Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

Podsumowanie

Ten protokół opisuje połączenie chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) dla absolutnej charakterystyki białek i kompleksów w roztworze. SEC-MALS określa masę cząsteczkową i wielkość czystych białek, natywnych oligomerów, heterokompleksów i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny.

Streszczenie

Analityczna chromatografia wykluczania wielkości (SEC), powszechnie używana do oznaczania masy cząsteczkowej białek i kompleksów białko-białko w roztworze, jest techniką względną, która opiera się na objętości elucji analitu w celu oszacowania masy cząsteczkowej. Gdy białko nie jest kuliste lub ulega nieidealnym interakcjom kolumnowym, krzywa kalibracyjna oparta na wzorcach białka jest nieważna, a masa cząsteczkowa określona na podstawie objętości elucji jest nieprawidłowa. Rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) to technika absolutna, która określa masę cząsteczkową analitu w roztworze na podstawie podstawowych równań fizycznych. Połączenie SEC do separacji z MALS do analizy stanowi wszechstronny, niezawodny sposób charakteryzowania roztworów jednego lub więcej gatunków białek, w tym monomerów, natywnych oligomerów lub agregatów oraz heterokompleksów. Ponieważ pomiar jest wykonywany przy każdej objętości elucji, SEC-MALS może określić, czy pik eluujący jest jednorodny czy niejednorodny i odróżnić stały rozkład masy cząsteczkowej od równowagi dynamicznej. Możliwa jest również analiza zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny lub lipoproteiny, lub koniugatów, takich jak białka błonowe rozpuszczone w detergentach. W związku z tym SEC-MALS jest kluczowym narzędziem dla chemików białek, którzy muszą potwierdzić właściwości biofizyczne i zachowanie roztworu cząsteczek wytwarzanych do badań biologicznych lub biotechnologicznych. Ten protokół dla SEC-MALS analizuje masę cząsteczkową i wielkość czystych monomerów i agregatów białkowych. Uzyskane dane służą jako podstawa do dalszych analiz SEC-MALS, w tym dotyczących kompleksów, glikoprotein i białek błonowych związanych z surfaktantami.

Wprowadzenie

Wiarygodna analiza masy cząsteczkowej (MW) białek w roztworze jest niezbędna do badań biomolekularnych^1,2,3,4. Analiza MW informuje naukowca, czy wyprodukowano prawidłowe białko i czy nadaje się ono do wykorzystania w dalszych eksperymentach^5,6. Jak opisano na stronach internetowych sieci badawczych P4EU⁷ i ARBRE-Mobieu⁸, kontrola jakości białka musi charakteryzować nie tylko czystość produktu końcowego, ale także jego stan oligomeryczny, jednorodność, tożsamość, konformację, strukturę, modyfikacje po translacji i inne właściwości.

MW pomiar w roztworze niedenaturującym identyfikuje formę białka, które jest obecne w środowisku wodnym, czy to monomeryczne, czy oligomerowe. Podczas gdy w przypadku wielu białek celem jest wytworzenie formy monomerycznej, dla innych kluczem do aktywności biologicznej jest określony natywny oligomer^9,10,11,12. Inne oligomery i nienatywne agregaty są niepożądane i prowadzą do błędów w określaniu struktury za pomocą krystalografii, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem, a także artefaktów lub niedokładności w testach funkcjonalnych w celu ilościowego określenia wiązania za pomocą kalorymetrii miareczkowania izotermicznego lub powierzchniowego rezonansu plazmonowego^2,13.

W przypadku bioterapeutyków, takich jak przeciwciała monoklonalne (mAb), analiza MW oparta na roztworze służy podobnemu celowi kontroli jakości i charakterystyki produktu. Nadmierna ilość kruszyw i fragmentów wskazuje na niestabilny produkt, który nie nadaje się do stosowania przez ludzi. Agencje regulacyjne wymagają starannej charakterystyki, nie tylko cząsteczki terapeutycznej, ale także potencjalnych degradantów, które mogą być obecne w produkcie końcowym^14,15,16,17.

Niektóre z najbardziej rozpowszechnionych metod analizy białka MW to elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), elektroforeza kapilarna (CE), natywna PAGE, spektrometria mas (MS), chromatografia wykluczania wielkości (SEC) i ultrawirowanie analityczne (AUC). Spośród nich SDS-PAGE, CE i MS nie są wykonywane w stanie natywnym i zazwyczaj prowadzą do dysocjacji oligomerów i agregatów, dlatego nie nadają się do określania natywnych oligomerów lub ilościowego określania agregatów. Chociaż natywny PAGE teoretycznie zachowuje stan natywny, z naszego doświadczenia wynika, że trudno jest zoptymalizować go dla wielu białek, a wyniki nie są zbyt wiarygodne. AUC, czy to na podstawie prędkości sedymentacji, czy równowagi sedymentacji, jest ilościowe i może określić MW na podstawie podstawowych zasad, ale jest dość kłopotliwe, wymaga dużo pracy ręcznej i znacznej wiedzy specjalistycznej w zakresie interpretacji danych, długiego czasu eksperymentu i bardzo drogiego instrumentu.

