Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Podsumowanie

Biopsja blastocysty i witryfikacja są niezbędne do skutecznego przeprowadzenia preimplantacyjnych badań genetycznych. Podejście polegające na sekwencyjnym otwieraniu osłonki przejrzystej i pobieraniu 7-8 komórek trofektodermy w 5-7 dniu po inseminacji ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe.

Streszczenie

Biopsja blastocysty jest wykonywana w celu uzyskania wiarygodnej diagnozy genetycznej podczas cykli IVF z preimplantacyjnymi testami genetycznymi. Następnie, idealny przebieg pracy pociąga za sobą bezpieczny i wydajny protokół witryfikacji, ze względu na czas realizacji technik diagnostycznych i transfer wybranego zarodka (zarodków) na fizjologicznym endometrium w następnym naturalnym cyklu. Biopsja obejmująca sekwencyjne otwieranie osłonki przejrzystej i pobieranie 5-10 komórek trofektodermy (najlepiej 7-8) ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe. Po odpowiednim przeszkoleniu technika była powtarzalna u różnych operatorów pod względem czasu biopsji (~8 min, w zakresie 3-22 min w zależności od liczby zarodków do biopsji na talerz), uzyskanych rozstrzygających diagnoz (~97,5%) i odsetka żywych urodzeń po transferze blastocysty euploidalnej (>40%). Wskaźnik przeżycia po biopsji, witryfikacji i ociepleniu wynosił aż 99,8%. Szybkość reekspansji po 1,5 godziny od ocieplenia wynosiła aż 97%, w dużej mierze zależała od czasu między biopsją a witryfikacją (najlepiej ≤30 min), jakości morfologicznej blastocysty i dnia biopsji. Ogólnie rzecz biorąc, lepiej jest zeszkleić zapadniętą blastocystę; w związku z tym, w cyklach innych niż PGT, można wykonać sztuczny skurcz wspomagany laserem w celu wywołania zapadnięcia się zarodka przed krioprezerwacją. Najbardziej obiecującą perspektywą na przyszłość jest nieinwazyjna analiza pożywki hodowlanej IVF po posiewie blastocyst jako przypuszczalnego źródła embrionalnego DNA. Jednak ta potencjalna awangarda jest nadal badana, a niezawodny protokół musi jeszcze zostać zdefiniowany i zweryfikowany.

Wprowadzenie

Głównym celem współczesnej embriologii ludzkiej jest maksymalizacja liczby żywych urodzeń w jednym stymulowanym cyklu oraz zmniejszenie kosztów, czasu i wysiłku związanego z osiągnięciem ciąży. Aby osiągnąć ten cel, należy zastosować zwalidowane podejścia do selekcji zarodków w celu identyfikacji zarodków zdolnych do reprodukcji w kohorcie uzyskanej podczas cyklu IVF. Zgodnie z najnowszymi dowodami, hodowla blastocyst ¹ w połączeniu z kompleksowymi badaniami chromosomowymi i euploidalnym transferem zarodków (ET) jest najskuteczniejszym sposobem na zwiększenie efektywności IVF². Oczywiste jest, że badanie aneuploidalne wymaga próbki embrionalnej, która obecnie jest w większości reprezentowana z kilku komórek pobranych z trofektodermy (TE), tj. odcinka blastocysty, który daje początek aneksom zarodka (np. łożysku) podczas ciąży. Poza analizą kariotypu, również mutacje pojedynczych genów mogą być oceniane na podstawie biopsji TE w ramach strategii klinicznej znanej jako preimplantacyjne testy genetyczne (PGT; -A dla aneuploidii, -SR dla strukturalnych rearanżacji chromosomów, -M dla chorób monogenowych). Inne metody biopsji oocytów/zarodków zostały teoretyzowane i przyjęte klinicznie w ciągu ostatnich dziesięcioleci, a mianowicie biopsja ciał polarnych i biopsja blastomerów. Jednak ich stosowanie jest obecnie ograniczone, ponieważ ich wady proceduralne (np. większe obciążenie pracą i ryzyko wpływu na rozrodczość) oraz ograniczenia diagnostyczne (np. problemy z analizą pojedynczych komórek) pośrednio utrudniają wystarczającą równowagę między kosztami, ryzykiem i korzyściami (przegląd patrz³).

W tym artykule, jeden z głównych protokołów biopsji TE jest dokładnie opisany wraz z późniejszymi procedurami witryfikacji, ogrzewania i transferu. Opisany tutaj przepływ pracy jest idealny dla zatłoczonej jednostki PGT.

Jak już wcześniej opisała nasza grupa^4,5, procedura polega na sekwencyjnym otwarciu osłonki przejrzystej w pełni rozwiniętych blastocyst i usunięciu kilku komórek TE (średnio 7-8). W porównaniu z metodą biopsji blastocysty wspomaganej laserowo w dniu 3⁶, ta procedura może ułatwić codzienny harmonogram na oddziale IVF, gdzie delikatne procedury, takie jak biopsja blastocysty i witryfikacja, muszą być wykonywane na czas. Gdy tylko blastocysta osiągnie pełną ekspansję, biopsję można przeprowadzić, wybierając komórki TE do usunięcia, zapobiegając w ten sposób ryzyku przepukliny wewnętrznej masy komórkowej (ICM), co w przeciwnym razie utrudniłoby procedurę. W literaturze opisano również trzeci protokół biopsji blastocysty, który polega na laserowym wylęganiu się, gdy zarodek osiągnął już stadium blastocysty, na kilka godzin przed zabiegiem^5,7. Podejście to jest jednak bardziej czasochłonne i odpowiada głównie jednostkom IVF, które wdrażają biopsję TE w rękach mało doświadczonych operatorów i ze względu na umiarkowanie niskie dzienne obciążenie pracą.

Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI)⁸ powinno być skonsolidowaną techniką, jeśli ma na celu przeprowadzanie analiz genetycznych w IVF. Podobnie, odpowiedni system hodowli w celu bezpiecznego pobrania zarodków do stadium blastocysty ma kluczowe znaczenie dla wdrożenia strategii biopsji TE. Odpowiednia liczba inkubatorów, a także stosowanie niskiego ciśnienia tlenu są kluczowymi warunkami wstępnymi do osiągnięcia tego celu, aby nie zagrozić wskaźnikowi blastocyst⁹. Jednocześnie potrzebny jest skuteczny program krioprezerwacji, aby bezpiecznie zarządzać cyklem PGT. W ciągu ostatniej dekady wdrożenie witryfikacji zwiększyło wskaźniki krioprzeżywalności zarodków nawet do >99%^10,11. Dało to wystarczająco dużo czasu na wykonanie badań genetycznych i odroczenie transferu zarodków do następnego cyklu miesiączkowego, na niestymulowanym i prawdopodobnie bardziej podatnym endometrium¹².

Zarówno biopsja TE, jak i witryfikacja są wymagającymi zadaniami wymagającymi rygorystycznych umiejętności, a ich skuteczność może być różna u niedoświadczonych operatorów. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie specjalnego okresu szkolenia przed umożliwieniem każdemu operatorowi klinicznego wykonania tych procedur; Ponadto utrzymanie umiejętności operatorów powinno być okresowo oceniane poprzez monitorowanie kluczowych wskaźników efektywności (KPI) dla procedur kriokonserwacji i biopsji. W tym celu każda klinika IVF powinna ustalić wewnętrzne KPI, które muszą być zbliżone do tych publikowanych przez międzynarodowe konsorcja i/lub wyników publikowanych przez laboratoria referencyjne.

TE biopsja, rozgrzewanie witryfikacji i procedury obserwowania są zatwierdzonymi technikami w naszej jednostce, które zostały ujednolicone dla wszystkich zaangażowanych operatorów, jak opisano w trzech poprzednich publikacjach^11,13,14.

Protokół

Protokół biopsji ludzkiej blastocysty, opisany tutaj, jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach G.EN.E.R.A.

UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby zapoznać się z wymaganymi materiałami. Dalsze wymagane materiały obejmują obuwie i strój laboratoryjny, maskę chirurgiczną, osłonę włosów, rękawiczki chirurgiczne, trwały nietoksyczny marker, kleszcze i środek dezynfekujący. Stosowanie fartucha chirurgicznego, jednorazowych rękawiczek chirurgicznych, maski na twarz, osłony włosów jest obowiązkowe, aby zapobiec ryzyku zakażenia. Wszystkie obszary robocze, a także sprzęt biorący udział w procesie, muszą być dokładnie oczyszczone laboratoryjnym środkiem dezynfekującym (np. Oosafe) przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury. Wszystkie używane materiały eksploatacyjne i media powinny być sterylne i pakowane pojedynczo lub porcjowane. Sugeruje się korzystanie z dedykowanego stanowiska do biopsji i rurki oraz ograniczenie dostępu do tego obszaru tylko do operatorów zaangażowanych w zabieg (embriologa i świadka).

