Artykuł metodologiczny

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

61.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59615

⸱

20 czerwca 2019

 ,  ,  , 
1Wyatt Technology Corporation, 2Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 3Danyel Biotech Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje połączenie chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) dla absolutnej charakterystyki białek i kompleksów w roztworze. SEC-MALS określa masę cząsteczkową i wielkość czystych białek, natywnych oligomerów, heterokompleksów i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny.

Streszczenie

Analityczna chromatografia wykluczania wielkości (SEC), powszechnie używana do oznaczania masy cząsteczkowej białek i kompleksów białko-białko w roztworze, jest techniką względną, która opiera się na objętości elucji analitu w celu oszacowania masy cząsteczkowej. Gdy białko nie jest kuliste lub ulega nieidealnym interakcjom kolumnowym, krzywa kalibracyjna oparta na wzorcach białka jest nieważna, a masa cząsteczkowa określona na podstawie objętości elucji jest nieprawidłowa. Rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) to technika absolutna, która określa masę cząsteczkową analitu w roztworze na podstawie podstawowych równań fizycznych. Połączenie SEC do separacji z MALS do analizy stanowi wszechstronny, niezawodny sposób charakteryzowania roztworów jednego lub więcej gatunków białek, w tym monomerów, natywnych oligomerów lub agregatów oraz heterokompleksów. Ponieważ pomiar jest wykonywany przy każdej objętości elucji, SEC-MALS może określić, czy pik eluujący jest jednorodny czy niejednorodny i odróżnić stały rozkład masy cząsteczkowej od równowagi dynamicznej. Możliwa jest również analiza zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny lub lipoproteiny, lub koniugatów, takich jak białka błonowe rozpuszczone w detergentach. W związku z tym SEC-MALS jest kluczowym narzędziem dla chemików białek, którzy muszą potwierdzić właściwości biofizyczne i zachowanie roztworu cząsteczek wytwarzanych do badań biologicznych lub biotechnologicznych. Ten protokół dla SEC-MALS analizuje masę cząsteczkową i wielkość czystych monomerów i agregatów białkowych. Uzyskane dane służą jako podstawa do dalszych analiz SEC-MALS, w tym dotyczących kompleksów, glikoprotein i białek błonowych związanych z surfaktantami.

Wprowadzenie

Niezawodna analiza masy cząsteczkowej (MW) białek w roztworze jest niezbędna w badaniach biomolekularnych1,2,3,4. Analiza MW informuje naukowca, czy wyprodukowano właściwe białko oraz czy nadaje się ono do dalszych eksperymentów5,6. Jak opisano na stronach internetowych sieci badawczych nad białkami P4EU7 oraz ARBRE-Mobieu8, kontrola jakości białek musi charakteryzować nie tylko czystość produktu końcowego, ale także jego stan oligomeryczny, homogeniczność, tożsamość, konformację, strukturę, modyfikacje potranslacyjne i inne właściwości.

Pomiar MW w roztworze niedenaturującym pozwala zidentyfikować formę białka występującą w środowisku wodnym, tzn. czy jest ono monomerem, czy oligomerem. Podczas gdy w przypadku wielu białek celem jest uzyskanie formy monomerycznej, dla innych kluczem do aktywności biologicznej jest konkretny natywny oligomer9,10,1,12. Inne oligomery oraz agregaty nienatywne są niepożądane i prowadzą do błędów w wyznaczaniu struktury za pomocą krystalografii, rezonansu magnetycznego jądra (NMR) lub małokątnego rozpraszania promieni rentgenowskich, a także do artefaktów lub niedokładności w testach funkcjonalnych służących do ilościowego określania wiązania metodą izotermicznej kalorymetrii miareczkowania lub powierzchniowego rezonansu plazmonowego2,13.

W przypadku leków bioterapeutycznych, takich jak przeciwciała monoklonalne (mAbs), analiza MW w roztworze służy podobnemu celowi kontroli jakości i charakterystyki produktu. Nadmierna obecność agregatów i fragmentów świadczy o niestabilności produktu, co czyni go nieprzydatnym do stosowania u ludzi. Organy regulacyjne wymagają dokładnej charakterystyki nie tylko samej cząsteczki terapeutycznej, ale także potencjalnych produktów degradacji, które mogą występować w końcowym produkcie14,15,16,17.

Niektórymi z najpowszechniejszych metod analizy masy cząsteczkowej (MW) białek są elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), elektroforeza kapilarna (CE), natywna elektroforeza PAGE, spektrometria mas (MS), chromatografia wykluczania sterycznego (SEC) oraz analityczna ultrawirowanie (AUC). Spośród nich SDS-PAGE, CE i MS nie są przeprowadzane w stanie natywnym i zazwyczaj prowadzą do dysocjacji oligomerów oraz agregatów, w związku z czym nie nadają się do wyznaczania natywnego oligomeru ani do ilościowego określania agregatów. Choć natywna elektroforeza PAGE teoretycznie zachowuje stan natywny, w naszym doświadczeniu jej optymalizacja dla wielu białek jest trudna, a wyniki nie są zbyt wiarygodne. AUC, niezależnie od tego, czy opiera się na prędkości sedymentacji, czy na równowadze sedymentacyjnej, jest metodą ilościową i pozwala wyznaczyć MW na podstawie zasad podstawowych, jednak jest ona dość uciążliwa, wymagając dużego nakładu pracy ręcznej, znacznej wiedzy specjalistycznej w interpretacji danych, długiego czasu trwania eksperymentu oraz bardzo drogiego urządzenia.

Analityczna SEC jest ilościową, stosunkowo odporną i prostą metodą, która rozdziela makrocząsteczki podczas przepływu przez kolumnę z wypełnieniem. Zasady i zastosowania SEC zostały szczegółowo opisane w kilku przeglądach literatury18,19,20 oraz w podręczniku „Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods”21. Różnice w retencji wynikają z różnego czasu dyfuzji cząsteczek do porów fazy stacjonarnej i z powrotem przed ich wymyciem z końca kolumny. Różnice te wynikają (nominalnie) z wzglbowych rozmiarów oraz współczynników dyfuzji cząsteczek2. Krzywa kalibracyjna jest konstruowana przy użyciu serii cząsteczek referencyjnych, wiążąc masę cząsteczkową (MW) cząsteczki z objętością elucji. W przypadku białek jako cząsteczki referencyjne stosuje się zazwyczaj stabilne białka globularne, które nie oddziałują z kolumną poprzez ładunek lub hydrofobowe reszty powierzchniowe. Objętość elucji mierzy się za pomocą detektora absorbancji w ultrafiolecie (UV). Jeśli znany jest współczynnik ekstynkcji UV – często obliczany na podstawie sekwencji – można również wyznaczyć całkowitą masę piku białka.

