnym pozbawionym kodonu start (Rysunek 1), podobnie jak w krokach 1.2.2-1.2.4. Upewnij się, że plazmid RBP zawiera inny gen oporności na antybiotyki niż plazmid miejsca wiązania.
   3. Zidentyfikuj transformanty dodatnie za pomocą sekwencjonowania Sangera, podobnie jak w kroku 1.2.5 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów).
   4. Wybierz jeden dodatni transformant i spraw, aby był kompetentny chemicznie²⁵. Przechowywać w temperaturze -20 °C jako oczyszczone plazmidy z glicerolem i zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych²⁴ w temperaturze -80 °C na płytkach 96-dołkowych.
   5. Przekształć plazmidy w miejscu wiązania (z kroku 1.2.6) przechowywane w 96-dołkowych płytkach w chemicznie kompetentne komórki bakteryjne już zawierające plazmid RBP-mCerulean ²¹. Aby zaoszczędzić czas, zamiast posiewać komórki na szalkach Petriego, posmaruj je za pomocą 8-kanałowego pipetora na 8-pasmowych płytkach zawierających agar Luria-Bertani (LB)²⁶ z odpowiednimi antybiotykami (Kan i Amp). Rodziny powinny pojawić się w ciągu 16 godzin.
   6. Wybierz pojedynczą kolonię dla każdego podwójnego transformantu i hoduj przez noc w pożywce LB z odpowiednimi antybiotykami (Kan i Amp) i przechowuj jako zapasy glicerolu²⁴ w temperaturze -80 °C na 96-dołkowych płytkach.

2. Konfiguracja eksperymentu

UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół został wykonany przy użyciu robotycznego systemu obsługi płynów w połączeniu z inkubatorem i czytnikiem płytek. Każdy pomiar przeprowadzono dla 24 stężeń induktora, z dwoma duplikatami dla każdej kombinacji szczep + induktor. Za pomocą tego zrobotyzowanego systemu zebrano dane dla 16 szczepów dziennie o 24 stężeniach induktorów. Jeśli jednak takie urządzenie jest niedostępne lub jeśli potrzeba mniej eksperymentów, można je łatwo wykonać ręcznie za pomocą 8-kanałowej pipety wielokanałowej i odpowiednio dostosowując protokół. W ten sposób uzyskano na przykład wstępne wyniki dla czterech szczepów dziennie o 12 stężeniach induktora i czterech punktach czasowych.

1. Przygotuj wcześniej 1 l buforu do testu biologicznego (BA), mieszając 0,5 g tryptonu, 0,3 ml glicerolu, 5,8 g NaCl, 50 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 10x buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 i 950 ml podwójnie destylowanej wody (DDW). Autoklaw lub sterylny filtr buforu BA.
2. Szczepy z podwójną transformacją należy hodować w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min, wytrząsając w 1,5 ml LB z odpowiednimi antybiotykami (kanamycyna w końcowym stężeniu 25 μg/ml i ampicylina w końcowym stężeniu 100 μg/ml), na 48-dołkowych płytkach, przez okres 18 godzin (przez noc).
3. Rano przygotuj następujące preparaty.
   1. Płytka induktora. Na czystej 96-dołkowej płytce przygotować studzienki z podłożem półubogim (SPM) składającym się z 95% BA i 5% LB²⁶ w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Liczba studzienek odpowiada pożądanej liczbie stężeń induktora. Dodaj C4-HSL do studzienek w płytce induktora, które będą zawierały najwyższe stężenie induktora (218 nM).
   2. Zaprogramuj robota tak, aby seryjnie rozcieńczał medium z każdej ze studni o najwyższym stężeniu do 23 niższych stężeń w zakresie od 0 do 218 nM. Objętość każdego rozcieńczenia induktora powinna być wystarczająca dla wszystkich szczepów (w tym duplikatów).
   3. Podczas przygotowywania rozcieńczeń induktora należy ogrzać 180 μl SPM w inkubatorze w temperaturze 37 °C na płytkach 96-dołkowych.
   4. Rozcieńczyć szczepy przez noc z kroku 2.2 przez współczynnik 100 przez seryjne rozcieńczenia: najpierw rozcieńczyć 100 μl bakterii przez zmieszanie 100 μl SPM na płytkach 48-dołkowych, a następnie ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, pobierając 20 μl z rozcieńczonego roztworu do 180 μl wstępnie podgrzanego SPM, w 96-dołkowych płytkach odpowiednich do pomiarów fluorescencyjnych.
   5. Dodać rozcieńczony induktor z płytki induktora do 96-dołkowych płytek z rozcieńczonymi szczepami zgodnie z końcowymi stężeniami.
4. Wytrząsać 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez 6 godzin, wykonując pomiary gęstości optycznej przy fluorescencji 595 nm (OD₅₉₅), mCherry (560 nm/612 nm) i mCerulean (460 nm/510 nm) za pomocą czytnika płytek co 30 minut. W celu normalizacji zmierz wzrost SMP bez dodawania komórek.

