Ten artykuł opisuje rozwój metody wywoływania ostrej lub przewlekłej choroby suchego oka u królików poprzez wstrzykiwanie konkanawaliny A do wszystkich części układu gruczołu łzowego oczodołu. Ta metoda, lepsza od już opisanych, generuje powtarzalny, stabilny model suchego oka, odpowiedni do badania środków farmakologicznych.
Artykuł metodologiczny
Króliczy model zespołu suchego oka z niedoborem wody wywołanej wstrzyknięciem konkanawaliny A do gruczołów łzowych: zastosowanie do badań skuteczności leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Suche oko (DED), wieloczynnikowa choroba zapalna powierzchni oka, dotyka 1 na 6 ludzi na całym świecie, co ma oszałamiające konsekwencje dla jakości życia i kosztów opieki zdrowotnej. Brak informacyjnych modeli zwierzęcych, które podsumowują jego kluczowe cechy, utrudnia poszukiwanie nowych środków terapeutycznych dla DED. Dostępne modele zwierzęce DED mają ograniczoną odtwarzalność i skuteczność. Przedstawiono tutaj model, w którym DED jest indukowany przez wstrzyknięcie mitogenu konkanawaliny A (Con A) do oczodołowych gruczołów łzowych królików. Innowacyjnymi aspektami tego modelu jest zastosowanie wskazówek ultrasonograficznych (US) w celu zapewnienia optymalnego i powtarzalnego wstrzykiwania Con A do dolnego gruczołu łzowego; wstrzyknięcie Con A do wszystkich oczodołowych gruczołów łzowych, co ogranicza kompensacyjną produkcję łez; oraz stosowanie okresowych powtórnych wstrzyknięć Con A, które przedłużają stan DED do woli. DED i jego odpowiedź na czynniki testowe są monitorowane za pomocą panelu parametrów, które oceniają produkcję łez, stabilność filmu łzowego oraz stan błony śluzowej rogówki i spojówek. Należą do nich osmolarność łez, czas rozpadu łez, próba łez Schirmera, barwienie różanego bengalu i poziom laktoferyny we łzach. Indukcja DED i monitorowanie jego parametrów są szczegółowo opisane. Ten model jest prosty, solidny, powtarzalny i pouczający. Ten model zwierzęcy jest odpowiedni do badania fizjologii łez i patofizjologii DED, a także do oceny skuteczności i bezpieczeństwa potencjalnych środków do leczenia DED.
Wprowadzenie
Suche oko (DED) jest przewlekłym schorzeniem o wysokiej częstości występowania i zachorowalności1,2,3,4. Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w jego patogenezie5,6. Patofizjologia DED jest konceptualizowana jako wynikająca z niedostatecznej produkcji lub nadmiernego parowania łez; pierwsza z nich jest również znana jako DED7. Zespół Sjögrena, szeroko badana prototypowa przyczyna DED, atakuje przede wszystkim gruczoły łzowe (LG) i jest uderzającym przykładem ich znaczenia w patogenezie DED. DED jest często leczony sztucznymi łzami, które zapewniają tymczasową ulgę, lub cyklosporyną lub lifitegrastem, które hamują stan zapalny oka. Żadna z dostępnych metod leczenia DED nie jest optymalna, co wymaga opracowania nowych leków8,9.
Poszukiwanie nowych środków terapeutycznych dla DED jest utrudnione przez trzy główne wyzwania: brak rozpoznanego celu molekularnego nadającego się do leczenia, który może być nieuchwytny ze względu na patofizjologiczną złożoność DED; rzadkość obiecujących środków; oraz brak modeli zwierzęcych, które podsumowują kluczowe cechy DED.
Podobnie jak w przypadku większości wysiłków związanych z rozwojem leków, informacyjne modele zwierzęce DED są kluczowym narzędziem badawczym, pomimo aksjomatycznego stwierdzenia, że żaden model zwierzęcy nie podsumowuje całkowicie ludzkiej choroby. Modele DED na myszach, szczurach i królikach są najczęściej używane, podczas gdy psy i naczelne są używane rzadko10,11. Większość z ponad 12 zgłoszonych do tej pory modeli DED królików próbuje zmniejszyć produkcję łez poprzez usunięcie LG lub utrudnienie ich funkcji12,13,14,15,16. Do takich podejść zalicza się chirurgiczną resekcję ILG; zamknięcie przewodu wydalniczego; oraz upośledzenie funkcji LG przez napromieniowanie lub wstrzyknięcie jednego z poniższych: aktywowanych limfocytów, mitogenów, toksyny botulinowej, atropiny lub benzalklonium. Głównymi ograniczeniami tych metod są ich niespójność i częste częściowe zahamowanie produkcji łez.
Concanavalin A (Con A), lektyna pochodzenia roślinnego, jest silnym stymulatorem podzbiorów limfocytów T i była używana w eksperymentalnych modelach zapalenia wątroby17 i DED18. Oryginalny model oparty na Con A miał oferować znaczące korzyści, w tym względną prostotę; napływ komórek zapalnych w LG, naśladując choroby takie jak choroba Sjögrena; stymulacja cytokin prozapalnych IL-1β, IL-8 i TGF-β1; zmniejszona funkcja łez monitorowana poprzez pomiar klirensu fluoresceiny łez i czasu rozpadu łez (TBUT); i odpowiedź na lek wykazana dla przeciwzapalnego kortykosteroidu.
Gdy ta obiecująca metoda została zastosowana, oprócz jej zalet, zidentyfikowano ograniczenia, które wymagały jej ogólnej rewizji i drastycznych ulepszeń. Udokumentowano trzy krytyczne niedociągnięcia tej metody. Po pierwsze, model był ostry; indukowany DED ustąpił po około 1 tygodniu. Po drugie, reakcja zwierząt była niespójna. Jak wykazano, w "ślepych" wstrzyknięciach przezskórnych do dolnego LG (ILG), Con A był dostarczany tylko losowo do docelowego gruczołu. Szczegółowe badania anatomii ILG wykazały, że jego rozmiar może różnić się nawet 4-krotnie19, co sprawia, że takie zastrzyki są "trafione". Wreszcie, nawet po wstrzyknięciu ILG, lepszy LG (SLG) często kompensował zmniejszony przepływ łez, co sprawiało, że model był problematyczny.
Te kluczowe ograniczenia zostały przezwyciężone poprzez wprowadzenie trzech modyfikacji do metody, generując lepszy model zwierzęcy DED. Po pierwsze, wstrzyknięcie Con A do ILG przeprowadzono pod kontrolą ultrasonograficzną (US), zapewniając, że Con A dostanie się do gruczołu. Powodzenie wstrzyknięcia zostało potwierdzone przez uzyskanie obrazu US po wstrzyknięciu, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Po drugie, aby usunąć kompensacyjny wkład łzowy SLG, zarówno do części powiekowej, jak i oczodołowej tego gruczołu wstrzyknięto Con A. Wreszcie, ten ostry model DED został przekształcony w przewlekły przez wielokrotne wstrzyknięcia Con A co 7-10 dni. DED trwający 2 miesiące jest łatwo osiągany u tych królików. Sukces tego podejścia został obszernie udokumentowany19.
Jak już wspomniano, ważnym zastosowaniem zwierzęcych modeli DED jest określenie skuteczności i bezpieczeństwa potencjalnych środków terapeutycznych. Użyteczność tego modelu została zademonstrowana w badaniu fosfosulindaku (OXT-328), nowego przeciwzapalnego leku o małej cząsteczce20,21 podawanego w postaci kropli do oczu. Jego skuteczność wykazano na podstawie panelu parametrów DED19. Względna prostota i informacyjny charakter tego modelu pozwoliły również na porównanie fosfosulindaku z dwoma zatwierdzonymi przez FDA lekami na DED, cyklosporyną i lifitegrastem, wykazując jego silną przewagę przedkliniczną.
Protokół
Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Stony Brook i przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Zwierzęta i pomieszczenia
- Zdobądź króliki nowozelandzkie białe (NZW) o wadze 2-3 kg.
- Trzymaj króliki pojedynczo w klatkach z ścisłą kontrolą temperatury (65 ± 5 °F) i wilgotności (45 ± 5%). Oświetlenie powinno mieć 12-godzinny cykl włączania/wyłączania.
- Zapewnij nieograniczony dostęp do wody i standardowej karmy dla królika. Wyeliminuj dodatki dietetyczne, ponieważ mogą one zawierać witaminę A, która wpływa na wzrok.
- Zwierzęta należy aklimatyzować przez co najmniej 2 tygodnie przed pomiarami wyjściowymi lub indukcją zespołu suchego oka.
2. Metody znieczulenia i eutanazji
UWAGA: Wszystkie procedury wymagają łagodnego uspokojenia, z wyjątkiem iniekcji Con A, która wymaga umiarkowanej sedacji.
- W celu łagodnego uspokojenia należy wstrzyknąć acepromazynę (1 mg/kg) podskórnie na ramiona za pomocą igły o rozmiarze 26G. Punkt końcowy dla łagodnej sedacji: zwierzęta utrzymują zrelaksowaną pozycję głowy, a płatki uszu nie są już w pełni wyprostowane.
UWAGA: Jeśli odpowiedni punkt końcowy nie zostanie osiągnięty, można podać dodatkowe wstrzyknięcie acepromazyny. Zwierzęta powinny zawsze pozostawać przytomne, reagować na dotykanie wąsów i nigdy nie wykazywać spowolnionego oddechu. - W celu umiarkowanego uspokojenia najpierw podaj zwierzętom acepromazynę, jak powyżej. Po osiągnięciu punktu końcowego (patrz uwaga powyżej) podać izofluran za pomocą maski gazowej o przepływieO2 ustawionym na 1 l/min i podawaniu izofluranu ustawionym na 5% (Rysunek 2).
- Podawaj izofluran do momentu, gdy odcień ciała królika zostanie całkowicie rozluźniony, a uszy będą całkowicie oklapnięte.
UWAGA: Nie powinny występować kompensacyjne ruchy mięśni, gdy zwierzę jest obrócone na bok; Oddech zawsze pozostaje spontaniczny. - Spontaniczne ożywienie następuje w ciągu 2-5 minut: objawy obejmują spontaniczne ruchy głowy i zwiększone lub normalne napięcie mięśniowe. Po zakończeniu procedury eksperymentalnej z umiarkowaną sedacją obserwuj króliki przez około 30 minut lub do momentu, gdy ich zachowanie wróci do normy.
UWAGA: Maść okulistyczna nie jest wymagana podczas żadnej z form sedacji. 1) W łagodnym uspokojeniu zwierzęta są nadal czujne i utrzymują odruch mrugania. W umiarkowanej sedacji zahamowanie odruchu mrugania jest tak krótkie, że powierzchnia oka nie jest zagrożona. 2) Umieszczenie maści okulistycznej na powierzchni oka wyklucza uwidocznienie struktur ocenianych podczas badania. - Eutanazja: Przedawkować dożylnie pentobarbital (100 mg/kg).
3. Usunięcie błony ochronnej
- Usuń rogówkę w okresie aklimatyzacji (zwykle w pierwszym tygodniu), aby umożliwić pełną i dokładną ocenę rogówki.
- Iniekcja do prawej błony naszywkowej
UWAGA: Jeśli ma zostać usunięta błona nazębna obu oczu, najprościej jest to zrobić podczas jednej sesji. Zacznij od jednego oka i postępuj zgodnie z opisem. Dla jasności opisu, ta metoda zaczyna się od prawego oka.- Umieść królika w odpowiedniej wielkości torbie krępującej.
- Wywołać łagodną sedację zgodnie z opisem w kroku 2.1.
- Nanieś 25 μl lidokainy bez konserwantów na prawe oko za pomocą mikropipety.
- Umieść elastyczny wziernik z drutu między powiekami.
- Za pomocą kleszczy 0,3 (lub odpowiednika) chwyć błonę nazębną na jej wierzchołku i rozciągnij ją nad rogówką.
- Wstrzyknij lidokainę 1% z epinefryną w proporcji 1:100 000 podspojówkowo do podstawy błony mitynacyjnej za pomocą ostrej igły o rozmiarze 26 (Rysunek 3A). Nad błoną nazębną powinien uformować się umiarkowany pęcherzyk.
- Usuń wziernik.
- Wykonać identyczne wstrzyknięcie do lewej błony naszywkowej.
- Przecięcie błony naszywkowej
- Po około 5 minutach umieść wziernik pokrywki z powrotem w prawym oku. Chwyć i wsuń błonę nazębną na jej wierzchołku za pomocą kleszczy 0,3 (lub podobnych).
- Odetnij błonę naszywkową u podstawy za pomocą nożyczek Westcotta lub ich odpowiednika (Rysunek 3B).
UWAGA: Krwawienie jest minimalne i zazwyczaj nie wymaga kauteryzacji. Niemniej jednak kauteryzacja baterii wysokotemperaturowej jest zawsze przechowywana w pobliżu na wypadek, gdyby potrzebna była dodatkowa hemostaza. - Usuń wziernik.
- Umieść miejscową maść z antybiotykiem na oku (np. neomycyną, polimyksyną, bacytracyną i hydrokortyzonem).
- Pozostaw gruczoł Hardera nienaruszony. Gruczoł Hardera jest czasami widoczny, gdy błona naszywkowa jest cofnięta.
UWAGA: Jeśli po usunięciu błony nosowej lub górnej okolicy podspojówkowej obserwuje się dużą białą masę lub uniesienie tkanki, oznacza to, że błona została wycięta zbyt blisko jej podstawy, co pozwoliło gruczołowi Hardera na samoistne wypadnięcie. Aby temu zapobiec w kolejnych procedurach, pozostaw więcej błony naszywkowej u podstawy. - Pozwól powierzchni oka zagoić się przez co najmniej 1 tydzień przed wykonaniem dalszych manipulacji lub wykonaniem testów powierzchni oka.
4. Pomiar parametrów suchego oka i pobieranie próbek łez
UWAGA: Mierz parametry DED w oparciu o potrzeby protokołu badania (np. na początku badania i w określonych punktach czasowych później). Pomiary dla DED należy wykonywać w następującej kolejności, z rygorystycznym wysiłkiem, aby za każdym razem wiernie je odtworzyć. Przetestuj wszystkie zwierzęta mniej więcej o tej samej porze dnia (± 1 godzinie), aby zminimalizować zmiany okołodobowe. Pomiary te zwykle wymagają zespołu składającego się z dwóch badaczy.
- Umieść królika w torbie krępującej. Wywołaj łagodne uspokojenie.
- Osmolarność łez22
- