Artykuł metodologiczny

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

DOI:

10.3791/59630

⸱

13 maja 2019

 , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wskaźnik konkurencyjności jest powszechną metodą używaną do oceny przydatności bakterii i/lub zjadliwości. Użyteczność tego podejścia jest zilustrowana jego łatwością wykonania i zdolnością do standaryzacji dopasowania wielu szczepów do organizmu typu dzikiego. Technika ta jest jednak ograniczona ze względu na dostępne markery fenotypowe i liczbę szczepów, które można oceniać jednocześnie, co stwarza potrzebę przeprowadzenia dużej liczby powtórzonych eksperymentów. Równolegle z dużą liczbą eksperymentów, koszty pracy i materiałów związanych z ilościowym określaniem bakterii na podstawie markerów fenotypowych nie są bez znaczenia. Aby przezwyciężyć te negatywne aspekty, zachowując jednocześnie aspekty pozytywne, opracowaliśmy podejście oparte na molekularnym określaniu ilościowym mikroorganizmów po inżynierii markerów genetycznych na chromosomach bakteryjnych. Unikalne, 25 kodów kreskowych DNA par zasad umieszczono w nieszkodliwym locus na chromosomie dzikich i zmutowanych szczepów Salmonelli. Eksperymenty konkursowe in vitro przeprowadzono przy użyciu inokulantów składających się z połączonych szczepów. Po przeprowadzeniu zawodów liczby bezwzględne każdego szczepu zostały określone ilościowo za pomocą cyfrowego PCR, a na podstawie tych wartości obliczono wskaźniki konkurencyjności dla każdego szczepu. Nasze dane wskazują, że to podejście do ilościowego oznaczania Salmonelli jest niezwykle czułe, dokładne i precyzyjne w wykrywaniu zarówno bardzo licznych (wysoka sprawność), jak i rzadkich (niskiej sprawności) mikroorganizmów. Ponadto technikę tę można łatwo dostosować do prawie każdego organizmu z chromosomami zdolnymi do modyfikacji, a także do różnych projektów eksperymentalnych, które wymagają bezwzględnej kwantyfikacji mikroorganizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena przydatności i zjadliwości organizmów chorobotwórczych jest podstawowym aspektem badań mikrobiologicznych. Umożliwia ona dokonywanie porównań między szczepami lub między zmutowanymi organizmami, co pozwala naukowcom określić znaczenie niektórych genów w określonych warunkach. Tradycyjnie, ocena zjadliwości wykorzystuje zwierzęcy model infekcji przy użyciu różnych szczepów bakteryjnych i obserwując wynik zakażonego zwierzęcia (np. dawka zakaźna50, dawka śmiertelna50, czas do śmierci, nasilenie objawów, brak objawów itp.). Procedura ta dostarcza cennych opisów zjadliwości, ale wymaga, aby szczepy powodowały znaczne różnice w wynikach w celu wykrycia różnic w stosunku do typu dzikiego. Co więcej, wyniki są półilościowe, ponieważ podczas gdy postęp choroby i nasilenie objawów można subiektywnie określić ilościowo w czasie, interpretacja zjadliwości w porównaniu z typem dzikim jest bardziej jakościowa (tj. bardziej, mniej lub równie zjadliwy). Powszechną alternatywą dla przeprowadzania testów zakaźności zwierząt jest generowanie wskaźników konkurencyjnych (CI), wartości, które bezpośrednio porównują dopasowanie lub zjadliwość szczepu z jego dzikim odpowiednikiem w infekcji mieszanej1. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym zwierzęcym modelem infekcji poprzez standaryzację zjadliwości do szczepu typu dzikiego i określenie wartości wymiernej odzwierciedlającej stopień osłabienia. Technikę tę można również zaadaptować do analizy interakcji genów u bakterii poprzez określenie anulowanego indeksu konkurencyjnego (COI)2. Obliczenie COI dla grupy zmutowanych organizmów pozwala naukowcom określić, czy dwa geny niezależnie przyczyniają się do patogenezy, czy też są zaangażowane w ten sam szlak wirulencji i zależne od siebie. Ponadto obliczenie CI wymaga zliczenia bakterii, co może dostarczyć cennych informacji na temat patogenezy organizmów. CI i COI pozwalają również naukowcom ocenić szczepy awirulentne, które nie powodują choroby klinicznej, ale nadal mają różnice w dopasowaniu. Technika ta jest ograniczona przez zastosowanie tradycyjnych markerów oporności na antybiotyki do identyfikacji szczepów, ograniczając w ten sposób liczbę szczepów wejściowych do zaledwie jednego lub dwóch na raz. Z powodu tego ograniczenia wymagana jest duża liczba grup eksperymentalnych i powtórzeń, co oprócz zwiększenia kosztów pracy i materiałów, zwiększa również możliwości zmienności warunków eksperymentalnych i niedokładnych wyników. (Szczegółowy przegląd korzyści i zastosowań stosowania infekcji mieszanych do badania zjadliwości, dopasowania i interakcji genów można znaleźć w C.R. Beuzón i D.W. Holden 1)