Analityczny SEC to ilościowa i stosunkowo solidna, prosta metoda, która rozdziela makrocząsteczki podczas przepływu przez wypełnioną kolumnę. Zasady i zastosowania SEC są dobrze przedstawione w kilku recenzjach^18,19,20 oraz w podręczniku "Chromatografia wykluczania rozmiarów: zasady i metody"²¹. Różnice w retencji wynikają z różnej ilości czasu spędzonego na dyfuzji do i z porów w fazie stacjonarnej przed elucją. Różnice wynikają (nominalnie) ze względnych rozmiarów i współczynników dyfuzji cząsteczek²². Krzywa kalibracyjna jest konstruowana przy użyciu szeregu cząsteczek odniesienia, wiążących MW cząsteczki z objętością elucji. W przypadku białek cząsteczkami odniesienia są na ogół dobrze zachowujące się, globularne białka, które nie oddziałują z kolumną za pośrednictwem ładunku lub hydrofobowych reszt powierzchniowych. Objętość elucji mierzy się za pomocą detektora absorbancji ultrafioletu (UV). Jeśli znany jest współczynnik ekstynkcji UV - często obliczany na podstawie sekwencji - można również określić ilościowo masę całkowitą piku białka.

Warto zauważyć, że analiza MW przez SEC opiera się na dwóch kluczowych założeniach dotyczących białek, które mają być scharakteryzowane: 1) mają one tę samą konformację i objętość właściwą z wzorcami referencyjnymi (innymi słowy, ten sam związek między właściwościami dyfuzyjnymi a MW) i 2) podobnie jak wzorce referencyjne, nie oddziałują z kolumną, z wyjątkiem właściwości sterycznych - nie przylegają do wypełnienia kolumny przez ładunek lub oddziaływania hydrofobowe. Odchylenia od tych założeń unieważniają krzywą kalibracyjną i prowadzą do błędnych oznaczeń MW. Dzieje się tak w przypadku wewnętrznie nieuporządkowanych białek, które mają duże promienie Stokesa ze względu na ich rozległe nieustrukturyzowane regiony^23,24 lub niesferyczne/liniowe zespoły oligomeryczne¹⁰. Białka glikozylowane będą na ogół miały większy promień Stokesa niż forma nieglikozylowana, nawet jeśli weźmie się pod uwagę dodaną masę węglowodanów¹⁹. Białka błonowe rozpuszczone w detergentach eluują inaczej niż białka kalibracyjne, ponieważ ich elucja z SEC zależy od całkowitej wielkości kompleksu polipeptyd-detergent-lipidy, a nie od stanu oligomerycznego i masy molowej białka^25,26. Skład chemiczny kolumny, pH i warunki soli wpływają na objętość elucji białek z naładowanymi lub hydrofobowymi pozostałościami powierzchniowymi^27,28.

SEC staje się znacznie bardziej wszechstronny i niezawodny do wyznaczania MW w połączeniu z detektorami wielokątowego rozpraszania światła (MALS) i różnicowego indeksu refrakcji (dRI)3^,4^{,11,29,30,31,32}. Detektor dRI określa stężenie na podstawie zmiany współczynnika załamania światła roztworu spowodowanej obecnością analitu. Detektor MALS mierzy proporcję światła rozproszonego przez analit pod różnymi kątami w stosunku do padającej wiązki laserowej. Zbiorczo znane jako SEC-MALS, oprzyrządowanie to określa MW niezależnie od czasu elucji, ponieważ MW można obliczyć bezpośrednio z pierwszych zasad za pomocą równania 1,

(1)

gdzie M to masa cząsteczkowa analitu, R(0) zredukowany współczynnik Rayleigha (tj. ilość światła rozproszonego przez analit w stosunku do intensywności lasera) wyznaczony przez detektor MALS i ekstrapolowany do kąta zero, c stężenie wagowe określone przez detektor UV lub dRI, dn/dc przyrost indeksu refrakcji analitu (zasadniczo różnica między indeksem refrakcji analitu a buforem), i K stała optyczna, która zależy od właściwości systemu, takich jak długość fali i współczynnik załamania światła rozpuszczalnika²⁹.

W SEC-MALS, kolumna SEC jest używana wyłącznie do rozdzielania różnych gatunków w roztworze, tak aby wchodziły one do komórek MALS i detektora koncentracji indywidualnie. Rzeczywisty czas retencji nie ma znaczenia dla analizy, z wyjątkiem tego, jak dobrze rozdziela gatunki białek. Przyrządy są kalibrowane niezależnie od kolumny i nie opierają się na wzorcach odniesienia. W związku z tym SEC-MALS jest uważana za "bezwzględną" metodę wyznaczania MW na podstawie podstawowych równań fizycznych. Jeżeli próbka jest niejednorodna i nie jest całkowicie oddzielona przez kolumnę, wówczas wartość podana dla każdej objętości elucji będzie średnią wagową cząsteczek w każdej objętości elucyjnej, która przepływa przez komórkę przepływową w przedziale czasu, około 75 μl.