Warto zauważyć, że analiza MW za pomocą SEC opiera się na dwóch kluczowych założeniach dotyczących charakteryzowanych białek: 1) posiadają one tę samą konformację i objętość właściwą co standardy referencyjne (innymi słowy, ten sam związek między właściwościami dyfuzyjnymi a MW) oraz 2) podobnie jak standardy referencyjne, nie wchodzą one w interakcje z kolumną poza właściwościami sterycznymi – nie przylegają do wypełnienia kolumny poprzez oddziaływania elektrostatyczne lub hydrofobowe. Odstępstwa od tych założeń unieważniają krzywą kalibracyjną i prowadzą do błędnego wyznaczania MW. Ma to miejsce w przypadku białek wewnętrznie nieuporządkowanych, które mają duże promienie Stokesa ze względu na rozległe obszary nieustrukturyzowane23,24 lub niesferycznych/liniowych kompleksów oligomerycznych10. Białka glikozylowane zazwyczaj mają większy promień Stokesa niż forma nieglikozylowana, nawet przy uwzględnieniu dodanej masy węglowodanów19. Białka błonowe solubilizowane detergentami eluują inaczej niż białka kalibracyjne, ponieważ ich elucja w SEC zależy od całkowitej wielkości kompleksu polipeptyd-detergent-lipidy, a nie od stanu oligomerycznego i masy molowej białka25,26. Chemia kolumny, pH oraz warunki zasolenia wpływają na objętości elucji białek z naładowanymi lub hydrofobowymi resztami powierzchniowymi27,28.

SEC staje się znacznie bardziej wszechstronny i niezawodny w określaniu MW, gdy jest połączony z detektorami wielkątnego rozpraszania światła (MALS) i różnicowego współczynnika załamania (dRI)3,4,1,29,30,31,32. Detektor dRI określa stężenie na podstawie zmiany współczynnika załamania roztworu spowodowanej obecnością analizatu. Detektor MALS mierzy proporcję światła rozpraszanego przez analizat pod wieloma kątami w stosunku do padającej wiązki lasera. Ta konfiguracja aparatury, znana jako SEC-MALS, pozwala wyznaczyć MW niezależnie od czasu elucji, ponieważ MW można obliczyć bezpośrednio z zasad pierwszych, korzystając z równania 1,

Wzór na wyznaczanie masy cząsteczkowej, M=R(0)/Kc(dn/dc)^2, równanie do analizy polimerów.  (1)

gdzie M to masa cząsteczkowa analizatu, R(0) to zredukowany stosunek Rayleigha (tj. ilość światła rozproszonego przez analizat w stosunku do natężenia lasera) wyznaczony przez detektor MALS i ekstrapolowany do kąta zero, c to stężenie masowe wyznaczone przez detektor UV lub dRI, dn/dc to przyrost współczynnika załamania analizatu (w istocie różnica między współczynnikiem załamania analizatu a buforu), a K to stała optyczna zależna od właściwości układu, takich jak długość fali i współczynnik załamania rozpuszczalnika29.

W metodzie SEC-MALS kolumna SEC służy wyłącznie do rozdzielenia poszczególnych form w roztworze, aby mogły one pojedynczo trafiać do cel detektora MALS i detektora stężenia. Rzeczywisty czas retencji nie ma znaczenia dla analizy, poza stopniem, w jakim pozwala on na rozdzielenie form białkowych. Instrumenty są kalibrowane niezależnie od kolumny i nie opierają się na standardach referencyjnych. W związku z tym SEC-MALS jest uważana za metodę „bezwzględną” wyznaczania MW na podstawie podstawowych równań fizycznych. Jeśli próbka jest heterogenna i nie została całkowicie rozdzielona przez kolumnę, wartość podana dla każdego objętości elucji będzie średnią wagową cząsteczek w każdej objętości elucji przepływającej przez cel pomiarową w danym przedziale czasowym, wynoszącym około 75 μL.

Dzięki analizie zmienności kątowej intensywności rozpraszania, MALS może również określić rozmiar (promień żyzności, Rg) makrocząsteczek i nanocząsteczek o promieniu geometrycznym większym niż około 12,5 nm29. W przypadku mniejszych cząsteczek, takich jak białka monomeryczne i oligomery, do urządzenia MALS można dodać moduł dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w celu pomiaru promieni hydrodynamicznych od 0,5 nm wzwyż3.

Choć analiza stężenia metodą UV lub dRI może dostarczyć wartości c w równaniu 1, preferowane jest użycie dRI z dwóch powodów: 1) dRI jest uniwersalnym detektorem stężenia, odpowiednim do analizy cząsteczek takich jak cukry lub polisacharydy, które nie zawierają chromoforu UV34; oraz 2) odpowiedź stężeniowa dn/dc niemal wszystkich czystych białek w buforze wodnym jest taka sama z dokładnością do jednego lub dwóch procent (0.185 mL/g)35, zatem nie ma potrzeby znania współczynnika ekstynkcji UV.

Zastosowanie SEC-MALS w badaniach białek jest bardzo szerokie. Do najczęstszych zastosowań należy ustalanie, czy oczyszczone białko występuje w formie monomeru czy oligomeru, określanie stopnia oligomeryzacji oraz ocena agregacji3,10,1,17,31,36,37,38. Szczególnie ceniona jest możliwość prowadzenia takich analiz dla białek błonowych solubilizowanych detergentami, których nie można scharakteryzować tradycyjnymi metodami; opublikowano już szczegółowe protokoły dla tego typu badań31,39,40,41,42,43. Inne powszechne zastosowania obejmują ustalanie stopnia modyfikacji potranslacyjnych oraz polidyspersyjności glikoprotein, lipoprotein i podobnych koniugatów4,31,4,45,46,47; badanie formowania się (lub jego braku) oraz absolutnej stechiometrii (w przeciwieństwie do stosunku stechiometrycznego) heterokompleksów, w tym kompleksów białko-białko, białko-kwas nukleikowy oraz białko-polisacharyd24,46,48,49,50,51,52; wyznaczanie stałej dysocjacji równowagi monomer-dimer49,53,54; a także ocena konformacji białek5,56. Poza białkami, SEC-MALS jest nieoceniony w charakterystyce peptydów57,58, szeroko heterogenicznych polimerów naturalnych, takich jak heparyny59 i chitosan60,61, małych wirusów62 oraz większości rodzajów polimerów syntetycznych lub przetworzonych63,64,65,6. Obszerna bibliografia dostępna jest w literaturze przedmiotu67 oraz online (pod adresem http://www.wyatt.com/bibliography).

W niniejszym materiale przedstawiamy standardowy protokół przeprowadzania i analizy eksperymentu SEC-MALS. Jako przykład rozdziału i charakterystyki monomerów oraz oligomerów białek posłużyła albumina surowicy bydlęcej (BSA). Protokół z użyciem BSA pozwala wyznaczyć określone stałe systemu, które stanowią podstawę do dalszych analiz SEC-MALS, w tym badań kompleksów, glikoprotein i białek błonowych związanych z surfaktantem.

Zauważamy, że metodę SEC-MALS można przeprowadzić przy użyciu standardowego sprzętu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) wielu producentów. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu FPLC powszechnie spotykanego w laboratoriach zajmujących się produkcją białek na potrzeby badań i rozwoju (patrz Tabela materiałów). Przed rozpoczęciem protokołu należy zainstalować system FPLC oraz detektory MALS i dRI, wraz z odpowiednimi pakietami oprogramowania do sterowania, akwizycji i analizy danych, zgodnie z instrukcjami producentów; w oprogramowaniu należy wprowadzić wszelkie wymagane stałe kalibracyjne lub inne ustawienia. Pomiędzy pompą a injektorem należy umieścić filtr przepływowy z hydrophiliczną, 0.1 µm Zainstalowano membranę porowatą.

Protokół

1. Przygotowanie systemu

  1. Podłącz detektory MALS i dRI za detektorem UV FPLC. Pomiń detektory pH i przewodności, ponieważ dodadzą one znaczną objętość między detektorami UV i MALS. Użyć rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,25 mm od kolumny do detektorów i między nimi oraz rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,75 mm na wyjściu detektorów do kolektora odpadów lub frakcji.
  2. Upewnij się, że zostały ustanowione niezbędne połączenia sygnałowe między FPLC a detektorami, w tym wyjście analogowe z detektora UV do wejścia analogowego MALS oraz wyjście cyfrowe z FPLC do automatycznego wstrzykiwania MALS za pośrednictwem skrzynki I/O FPLC.
  3. Zainstalować odpowiednią kolumnę analityczną SEC obejmującą zakres frakcjonowania od co najmniej 20 kDa do 500 kDa. Sprawdź informacje o produkcie, aby określić, czy kolumna jest odpowiednia dla zakresu MW, pH i innych właściwości próbki i fazy ruchomej.

2. Przygotowanie bufora, płukanie systemu przez noc i sprawdzenie czystości

  1. Używając odczynników klasy HPLC, przygotuj 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 50 - 100 mM NaCl. Przefiltrować bufor do 0,1 μm za pomocą filtra polieterowo-sulfonowego lub podobnego filtra w butelce. Przefiltruj pierwsze 50-100 ml buforu do butelki na odpady i wyrzuć, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów, a następnie przefiltruj resztę do czystej, sterylnej butelki, która została dokładnie umyta przefiltrowaną, zdejonizowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
    UWAGA: Inne rozpuszczalniki fazy ruchomej, takie jak bufor Tris, mogą być stosowane, jeśli mają być analizowane dodatkowe białka, które są preferencyjnie rozpuszczone w tych rozpuszczalnikach.
  2. Przepłukiwać przez noc z natężeniem przepływu 0,5 ml/min lub w inny sposób zalecany przez producenta kolumny, aby zrównoważyć kolumnę w buforze i usunąć cząstki stałe. Użyj trybu ciągłego przepływu FPLC i upewnij się, że przepływ nie zatrzyma się, dopóki wszystkie przebiegi SEC-MALS nie zostaną zakończone.
    1. Umieść celę przepływową dRI w trybie przedmuchiwania podczas płukania przez noc. Wyłącz przedmuchiwanie przed rozpoczęciem próbnych przebiegów.
    2. Rozpoczynając płukanie, stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, aby zapobiec efektowi "zrzucania kolumny" (lub uwalnianiu cząstek) spowodowanemu nagłą zmianą ciśnienia w kolumnie.
    3. Jeśli wiadomo, że system jest dość stabilny i wolny od cząstek stałych oraz znajduje się w równowadze z pożądaną fazą ruchomą, należy wymienić spłukiwanie nocne na krótsze, trwające 2-3 godziny.
  3. Sprawdź czystość systemu, lekko stukając w rurkę za kolumną, aby uwolnić nagromadzone cząstki i obserwując sygnał w detektorze 90° na wyświetlaczu na panelu przednim przyrządu MALS. Sprawdź, czy szum międzyszczytowy nie przekracza 50 -100 μV.
  4. Wykonać "ślepą" próbę wstrzyknięcia, aby sprawdzić, czy wtryskiwacz jest oczyszczony z cząstek stałych. "Ślepa próba" to po prostu bufor do biegania, przygotowany w świeżej, sterylnej fiolce.
    1. Jeśli pik cząstek nie przekracza objętości 1 ml i nie przekracza 5 mV powyżej linii podstawowej, oznacza to, że system jest gotowy do pobrania próbek. W przeciwnym razie wykonaj dodatkowe ślepe wstrzyknięcia, aż do wyczyszczenia, lub przeprowadź konserwację w celu wyczyszczenia wtryskiwacza.

3. Przygotowanie i załadunek próbki

  1. Przygotować co najmniej 200 μl BSA w stężeniu 1-2 mg/ml w buforze SEC.
    UWAGA: Aby zapobiec wytrącaniu się osadów, BSA nigdy nie należy rozpuszczać w czystej wodzie.
  2. Przefiltruj białko do 0,02 μm za pomocą filtra z końcówką strzykawki.
  3. Wyrzuć kilka pierwszych kropli filtratu, aby wyeliminować cząstki z suchych filtrów.
  4. Alternatywnie, należy odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 15 minut, aby umożliwić wytrącanie nierozpuszczalnych agregatów i innych dużych cząstek.
  5. Wstrzyknąć 100 μl roztworu BSA do pętli.
    UWAGA: Jest to zalecana ilość materiału i może być wstrzykiwana mniej więcej w zależności od okoliczności próbki, takich jak stabilność lub dostępność. Ilość białka wymagana na wstrzyknięcie zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do masy cząsteczkowej - dwa razy więcej masy białka jest potrzebne, jeśli masa cząsteczkowa wynosi 33 kDa, czyli o połowę mniejsza niż BSA.

4. Przygotowanie oprogramowania MALS

  1. Otwórz nowy | Eksperymentuj z metody w menu oprogramowania MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła. Jeśli detektor DLS jest obecny, wybierz metodę Online z menu Rozpraszanie światła | Z folderem QELS.
  2. W sekcji Konfiguracja ustaw parametry próbki i fazy ruchomej.
    1. W widoku Pompa ogólna ustaw natężenie przepływu na używane w FPLC.
    2. W widoku Pompa ogólna, w polu Solvent branch, Name (Nazwa) wybierz PBS.
    3. W widoku Wtryskiwacz, gałąź Próbka, wprowadź nazwę jako BSA i ustaw dn/dc = 0,185 (standardowa wartość dla niezmodyfikowanych białek), A2 = 0 i współczynnik ekstynkcji UV = 0,667 ml / (mg-cm).
      UWAGA: W przypadku innych białek współczynnik ekstynkcji UV280 nm można znaleźć w literaturze lub obliczyć na podstawie jego sekwencji przy użyciu różnych narzędzi oprogramowania z domeny publicznej.
  3. W sekcji Procedury, w widoku Kolekcja podstawowa, zaznacz pole wyboru Wyzwalaj przy automatycznym wstrzykiwaniu i ustaw czas trwania przebiegu na 70 minut, aby dane były zbierane dla całej elucji, aż do osiągnięcia całkowitej objętości przenikania kolumny SEC.
    UWAGA: Niezbędny czas może się różnić w zależności od kolumny i natężenia przepływu - w przypadku standardowej kolumny HPLC-SEC o wymiarach 7,8 mm x 300 mm przy 0,5 ml/min wymagane jest 35 minut zbierania.
  4. Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom. Odczyt danych rozpocznie się po odebraniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.
  5. Wyzeruj sygnał dRI, klikając przycisk Autozero na panelu przednim przyrządu.