Podjęto próby obejścia tego ograniczenia, takie jak użycie komórek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą cytometrii przepływowej3,4,5. Technika ta określa ilościowo komórki za pomocą 1) znakowanych przeciwciał przeciwko markerom fenotypowym lub 2) endogennie wytwarzanych białek fluorescencyjnych. Użycie znakowanych przeciwciał ma limit wykrywalności 1,000 komórek/ml, a zatem wymaga dużej liczby komórek do analizy3. Komórki wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych mają zmienioną fizjologię i są podatne na zmiany przystosowania wynikające z wysokiej ekspresji białek6. Obie metody są ograniczone liczbą markerów fluorescencyjnych wykrywalnych za pomocą cytometrii przepływowej. Postęp w kwantyfikacji molekularnej osiągnięto dzięki opracowaniu techniki mikromacierzy, która wykryła osłabienie w 120 szczepach z początkowej infekcji mieszanej ponad 1000 szczepów w modelu mysim7. Technika ta wykorzystywała analizę mikromacierzy RNA ze zmutowanych szczepów, co doprowadziło do znacznej zmienności wyników. Niemniej jednak ustalono, że duże pule infekcji mieszanych mogą być użytecznym narzędziem i że dzięki zastosowaniu czułych technik wykrywania można zidentyfikować różnice w zjadliwości bakterii. Wraz z opracowaniem sekwencjonowania nowej generacji, Tn-seq rozszerzyło użyteczność mutacji transpozonów, umożliwiając potężną metodę ilościowego oznaczania bakterii, które zostały losowo zmutowane8,9,10,11. Niedawno opracowano alternatywny protokół, który eliminuje potrzebę stosowania transpozonów, a zamiast tego wykorzystuje kody kreskowe DNA do łatwiejszej identyfikacji i śledzenia zmian genomowych oraz ich wpływu na fitness12. Technologia ta jest dużym postępem, ale wprowadzanie genomowych kodów kreskowych jest nadal procesem losowym. Aby przezwyciężyć losowość poprzednich eksperymentów, Yoon i in. opracowali metodę obliczania CI szczepów Salmonelli przy użyciu unikalnych kodów kreskowych DNA wstawionych w precyzyjnych miejscach na chromosomach bakterii13. Unikalne szczepy z kodami kreskowymi wykryto przy użyciu metody opartej na qPCR z zielonym SYBR i starterami specyficznymi dla każdego unikalnego kodu kreskowego. Technika ta była ograniczona ograniczeniami narzuconymi przez qPCR, w tym różnicami w wydajności starterów i niską czułością, o czym świadczy potrzeba zagnieżdżonego PCR przed qPCR. Niemniej jednak podejście to wykazało, że ukierunkowane modyfikacje genomu mogą zostać wykorzystane do wykrywania i potencjalnego ilościowego określania puli wielu szczepów bakteryjnych.

W poniższym protokole opisujemy nowatorską metodologię przeprowadzania eksperymentów z konkurencją bakteryjną z dużymi pulami mieszanych inokulantów, a następnie dokładnej kwantyfikacji przy użyciu bardzo czułej techniki cyfrowego PCR. Protokół polega na genetycznym znakowaniu szczepów bakteryjnych za pomocą unikalnego kodu kreskowego DNA umieszczonego w nieszkodliwym regionie chromosomu. Modyfikacja ta pozwala na szybkie i dokładne ilościowe oznaczanie szczepów przy użyciu nowoczesnej technologii molekularnej zamiast tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń, posiewu replik i liczenia jednostek tworzących kolonie, które opierają się na markerach fenotypowych (tj. oporności na antybiotyki). Modyfikacje pozwalają na jednoczesną ocenę wielu szczepów w jednym inokulum, co znacznie zmniejsza możliwość zmienności eksperymentalnej, ponieważ wszystkie szczepy są wystawione na dokładnie te same warunki. Co więcej, chociaż technika ta została opracowana w serowarze Salmonella enterica Typhimurium, jest ona wysoce elastyczna w odniesieniu do każdego genetycznie plastycznego organizmu i prawie każdego projektu eksperymentalnego, w którym wymagane jest dokładne zliczanie bakterii, zapewniając nowe narzędzie do zwiększenia dokładności i przepustowości w laboratoriach mikrobiologicznych bez ograniczeń narzuconych przez poprzednie metody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wprowadź unikalne kody kreskowe DNA do plazmidu zawierającego składniki niezbędne do wymiany alleli

UWAGA: Stworzono nowy plazmid, nazwany pSKAP, o dużej liczbie kopii i zwiększonej wydajności transformacji w porównaniu do istniejącego plazmidu wymiany allelicznej pKD13. Jest to opisane w krokach 1.1-1.12 (Rysunek 1). Sfinalizowane plazmidy zawierające unikalne kody kreskowe DNA i komponenty do wymiany alleli są dostępne w repozytorium plazmidów (tabela materiałów).