Poprzez analizę kątowej zmienności intensywności rozpraszania, MALS może również określić rozmiar (pierwiastek średni kwadratowy, R_g) makrocząsteczek i nanocząstek o promieniu geometrycznym większym niż około 12,5 nm²⁹. W przypadku mniejszych gatunków, takich jak białka monomeryczne i oligomery, moduł dynamicznego rozpraszania światła (DLS) może zostać dodany do instrumentu MALS w celu pomiaru promieni hydrodynamicznych od 0,5 nm wzwyż³³.

Podczas gdy analiza stężenia UV lub dRI może dostarczyć wartości c w Eq. 1, użycie dRI jest preferowane z dwóch powodów: 1) dRI jest uniwersalnym detektorem stężeń, odpowiednim do analizy cząsteczek takich jak cukry lub polisacharydy, które nie zawierają chromoforu UV³⁴; oraz 2) odpowiedź na stężenie dn/dc prawie wszystkich czystych białek w buforze wodnym jest taka sama z dokładnością do jednego lub dwóch procent (0,185 ml / g)³⁵, więc nie ma potrzeby znać współczynnika ekstynkcji UV.

Zastosowanie SEC-MALS w badaniach nad białkami jest dość szerokie. Zdecydowanie najczęstszymi zastosowaniami są ustalenie, czy oczyszczone białko jest monomeryczne czy oligomeryczne oraz stopień oligomeryzacji oraz ocena agregatów^{3,10,11,17,31,36,37,38}. Możliwość zrobienia tego w przypadku rozpuszczalnych w detergentach białek błonowych, których nie można scharakteryzować tradycyjnymi metodami, jest szczególnie ceniona, a szczegółowe protokoły w tym zakresie zostały opublikowane^{31,39,40,41,42,43}. Inne typowe zastosowania obejmują ustalanie stopnia modyfikacji potranslacyjnej i polidyspersyjności glikoprotein, lipoprotein i podobnych koniugatów^{4,31,44,45,46,47}; Powstawanie (lub jego brak) i bezwzględna stechiometria (w przeciwieństwie do stosunku stechiometrycznego) heterokompleksów zawierających kompleksy białko-białko, białko-kwas nukleinowy i białko-polisacharydy^{24,46,48,49,50,51,52}; Wyznaczanie stałej dysocjacji równowagi monomer-dimer^49,53,54; i ocena konformacji białka^55,56. Poza białkami, SEC-MALS jest nieoceniony w charakterystyce peptydów^57,58, szeroko heterogenicznych polimerów naturalnych, takich jak heparyny⁵⁹ i chitozany^60,61, małe wirusy⁶² i większość rodzajów syntetycznych lub przetworzonych polimerów^63,64,65,66. Obszerną bibliografię można znaleźć w literaturze⁶⁷ oraz w Internecie (pod adresem http://www.wyatt.com/bibliography).

Tutaj prezentujemy standardowy protokół do przeprowadzania i analizowania eksperymentu SEC-MALS. Albumina surowicy bydlęcej (BSA) jest przedstawiona jako przykład do separacji i charakterystyki monomerów i oligomerów białkowych. Protokół BSA określa pewne stałe systemowe, które służą jako podstawa do dalszych analiz SEC-MALS, w tym kompleksów, glikoprotein i białek błonowych związanych z surfaktantami.

Zauważamy, że SEC-MALS może być wykonywany przy użyciu standardowego sprzętu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) od wielu dostawców. Protokół ten opisuje zastosowanie systemu FPLC powszechnie spotykanego w laboratoriach produkujących białka do celów badawczo-rozwojowych (patrz Tabela materiałów). Przed uruchomieniem protokołu powinien zostać zainstalowany system FPLC, detektory MALS i dRI wraz z odpowiednimi pakietami oprogramowania do sterowania, akwizycji i analizy danych zgodnie z instrukcjami producenta oraz wszelkimi wymaganymi stałymi kalibracji lub innymi ustawieniami wprowadzonymi do oprogramowania. Pomiędzy pompą a wtryskiwaczem należy umieścić filtr liniowy z zainstalowaną hydrofilową membraną porową 0,1 μm.

Protokół

1. Przygotowanie systemu

1. Podłącz detektory MALS i dRI za detektorem UV FPLC. Pomiń detektory pH i przewodności, ponieważ dodadzą one znaczną objętość między detektorami UV i MALS. Użyć rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,25 mm od kolumny do detektorów i między nimi oraz rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,75 mm na wyjściu detektorów do kolektora odpadów lub frakcji.
2. Upewnij się, że zostały ustanowione niezbędne połączenia sygnałowe między FPLC a detektorami, w tym wyjście analogowe z detektora UV do wejścia analogowego MALS oraz wyjście cyfrowe z FPLC do automatycznego wstrzykiwania MALS za pośrednictwem skrzynki I/O FPLC.
3. Zainstalować odpowiednią kolumnę analityczną SEC obejmującą zakres frakcjonowania od co najmniej 20 kDa do 500 kDa. Sprawdź informacje o produkcie, aby określić, czy kolumna jest odpowiednia dla zakresu MW, pH i innych właściwości próbki i fazy ruchomej.