1. Przygotowanie w dniu poprzedzającym zabieg biopsji

1. Przygotuj naczynie do hodowli po biopsji.
   1. Umieścić 6 kropli po 20 μl pożywki do hodowli in vitro (tabela materiałów) w naczyniu do hodowli in vitro i nałożyć na 6 ml wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do hodowli zarodków (tabela materiałów).
   2. Do każdej kropli dodać kolejne 10 μl pożywki do hodowli in vitro. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze (5%_O2, 6% CO_{2 ).}
2. Przygotuj 4-dołkową płytkę do zapłodnienia in vitro do płukania blastocysty po biopsji.
   1. Umieścić 600 μl pożywki do hodowli in vitro w pierwszych dwóch dołkach i nałożyć 300 μl wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do hodowli zarodków.
   2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze (5%_O2, 6% CO_{2 ).}
3. Dozować 1,5 μl roztworu ładującego (tabela materiałów) do każdej probówki do PCR, która ma być użyta do rurki komórek TE, odwirować ją i utrzymywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie w dniu zabiegu biopsji

1. Przygotuj naczynie do biopsji.
   1. Umieścić 3 krople 10 μl pożywki buforowanej HEPES (uzupełnionej albuminą surowicy ludzkiej) (tabela materiałów) w rzędzie w naczyniu do hodowli in vitro.
   2. Powtórzyć krok 1.1.1 w zależności od liczby dostępnych blastocyst (do 4 blastocyst na szalkę) i nałożyć 6 ml wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do hodowli zarodków.
   3. Inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed wykonaniem procedury biopsji.

3. Selekcja i klasyfikacja blastocyst

1. Oceń blastocystę zgodnie z jej ekspansją i morfologicznym wyglądem ICM i TE (Rysunek 1).
   UWAGA: Kryteria oceniania zostały zaczerpnięte z Gardner and Schoolcraft¹⁵ i wcześniej opisane przez Capalbo et al. oraz Cimadomo et al.^4,11.
   1. Zdefiniuj rozmiar i stopień ekspansji jako: A dla w pełni wykukłowanej blastocysty, B dla wylęgającej się blastocysty, C dla w pełni rozwiniętej blastocysty i D dla nierozwiniętej blastocysty (te zarodki są poddawane biopsji tylko wtedy, gdy nie rozszerzały się dalej do 7 dnia).
   2. Zdefiniuj stopień ICM: 1 dla zauważalnego ICM z kilkoma ściśle upakowanymi komórkami; 2 dla rozpoznawalnego z kilku, ale z grubsza upakowanymi komórkami; 3 dla trudnego do odróżnienia z bardzo małą liczbą komórek niskiej jakości.
   3. Zdefiniuj stopień TE w następujący sposób: 1 dla dobrze zorganizowanego nabłonka z kilkoma komórkami; 2 dla luźnego nabłonka z kilkoma komórkami; 3 dla kilku i/lub dużych komórek niskiej jakości.

