Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Podsumowanie

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Streszczenie

Wiele badań ograniczało się do stosowania testów komórkowych in vitro i całych tkanek lub izolowania określonych typów komórek od zwierząt do analizy in vitro transkryptomu i ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania qPCR i RNA. Kompleksowa analiza transkryptomu i ekspresji genów określonych typów komórek w złożonych tkankach i narządach będzie miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych, za pomocą których geny są regulowane, oraz ich związku z homeostazą tkanek i funkcjami narządów. W tym artykule przedstawiono na przykład metodologię izolacji RNA związanego z rybosomem bezpośrednio in vivo w śródbłonku naczyniowym płuc zwierząt. Opisane zostaną konkretne materiały i procedury do przetwarzania tkanek i oczyszczania RNA, w tym ocena jakości i wydajności RNA, a także qPCR w czasie rzeczywistym do testów genów tętniczych. Podejście to, znane jako technika oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP), może być wykorzystane do charakterystyki ekspresji genów i analizy transkryptomu niektórych typów komórek bezpośrednio in vivo w dowolnym określonym typie w złożonych tkankach.

Wprowadzenie

W złożonych tkankach, takich jak mózg, serce i płuca ssaków, wysoki poziom niejednorodności komórkowej komplikuje analizę danych dotyczących ekspresji genów pochodzących z całych próbek tkanek. Aby zaobserwować profile ekspresji genów w określonym typie komórki in vivo, opracowano niedawno nową metodologię, która umożliwia badanie całego translowanego dopełniacza mRNA dowolnego genetycznie zdefiniowanego typu komórki. Ta metodologia jest znana jako technika oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP)^1,2. Jest to przydatne narzędzie do badania biologii komórek śródbłonka i angiogenezy w połączeniu z genetycznym manipulowaniem innymi genami związanymi z angiogenezą u zwierząt.

Wykazaliśmy, że angiogenna sygnalizacja PKD-1 i transkrypcja angiogennego genu CD36 są kluczowe dla różnicowania komórek śródbłonka (EC) i funkcjonalnej angiogenezy^3,4,5,6. Aby określić molekularne mechanizmy sygnalizacji angiogennej i metabolicznej w transkrypcji genów i transróżnicowaniu EC, stworzyliśmy genetycznie zmodyfikowane myszy TRAP ze specyficznie usuniętymi genami angiogennymi na podstawie techniki TRAP^1,2. Co więcej, u naszych zwierząt TRAP nie tylko mają one niedobór genu pkd-1 lub cd36 w śródbłonku naczyniowym lub globalną delecję genu cd36, ale także wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP) jest genetycznie znakowane na rybosomach translujących EC. TRAP umożliwia oczyszczanie z powinowactwem mRNA związanego z rybosomami bezpośrednio z śródbłonka naczyniowego docelowych tkanek, umożliwiając analizę ekspresji genów i identyfikację nowych transkryptomów, które są związane z różnicowaniem EC i angiogenezą bezpośrednio w warunkach in vivo. Udało nam się wyizolować RNA związane z rybosomami ze śródbłonka u tych genetycznie zmodyfikowanych zwierząt. Oczyszczone RNA może być wykorzystane do dalszej charakterystyki genów angiogennych lub arteriogennych w regulacji różnicowania i funkcji EC. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący wdrażania podejścia TRAP do izolacji mRNA w EC bezpośrednio in vivo.

Protokół

Dla eksperymentów na zwierzętach, wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kolegium Medycznego Wisconsin.