2. Przygotowanie bufora, płukanie systemu przez noc i sprawdzenie czystości

1. Używając odczynników klasy HPLC, przygotuj 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 50 - 100 mM NaCl. Przefiltrować bufor do 0,1 μm za pomocą filtra polieterowo-sulfonowego lub podobnego filtra w butelce. Przefiltruj pierwsze 50-100 ml buforu do butelki na odpady i wyrzuć, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów, a następnie przefiltruj resztę do czystej, sterylnej butelki, która została dokładnie umyta przefiltrowaną, zdejonizowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
   UWAGA: Inne rozpuszczalniki fazy ruchomej, takie jak bufor Tris, mogą być stosowane, jeśli mają być analizowane dodatkowe białka, które są preferencyjnie rozpuszczone w tych rozpuszczalnikach.
2. Przepłukiwać przez noc z natężeniem przepływu 0,5 ml/min lub w inny sposób zalecany przez producenta kolumny, aby zrównoważyć kolumnę w buforze i usunąć cząstki stałe. Użyj trybu ciągłego przepływu FPLC i upewnij się, że przepływ nie zatrzyma się, dopóki wszystkie przebiegi SEC-MALS nie zostaną zakończone.
   1. Umieść celę przepływową dRI w trybie przedmuchiwania podczas płukania przez noc. Wyłącz przedmuchiwanie przed rozpoczęciem próbnych przebiegów.
   2. Rozpoczynając płukanie, stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, aby zapobiec efektowi "zrzucania kolumny" (lub uwalnianiu cząstek) spowodowanemu nagłą zmianą ciśnienia w kolumnie.
   3. Jeśli wiadomo, że system jest dość stabilny i wolny od cząstek stałych oraz znajduje się w równowadze z pożądaną fazą ruchomą, należy wymienić spłukiwanie nocne na krótsze, trwające 2-3 godziny.
3. Sprawdź czystość systemu, lekko stukając w rurkę za kolumną, aby uwolnić nagromadzone cząstki i obserwując sygnał w detektorze 90° na wyświetlaczu na panelu przednim przyrządu MALS. Sprawdź, czy szum międzyszczytowy nie przekracza 50 -100 μV.
4. Wykonać "ślepą" próbę wstrzyknięcia, aby sprawdzić, czy wtryskiwacz jest oczyszczony z cząstek stałych. "Ślepa próba" to po prostu bufor do biegania, przygotowany w świeżej, sterylnej fiolce.
   1. Jeśli pik cząstek nie przekracza objętości 1 ml i nie przekracza 5 mV powyżej linii podstawowej, oznacza to, że system jest gotowy do pobrania próbek. W przeciwnym razie wykonaj dodatkowe ślepe wstrzyknięcia, aż do wyczyszczenia, lub przeprowadź konserwację w celu wyczyszczenia wtryskiwacza.

3. Przygotowanie i załadunek próbki

1. Przygotować co najmniej 200 μl BSA w stężeniu 1-2 mg/ml w buforze SEC.
   UWAGA: Aby zapobiec wytrącaniu się osadów, BSA nigdy nie należy rozpuszczać w czystej wodzie.
2. Przefiltruj białko do 0,02 μm za pomocą filtra z końcówką strzykawki.
3. Wyrzuć kilka pierwszych kropli filtratu, aby wyeliminować cząstki z suchych filtrów.
4. Alternatywnie, należy odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 15 minut, aby umożliwić wytrącanie nierozpuszczalnych agregatów i innych dużych cząstek.
5. Wstrzyknąć 100 μl roztworu BSA do pętli.
   UWAGA: Jest to zalecana ilość materiału i może być wstrzykiwana mniej więcej w zależności od okoliczności próbki, takich jak stabilność lub dostępność. Ilość białka wymagana na wstrzyknięcie zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do masy cząsteczkowej - dwa razy więcej masy białka jest potrzebne, jeśli masa cząsteczkowa wynosi 33 kDa, czyli o połowę mniejsza niż BSA.

4. Przygotowanie oprogramowania MALS

1. Otwórz nowy | Eksperymentuj z metody w menu oprogramowania MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła. Jeśli detektor DLS jest obecny, wybierz metodę Online z menu Rozpraszanie światła | Z folderem QELS.
2. W sekcji Konfiguracja ustaw parametry próbki i fazy ruchomej.
   1. W widoku Pompa ogólna ustaw natężenie przepływu na używane w FPLC.
   2. W widoku Pompa ogólna, w polu Solvent branch, Name (Nazwa) wybierz PBS.
   3. W widoku Wtryskiwacz, gałąź Próbka, wprowadź nazwę jako BSA i ustaw dn/dc = 0,185 (standardowa wartość dla niezmodyfikowanych białek), A2 = 0 i współczynnik ekstynkcji UV = 0,667 ml / (mg-cm).
      UWAGA: W przypadku innych białek współczynnik ekstynkcji UV₂₈₀ nm można znaleźć w literaturze lub obliczyć na podstawie jego sekwencji przy użyciu różnych narzędzi oprogramowania z domeny publicznej.
3. W sekcji Procedury, w widoku Kolekcja podstawowa, zaznacz pole wyboru Wyzwalaj przy automatycznym wstrzykiwaniu i ustaw czas trwania przebiegu na 70 minut, aby dane były zbierane dla całej elucji, aż do osiągnięcia całkowitej objętości przenikania kolumny SEC.
   UWAGA: Niezbędny czas może się różnić w zależności od kolumny i natężenia przepływu - w przypadku standardowej kolumny HPLC-SEC o wymiarach 7,8 mm x 300 mm przy 0,5 ml/min wymagane jest 35 minut zbierania.
4. Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom. Odczyt danych rozpocznie się po odebraniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.
5. Wyzeruj sygnał dRI, klikając przycisk Autozero na panelu przednim przyrządu.