4. Biopsja trofektodermy

1. Wykonaj biopsję TE na wszystkich żywych, w pełni rozwiniętych blastocystach (najlepiej klasy C ze względu na rozmiar i ekspansję).
2. Zestaw pipet do trzymania i biopsji do każdej procedury biopsji. Zalecenia dotyczące pipety do biopsji są następujące: średnica wewnętrzna 30 μm, kąt gięcia 35°, odległość od końcówki do zgięcia 0,75 mm.
3. Oznacz miskę do biopsji danymi pacjenta (imię i nazwisko kobiety, data urodzenia i dowód osobisty), a następnie ponumeruj każdą kroplę identyfikatorami zarodka i cyklu. Użyj trwałego, nietoksycznego markera.
4. Przenieść blastocystę za pomocą pipety do strippingu 300 μm do pierwszej kropli naczynia biopsyjnego i wypłukać ją w celu usunięcia nadmiaru pożywki hodowlanej. Następnie przenieś blastocystę do drugiej kropli naczynia biopsyjnego.
5. Przenieś naczynie do odwróconego mikroskopu i zalej pipetę biopsyjną, odsysając trochę pożywki z trzeciej kropli naczynia biopsyjnego.
6. Przy 20-krotnym powiększeniu ustaw blastocystę tak, aby mieć wyraźny widok na ICM. Po uwidocznieniu zarodka na godzinie 7 (naprzeciwko obszaru, który będzie celem usunięcia komórek TE), zabezpiecz zarodek na pipecie przytrzymującej (Ryc. 2a).
7. Skoncentruj się na osłonce przejrzystej i upewnij się, że zarówno pipety, jak i blastocysta znajdują się na tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
8. Przełącz się na obiektyw laserowy (czas impulsu 0,3 ms, 6,5 μm) i ustaw wskaźnik laserowy na osłonie przejrzystej po przeciwnej stronie ICM. Przewiercić osłonę przezroczystą przez 2−3 impulsy laserowe (Rysunek 2b).
9. Delikatnie dociśnij pipetę do biopsji do osłonki przejrzystej i przedmuchaj trochę pożywki przez szczelinę, aby oderwać komórki TE od jej wewnętrznej powierzchni i przyspieszyć zapadanie się blastocysty (Rysunek 2c).
10. Po odłączeniu TE (Rysunek 2d), wejdź przez otwór (jeśli to konieczne, poszerz go ostatnim impulsem laserowym) i odessaj kilka komórek TE (najlepiej 7−8^13,16) do pipety do biopsji z delikatnym odsysaniem (Rysunek 2e).
11. Lekko przesuń pipetę do biopsji do tyłu, stosując umiarkowane ssanie, aby rozciągnąć komórki docelowe ( Rysunek 2f).
12. Skieruj laser w stronę najcieńszej części aspirowanych komórek i wystrzel 2−5 impulsów laserowych na skrzyżowaniach między komórkami, aby oddzielić komórki docelowe od ciała zarodka (Rysunek 2g). Czas impulsów laserowych i liczbę impulsów można dostosować w zależności od jakości blastocysty; Staraj się jednak je minimalizować, aby uniknąć lizy komórek.
13. Po oddzieleniu się fragmentu TE od blastocysty (Ryc. 2h), uwolnij go do tej samej kropli biopsyjnej z dala od blastocysty. Jest to konieczne, aby zapobiec ich ponownemu zassaniu do pipety do biopsji (Rysunek 2i).
14. Uwolnij blastocystę z pipety trzymającej i natychmiast podnieś obie pipety, aby zapobiec przyklejaniu się do nich fragmentu.
15. Zrób zdjęcie biopsyjnego fragmentu w celu kontroli jakości (Rysunek 3).
    UWAGA: Jeśli w jednej procedurze ma zostać pobrana więcej niż jedna blastocysta (do czterech na miskę biopsyjną), należy wymienić pipetę do biopsji na nową, aby zapobiec zakażeniu krzyżowemu między zarodkami.
16. Powtórz kroki 4.1−4.13.
17. Przenieś naczynie do biopsji z powrotem do okapu z przepływem laminarnym.
18. Oznacz naczynie do hodowli po biopsji identyfikatorem pary, a każdą kroplę zarodkiem i identyfikatorem cyklu.
19. W obecności świadka przepłucz blastocystę w czystym pożywce IVF, a na koniec przenieś ją do odpowiedniej kropli naczynia po biopsji.
20. Przenieść naczynie po biopsji do inkubatora w kontrolowanej atmosferze (37 °C, 6% CO₂ , 5 % O₂) do czasu witryfikacji. Wskazane jest wykonanie witryfikacji w ciągu 30 minut od zabiegu biopsji, aby zapobiec ponownemu namnażaniu się blastocysty.

5. Rurki

UWAGA: Cała procedura musi być przeprowadzona w obecności świadka i wewnątrz okapu z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej. Podczas zabiegu należy przechowywać probówki do PCR w zimnym stojaku na probówki na lodzie (rysunek uzupełniający 1).