5. Przygotowanie oprogramowania FPLC

  1. Wstaw nazwę białka i przebieg w oprogramowaniu FPLC, w Podręczniku | Wykonywanie instrukcji ręcznych | Ustaw znak.
  2. Przełącz zawór wtryskowy z obciążenia ręcznego na Wtrysk w ścieżce przepływu | Zawór wtryskowy.
  3. Dołączanie sygnału impulsowego poprzez włożenie impulsu 0,5 s pod skrzynkę we/wy | Wyjście cyfrowe impulsu. Spowoduje to rozpoczęcie zbierania danych w oprogramowaniu MALS.

6. Wstrzyknij próbkę do pętli. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj) w oprogramowaniu FPLC, aby rozpocząć przebieg eksperymentu.

7.Analiza danych SEC-MALS BSA

  1. Wykonaj analizę krok po kroku w sekcji Procedury w oprogramowaniu MALS.
    1. Sprawdź, czy piki pojawiają się w przybliżeniu przy tej samej objętości elucji w UV, MALS i RI, sprawdzając widok Kolekcja podstawowa.
    2. W widoku Linia bazowa zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów (wszystkie detektory LS, UV i dRI). Linie podstawowe powinny być zdefiniowane w taki sposób, aby wskazywały poziom czystego rozpuszczalnika, najlepiej rozciągając się z jednej strony pików próbki na drugą.
    3. W widoku Szczyty zdefiniuj szczyty, które mają być analizowane, klikając i przeciągając myszą. Wybierz środkowe 50% każdego szczytu. Najpierw wybierz pik monomeru ("Szczyt 1"), a następnie pik dimera ("Szczyt 2"). Sprawdź poprawność wartości dn/dc = 0,185 i współczynnik ekstynkcji UV 280 nm = 0,667 dla BSA pod każdym pikiem.
  2. Wykonaj procedury wyrównywania pików, korekcji poszerzenia pasma i normalizacji.
    UWAGA: Zwykle metoda SEC-MALS jest okresowo kalibrowana pod kątem wyrównania pików, poszerzenia pasma i normalizacji detektorów kątowych do detektora 90° przy użyciu białka monodyspersyjnego o promieniu bezwładności Rg < 10 nm, takiego jak monomer BSA. W tym przykładzie BSA służy zarówno jako cząsteczka kalibracyjna, jak i sama jest przedmiotem analizy MW.
    1. W sekcji Procedury | Wyrównanie view, wybierz środkowy region szczytów, klikając i przeciągając myszą, kliknij Wyrównaj sygnały, a następnie OK.
    2. W sekcji Procedury | Poszerzenie pasma, wybierz środkowe 50% piku monomeru. Upewnij się, że detektor RI jest określony jako instrument odniesienia, a następnie kliknij przycisk Wykonaj dopasowanie i zastosuj, aby dopasować sygnały UV i LS do sygnału RI.
      1. Powiększ szczyty, aby sprawdzić, czy nakładają się one bardzo ściśle w środkowym obszarze 50–70%, a następnie kliknij przycisk OK.
      2. Jeśli zakładka nie jest idealna, (może być konieczne) wykonaj dopasowanie i "Zastosuj" jeszcze raz lub dwa razy, aż zakładka będzie idealna.
    3. W sekcji Procedury | Normalizacja view, wybierz Szczyt 1, wprowadź 3,0 nm jako wartość Rg, kliknij Normalizuj, a następnie OK.
    4. W sekcji Procedury | Masa molowa i Rg z widoku MALS, przejrzyj dane, aby określić, które kąty detekcji, jeśli w ogóle, powinny zostać odznaczone z analizy z powodu nadmiernego szumu. Zazwyczaj będą to dolne kąty, w które cząsteczki pyłu rozpraszają się ze stosunkowo dużą intensywnością. Wybierz poszczególne wycinki w obrębie pików z wykresu po prawej stronie i wyświetl zależność kątową odwrotnego zredukowanego współczynnika Rayleigha na wykresie po lewej stronie. Jeśli najniższe (a czasem najwyższe) kąty stale znacznie odbiegają od pasowania, usuń ich zaznaczenie z listy u dołu widoku.
  3. Wyświetl wykres wyników w widoku Wykres EASI. Wybierz Masę molową z listy rozwijanej Wyświetlanie w górnej części okna. Użyj Ctrl + kliknięcie i przeciągnij, aby powiększyć obszar szczytu.
  4. Zobacz końcowe tabelaryczne wyniki średniej wagowo-masowej masy molowej dla pików monomerów i dimerów w sekcji Wyniki | Widok raportu (podsumowania) w obszarze Szczytowe wyniki | Momenty masy molowej (g/mol) | Mw. Czystość jest podawana w obszarze Wyniki szczytowe | Ułamek masowy (%).
    UWAGA: Pokazane są również inne momenty masy molowej; Są one zwykle istotne dla heterogenicznych polimerów, ale nie dla białek o dyskretnych rozmiarach. W raporcie można uwzględnić wiele innych wyników uzyskanych przez oprogramowanie, takich jak procentowy odzysk masy (frakcja białka, która wymywała się przez detektor stężeń w stosunku do ilości wstrzykniętego), statystyki pików, polidyspersyjność, momenty Rg i Rh itp. Miary niepewności, o ile są podane, odzwierciedlają precyzję podanej wartości w oparciu o szum w serii pomiarów i nie powinny być uznawane za reprezentujące dokładność. Rzeczywista dokładność podawanych wartości zależy od różnych czynników, takich jak dokładność podanych wartości dn/dc i współczynnika ekstynkcji, kalibracja przyrządu itp.
  5. Z menu Plik wybierz opcję Zapisz jako metodę i zapisz analizowane dane BSA jako standardową metodę do przyszłych pomiarów wszystkich typów białek. Parametry normalizacji i poszerzenia pasma wyznaczone dla BSA zostaną przeniesione do analizy.