  1. Korzystając z komercyjnego zestawu do minipreparacji plazmidu, oczyść pKD1314 i pPCR Script Cam SK+ z nocnych kultur bakteryjnych wyhodowanych w bulionie Luria-Bertani (LB) uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny lub 25 μg/ml chloramfenikolu (odpowiednio dla pKD13 i pPCR Script Cam SK+) (Tabela 1).
  2. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne na obu plazmidach przy użyciu komercyjnych enzymów restrykcyjnych HindIII i BamHI zgodnie ze specyfikacjami producenta.
  3. Usuń enzymy restrykcyjne i wycięte DNA z reakcji pPCR Script Cam SK+ i oczyść szkielet plazmidu o długości 3 370 par zasad (bp) za pomocą dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia DNA zgodnie ze specyfikacjami producenta.
  4. Oddzielić fragmenty od trawienia restrykcyjnego pKD13 na 1% żelu agarozowym za pomocą komory do elektroforezy.
  5. Wizualizuj pasma za pomocą transiluminatora światła niebieskiego i wytnij fragment 1,333 pz z żelu (Rysunek 1C).
    nuta: Fragment ten zawiera gen oporności na kanamycynę po flankach FRT, wymagany do wymiany alleli chromosomów.
  6. Oczyść wycięte DNA z kroku 1.5 za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu.
  7. Aby utworzyć pSKAP, należy podwiązać oczyszczony fragment z pKD13 (z kroku 1.6) do pPCR Script Cam SK+ (z kroku 1.3) przy użyciu komercyjnej ligazy DNA T4 zgodnie ze specyfikacją producenta.
  8. Przekształć chemicznie kompetentne komórki DH5α za pomocą ligowanego plazmidu pSKAP zgodnie z protokołem producenta (Tabela 1).
  9. Rozprowadzić transformanty na płytkach agarowych LB uzupełnionych 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  10. Wybrać kolonię z płytki i rozprowadzić ją na nowej płytce agarowej LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Wybierz kolonię z tej płytki i użyj do zaszczepienia bulionu LB uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C, stale mieszając.
  11. Użyj dostępnego w handlu zestawu do miniprzygotowania plazmidu, aby oczyścić pSKAP z nocnej hodowli bakteryjnej.
  12. Przeprowadzić diagnostyczne trawienie restrykcyjne plazmidu z kroku 1.11 przy użyciu Hind III i Bam HI zgodnie ze specyfikacjami producenta. Wizualizuj fragmenty na 1% żelu agarozowym, jak w krokach 1.4-1.5.
    nuta: Całkowita wielkość pSKAP powinna wynosić 4 703 pz. Fragmenty po kroku 1.12 powinny mieć 3,370 i 1,333 pz.
  13. Zaprojektuj startery PCR do mutagenezy insercyjnej skierowanej w miejscu (SDM) (Tabela 2 i S1) w taki sposób, aby wprowadzić unikalną sekwencję DNA z 25 parami zasad w pozycji 725 pSKAP (Rysunek 2).
    nuta: DNA kodu kreskowego jest wprowadzane do plazmidu tuż poza genem oporności na kanamycynę flankowaną przez FRT, dzięki czemu kod kreskowy nie jest tracony podczas późniejszego usuwania kasety oporności na kanamycynę. W przypadku generowania nowych sekwencji kodów kreskowych należy użyć narzędzi online, aby upewnić się, że znakowane fluorescencyjnie sondy PCR specyficzne dla celu (zwane dalej po prostu "sondami") skutecznie zwiążą się z nową sekwencją. Zaprojektowane do tej pory sekwencje insercji wraz z niezbędnymi starterami do ich utworzenia przedstawiono w tabelach 2 i S1.
  14. Przygotować reakcje SDM przy użyciu komercyjnej polimerazy DNA o wysokiej wierności, pożądanych par starterów (Tabela 2) i matrycy pSKAP. Ustaw termocykler tak, aby wykonywał następujące czynności: 1) 98 °C przez 30 s, 2) 98 °C przez 10 s, 56 °C przez 15 s, 72 °C przez 2 minuty, 3) powtórz kroki 2, 24 razy, 4) 72 °C przez 5 minut, 5) trzymaj w temperaturze 4 °C.
  15. Po zakończeniu PCR zubożyć matrycę pSKAP, dodając do reakcji enzym restrykcyjny Dpn I. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 min.
    nuta: Produkty z PCR należy uwidocznić na żelu agarozowym w celu weryfikacji wielkości i czystości produktu. Kontrolne trawienie Dpn I składające się z niezmodyfikowanej matrycy pSKAP może być przeprowadzone i wykorzystane w kolejnych etapach, aby zapewnić całkowite trawienie matrycowego DNA.
  16. Użyj 5 μL produktu z kroku 1.15, aby przekształcić 100 μl komercyjnych chemicznie kompetentnych komórek DH5α zgodnie z zaleceniami producenta.
  17. Rozprowadzić transformanty na płytkach agarowych LB uzupełnionych 25 μg/ml chloramfenikolu i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  18. Wybierz kolonię (lub kolonie) z nocnych szalek i rozprowadź na pojedynczych płytkach agarowych LB uzupełnionych 25 μg/ml chloramfenikolu i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Wybierz kolonię z nocnych płytek i użyj do zaszczepienia 5 ml bulionu LB uzupełnionego 25 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować kulturę(-y) przez noc w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu.
  19. Użyj komercyjnego zestawu miniprep plazmidu, aby oczyścić plazmidy z nocnych kultur (kultur).
  20. Oczyszczone plazmidy sekwencją Sangera przy użyciu startera sekwencjonowania M13 Forward (Tabela 2). Porównaj zmutowany region z oryginalnym plazmidem i oceń dokładność insercji SDM.
  21. Po potwierdzeniu wprowadzenia i dokładności kodu kreskowego przypisz nazwę każdemu kodowi kreskowemu i plazmidowi.
    nuta: Wygenerowanym do tej pory kodom kreskowym przypisano dwuliterowe oznaczenie: AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC itd. Plazmidy z kodami kreskowymi są oznaczone jako pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC itp.
  22. Powtórz kroki 1.14-1.21, aby wygenerować żądaną liczbę kodów kreskowych DNA.

2. Wprowadź kod kreskowy DNA do chromosomu S. typhimurium

UWAGA: Wstawianie kodów kreskowych DNA na literę S. Chromosom Typhimurium uzyskuje się za pomocą metody wymiany alleli opisanej przez Datsenko i Wanner14, która została zmodyfikowana do użycia w S. Typhimurium.

  1. Określ locus na S. Genom typhimurium, do którego należy wstawić kod kreskowy DNA (Rysunek 3).
    nuta: Wybierz duży, międzygenowy region chromosomu. Unikaj regionów, które wytwarzają niekodujące RNA. W badaniu tym wykorzystano locus za umieszczonym P między resztami 1,213,840 i 1,213,861 (określonym na podstawie złożenia genomu GCA_000022165.1). Region ten był wcześniej genetycznie modyfikowany w celu trans komplementacji genów15. Alternatywnie, kod kreskowy DNA może zostać wprowadzony przy jednoczesnym zakłóceniu interesującego genu. Wymagałoby to minimalnych zmian w tym protokole i usprawniłoby tworzenie mutantów.
  2. Zaprojektuj startery PCR w celu amplifikacji unikalnego genu oporności na kanamycynę z kodem kreskowym i FRT z pożądanego plazmidu zawierającego kod kreskowy pSKAP z kroku 1.21 (Tabela 2). Dodaj 40-nukleotydowe rozszerzenia, które są homologiczne do regionu wybranego w kroku 2.1, do końca 5' każdego startera (Tabela 2).
  3. Wykonaj amplifikację przy użyciu dostępnej na rynku polimerazy o wysokiej wierności, starterów z kroku 2.2 i żądanego plazmidu zawierającego kod kreskowy pSKAP jako matrycy. Ustaw termocykler tak, aby wykonywał następujące czynności: 1) 98 °C przez 30 s, 2) 98 °C przez 10 s, 3) 56 °C przez 15 s, 4) 72 °C przez 60 s, powtórz kroki 2-4 29 razy, 5) 72 °C przez 5 minut, 6) trzymaj w temperaturze 4 °C.
  4. Po zakończeniu PCR należy zubożyć matrycę DNA za pomocą DpnI, jak opisano w kroku 1.15. Oczyść i skoncentruj DNA za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia DNA zgodnie ze specyfikacjami producenta.
  5. Zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protokołem generowania mutantów w S. Szczep Typhimurium 14028s z produktów PCR14,16,17,18.
    nuta: Nie jest konieczne, aby gen oporności na kanamycynę został wycięty z chromosomu. Jednak wycięcie genu jest minimalnie destrukcyjne dla chromosomu bakteryjnego, ponieważ powoduje powstanie blizny o długości 129 pz, która pozostawiłaby potencjalne geny w dalszej części składu. Zaleca się, aby szczep zawierający gen oporności na kanamycynę został zachowany, ponieważ może być używany do przenoszenia kodów kreskowych między szczepami za pośrednictwem transdukcji za pośrednictwem P22.
  6. Powtórz kroki 2.3 – 2.5, aby utworzyć żądane szczepy z odpowiednimi kodami kreskowymi.
    nuta: Kody kreskowe można wprowadzać do dzikiej czcionki S. Typhimurium, które można następnie poddać dalszej manipulacji genetycznej lub wprowadzić kody kreskowe do szczepów, które zostały wcześniej zmienione genetycznie.

3. Warunki rozwoju bakterii i testy konkurencji in vitro

  1. Z zapasu bakterii, smuga pożądana S. Szczepy Typhimurium, z których każdy zawiera unikalny kod kreskowy DNA na płytkach agarowych LB. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Wybierz pojedynczą kolonię z każdego szczepu i zaszczep 5 ml bulionu LB. Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C ze stałym mieszaniem.
    nuta: Korzystając z hodowli przez noc, przejdź do kroku 3.5, aby pobrać czyste genomowe DNA (gDNA) z każdego szczepu oznaczonego kodem kreskowym. Jest to konieczne do przeprowadzenia późniejszych eksperymentów walidacyjnych i kontrolnych w sekcji 6.
  3. Dla każdego testu konkursowego przenieś równą objętość każdej nocnej hodowli do sterylnej probówki o odpowiedniej wielkości. Dokładnie wymieszaj szczepy ze sobą, energicznie wirując przez co najmniej 5 s.
    nuta: Objętość każdej nocnej hodowli do przeniesienia powinna być wystarczająca dla każdego warunku i replikacji, a także do wyizolowania gDNA w celu ilościowego określenia danych wejściowych. Chociaż nie jest całkowicie konieczne mierzenie gęstości optycznej kultur, ponieważ bezwzględna liczba mikroorganizmów wejściowych zostanie określona ilościowo za pomocą cyfrowego PCR, liczba bakterii wejściowych dla każdego szczepu powinna być w przybliżeniu równa, aby uniknąć wąskich gardeł lub nierównej konkurencji na wczesnym etapie eksperymentu. Reprezentatywne testy konkurencji w tym protokole porównały tempo wzrostu 8 szczepów jednocześnie. Dodatkowe lub mniej szczepów może być konieczne dla indywidualnych projektów doświadczalnych.
  4. Przenieść 100 μl zmieszanego inokulum do 4,9 ml sterylnego bulionu LB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez żądany czas lub do pożądanej gęstości optycznej.
  5. Zebrać 500 μl inokulum przez odwirowanie przy >12 000 x g przez 1 minutę. Usunąć i wyrzucić supernatant. Przejdź natychmiast do sekcji 4 z komórkami.
  6. W żądanych punktach czasowych usunąć 500 μl podwielokrotności hodowli i zebrać komórki przez odwirowanie przy >12 000 x g przez 1 minutę. Usunąć i wyrzucić supernatant.
    >nuta: W przypadku zbierania podwielokrotności w wielu punktach czasowych, zamrozić granulki w temperaturze -20 °C lub natychmiast przejść do kroku 4.1 po każdym pobraniu.