3. Wstępna analiza wyników

1. Dla każdego dnia eksperymentu wybierz przedział czasowy wzrostu logarytmicznego zgodnie ze zmierzonymi krzywymi wzrostu, między fazą wzrostu liniowego a fazą stacjonarną (T₀, T_końcowy). Weź około 6−8 punktów czasowych, odrzucając pierwszy i ostatni pomiar, aby uniknąć błędu wynikającego z niedokładności wykrywania wzrostu wykładniczego (patrz Rysunek 2A, górny panel).
   nuta: Odrzuć szczepy, które wykazują nieprawidłowe krzywe wzrostu lub szczepy, w których nie można było wykryć logarytmicznej fazy wzrostu i powtórz eksperyment.
2. Oblicz średnią znormalizowaną fluorescencję mCerulean i szybkość produkcji mCherry, na podstawie surowych danych zarówno fluorescencji mCerulean, jak i mCherry dla każdego stężenia induktora (Rysunek 2A).
   1. Oblicz znormalizowany mCerulean w następujący sposób:
      
      gdzie ślepa próba (mCerulean) jest poziomem mCerulean [a.u.] tylko dla pożywki, ślepa próba (OD) jest gęstością optyczną tylko dla pożywki, a mCerulean i OD to odpowiednio wartości fluorescencji mCerulean i gęstości optycznej.
   2. Średnia mCerulean w różnych punktach czasowych (Rysunek 2B, dwa górne panele) w następujący sposób:
      
      gdzie #Time punktów oznacza liczbę uwzględnianych punktów czasowych danych, T₀ jest czasem, w którym rozpoczyna się faza wzrostu wykładniczego, a T_końcowy jest czasem, w którym kończy się faza wzrostu wykładniczego.
   3. Oblicz wskaźnik produkcji mCherry (Rysunek 2B, dwa dolne panele) w następujący sposób:
      
      gdzie mCherry(t) to poziom mCherry [a.u.] w czasie t, OD to wartość gęstości optycznej, T₀ to czas, w którym rozpoczyna się faza wzrostu wykładniczego, a T_final to czas, w którym kończy się faza wzrostu wykładniczego.
3. Na koniec wykreśl szybkość produkcji mCherry jako funkcję mCerulean, tworząc krzywe odpowiedzi na dawkę jako funkcję fluorescencji fuzyjnej RBP-mCerulean (Rysunek 2C). Takie wykresy reprezentują produkcję genu reporterowego w funkcji obecności RBP w komórce.

4. Funkcja odpowiedzi na dawkę, dopasowywanie rutyny i ekstrakcji_{K RBP}

1. Zakładając, że szybkość translacji rybosomów z wiązanym RBP jest stała, modeluj tempo produkcji mCherry w następujący sposób (patrz Rysunek 2D, zielona linia):
   