Wyniki

Rysunek 1a,b pokazują, że trzy formy oligomeryczne BSA: monomer, dimer i trimer, zostały dobrze rozdzielone na kolumnie z porami 20 Å z rozdzielczością linii podstawowej dla monomeru i dimeru, podczas gdy Rysunek 2a pokazuje, że rozdzielenie na kolumnie z porami 75 Å nie pozwoliło na uzyskanie dobrej rozdzielczości między monomerem a dimerem. Ten drugi przykład został zamieszczony w celu zilustrowania „słabego” wyniku; różnice w rozdzieleniu dla tych dwóch kolumn mogą w rzeczywistości być spodziewane zgodnie z zakresami rozdzielania podanymi przez producenta. Trimer nie jest w pełni oddzielony od dimeru, a wyższe oligomery nie są dobrze rozdzielone od trimeru ani od siebie nawzajem. Rysunek 2b przedstawia przykład zaszumionego sygnału rozpraszania światła z cząstkami obecnymi w całym chromatogramie, co uniemożliwia dokładne oznaczenie MW.

W dalszej części skupiamy się na Rysunku 1b. Monomer, który eluował w 13,8 min, wykazuje średnią masę molową Mw wynoszącą 64,1 ± 0,4 kDa wyznaczoną metodą MALS oraz promień hydrodynamiczny Rh wynoszący 3,54 ± 0,01 nm. Wyniki te są zgodne z masą sekwencyjną i znanym promieniem hydrodynamicznym BSA, odpowiednio 66,4 kDa i 3,5 nm68, w granicach typowej dokładności metody SEC-MALS, wynoszącej 5%3,69. Dimer, który eluował w 12 min, wykazał wartość Mw wynoszącą 127 ± 1 kDa wyznaczoną metodą MALS – co było spodziewane, gdyż jest to dwukrotność masy monomeru w granicach precyzji eksperymentalnej – oraz Rh wynoszący 5,68 ± 0,06 nm. Zaobserwowano również pik trimeru w 1 min z wartością Mw wynoszącą 194 ± 9 kDa wyznaczoną metodą MALS, co zgodnie z oczekiwaniami stanowi trzykrotność masy monomeru w granicach precyzji eksperymentalnej. Wartości Rh trimeru nie udało się wyznaczyć ze względu na niską intensywność sygnału DLS.

Wartości masy molowej obliczone w obrębie piku monomeru są jednolite w zakresie 2-5%, co wskazuje na homogeniczność. Niezwykłe jest stwierdzenie śladu ramienia z masą molową w zakresie 38-50 kDa, odpowiadającego fragmentom BSA70. Wartości masy molowej w obrębie pików dimeru i trimeru nie są jednolite, co świadczy o heterogeniczności. Pik dimeru jest nieco heterogeniczny ze względu na ślady trimeru przenikające do piku dimeru, natomiast pik trimeru jest heterogeniczny z powodu współelucji słabo rozdzielonych wyższych oligomerów.

Poziom sygnału do szumu dla piku monomeru jest w pełni akceptowalny we wszystkich trzech sygnałach i wynosi powyżej 10:1, podobnie jak w przypadku piku dimeru, gdzie stosunek sygnału do szumu wynosi 40:1. Obszary chromatogramu poza pikami białek są płaskie, z wyjątkiem piku spowodowanego obecnością cząstek w pobliżu objętości całkowitego wykluczenia (objętości martwej) w śladzie LS oraz (dodatniego) piku soli i (ujemnego) piku rozpuszczonego powietrza w śladzie dRI, w pobliżu objętości całkowitej przenikalności. Zostały one wskazane na Ryc. 1a.

Poziom czystości można obliczyć również w eksperymencie SEC-MALS: ułamek masowy piku monomeru w raporcie reprezentuje procent czystości formy monomerycznej. Dla monomeru BSA obliczona czystość wynosi 88%.

Schemat analizy danych chromatografii wykluczania rozmiarów przedstawiający piki analitów, masę molową w funkcji czasu elucji.
Rysunek 1Analiza SEC-MALS albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z wykorzystaniem kolumny do chromatografii wykluczania z porami o rozmiarze 20 Å. Przebiegi chromatogramów zostały znormalizowane do piku monomeru i przesunięte w celu zwiększenia przejrzystości.AWskazano typowe artefakty, które można zignorować, w tym piky cząsteczkowe w pobliżu początku sygnału rozpraszania światła, a także piki soli i rozpuszczonego powietrza w pobliżu całkowitej objętości przenikania w sygnale współczynnika refrakcji.B) Chromatogram wykazuje doskonały rozdział monomeru, dimeru i trimeru, a sygnał rozpraszania światła charakteryzuje się wysokim stosunkiem sygnału do szumu. Wartości masy cząsteczkowej (MW) monomeru i dimeru wykazują wysoką homogeniczność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykres chromatografii wykluczania; rozdział monomerów, detekcja LS/UV/RI, analiza masy molowej.
Rycina 2Przykłady analiz SEC-MALS o niskiej jakości. Ślady chromatogramów zostały znormalizowane do piku monomeru i przesunięte dla przejrzystości.A) Niewystarczająca separacja na kolumnie do chromatografii wykluczania z rozmiarem porów 75 Å; pik cząsteczek w czasie od 8 do 9 min nie jest dobrze oddzielony od białek.B) W sygnale rozpraszania światła (LS) widoczny jest niewystarczający stosunek sygnału do szumu oraz obecność licznych cząsteczek w sąsiedztwie białek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Eksperyment SEC-MALS dostarczył dobrej separacji monomerów, dimerów i trimerów oraz wyników ilościowych dla mas molowych i rozmiarów hydrodynamicznych każdego piku. To z kolei wyraźnie identyfikuje i charakteryzuje każdy obecny gatunek, a także określa ilościowo czystość. Zazwyczaj uzyskane wyniki są dokładne z dokładnością do 5%, a precyzyjne i powtarzalne z dokładnością do 1-2%3,69. Ten poziom precyzji i powtarzalności umożliwia pewne rozróżnienie gatunków, które mogą być zbliżone pod względem MW, o ile są oddzielone przez SEC (mogą częściowo nakładać się w obrębie tego samego piku). Korzyści dla kontroli jakości białek i podstawowej charakterystyki biofizycznej są oczywiste.

Weryfikacja braku cząstek stałych jest bardzo ważna dla czułych, powtarzalnych pomiarów SEC-MALS. Piki cząstek zazwyczaj pojawiają się jako duże sygnały MALS, którym nie towarzyszą porównywalne sygnały UV lub RI. Faza ruchoma i próbka powinny być starannie przygotowane w celu wyeliminowania takich cząstek. Zaleca się stosowanie odczynników klasy HPLC lub lepszych, filtrację fazy ruchomej i bufor rozcieńczający do 0,1 - 0,2 μm (wstępne mycie filtra w celu wyeliminowania cząstek, które są zawsze obecne na suchych membranach), konserwację ekstra czystych butelek z fazą ruchomą i innych naczyń szklanych do SEC-MALS oraz przedłużoną równowagę kolumny pod przepływem (w celu usunięcia cząstek stałych i kruszyw, które mogły się nagromadzić, gdy przepływ został zatrzymany lub kolumna nie była używana). Próbka powinna być filtrowana do najmniejszego rozmiaru porów, który nie usuwa interesującego go materiału, zwykle nie większego niż 0,1 μm i, jeśli to możliwe, 0,02 μm. Jeśli filtr szybko się zapcha, próbkę można odwirować, przefiltrować w etapach zmniejszającej się wielkości porów i/lub ponownie oczyścić. Gdy systemy są konsekwentnie utrzymywane z wysokiej jakości, świeżą i przefiltrowaną fazą ruchomą, zapobiega się wstrząsom kolumny, próbki są czyste i nie przylegają do kolumny, pomiary nie będą wykazywały wspomnianego wcześniej hałasu cząstek stałych i dostarczą danych wysokiej jakości.

MALS jest niezależny od typowych SEC dla białek; Wiele innych systemów buforowych oprócz PBS może być stosowanych w celu optymalizacji separacji i stabilności, w tym różnych substancji pomocniczych71. MALS jest również niezależny od konkretnej kolumny, którą należy wybrać w celu optymalnego oddzielenia i odzysku. Głównymi problemami dotyczącymi substancji pomocniczych w analizie są znaczące zmiany współczynnika załamania światła, prowadzące do modyfikacji przyrostu specyficznego współczynnika załamania światła dn/dc oraz substancje pomocnicze, które absorbują 280 nm, gdy potrzebna jest analiza UV. Na przykład arginina jest powszechną substancją pomocniczą redukującą agregację, która może dramatycznie wpłynąć na dn/dc typowego białka, nawet wprowadzając je w reżim ujemny (białko o ujemnym dn/dc może być nadal analizowane przez SEC-MALS, jeśli dn/dc zostanie określone empirycznie, ale jeśli dn/dc = 0, intensywność światła rozproszonego przez białko będzie zerowa, a analiza MW będzie niemożliwa). Temat wartości dn/dc dla białek jest szeroko omawiany przez Zhao i wsp.35, gdzie wykazano, że w przypadku standardowych wodnych zdecydowana większość niezmodyfikowanych białek mieści się w zakresie 2-3% wartości wzorcowej (0,185 lub 0,186 ml / g przy = 660 nm), chociaż białka poniżej ~ 10 kDa są bardziej zmienne i istnieje kilka gatunków, które mogą osiągać nawet 0,21 ml / g.

Profile MW w pikach monomeru i dimerów BSA w przedstawionych danych były dość jednorodne z dokładnością do 2% lub mniej, co wskazuje na gatunki monodyspersyjne. Niejednorodne wartości MW w całym szczycie mogą wynikać z niejednorodności lub niewłaściwej analizy. W szczególności profil BSA MW, który jest wklęsły ("uśmiech") lub wypukły ("grymas") może wynikać z nieprawidłowego zastosowania korekcji poszerzenia pasma. W przypadku innych białek profil wypukły może również wynikać z dynamicznej równowagi między monomerami i oligomerami, gdzie stosunek monomeru do oligomeru - a tym samym pozorna wartość MW - zależy od stężenia piku (BSA nie wykazuje tego zachowania i jest często używany jako próbka kontrolna w celu sprawdzenia prawidłowych parametrów poszerzenia pasma). Profil MW, który zmienia się od krawędzi czołowej do krawędzi spływu i nie zmienia się wraz ze stężeniem próbki, jest typowy dla rozkładu gatunków o masie cząsteczkowej, które są częściowo rozwiązane przez SEC. Równowagę dynamiczną można łatwo odróżnić od innych źródeł pozornie niejednorodnych rozkładów poprzez wstrzyknięcie różnych całkowitych ilości białka - rozkład będzie się zmieniał wraz z równowagą dynamiczną, ale nie z ustalonym rozkładem lub nieprawidłową korektą poszerzenia pasma.

Biorąc pod uwagę ograniczenia opisane powyżej, SEC-MALS nie nadaje się do różnych zadań. Nie nadaje się do analizy próbek surowych; Próbki powinny być dobrze oczyszczone standardowymi metodami powinowactwa i polerowania. Nie ma wystarczającej dokładności ani zdolności rozdzielczej, aby zidentyfikować mutanty i warianty białka lub mAb o tej samej lub bardzo bliskiej masie i nie może być stosowany z analitami, które nie eluują lub nie rozdzielają się na kolumnie SEC, chociaż ostatnio wykazano, że chromatografia jonowymienna lub chromatografia z odwróconymi fazami może być połączona z MALS w celu oddzielenia i scharakteryzowania gatunków, które nie są rozwiązane przez SEC72, Rozdział 73,74. Tam, gdzie ilości białka są poważnie ograniczone, SEC-MALS może nie być wykonalny, ponieważ zwykle wymaga 10 - 200 μg3, a nawet więcej może być wymagane przez system FPLC z wewnętrzną średnicą rurki większą niż 0,25 mm; jednak mniejsze ilości mogą być analizowane przez UHPLC-SEC-MALS. Wysoce niestabilne białka, które agregują się po wprowadzeniu do fazy ruchomej, nie nadają się do analizy SEC-MALS, chociaż optymalizacja bufora przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła off-line może rozwiązać ten problem75.

Pomimo dodatkowego wysiłku, jaki wiąże się z SEC-MALS, jest on nieoceniony w badaniach nad białkami i jest szeroko stosowany przez społeczności akademickie i biofarmaceutyczne. Oprócz charakterystyki monomerów, oligomerów i agregatów zgodnie z opisem w powyższym protokole, SEC-MALS może charakteryzować zmodyfikowane białka, takie jak glikoproteiny (określając MW składników białka i glikanów indywidualnie), białka błonowe rozpuszczone w środkach powierzchniowo czynnych lub lipidach (określające MW składników białka i solubilizatora indywidualnie), zespoły białek, takie jak cząstki wirusopodobne, kompleksy białko-białko i białko-kwas nukleinowy, polisacharydy, koniugaty białko-polisacharydy, peptydy i wiele innych biomakrocząsteczek.

Oświadczenia

DS jest pracownikiem firmy Wyatt Technology Corporation, której produkty MALS są wykorzystywane w tym protokole. AT jest pracownikiem firmy Danyel Biotech, dystrybutora instrumentów Wyatt MALS i AKTA FPLC.