4. Zbieranie i ilościowe oznaczanie gDNA z S. Typhimurium (z kroków 3.5 i 3.6)

  1. Zbierz gDNA z komórek za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania gDNA. Jeśli to możliwe, wykonaj opcjonalny krok zubożenia RNA.
    nuta: Zubożenie RNA nie jest konieczne; jednak obecność RNA sztucznie zwiększy stężenie DNA, prowadząc do nieprawidłowych obliczeń w kolejnych krokach. Jeśli używasz komercyjnego zestawu do oczyszczania gDNA, postępuj zgodnie z zaleceniami producenta, aby upewnić się, że kolumna nie jest przeciążona DNA. Nie jest wymagane minimalne stężenie DNA, jeśli próbka jest możliwa do określenia ilościowego w kolejnych etapach.
  2. Użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo DNA w każdej próbce.
    nuta: DNA można określić ilościowo przy użyciu dowolnej wiarygodnej metody.
  3. Oblicz liczbę kopii gDNA na podstawie wielkości genomu bakteryjnego, korzystając z następującego równania, gdzie: X to ilość DNA w ng, a N to długość dwuniciowej cząsteczki DNA (rozmiar genomu).
    figure-protocol-1
    UWAGA: 660 g/mol jest używane jako średnia masa 1 DNA pz. Mogą występować niewielkie różnice w zależności od składu nukleotydów organizmu. W Internecie dostępnych jest wiele kalkulatorów do wykonania obliczeń.

5. Projektowanie starterów i sond do ilościowego wykrywania kodów kreskowych DNA za pomocą dDigital PCR

  1. Zaprojektuj podkłady, aby wzmocnić obszar kodu kreskowego litery S. Chromosom Typhimurium za putP (ryc. 3C i tabela 2).
    nuta: Projektowanie podkładów i sond może być ułatwione dzięki licznym programom online (tabela materiałów). Jeśli wszystkie kody kreskowe są wstawione w tych samych loci, pojedynczy zestaw starterów amplifikacyjnych jest uniwersalny dla wszystkich kodów kreskowych.
  2. Projektowanie sond na bazie 6-karboksyfluoresceiny (FAM) i/lub heksachlorofluoresceiny (HEX) specyficznych dla każdego kodu kreskowego (Tabela 2 i S1).
    nuta: Czytnik kropel użyty w tym eksperymencie jest w stanie wykryć jednocześnie sondy oparte na FAM i HEX w reakcji multipleksowej. Zaprojektuj 1/2 sond tak, aby wykorzystywały FAM, a 1/2 wykorzystywały HEX. Nie jest to konieczny krok, ale jeśli zostanie wdrożony, zmniejszy zużycie odczynników i koszty eksperymentalne.
  3. Wykonaj 20 mieszanek głównych starter-sonda zawierających 1) 20 mM każdego startera do przodu i do tyłu, 2) 10 mM pojedynczej sondy FAM i 3) 10 mM pojedynczej sondy HEX (w przypadku multipleksowania).

6. Sprawdź czułość i swoistość każdego zestawu sondy Pprimer dla każdego genomowego kodu kreskowego za pomocą cyfrowego PCR

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje walidację ośmiu unikalnych kodów kreskowych z ośmioma unikalnymi sondami jako przykład. Liczba wykorzystywanych kodów kreskowych może być zwiększana lub zmniejszana, aby dostosować się do różnych projektów eksperymentalnych.