   gdzie [x] jest znormalizowaną średnią fluorescencją mCerulean obliczoną zgodnie z równaniem 2, szybkość produkcji mCherry jest wartością obliczoną zgodnie z równaniem 3, K_RBP jest względnym powinowactwem wiązania [a.u.], K_unbound jest szybkością translacji rybosomu przy niezwiązanym RBP, n jest współczynnikiem kooperatywności, a C jest fluorescencją zasadową [a.u.]. C, n, K_niezwiązane i K_RBP określa się, dopasowując dane dotyczące szybkości produkcji mCherry do modelu (równanie 4).
2. Korzystając z oprogramowania do analizy danych, przeprowadź procedurę dopasowania na poletkach przedstawiających szybkość produkcji mCherry jako funkcję uśrednionego mCerulean (krok 3.3) i wyodrębnij parametry dopasowania zgodnie ze wzorem w równaniu 4.
   nuta: Pod uwagę brane są tylko wyniki dopasowania z R² > 0,6. W przypadku tych dopasowań błąd K_RBP mieści się najczęściej w zakresie od 0,5% do 20% wartości K_RBP, dla przedziału ufności 0,67, podczas gdy te z wyższym błędem_{K RBP} można również zweryfikować na oko.
3. Znormalizować wartości_{K RBP} przez odpowiednią maksymalną wartość uśrednionego mCerulean dla każdej funkcji dawka-odpowiedź.
   
   gdzie K_RBP w [a.u.] jest wartością uzyskaną z procedury dopasowania w równaniu 4, a max (uśredniony mCerulean) jest maksymalnym uśrednionym sygnałem mCerulean [a.u] obserwowanym dla bieżącego odkształcenia.
   nuta: Normalizacja ułatwia prawidłowe porównanie efektu regulacyjnego między szczepami poprzez wyeliminowanie zależności od poszczególnych maksymalnych poziomów ekspresji RBP.

Wyniki

Prezentowana metoda wykorzystuje konkurencję między RBP a rybosomem do wiązania się z cząsteczką mRNA (Rysunek 1). Konkurencja ta znajduje odzwierciedlenie w zmniejszającym się poziomie mCherry w funkcji zwiększonej produkcji RBP-mCerulean, ze względu na rosnące stężenie induktora. W przypadku nasilającej się fluorescencji mCerulean, przy braku istotnych zmian w mCherry, stwierdza się brak wiązania RBP. Reprezentatywne wyniki zarówno dla szczepu pozytywnego, jak i ujem...

Dyskusja

Opisana w artykule metoda ułatwia ilościowy pomiar in vivo powinowactwa wiązania RBP-RNA w komórkach E. coli . Protokół jest stosunkowo łatwy i można go przeprowadzić bez użycia zaawansowanych maszyn, a analiza danych jest prosta. Co więcej, wyniki są uzyskiwane natychmiast, bez stosunkowo długiego czasu oczekiwania związanego z wynikami sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że działa ona tylko w komórkach bakteryjnych. Jednak poprzednie badan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól sodowa ampicyliny	SIGMA	A9518
Siarczan magnezu (MgSO4)	ALFA AESAR	33337
48 płytek	Axygen	P-5ML-48-C-S
Płytki 8-pasmowe	Axygen	RESMW8I
96-dołkowe	Axygen	P-DW-20-C
Płytki 96-dołkowe do czytnika płytek	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
Sekwencje miejsca wiązania	Gen9 Inc. i Twist Bioscience		patrz Tabela 1
E. komórki TOP10	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
Inkubator 071205			BIO LAB
	Inkubator		TECAN
Roztwór kanamycyny	SIGMA	K4000
KpnI- HF	NEB	R0142
Ligaza	NEB	B0202S
Zrobotyzowany system transportu cieczy	TECAN	EVO 100, MCA 96-kanałowe
oprogramowanie analityczne Matlab	Mathworks
Multipipeta 8 torów	Axygen	BR703710
N-butanoilo-L-homoseryna lakton (C4-HSL)	cayman	K40982552 019
PBS Bufor Branże	biologiczne	020235A Czytnik płytek
	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polimeraza	NEB	M0493
Sekwencje RBP	Addgene	27121 & 40650	patrz Tabela 2
Chlorek sodu (NaCL)	BIO LAB	190305
SV Żel i system oczyszczania PCR	Promega	A9281
Trypton	BD	211705