5. Przygotowanie oprogramowania FPLC

1. Wstaw nazwę białka i przebieg w oprogramowaniu FPLC, w Podręczniku | Wykonywanie instrukcji ręcznych | Ustaw znak.
2. Przełącz zawór wtryskowy z obciążenia ręcznego na Wtrysk w ścieżce przepływu | Zawór wtryskowy.
3. Dołączanie sygnału impulsowego poprzez włożenie impulsu 0,5 s pod skrzynkę we/wy | Wyjście cyfrowe impulsu. Spowoduje to rozpoczęcie zbierania danych w oprogramowaniu MALS.

6. Wstrzyknij próbkę do pętli. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj) w oprogramowaniu FPLC, aby rozpocząć przebieg eksperymentu.

7.Analiza danych SEC-MALS BSA

1. Wykonaj analizę krok po kroku w sekcji Procedury w oprogramowaniu MALS.
   1. Sprawdź, czy piki pojawiają się w przybliżeniu przy tej samej objętości elucji w UV, MALS i RI, sprawdzając widok Kolekcja podstawowa.
   2. W widoku Linia bazowa zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów (wszystkie detektory LS, UV i dRI). Linie podstawowe powinny być zdefiniowane w taki sposób, aby wskazywały poziom czystego rozpuszczalnika, najlepiej rozciągając się z jednej strony pików próbki na drugą.
   3. W widoku Szczyty zdefiniuj szczyty, które mają być analizowane, klikając i przeciągając myszą. Wybierz środkowe 50% każdego szczytu. Najpierw wybierz pik monomeru ("Szczyt 1"), a następnie pik dimera ("Szczyt 2"). Sprawdź poprawność wartości dn/dc = 0,185 i współczynnik ekstynkcji UV 280 nm = 0,667 dla BSA pod każdym pikiem.
2. Wykonaj procedury wyrównywania pików, korekcji poszerzenia pasma i normalizacji.
   UWAGA: Zwykle metoda SEC-MALS jest okresowo kalibrowana pod kątem wyrównania pików, poszerzenia pasma i normalizacji detektorów kątowych do detektora 90° przy użyciu białka monodyspersyjnego o promieniu bezwładności R_{g <} 10 nm, takiego jak monomer BSA. W tym przykładzie BSA służy zarówno jako cząsteczka kalibracyjna, jak i sama jest przedmiotem analizy MW.
   1. W sekcji Procedury | Wyrównanie view, wybierz środkowy region szczytów, klikając i przeciągając myszą, kliknij Wyrównaj sygnały, a następnie OK.
   2. W sekcji Procedury | Poszerzenie pasma, wybierz środkowe 50% piku monomeru. Upewnij się, że detektor RI jest określony jako instrument odniesienia, a następnie kliknij przycisk Wykonaj dopasowanie i zastosuj, aby dopasować sygnały UV i LS do sygnału RI.
      1. Powiększ szczyty, aby sprawdzić, czy nakładają się one bardzo ściśle w środkowym obszarze 50–70%, a następnie kliknij przycisk OK.
      2. Jeśli zakładka nie jest idealna, (może być konieczne) wykonaj dopasowanie i "Zastosuj" jeszcze raz lub dwa razy, aż zakładka będzie idealna.
   3. W sekcji Procedury | Normalizacja view, wybierz Szczyt 1, wprowadź 3,0 nm jako wartość R_g, kliknij Normalizuj, a następnie OK.
   4. W sekcji Procedury | Masa molowa i Rg z widoku MALS, przejrzyj dane, aby określić, które kąty detekcji, jeśli w ogóle, powinny zostać odznaczone z analizy z powodu nadmiernego szumu. Zazwyczaj będą to dolne kąty, w które cząsteczki pyłu rozpraszają się ze stosunkowo dużą intensywnością. Wybierz poszczególne wycinki w obrębie pików z wykresu po prawej stronie i wyświetl zależność kątową odwrotnego zredukowanego współczynnika Rayleigha na wykresie po lewej stronie. Jeśli najniższe (a czasem najwyższe) kąty stale znacznie odbiegają od pasowania, usuń ich zaznaczenie z listy u dołu widoku.
3. Wyświetl wykres wyników w widoku Wykres EASI. Wybierz Masę molową z listy rozwijanej Wyświetlanie w górnej części okna. Użyj Ctrl + kliknięcie i przeciągnij, aby powiększyć obszar szczytu.
4. Zobacz końcowe tabelaryczne wyniki średniej wagowo-masowej masy molowej dla pików monomerów i dimerów w sekcji Wyniki | Widok raportu (podsumowania) w obszarze Szczytowe wyniki | Momenty masy molowej (g/mol) | Mw. Czystość jest podawana w obszarze Wyniki szczytowe | Ułamek masowy (%).
   UWAGA: Pokazane są również inne momenty masy molowej; Są one zwykle istotne dla heterogenicznych polimerów, ale nie dla białek o dyskretnych rozmiarach. W raporcie można uwzględnić wiele innych wyników uzyskanych przez oprogramowanie, takich jak procentowy odzysk masy (frakcja białka, która wymywała się przez detektor stężeń w stosunku do ilości wstrzykniętego), statystyki pików, polidyspersyjność, momenty R_g i R_h itp. Miary niepewności, o ile są podane, odzwierciedlają precyzję podanej wartości w oparciu o szum w serii pomiarów i nie powinny być uznawane za reprezentujące dokładność. Rzeczywista dokładność podawanych wartości zależy od różnych czynników, takich jak dokładność podanych wartości dn/dc i współczynnika ekstynkcji, kalibracja przyrządu itp.
5. Z menu Plik wybierz opcję Zapisz jako metodę i zapisz analizowane dane BSA jako standardową metodę do przyszłych pomiarów wszystkich typów białek. Parametry normalizacji i poszerzenia pasma wyznaczone dla BSA zostaną przeniesione do analizy.