1. Oznacz probówki PCR trwałym, nietoksycznym markerem.
   nuta: Oznakowanie powinno być wykonane zgodnie z wymaganiami laboratorium genetycznego. Ogólnie rzecz biorąc, imię i nazwisko pacjenta (inicjały), identyfikator pary, identyfikator zarodka i identyfikator cyklu (na przykład: JD 12345 1.2 dla zarodka nr 1 drugiego cyklu należącego do Jane Doe, której identyfikator pary to 12345). Identyfikator zarodka powinien być również podany w postaci liter na korpusie probówki.
2. Oznaczyć pokrywkę naczynia hodowlanego o wymiarach 60 mm x 15 mm identyfikatorami zarodków poddanych biopsji (rysunek uzupełniający 1) i przygotować w nim dwie krople 10 μl roztworu do przemywania biopsji (tabela materiałów).
3. Zalać pipetę do striptizu o długości 140 μm (Rysunek Uzupełniający 1) roztworem do płukania biopsji z drugiej kropli naczynia z rurką.
4. Umieść naczynie biopsyjne pod mikroskopem stereoskopowym, aby łatwo uwidocznić fragment(y) TE.
5. Delikatnie wypuścić trochę roztworu do płukania biopsji na fragment TE, a następnie załadować go do pipety do zdejmowania izolacji.
6. Przenieś fragment TE do drugiej kropli roztworu do płukania biopsji w naczyniu z rurką i ostrożnie wypłucz go 2−3 razy.
7. Przenieść fragment TE na dno probówki do PCR (wcześniej oznaczonej po niej) z roztworem ładującym, zwracając uwagę, aby nie dotykać jej ścianek końcówką pipety do strippingu.
8. Powtórz procedurę od kroku 5.3 do kroku 5.7 dla każdego fragmentu TE, zwracając uwagę, aby użyć nowej kapilary dla każdego fragmentu TE.
9. Pod koniec procedury rurkowania włóż wszystkie probówki PCR do mini wirówki i wiruj je przez kilka sekund.
10. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu wysłania ich do laboratorium genetycznego w celu przeprowadzenia badań.

6. Witryfikacja blastocyst

1. Vitrify spowodowały zapadnięcie się blastocyst w ciągu 30 minut od biopsji TE, aby zapobiec ich ponownemu rozszerzaniu się.
2. Oznacz płytkę witryfikacyjną danymi kobiety i identyfikatorami blastocyst, które muszą zostać zeszklone.
3. Oznacz nośnik(i) witryfikacyjny imieniem i nazwiskiem kobiety, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który zostanie na niego załadowany, a także datą zabiegu. Stosowane są specjalne krioetykiety, które zachowują swoją integralność nawet w bardzo niskiej temperaturze (-196 °C).
4. W temperaturze pokojowej dozować 0,3 ml roztworu równoważącego (ES) (tabela materiałów) dla każdej blastocysty, która będzie witryfikowana.
5. W obecności świadka przesunąć blastocystę w ES za pomocą pipety do strippingu 300 μm.
6. Pozostaw blastocystę w ES na 13-15 minut. Po początkowym zmniejszeniu objętości obserwuje się stopniową ponowną ekspansję.
7. Napełnij mały stojak chłodzący ciekłym azotem (LN₂) i umieść go pod okapem z przepływem laminarnym.
8. Dozować 300 μl roztworu do witryfikacji (VS) (tabela materiałów) do drugiego dołka. Po całkowitym ponownym rozprężeniu blastocysty przenieś ją do roztworu VS na 1 minutę i przepłucz w celu rozcieńczenia ES.
9. W obecności świadka należy obciążyć blastocystę na podporę witryfikacyjną i zająć się usunięciem nadmiaru VS. Delikatna warstwa roztworu powinna otaczać blastocystę.
10. Zanurz nośnik witryfikacyjny w LN₂ i przesuń go energicznie, aby zmniejszyć ryzyko tworzenia się pęcherzyków w pobliżu próbki.
11. Umieść nasadkę ochronną, trzymając podporę witryfikacyjną zanurzoną w LN_2.
12. W obecności świadka przenieść podporę witryfikacyjną w długoterminowym zbiorniku magazynowym LN₂.

7. Sztuczne kurczenie się blastocyst bez biopsji

1. Jeśli nie zostanie przeprowadzona biopsja TE, należy sztucznie zapaść blastocysty bezpośrednio przed witryfikacją (Ryc. 4).
   1. Przenieś szalkę hodowlaną z inkubatora do mikroskopu odwróconego i skup się na wybranym zarodku.
   2. Przełącz się na obiektyw laserowy (wstępnie ustawiony impuls: 0,3 ms, 6,5 μm), skieruj osłonę przejrzystą po przeciwnej stronie ICM, a następnie skieruj 1–2 impulsy laserowe na połączenia między komórkami TE w bezpiecznej odległości od ICM. Blastocysty powinny zapaść się w czasie krótszym niż 5 minut.
2. Kontynuuj witryfikację zapadniętej blastocysty zgodnie z opisem w punkcie 6.