  1. Utwórz pulę gDNA, która zawiera każdy kod kreskowy z wyjątkiem jednego. Użyj tej puli jako rozcieńczalnika do wykonania serii rozcieńczeń z gDNA zawierającym pojedynczy pozostały kod kreskowy (schemat rozcieńczania próbki jest podany w Rysunek 4).
    nuta: Użycie zbiorczego gDNA jako rozcieńczalnika zapewnia spójne tło podczas ustalania wrażliwości. Korzystając z liczby kopii określonej w kroku 4.3, rozcieńczyć gDNA do liczby kopii w zalecanym zakresie digital PCR (1-100 000 kopii na 20 μl reakcji). Należy pamiętać, że zakres jest ustawiany dla każdego unikalnego celu (kodu kreskowego), a nie dla całkowitego gDNA.
  2. Przygotować reakcje do cyfrowego PCR w dwóch egzemplarzach zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stosowania cyfrowego supermiksu PCR przeznaczonego do chemii opartej na sondzie. Mieszaniny z kroku 6.1 należy wykorzystać jako matrycę DNA. Użyj 20-krotnej mieszanki wzorcowej starter-sonda z kroku 5.3, która zawiera sondę dla rozcieńczonego kodu kreskowego z kroku 6.1.
  3. Przygotować powtórzone reakcje kontrolne do cyfrowego PCR zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stosowania cyfrowego supermiksu PCR przeznaczonego do chemii opartej na sondzie. Reakcje kontrolne dla każdej mieszaniny sondy muszą składać się z: 1) kontroli bez matrycy (NTC), 2) kontroli ujemnych i 3) kontroli dodatnich.
    nuta: Minimalna liczba powtórzonych reakcji kontrolnych wynosi dwie. W tym przykładowym protokole dla każdego kodu kreskowego używane są cztery NTC, sześć kontroli ujemnych i sześć kontroli dodatnich. Kontrole ujemne powinny zawierać gDNA przy każdym kodzie kreskowym, z wyjątkiem kodu kreskowego odpowiadającego badanej sondzie. Pozwoli to zweryfikować specyficzność każdej sondy.
  4. Powtórz kroki 6.1-6.3, aby utworzyć cyfrowe reakcje PCR dla każdej próbki gDNA z kodem kreskowym. Przykładowy układ płytek jest przedstawiony w Rysunek 5.
    nuta: Ten i kolejne kroki są opisane w oparciu o specyficzną cyfrową platformę PCR, która wykorzystuje kropelki i technologię opartą na przepływie. Alternatywne cyfrowe platformy PCR, które wykorzystują technologię opartą na chipach, można łatwo zastąpić niewielkimi modyfikacjami tego protokołu. Krok 6.4 może wymagać więcej niż jednej płytki 96-dołkowej w celu walidacji wszystkich zestawów starterów. W przeciwieństwie do qPCR, oddzielne płytki analizowane za pomocą cyfrowego PCR mogą być łatwo porównywane bez potrzeby stosowania standardowych dołków referencyjnych między płytkami.
  5. Generuj kropelki dla każdego warunku reakcji za pomocą generatora kropel zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Przenieś nowo utworzone kropelki do odpowiedniej płytki 96-dołkowej. Używaj końcówek do pipet o pojemności 200 μl na pipecie wielokanałowej o pojemności 5–50 μl.
    nuta: Podczas pipetowania kropelek pipetuj powoli i płynnie! Producent cyfrowego sprzętu do PCR zaleca używanie wyłącznie pipet i końcówek do pipet określonego producenta (np. Ranin). Te końcówki do pipet mają gładki otwór i nie zawierają mikroskopijnych fragmentów plastiku, które mogą zniszczyć kropelki lub uszkodzić mikroprzepływy czytnika kropel. Zbadano wiele marek końcówek i zaobserwowano, że mają spektrum jakości wykonania. Równoważne wyniki uzyskano przy użyciu alternatywnych końcówek do pipet; Należy jednak zachować ostrożność w przypadku odstępstw od zaleceń producenta.
  7. Po wytworzeniu i przeniesieniu wszystkich kropel należy uszczelnić płytkę za pomocą zgrzewarki do płyt foliowych.
  8. Użyj termocyklera zalecanego przez producenta, aby wykonać następujące warunki cyklu: 1) 94 °C przez 10 minut; 2) 94 °C przez 1 min, prędkość narastania ustawiona na 1 °C/s; 3) 55 °C przez 2 min, prędkość narastania ustawiona na 1 °C/s; 4) powtórz kroki 2 i 3 49 razy; 5) 98 °C przez 10 min; 6) przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 h.
    nuta: Przenikanie ciepła w reakcji kropelkowej to nie to samo, co standardowy PCR. Warunki reakcji mogą wymagać modyfikacji.
  9. Podczas wykonywania termocyklingu zaprogramuj oprogramowanie do analizy danych z informacjami o konfiguracji płytki, takimi jak nazwa próbki, typ eksperymentu (kwantyfikacja bezwzględna), zastosowany supermiks, nazwa celu 1 (nazwa kodu kreskowego FAM), typ celu 1 (NTC, kontrola pozytywna, kontrola ujemna lub nieznana), nazwa celu 2 (nazwa kodu kreskowego HEX), typ celu 2 (ślepa próba, kontrola dodatnia, kontrola ujemna lub nieznana). Końcowe informacje o konfiguracji płyty są pokazane w Rysunek 5.
  10. Po zakończeniu termocyklingu przenieś zakończone reakcje do czytnika kropel i rozpocznij proces odczytu zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Ilościowe określenie liczby bakterii w eksperymencie z indeksem konkurencyjności

  1. Rozcieńczyć gDNA wyizolowane i oznaczone ilościowo z sekcji 4 do odpowiedniego stężenia, jak opisano powyżej.
  2. Przygotować reakcje do cyfrowego PCR zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stosowania odpowiedniego supermiksu. Użyj DNA z kroku 7.1 jako szablonu. Użyj jednej 20-krotnej mieszanki głównej starter-sonda, która zawiera sondę (lub sondy, jeśli wykrywają zarówno FAM, jak i HEX) dla możliwych kodów kreskowych obecnych w eksperymencie.
  3. Przygotuj dodatkowe cyfrowe reakcje PCR, jak w kroku 7.2, używając różnych 20-krotnych mieszanek głównych starter-sonda, aż do wykrycia wszystkich kodów kreskowych wykorzystanych w projekcie eksperymentalnym.
  4. Uwzględnij kontrolki dla każdego warunku, jak opisano w 6.3. Obejmuje to: 1) brak kontroli wzorcowych (NTC), 2) kontrole ujemne i 3) kontrole pozytywne.
  5. Kontynuuj zgodnie z protokołem opisanym w krokach 6.5-6.10.