Wyniki

Rysunek 1a,b pokazuje, że trzy oligomeryczne formy BSA: monomer, dimer i trimer, były dobrze rozdzielone na kolumnie porów 200 A z podstawową rozdzielczością monomeru i dimera, podczas gdy Rysunek 2a pokazuje, że separacja na kolumnie porów 75 A nie osiągnęła dobrej rozdzielczości monomer-dimer. Ten ostatni przykład został dołączony, aby zilustrować "słaby" wynik; Tych różnic w separacji dla dwóch kolumn można w rzeczywistości oczekiwać zgodnie z zakresami separacji podanymi przez producenta. Trimer nie jest w pełni oddzielony od dimeru, a wyższe oligomery nie są dobrze oddzielone od trimera i od siebie nawzajem. Rysunek 2b to przykład sygnału rozpraszania światła przez szumy z cząstkami obecnymi na całym chromatogramie, co uniemożliwia dokładne określenie MW.

Odtąd skupiamy się na Rysunek 1b. Monomer, który został wyeluowany po 13,8 min, wykazuje średnią wagowo masę molową M_w wynoszącą 64,1 ± 0,4 kDa określoną przez MALS i promień hydrodynamiczny R_h wynoszący 3,54 ± 0,01 nm. Wyniki te są zgodne z masą sekwencji i znanym promieniem hydrodynamicznym BSA, odpowiednio 66,4 kDa i 3,5 nm⁶⁸, z typową dokładnością SEC-MALS, 5%^3,69. Dimer, który został wyeluowany po 12 minutach, wykazywał wartość M_w 127 ± 1 kDa określoną przez MALS - zgodnie z oczekiwaniami, dwa razy większą niż monomer w zakresie eksperymentalnej precyzji - i wilgotność względną_5,68 ± 0,06 nm. Szczyt trimera zaobserwowano również po 11 minutach z M_w wynoszącym 194 ± 9 kDa określonym przez MALS, trzykrotnie większym niż monomer w zakresie eksperymentalnej precyzji, zgodnie z oczekiwaniami. Nie można było określić wilgotności prawej trymera ze względu na niską intensywność sygnału DLS.

Punkty masy molowej obliczone na piku monomeru są jednakowe z dokładnością do 2-5%, co wskazuje na jednorodność. Nie jest niczym niezwykłym znalezienie tylnego pobocza o masie molowej w zakresie 38-50 kDa, odpowiadającej fragmentom BSA⁷⁰. Punkty masy molowej w poprzek pików dimerycznych i trimerycznych nie są jednorodne, co wskazuje na niejednorodność. Pik dimeru jest nieco niejednorodny ze względu na ślady trimera, które przenikają do piku dimeru, a pik trimeru jest niejednorodny z powodu koelucji słabo rozdzielonych wyższych oligomerów.

Poziom sygnału do szumu piku monomeru jest całkiem akceptowalny we wszystkich trzech sygnałach, powyżej 100:1, podobnie jak pik dimera z sygnałem do szumu 40:1. Regiony chromatogramu znajdujące się poza pikami białka są płaskie, z wyjątkiem piku spowodowanego cząstkami stałymi w pobliżu całkowitej objętości wykluczenia (pustek) w śladzie LS oraz (dodatniego) piku soli i (ujemnego) piku rozpuszczonego powietrza w śladzie dRI, w pobliżu całkowitej objętości przenikania. Są one wskazane w Rysunek 1a.

Poziom czystości można również obliczyć w eksperymencie SEC-MALS: ułamek masowy piku monomerycznego w raporcie reprezentuje procent czystości formy monomerycznej. Dla monomeru BSA obliczona czystość wynosi 88%.