8. Przenośne ocieplenie blastocyst

1. W dniu ET przygotuj 4-dołkową płytkę ET, umieszczając 600 μl wstępnie zbalansowanej pożywki hodowlanej IVF dla każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze (5%_O2, 6% CO₂), jednocześnie ogrzewając blastocysty.
2. Oznacz naczynie rozgrzewające imieniem i nazwiskiem kobiety, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który zostanie w nim podgrzany.
3. Przed rozpoczęciem procedury należy rozlać 1 ml roztworu do rozmrażania (TS) (tabela materiałów) do jednodołkowego naczynia do zapłodnienia in vitro (rysunek uzupełniający 1) i podgrzać je do 37 °C w termostacie przez co najmniej 1 godzinę.
4. Napełnij mały wspornik chłodzący LN₂ i umieść go w okapie z przepływem laminarnym w bliskiej odległości od obszaru roboczego.
5. Przed przystąpieniem do zabiegu należy zapoznać się z informacjami o blastocystach podanymi na podkładzie witryfikacyjnym. Wszystkie identyfikatory powinny być zgodne z raportem genetycznym, a blastocysta do rozgrzania musi być wybrana spośród tych, które można przenieść. W toku postępowania wymagany jest świadek.
6. Wyjmij jednodołkowe naczynie zawierające podgrzany TS z termostatu i umieść je na podgrzewanym stage pod mikroskopem stereoskopowym.
7. Przeciągnij nasadkę ochronną w LN₂ za pomocą kleszczy.
8. Szybko zanurz końcówkę nośnika witryfikacyjnego w TS o temperaturze 37 °C.
9. Pod obserwacją mikroskopową delikatnie przesuwaj podporę witryfikacji, aż blastocysta zostanie uwolniona z końcówki.
10. Pozostaw blastocystę na łącznie 1 minutę w TS, zwracając uwagę, aby utrzymać ją na dnie TS.
11. W temperaturze pokojowej dozować 200 μl roztworu rozcieńczającego (DS) (tabela materiałów) do pierwszego dołka płytki witryfikacyjnej.
12. Przenieś blastocystę do DS i umieść ją na dnie studzienki, uwalniając trochę TS na górze, aby stworzyć rodzaj gradientu. Pozostaw na 3 minuty.
13. Dozować 200 μl roztworu myjącego (WS) do 2 różnych dołków (WS1 i WS2).
14. Przenieś blastocystę do WS1 i umieść ją na dnie studzienki, uwalniając trochę pożywki DS na wierzchu. Następnie przenieś blastocystę do WS2 i pozostaw ją w spokoju na 1 minutę.
15. Oznacz tabliczkę ET po ociepleniu imieniem i nazwiskiem kobiety, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który będzie w niej hodowany.
16. W obecności świadka przenieś podgrzaną blastocystę do wstępnie zbalansowanej pożywki hodowlanej na pochodzącej po podgrzaniu płytce ET.
17. Wypłucz blastocystę w pierwszym dołku płytki ET i umieść ją w drugiej studzience.
18. Przenieść naczynie z hodowlą po podgrzaniu do inkubatora w kontrolowanej atmosferze (37 °C, 6% CO₂ , 5 % O₂) i hodować blastocystę przez co najmniej 1,5 godziny przed sprawdzeniem jej przeżywalności i ponownej ekspansji.
    UWAGA: Rysunek 5 pokazuje przykłady zdegenerowanych, krioprzeżywanych, ale nie ponownie rozprężonych oraz krioprzeżywalnych i w pełni rozwiniętych blastocyst.

9. Embriotransfer

1. Aby wykonać ET, umieść naczynie na podgrzewanym stoliku okapu z przepływem laminarnym, tak aby zarodek był widoczny pod mikroskopem w małym powiększeniu.
2. Weź około 0,4 ml pożywki hodowlanej IVF. Mocno przymocować końcówkę strzykawki do końcówki odbiorczej cewnika wewnętrznego, a następnie uwolnić pożywkę do 0,1 ml.
3. Odsysać pożywkę hodowlaną do momentu zaobserwowania zarodków wchodzących do cewnika (minimalna ilość pożywki: 10−15 μL).
4. Umieść cewnik w plastikowej obudowie i udaj się na salę operacyjną i umieść cewnik wewnętrzny w prowadnicy zewnętrznej.
5. Po dotarciu do macicy nacisnąć tłok strzykawki, aby uwolnić zarodek (zarodki). Bardzo powoli odpuszczać pożywkę, aż tłok zacznie wskazywać 0,1 ml.
6. Zabierz cewnik z powrotem do laboratorium i sprawdź pod mikroskopem, czy zarodek został przeniesiony.

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia schemat wszystkich wyników procedury biopsji, który można zastosować w celu standaryzacji protokołu i monitorowania wydajności każdego operatora. Głównym wynikiem proceduralnym jest czas zakończenia biopsji/biopsji; głównym wynikiem technicznym jest jakość poletka wyprodukowanego po przeprowadzeniu badań genetycznych, które mogą prowadzić do postawienia jednoznacznej lub niejednoznacznej diagnozy, przy czym ta ostatnia wymaga ponownej bi...

Dyskusja

Tylko doświadczeni wykwalifikowani embriolodzy, którzy ukończyli okres szkolenia, powinni wykonywać zarówno biopsję TE, jak i witryfikację blastocyst. Ponadto wymagany jest świadek, który monitoruje procedury i gwarantuje skuteczne śledzenie podczas i) przemieszczania się blastocysty poddanej biopsji z naczynia biopsyjnego (rysunek uzupełniający 1) do naczynia po biopsji (rysunek uzupełniający 1), następnie do płytki witryfikacyjnej (rysunek uzupełniający 1) i wreszcie d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt
Stojak na zimne rurki	Biocision	XTPCR96
Elektroniczny kontroler pipet	Fisher Scientific	710931
Flexipet Regulowany zestaw uchwytów	Cook	G18674	Uchwyt do ściągania izolacji
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Elektroniczny system obserwacyjny	CooperChirurgiczna płodność i Genomic Solutions		RI Witness ART System zarządzania
Mikroskop odwrócony	Nikon	Eclipse TE2000-U
Kaptur z przepływem laminarnym	IVF TECH		Przepływ powietrza klasy A
Obiektyw laserowy	RI	Saturn 5
Mikrowtryskiwacze	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini wirówka do probówek PCR	Eppendorf	CSLQSPIN	do probówek do PCR 0,2 mLl
Mikroskop stereoskopowy	Leica	Leica M80
Termostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Inkubator trójgazowy	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Materiały eksploatacyjne
Pipeta do biopsji	RI	7-71-30FB35720	30 µ m ID, płaskie 35 & deg; C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	Pożywka do hodowli in vitro uzupełniona
cewnikiem do transferu zarodków	Cook	G17934
Pipeta flexipet	Cook	G26712	140µ m końcówka do pipety do zdejmowania izolacji
Pipeta Flexipet	Cook	G46020	300µ m Zdejmowanie izolacji z końcówek do pipet
Pipeta podtrzymująca	RI	7-71-IH35/20	30 µ m ID, płaskie 35 & deg; C
Albumina surowicy ludzkiej	Irvine Scientific	9988
IVF Naczynie z jednej studni	Falcon	353653
Olej mineralny do hodowli zarodków	Irvine Scientific	9305
Zmodyfikowane podłoże	HTF Irvine Scientific	90126	Pożywka buforowana Hepes
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	Naczynie IVF 4- Płytka studzienkowa z przesuwaną
pokrywką Primaria Naczynie do hodowli komórkowych	Corning	353802	60 mm x15 mm
Reproplate	Kitazato	83016
Pipeta serologiczna	Falcon	357551	10ml
Sterylne jednorazowe końcówki Gilsona	Eppendorf	0030 075.021	200 µ L
Zestaw rurek	Dostarczony przez laboratorium		Probówki do PCR (0,2 ml), roztwór ładujący, roztwór do płukania biopsji
Pożywka do witryfikacji	Kitazato	VT801	Roztwory równoważące i witryfikacyjne
Media ocieplające	Kitazato	VT802	Roztwory do rozmrażania i rozcieńczania