8. Analizuj cyfrowe dane PCR i obliczaj bezwzględne liczby kopii

  1. Po odczytaniu wszystkich studzienek i zakończeniu przebiegu otwórz plik danych .qlp za pomocą oprogramowania do analizy danych.
    nuta: Opisane tutaj typy plików i procedury analizy danych są specyficzne dla jednego producenta cyfrowego PCR. W przypadku korzystania z alternatywnych cyfrowych platform PCR, typy plików i procedury analizy danych będą specyficzne dla używanej platformy i powinny być wykonywane zgodnie ze specyfikacjami zalecanymi przez producenta.
  2. Wybierz wszystkie studzienki, które wykorzystują tę samą mieszankę główną starter-sonda.
  3. Na karcie Krople sprawdź liczbę kropel analizowanych w każdym dołku (zarówno krople dodatnie, jak i ujemne). Wyklucz z analizy każdą studnię, która ma mniej niż 10 000 kropel ogółem.
  4. Przejdź do zakładki Amplituda 1D i zbadaj amplitudy dodatnich i ujemnych kropel. Upewnij się, że składają się one z dwóch odrębnych populacji.
  5. W oprogramowaniu użyj funkcji progowania, aby utworzyć granicę między dodatnimi i ujemnymi kroplami dla każdej użytej sondy ( Rysunek 6).
    nuta: Wszystkie studzienki, które używają tej samej mieszanki głównej starter-sonda z kroku 5.3, powinny mieć te same progi.
  6. Po zastosowaniu odpowiednich progów do wszystkich studzienek, oprogramowanie obliczy liczbę kopii DNA w każdej reakcji. Eksport danych do arkusza kalkulacyjnego w celu ułatwienia dalszej analizy.
    nuta: Oprogramowanie do analizy danych wykorzystuje liczbę dodatnich i ujemnych kropel, które są dopasowane do rozkładu Poissona, w celu określenia liczby kopii.
  7. Korzystając z wartości z kroku 8.6, oblicz początkową liczbę kopii każdego unikalnego genomowego kodu kreskowego w próbce. Oznaczyć średni odsetek wyników fałszywie dodatnich z ujemnych reakcji kontrolnych i odjąć tę wartość od wartości uzyskanych w reakcjach eksperymentalnych. W razie potrzeby należy pomnożyć wartości w oparciu o rozcieńczenia, które zostały przeprowadzone podczas przygotowywania każdego eksperymentu (Tabela 3).

9. Określ względną przydatność organizmu, obliczając CI lub COI na podstawie cyfrowej kwantyfikacji szczepów z kodami kreskowymi opartej na PCR

  1. Obliczyć CI szczepu oznaczonego kodem kreskowym, korzystając z następujących wzorów, gdzie:Wyjście to bezwzględna kwantyfikacja szczepu oznaczonego kodem kreskowym w danym punkcie czasowym,Wyjście WT to bezwzględna kwantyfikacja bakterii typu dzikiego z kodem kreskowym w tym samym punkcie czasowym,Wejście A to bezwzględna kwantyfikacja inokulum wejściowego szczepu oznaczonego kodem kreskowym,Wejście WT to bezwzględna kwantyfikacja inokulum wejściowego bakterii typu dzikiego z kodem kreskowym, X Output to suma wszystkich szczepów w tym samym punkcie czasowym, XInput to suma całkowitego inokulum wejściowego wszystkich szczepów oznaczonych kodem kreskowym.

figure-protocol-2
figure-protocol-3
nuta: Zapoznaj się z dyskusją, aby zapoznać się z zaletami, wadami i najbardziej odpowiednim zastosowaniem każdej formuły.

  1. Powtórz krok 9.1 dla każdego szczepu z kodem kreskowym we wszystkich punktach czasowych.
  2. W stosownych przypadkach należy obliczyć COI, stosując następujące wzory, gdzie: AWynik jest bezwzględną kwantyfikacją szczepu oznaczonego kodem kreskowym ze zmutowanym genem A w danym punkcie czasowym, ABWynik jest bezwzględną kwantyfikacją szczepu oznaczonego kodem kreskowym ze zmutowanymi genami A i B w tym samym punkcie czasowym, AWynik wejściowy jest bezwzględną kwantyfikacją inokulum wejściowego szczepu oznaczonego kodem kreskowym ze zmutowanym genem A, Wejście AB to bezwzględna kwantyfikacja inokulum wejściowego szczepu z kodem kreskowym ze zmutowanymi genami A i B,Wynik B to bezwzględna kwantyfikacja szczepu z kodem kreskowym ze zmutowanym genem B w danym punkcie czasowym, aB Input to bezwzględna kwantyfikacja inokulum wejściowego szczepu z kodem kreskowym ze zmutowanym genem B.