1. Przygotuj odczynniki

1. Przygotować bufor do lizy do stężeń 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0,5 mM DTT, 100 μg/ml cykloheksymidu, inhibitorów proteazy i rekombinowanych inhibitorów RNazy do stężeń opisanych poniżej.
   1. Do 500 ml wody dejonizowanej wolnej od RNaz dodać następujące odczynniki: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl₂, 35 mg DTT, 0,5 ml cykloheksymidu i NaOH w razie potrzeby do pH 7,4, inhibitory proteazy wolne od EDTA (jedna mini tabletka na 10 ml) i inhibitor RNazy (10 μl / ml).
   2. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.
2. Przygotować wysokosolny polisomowy bufor płuczący do stężeń 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1% obj./obj. CA-630, 0,5 mM DTT i 100 μg/ml cykloheksymidu.
   1. Do 500 ml wody dejonizowanej wolnej od RNaz dodać następujące odczynniki: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl₂, 5 ml niejonowego, niedenaturującego detergentu, 5 probówek 7,7 mg DTT i 0,5 ml cykloheksymidu oraz NaOH w razie potrzeby do pH 7,4.
   2. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.
3. Zwiąż przeciwciało anty-GFP z kulkami magnetycznymi białka G przed rozpoczęciem eksperymentu.
   1. Dodać 10 μg przeciwciała anty-GFP rozcieńczonego w 200 μl PBS do kulek białka G.
   2. Inkubować z obrotem od końca do końca przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Umieść koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
   4. Zawiesić kulki w 200 μl PBS i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
4. Przygotuj lodowaty PBS ze 100 μg/ml cykloheksymidu.
   1. Dodać 1 objętość roztworu cykloheksymidu (100 mg/ml) do 999 objętości lodowatego PBS.

2. Wyizoluj i zliza pożądanych tkanek

1. Poddaj myszy eutanazji przez wstrzyknięcie IP ketaminy (500 mg/kg/masę ciała) i ksylazyny (10 mg/kg/masę ciała) i wyizoluj pożądane tkanki (tj. serce, płuca). Natychmiast przejdź do następnego kroku.
2. Umieść żądane tkanki w 500 μl lodowatego PBS ze 100 μg/ml cykloheksymidu.
3. Zmiel tkankę na zawiesinę komórkową za pomocą homogenizatora napędzanego silnikiem lub homogenizatora szklanego o małym prześwicie. W przypadku korzystania z homogenizatora napędzanego silnikiem należy ograniczyć homogenizację do mniej niż 1 minuty przy niskiej częstotliwości (<15 000 Hz), aby uniknąć denaturacji RNA.
4. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do lizy, kilkakrotnie pipetując i ponownie pobierając bufor. Dalej homogenizować zawiesinę komórek za pomocą 10 pociągów w homogenizatorze szklanym o małym prześwicie lub przez 15 sekund przy niskiej częstotliwości (<15 000 Hz) w homogenizatorze napędzanym silnikiem.
5. Odwirowywać homogenaty przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzania jąder i dużych szczątków komórkowych i utrzymywania supernatantu.
6. Do supernatantu dodać niejonowy, niedenaturujący detergent do 1% obj./obj. i DHPC do 30 mM. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
7. Odwirować lizat przez 10 minut przy 16 000 x g do granulowania nierozpuszczalnego materiału. Przenieś i zachowaj 15% klarownego lizatu jako dane wejściowe dla przyszłych kroków.

3. Izolowanie kompleksów rybosom/mRNA

1. Dodać 50 μl kulek związanych z przeciwciałami do supernatantu z lizatu komórkowego i inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C z rotacją wierzchołka do końca przez 30 minut. W tym miejscu przeciwciała anty-GFP zwiążą rybosomy znakowane GFP, co pozwoli nam na dalszą izolację RNA od tych rybosomów.
2. Zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i umyj 5 razy buforem do mycia polisomów o wysokiej soli.
   1. Pobrać i wylać płyn, gdy kulki zbiorą się z boku tuby. Następnie odpipetować i kilkakrotnie pobrać 200 μl polisomenowego buforu do płukania o wysokiej zawartości soli. Powtórz ten krok 5 razy i odrzuć cały bufor po ostatnim powtórzeniu. Natychmiast przejdź do następnego kroku.