Podziękowania

Dziękujemy dr Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Hebrew University) za rady i współpracę. Dziękujemy również firmie Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Izrael) za pomoc i stworzenie analitycznego systemu FPLC-MALS wykorzystanego w tym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AKTA pureGE Healthcare29-0182-26szybki chromatograf cieczowy białek (FPLC) 
AKTA UNICORNGE HealthcareOprogramowanie sterujące FPLC
ASTRAWyatt TechnologyOprogramowanie do pozyskiwania i analizy danych MALS
Albumina surowicy bydlęcej (czystość >97%)Sigma Analit A1900
DAWN lub miniDAWNDetektor wielokątowego rozpraszania światła (MALS)Wyatt TechnologyWH2 lub WTREOS
Zwiększ 200 10/300GE Kolumnawykluczająca rozmiar opieki zdrowotnej, 200 i Aring; pory, średnica wewnętrzna 10 mm, długość 300 mm
nbsp;71382
Filtr butelkowy NaCl Stericup klasy HPLC sulfon polieterowy 0,1 i mikro; m 1000 ml Ruchomy filtr fazowyMilliporeSCVPU11RE
filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10 0,02 i mikro; mFiltr do próbekGE Healthcare6809-1002
Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10, 0,1 i mikro; m porów, średnica 10 mmFiltr do próbekGE Healthcare6809-1012
Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 25 0,1 i mikro; mGE Healthcare6809-2012mobilny filtr fazowy
WyattQELSWyatt TechnologyWIQdetektor dynamicznego rozpraszania światła
Wyatt Technology Optilab Wyatt Technology Detektor różnicowego indeksu refrakcji (RI) WTREX Chlorek sodu NaCl Sigma&

Bibliografia

  1. Acton, T. B., et al. Robotic cloning and Protein Production Platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Methods in Enzymology. 394, 210-243 (2005).
  2. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 493, 21-60 (2011).
  3. Folta-Stogniew, E., Williams, K. R. Determination of molecular masses of proteins in solution: Implementation of an HPLC size exclusion chromatography and laser light scattering service in a core laboratory. Journal of Biomolecular Technology. 10 (2), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19499008 51-63 (1999).
  4. Kendrick, B. S., Kerwin, B. A., Chang, B. S., Philo, J. S. Online size-exclusion high-performance liquid chromatography light scattering and differential refractometry methods to determine degree of polymer conjugation to proteins and protein-protein or protein-ligand association states. Analytical Biochemistry. 299 (2), 136-146 (2001).
  5. Hughes, C. S., Longo, E., Phillips-Jones, M. K., Hussain, R. Quality control and biophysical characterisation data of. Data Brief. 14, 41-47 (2017).
  6. Muthurajan, U., et al. In Vitro Chromatin Assembly: Strategies and Quality Control. Methods in Enzymology. 573, 3-41 (2016).
  7. P4EU. Protein Quality Standard PQS. , https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs (2019).
  8. Arbre Mobieu. Guidelines on Protein Quality Control. , https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control/ (2019).
  9. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  10. Bowman, G. R., et al. Oligomerization and higher-order assembly contribute to sub-cellular localization of a bacterial scaffold. Molecular Microbiology. 90 (4), 776-795 (2013).
  11. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, 97-112 (2006).
  12. Vieux, E. F., Wohlever, M. L., Chen, J. Z., Sauer, R. T., Baker, T. A. Distinct quaternary structures of the AAA+ Lon protease control substrate degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), E2002-E2008 (2013).
  13. Group, N.S.. use of SEC-MALS in crystallization QC. , http://www.nesg.org/documents/protein_aggregation_screening.pdf (2018).
  14. Ahrer, K., Buchacher, A., Iberer, G., Josic, D., Jungbauer, A. Analysis of aggregates of human immunoglobulin G using size-exclusion chromatography, static and dynamic light scattering. Journal of Chromatography A. 1009 (1-2), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13677648 89-96 (2003).
  15. Narhi, L. O., Schmit, J., Bechtold-Peters, K., Sharma, D. Classification of protein aggregates. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (2), 493-498 (2012).
  16. Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
  17. Philo, J. S. A critical review of methods for size characterization of non-particulate protein aggregates. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10 (4), 359-372 (2009).
  18. Stellwagen, E. Gel filtration. Methods in Enzymology. 463, 373-385 (2009).
  19. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
  20. Striegel, A. M., Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2009).
  21. GE Healthcare. Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods. , https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid=11639 (2014).
  22. Uliyanchenko, E. Size-exclusion chromatography-from high-performance to ultra-performance. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6087-6094 (2014).
  23. Dunker, A. K., Silman, I., Uversky, V. N., Sussman, J. L. Function and structure of inherently disordered proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 756-764 (2008).
  24. Hsiao, H. H., Nath, A., Lin, C. Y., Folta-Stogniew, E. J., Rhoades, E., Braddock, D. T. Quantitative characterization of the interactions among c-myc transcriptional regulators FUSE, FBP, and FIR. Biochemistry. 49 (22), 4620-4634 (2010).
  25. Hayashi, Y., Takagi, T., Maezawa, S., Matsui, H. Molecular weights of alpha beta-protomeric and oligomeric units of soluble (Na+, K+)-ATPase determined by low-angle laser light scattering after high-performance gel chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 748 (2), 153-167 (1983).
  26. Folta-Stogniew, E. J. Macromolecular Interactions: Light Scattering. Encyclopedia of Life Sciences. , (2009).
  27. Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography and Related Technology. 35 (20), 2923-2950 (2012).
  28. Chakrabarti, A. Separation of Monoclonal Antibodies by Analytical Size Exclusion Chromatography. Antibody Engineering. , (2018).
  29. Wyatt, P. J. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (1993).
  30. Takagi, T. Application of low-angle laser light scattering detection in the field of biochemistry: review of recent progress. Journal of Chromatography A. 506, 51-63 (1990).
  31. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
  32. Mogridge, J. Using light scattering to determine the stoichiometry of protein complexes. Methods in Molecular Biology. 1278, 233-238 (2015).
  33. Larkin, M., Wyatt, P. J. Light-Scattering Techniques and their Application to Formulation and Aggregation Concerns. Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceuticals. , (2010).
  34. Wolfender, J. L. HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue. Planta Medica. 75 (07), 719-734 (2009).
  35. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophysical Journal. 100, (2011).
  36. Serebryany, E., Folta-Stogniew, E., Liu, J., Yan, E. C. Homodimerization enhances both sensitivity and dynamic range of the ligand-binding domain of type 1 metabotropic glutamate receptor. FEBS Letters. 590 (23), 4308-4317 (2016).
  37. Arakawa, T., Wen, J. Size-exclusion chromatography with on-line light scattering. Current Protocols in Protein Science. Chapter 20, Unit 20.6(2001).
  38. Müller, R., et al. High-resolution structures of the IgM Fc domains reveal principles of its hexamer formation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (25), 10183-10188 (2013).
  39. Slotboom, D. J., Duurkens, R. H., Olieman, K., Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods. 46 (2), 73-82 (2008).
  40. Miercke, L. J., Robbins, R. A., Stroud, R. M. Tetra detector analysis of membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 77, 1-30 (2014).
  41. Gimpl, K., Klement, J., Keller, S. Characterising protein/detergent complexes by triple-detection size-exclusion chromatography. Biological Procedures Online. 18 (1), 4(2016).
  42. Korepanova, A., Matayoshi, E. D. HPLC-SEC characterization of membrane protein-detergent complexes. Current Protocols in Protein Science. Chapter 29, 1-12 (2012).
  43. Roy, A., Breyton, C., Ebel, C. Analytical Ultracentrifugation and Size-Exclusion Chromatography Coupled with Light Scattering for Characterization of Membrane Proteins in Solution. Membrane Proteins Production for Structural Analysis. , (2014).
  44. Hastie, K. M., et al. Crystal structure of the prefusion surface glycoprotein of the prototypic arenavirus LCMV. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (6), 513-521 (2016).
  45. Pallesen, J., et al. Structures of Ebola virus GP and sGP in complex with therapeutic antibodies. Nature Microbiology. 1 (9), 16128(2016).
  46. Micoli, F., Adamo, R., Costantino, P. Protein Carriers for Glycoconjugate Vaccines: History, Selection Criteria, Characterization and New Trends. Molecules. 23 (6), (2018).
  47. Li, J., et al. Characterizing the Size and Composition of Saposin A Lipoprotein Picodiscs. Analytical Chemistry. 88 (19), 9524-9531 (2016).
  48. Crichlow, G. V., et al. Dimerization of FIR upon FUSE DNA binding suggests a mechanism of c-myc inhibition. EMBO Journal. 27 (1), 277-289 (2008).
  49. Kapoor, N., Gupta, R., Menon, S. T., Folta-Stogniew, E., Raleigh, D. P., Sakmar, T. P. Nucleobindin 1 is a calcium-regulated guanine nucleotide dissociation inhibitor of G{alpha}i1. Journal of Biological Chemistry. 285 (41), 31647-31660 (2010).
  50. Pirruccello, M., Swan, L. E., Folta-Stogniew, E., De Camilli, P. Recognition of the F&H motif by the Lowe syndrome protein OCRL. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (7), 789-795 (2011).
  51. Lockyer, K., Gao, F., Derrick, J. P., Bolgiano, B. Structural correlates of carrier protein recognition in tetanus toxoid-conjugated bacterial polysaccharide vaccines. Vaccine. 33 (11), 1345-1352 (2015).
  52. Steinbach, T., Wurm, F. R. Degradable Polyphosphoester-Protein Conjugates: "PPEylation" of Proteins. Biomacromolecules. 17 (10), 3338-3346 (2016).
  53. Das, S., Stivison, E., Folta-Stogniew, E., Oliver, D. Reexamination of the role of the amino terminus of SecA in promoting its dimerization and functional state. Journal of Bacteriology. 190 (21), 7302-7307 (2008).
  54. Reshetnyak, A. V., et al. The strength and cooperativity of KIT ectodomain contacts determine normal ligand-dependent stimulation or oncogenic activation in cancer. Molecular Cell. 57 (1), 191-201 (2015).
  55. Zambelli, B., et al. a Chaperone in the Urease Assembly Process, Is an Intrinsically Unstructured GTPase That Specifically Binds Zn2+. Journal of Biological Chemistry. 280 (6), 4684-4695 (2005).
  56. Ren, X., et al. Hybrid Structural Model of the Complete Human ESCRT-0 Complex. Structure. 17 (3), 406-416 (2009).
  57. Moriarty, D. F., Fiorillo, C., Miller, C., Colón, W. A truncated peptide model of the mutant P61A FIS forms a stable dimer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (1), 78-85 (2007).
  58. la Garza, C. E., Miranda-Hernández, M. P., Acosta-Flores, L., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Analysis of therapeutic proteins and peptides using multiangle light scattering coupled to ultra high performance liquid chromatography. Journal of Separation Science. 38 (9), 1537-1543 (2015).
  59. Beirne, J., Truchan, H., Rao, L. Development and qualification of a size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering method for molecular weight determination of unfractionated heparin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (2), 717-725 (2011).
  60. Wang, W., et al. A new green technology for direct production of low molecular weight chitosan. Carbohydrate Polymers. 74 (1), 127-132 (2018).
  61. Kaderli, S., et al. A novel biocompatible hyaluronic acid-chitosan hybrid hydrogel for osteoarthrosis therapy. International Journal of Pharmaceutics. 483 (1-2), 158-168 (2015).
  62. Porterfield, J. Z., Zlotnick, A. A Simple and General Method for Determining the Protein and Nucleic Acid Content of Viruses by UV Absorbance. Virology. 407 (2), 281-288 (2010).
  63. Podzimek, S. The use of GPC coupled with a multiangle laser light scattering photometer for the characterization of polymers. On the determination of molecular weight, size and branching. Journal of Applied Polymer Science. 54 (1), 91-103 (1994).
  64. Podzimek, S., Vlcek, T., Johann, C. Characterization of branched polymers by size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering detector. I. Size exclusion chromatography elution behavior of branched polymers. Journal of Applied Polymer Science. 81 (7), 1588-1594 (2001).
  65. Podzimek, S. Importance of Multi-Angle Light Scattering in Polyolefin Characterization. Macromolecular Symposia. 330 (1), 81-91 (2013).
  66. Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1), 95-116 (2003).
  67. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  68. Hirayama, K., Akashi, S., Furuya, M., Fukuhara, K. Rapid confirmation and revision of the primary structure of bovine serum albumin by ESIMS and frit-FAB LC/MS. Biochemical and Biophysical Research Communications. 173 (2), 639-646 (1990).
  69. Zhu, H., Ownby, D. W., Riggs, C. K., Nolasco, N. J., Stoops, J. K., Riggs, A. F. Assembly of the gigantic hemoglobin of the earthworm Lumbricus terrestris. Roles of subunit equilibria, non-globin linker chains, and valence of the heme iron. The Journal of biological chemistry. 271 (47), 30007-30021 (1996).
  70. Peters, T., Feldhoff, R. C. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Isolation and characterization of tryptic fragments. Biochemistry. 14 (15), 3384-3391 (1975).
  71. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  72. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907(2018).
  73. Astafieva, I. V., Eberlein, G. A., John Wang, Y. Absolute on-line molecular mass analysis of basic fibroblast growth factor and its multimers by reversed-phase liquid chromatography with multi-angle laser light scattering detection. Journal of Chromatography A. 740 (2), 215-229 (1996).
  74. Onsberg, M., Øgendal, L. H., Jensen, M. L., Howells, L. B., Andersen, B., Bjerrum, M. J. Light scattering coupled with reversed phase chromatography to study protein self-association under separating conditions. Journal of Chromatography B. 938, 60-64 (2013).
  75. Kim, Y., et al. High-throughput protein purification and quality assessment for crystallization. Methods. 55 (1), 12-28 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wyznaczanie masy cz steczkowejanaliza agregacji bia ekprzygotowanie buforur wnowa enie kolumnyfiltracja pr beknormalizacja danychanaliza piku
Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.