figure-protocol-4
ORAZ/LUB
figure-protocol-5

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie tej metodologii wymaga przeprowadzenia odpowiednich reakcji kontrolnych w celu sprawdzenia czułości i swoistości każdej sondy używanej do identyfikacji docelowego DNA. W tym reprezentatywnym eksperymencie zwalidowaliśmy osiem unikalnych kodów kreskowych DNA z ośmioma odpowiadającymi im sondami do identyfikacji. Wszystkie osiem sond miało niski odsetek wyników fałszywie dodatnich zarówno w NTC, jak i w reakcjach kontroli negatywnej (Tabela 3), co podkreśla ich specy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do dokładnego ilościowego oznaczania mikroorganizmów ma ogromne znaczenie dla badań mikrobiologicznych, a możliwość wyliczenia unikalnych szczepów z początkowej populacji mieszanej okazała się nieocenionym narzędziem do oceny cech dopasowania i zjadliwości bakterii. Jednak techniki umożliwiające osiągnięcie tego celu nie rozwijają się w tempie nowoczesnych osiągnięć biologii molekularnej. Technologia umożliwiająca łatwą modyfikację chromosomów wielu bakterii, w tym S. Typhimurium jest dostępne od prawie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez George F. Haddix President's Faculty Research Fund oraz National Institute of General Medical Science of the National Institutes of Health (NIH) pod numerem nagrody GM103427. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlEppendorf22600028Zaopatrz się u dowolnego producenta
16 ml probówek hodowlanychMidSci8599Kup od dowolnego producenta
5-200 μ L końcówki do pipetRAININ30389241Kupuj alternatywne marki końcówek z ostrożnością w oparciu o jakość produkcji
5-50 μ Pipeta wielokanałowaL RAININ17013804Używaj ostrożnie alternatywnych pipet wielokanałowych
AgarozaThermoFisherScientific BP160-500Zakup od dowolnego producenta
Analiza BLASTNCBINie dotyczyhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Termocykler dotykowy C1000 z modułem reakcyjnym 96-studniowejBio Rad1851197Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
Chemicznie kompetentny DH5αInvitrogen18258012Zaopatrz się w dowolny producent lub przygotuj się samodzielnie
ChloramfenikolThermoFisher ScientificBP904-100Zaopatrz się w dowolny producent
Cytation5 Czytnik mikropłytekBioTekCYT5MFKup od dowolnego producenta, użyj dowolnego systemu zdolnego do dokładnego ilościowego określenia
oprogramowania do analizy danych DNA (QuantaSoft i QuantaSoft Data Analysis Pro)Bio RadNie dotyczyNależy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
Płytki 96-dołkowe ddPCRBio Rad12001925Należy zaopatrywać się w materiały ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
ddPCR Droplet Reader OilBio Rad1863004Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Bio Rad1863024Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
Wkłady DG8 do generatora kropel QX200/QX100Bio Rad1864008Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
Uszczelki DG8 do generatora kropel QX200/QX100Bio Rad1863009Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
Olej do wytwarzania kropelek do sondBio Rad1863005Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
KanamycynaThermoFisher ScientificBP906-5Zaopatrz się w dowolny producent
Agar Luria-BertaniThermoFisher ScientificBP1425-2Zaopatrz się w dowolny producent lub zrób to sam z agaru, tryptonu, trawienia drożdży i
NaCl Bulion Luria-BertaniThermoFisher ScientificBP1426-2Zaopatrz się w dowolny producent lub zrób to sam z tryptonu, trawienia drożdży i NaCl
Zgrzewanie płytowe PCR, folia, przebijalneBio Rad1814040Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
Probówki do PCREppendorf951010022Zaopatrz się w płytki
PetriegoThermoFisher ScientificFB0875712Kup od dowolnego producenta
pPCR Script Cam SK+Stratagene/Agilent211192Produkt nie jest już dostępny w handlu
Wzór podkładu/sondyIDTNie dotyczyhttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP i pSKAP_BarcodesNumeryplazmidów Addgene 122702-122726www.addgene.org
Uszczelniacz płytek PCR PX1Bio Rad1814000Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
QX200 Generator kropelBio Rad1864002Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
QX200 Czytnik kropelekBio Rad1864003Należy zakupić materiały ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.
Salmonella typhimurium szczep ATCC 14028sATCCATCC 14028swww.atcc.org
Take3 Micro-Volume PlateBioTekTAKE3Zaopatrz się od dowolnego producenta, użyj dowolnego systemu zdolnego do dokładnego ilościowego oznaczania DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHIThermoFisher ScientificFERFD0054Zaopatrz się od dowolnego producenta
Thermo Scientific FastDigest DpnIThermoFisher Scientific FERFD1704Zaopatrz się u dowolnego producenta
Thermo Scientific FastDigest HindIIIThermoFisher ScientificFERFD0504Zaopatrz się w dowolny producent
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro KitThermoFisher ScientificFERK0832Kup od dowolnego producenta
Thermo Scientific GeneJet Miniprep KitThermoFisher NaukoweFERK0503Zaopatrz się od dowolnego producenta
Thermo Scientific Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościThermoFisher ScientificF534LZaopatrz się od dowolnego producenta
Thermo Scientific T4 Ligaza DNAThermoFisher ScientificFEREL0011Zaopatrz się od dowolnego producenta
TermocyklerBio Rad1861096Kup od dowolnego producenta
Oświetlacz UVP Visi-BlueThermoFisher ScientificUV95043301Lub inny transiluminator, który umożliwia wizualizację DNA
Woda, Biologia molekularnaKlasa ThermoFisher Scientific BP28191Zaopatrz się w dowolnego producenta
dowolnego producenta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303(2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767(2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308(2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Salmonella FitnessBacterial QuantificationDNA BarcodesStrain CompetitionGenetic MarkersDroplet ReaderData Analysis

Powiązane artykuły