Rysunek 1: Analiza SEC-MALS albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przy użyciu kolumny wykluczającej wielkość porów 200 A. Ślady chromatogramu są normalizowane do piku monomeru i przesunięte w celu uzyskania przejrzystości. (A) Wskazano typowe artefakty, które można zignorować, w tym pik cząstek w pobliżu początku sygnału rozpraszania światła, a także piki soli i rozpuszczonego powietrza w pobliżu całkowitej objętości przenikania w sygnale współczynnika załamania światła. (B) Chromatogram wykazuje doskonałą separację monomer-dimer-trimer, a sygnał rozpraszania światła wykazuje wysoki stosunek sygnału do szumu. Wartości monomerów i dimerów MW wykazują wysoką jednorodność. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykłady niskiej jakości analiz SEC-MALS. Ślady chromatogramu są normalizowane do piku monomeru i przesunięte w celu uzyskania przejrzystości. (A) Nieodpowiednia separacja na kolumnie wykluczającej wielkość porów 75 A; Pik cząstek między 8 a 9 minutami nie jest dobrze oddzielony od białek. (B) Nieodpowiedni stosunek sygnału do szumu i rozległe cząstki przylegające do białek są widoczne w sygnale rozpraszania światła (LS). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Eksperyment SEC-MALS dostarczył dobrej separacji monomerów, dimerów i trimerów oraz wyników ilościowych dla mas molowych i rozmiarów hydrodynamicznych każdego piku. To z kolei wyraźnie identyfikuje i charakteryzuje każdy obecny gatunek, a także określa ilościowo czystość. Zazwyczaj uzyskane wyniki są dokładne z dokładnością do 5%, a precyzyjne i powtarzalne z dokładnością do 1-2%^3,69. Ten poziom precyzji i powtarzalności umożliwia pewne rozróżnienie gatunków, które mogą być zbliżone pod względem MW, o ile są oddzielone przez SEC (mogą częściowo nakładać się w obrębie tego samego piku). Korzyści dla kontroli jakości białek i podstawowej charakterystyki biofizycznej są oczywiste.

Weryfikacja braku cząstek stałych jest bardzo ważna dla czułych, powtarzalnych pomiarów SEC-MALS. Piki cząstek zazwyczaj pojawiają się jako duże sygnały MALS, którym nie towarzyszą porównywalne sygnały UV lub RI. Faza ruchoma i próbka powinny być starannie przygotowane w celu wyeliminowania takich cząstek. Zaleca się stosowanie odczynników klasy HPLC lub lepszych, filtrację fazy ruchomej i bufor rozcieńczający do 0,1 - 0,2 μm (wstępne mycie filtra w celu wyeliminowania cząstek, które są zawsze obecne na suchych membranach), konserwację ekstra czystych butelek z fazą ruchomą i innych naczyń szklanych do SEC-MALS oraz przedłużoną równowagę kolumny pod przepływem (w celu usunięcia cząstek stałych i kruszyw, które mogły się nagromadzić, gdy przepływ został zatrzymany lub kolumna nie była używana). Próbka powinna być filtrowana do najmniejszego rozmiaru porów, który nie usuwa interesującego go materiału, zwykle nie większego niż 0,1 μm i, jeśli to możliwe, 0,02 μm. Jeśli filtr szybko się zapcha, próbkę można odwirować, przefiltrować w etapach zmniejszającej się wielkości porów i/lub ponownie oczyścić. Gdy systemy są konsekwentnie utrzymywane z wysokiej jakości, świeżą i przefiltrowaną fazą ruchomą, zapobiega się wstrząsom kolumny, próbki są czyste i nie przylegają do kolumny, pomiary nie będą wykazywały wspomnianego wcześniej hałasu cząstek stałych i dostarczą danych wysokiej jakości.

MALS jest niezależny od typowych SEC dla białek; Wiele innych systemów buforowych oprócz PBS może być stosowanych w celu optymalizacji separacji i stabilności, w tym różnych substancji pomocniczych⁷¹. MALS jest również niezależny od konkretnej kolumny, którą należy wybrać w celu optymalnego oddzielenia i odzysku. Głównymi problemami dotyczącymi substancji pomocniczych w analizie są znaczące zmiany współczynnika załamania światła, prowadzące do modyfikacji przyrostu specyficznego współczynnika załamania światła dn/dc oraz substancje pomocnicze, które absorbują 280 nm, gdy potrzebna jest analiza UV. Na przykład arginina jest powszechną substancją pomocniczą redukującą agregację, która może dramatycznie wpłynąć na dn/dc typowego białka, nawet wprowadzając je w reżim ujemny (białko o ujemnym dn/dc może być nadal analizowane przez SEC-MALS, jeśli dn/dc zostanie określone empirycznie, ale jeśli dn/dc = 0, intensywność światła rozproszonego przez białko będzie zerowa, a analiza MW będzie niemożliwa). Temat wartości dn/dc dla białek jest szeroko omawiany przez Zhao i wsp.35, gdzie wykazano, że w przypadku standardowych wodnych zdecydowana większość niezmodyfikowanych białek mieści się w zakresie 2-3% wartości wzorcowej (0,185 lub 0,186 ml / g przy = 660 nm), chociaż białka poniżej ~ 10 kDa są bardziej zmienne i istnieje kilka gatunków, które mogą osiągać nawet 0,21 ml / g.

Profile MW w pikach monomeru i dimerów BSA w przedstawionych danych były dość jednorodne z dokładnością do 2% lub mniej, co wskazuje na gatunki monodyspersyjne. Niejednorodne wartości MW w całym szczycie mogą wynikać z niejednorodności lub niewłaściwej analizy. W szczególności profil BSA MW, który jest wklęsły ("uśmiech") lub wypukły ("grymas") może wynikać z nieprawidłowego zastosowania korekcji poszerzenia pasma. W przypadku innych białek profil wypukły może również wynikać z dynamicznej równowagi między monomerami i oligomerami, gdzie stosunek monomeru do oligomeru - a tym samym pozorna wartość MW - zależy od stężenia piku (BSA nie wykazuje tego zachowania i jest często używany jako próbka kontrolna w celu sprawdzenia prawidłowych parametrów poszerzenia pasma). Profil MW, który zmienia się od krawędzi czołowej do krawędzi spływu i nie zmienia się wraz ze stężeniem próbki, jest typowy dla rozkładu gatunków o masie cząsteczkowej, które są częściowo rozwiązane przez SEC. Równowagę dynamiczną można łatwo odróżnić od innych źródeł pozornie niejednorodnych rozkładów poprzez wstrzyknięcie różnych całkowitych ilości białka - rozkład będzie się zmieniał wraz z równowagą dynamiczną, ale nie z ustalonym rozkładem lub nieprawidłową korektą poszerzenia pasma.

Biorąc pod uwagę ograniczenia opisane powyżej, SEC-MALS nie nadaje się do różnych zadań. Nie nadaje się do analizy próbek surowych; Próbki powinny być dobrze oczyszczone standardowymi metodami powinowactwa i polerowania. Nie ma wystarczającej dokładności ani zdolności rozdzielczej, aby zidentyfikować mutanty i warianty białka lub mAb o tej samej lub bardzo bliskiej masie i nie może być stosowany z analitami, które nie eluują lub nie rozdzielają się na kolumnie SEC, chociaż ostatnio wykazano, że chromatografia jonowymienna lub chromatografia z odwróconymi fazami może być połączona z MALS w celu oddzielenia i scharakteryzowania gatunków, które nie są rozwiązane przez SEC^{72, Rozdział 73,74}. Tam, gdzie ilości białka są poważnie ograniczone, SEC-MALS może nie być wykonalny, ponieważ zwykle wymaga 10 - 200 μg³, a nawet więcej może być wymagane przez system FPLC z wewnętrzną średnicą rurki większą niż 0,25 mm; jednak mniejsze ilości mogą być analizowane przez UHPLC-SEC-MALS. Wysoce niestabilne białka, które agregują się po wprowadzeniu do fazy ruchomej, nie nadają się do analizy SEC-MALS, chociaż optymalizacja bufora przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła off-line może rozwiązać ten problem⁷⁵.

Pomimo dodatkowego wysiłku, jaki wiąże się z SEC-MALS, jest on nieoceniony w badaniach nad białkami i jest szeroko stosowany przez społeczności akademickie i biofarmaceutyczne. Oprócz charakterystyki monomerów, oligomerów i agregatów zgodnie z opisem w powyższym protokole, SEC-MALS może charakteryzować zmodyfikowane białka, takie jak glikoproteiny (określając MW składników białka i glikanów indywidualnie), białka błonowe rozpuszczone w środkach powierzchniowo czynnych lub lipidach (określające MW składników białka i solubilizatora indywidualnie), zespoły białek, takie jak cząstki wirusopodobne, kompleksy białko-białko i białko-kwas nukleinowy, polisacharydy, koniugaty białko-polisacharydy, peptydy i wiele innych biomakrocząsteczek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	szybki chromatograf cieczowy białek (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		Oprogramowanie sterujące FPLC
ASTRA	Wyatt Technology		Oprogramowanie do pozyskiwania i analizy danych MALS
Albumina surowicy bydlęcej (czystość >97%)	Sigma	Analit A1900
DAWN lub miniDAWN	Detektor wielokątowego rozpraszania światła (MALS)	Wyatt Technology	WH2 lub WTREOS
Zwiększ 200 10/300	GE Kolumna	wykluczająca rozmiar opieki zdrowotnej, 200 i Aring; pory, średnica wewnętrzna 10 mm, długość 300 mm
	nbsp;	71382
Filtr butelkowy NaCl Stericup klasy HPLC sulfon polieterowy 0,1 i mikro; m 1000 ml	Ruchomy filtr fazowy	Millipore	SCVPU11RE
filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10 0,02 i mikro; m	Filtr do próbek	GE Healthcare	6809-1002
Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10, 0,1 i mikro; m porów, średnica 10 mm	Filtr do próbek	GE Healthcare	6809-1012
Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 25 0,1 i mikro; m	GE Healthcare	6809-2012	mobilny filtr fazowy
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	detektor dynamicznego rozpraszania światła