4. Wyizoluj mRNA

1. Umieść koraliki w buforze RLT. Poniższe kroki zostały zaczerpnięte bezpośrednio z protokołu RNeasy mini kit i nie zostały w żaden sposób rozwinięte.
   UWAGA: Bufor RLT zawiera sole guanidyny; NIE mieszać z wybielaczem.
2. Odwirować lizat przez 3 minuty przy pełnej prędkości 13 000 obr./min lub 16 000 g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant o objętości 350 μl przez pipetowanie i przenieść go do nowej probówki do mikrofuge. W kolejnych krokach należy stosować tylko ten supernatant (lizat).
3. Dodaj równą objętość 70% etanolu do probówki do mikrofuge.
4. Przenieść do 700 μl próbki, łącznie z osadem, który mógł się utworzyć, do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ.
5. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Wyrzuć przepływ i ponownie użyj probówki zbiorczej w następnym kroku.
   UWAGA: Bufor RW1 zawiera sole guanidyny; NIE mieszać z wybielaczem.
6. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 s przy ≥8 000 x g. Odrzuć przepływ.
7. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ.
8. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 2 minuty przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Następnie ostrożnie wyjmij kolumnę wirową z rurki zbiorczej, upewniając się, że kolumna nie styka się z przepływem.
9. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzuć starą probówkę wraz z przepływem. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj z pełną prędkością przez 1 minutę, aby usunąć resztki buforu.
10. Umieść kolumnę wirującą w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1.5 ml. Dodaj 30-50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do membrany kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywkę i odwiruj przez 1 minutę przy ≥8 000 x g, aby wymyć RNA.
11. Jeśli oczekiwana wydajność RNA wynosi >30 μg, powtórz krok 4.10 z kolejnymi 30-50 μl wody wolnej od RNaz lub używając elucji z kroku 4.10 (jeśli wymagany jest wysoki [RNA]). Użyj ponownie probówki zbiorczej z kroku 4.10.
12. Użyj oczyszczonego RNA do dalszej analizy, w tym sekwencjonowania RNA lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, lub przechowuj RNA rozpuszczone w H₂O bez RNaz w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.

Wyniki

Nasze poprzednie badania^{4,7 sugerują,} że CD36 może funkcjonować jako przełącznik różnicowania tętniczek i tętnic włosowatych poprzez szlak sygnałowy LPA/PKD-1. Aby zbadać, czy oś sygnalizacyjna LPA / PKD-1-CD36 jest niezbędna do arteriogenezy in vivo, ustaliliśmy nowe linie TRAP, które nie tylko mają globalny niedobór cd36 lub specyficzny dla śródbłonka niedobór cd36 lub pkd-1, ale także umożliwiają selektywną izolację RNA związanego z rybosomem z linii komórkowy...

Dyskusja

Angiogeneza jest złożonym, wieloetapowym procesem, w którym transkrypcja i ekspresja genów angiogennych specyficznych dla EC odgrywa zasadniczą rolę w różnicowaniu EC i przeprogramowywaniu angiogennym ^3,4. Aby pokonać bariery wynikające z różnorodności komórkowej i złożoności architektonicznej w celu lepszego zrozumienia funkcji układu naczyniowego ssaków na poziomie molekularnym in vivo, stworzyliśmy myszy TRAP specyficzne dla EC, którym towarzyszy specyficzny <...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2100 Bioanalizator elektroforezy z nanochipami i pikochipami	Agilent	G2939AA, 5067-1511 i 5067-1513
Skrobaki do komórek	Sarstedt	83.1832
Homogenizatory	Fisher Scientific	K8855100020
Magnet (Dynamag-2)	Invitrogen	123-21D	Zależy od skali oczyszczania; próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml można zagęścić
a Miniwirówka	Fisher Scientific	05-090-100
Spektrofotometr NanoDrop 2000C	Thermo Scientific	ND-2000C
Wirówka z chłodzeniem	Eppendorf	5430R	z wirnikiem do probówek mikrowirówek 1,5 ml
RNaz Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Applied Biosystems
Probówki stożkowe 50 ml bez rnazy	Applied Biosystems
1000-μ Bez RNaz; l Końcówki	filtracyjne Rainin	RT-1000F
RNazo-free 200-μ l końcówki filtracyjne	Rainin	RT-200F
bez RNaz 20-μ l końcówki filtracyjne	Rainin	RT-20F
Wirnik do homogenizatorów	Yamato	LT-400D
Rotator rurowy, marki Labquake	Thermo Fisher	13-687-12Q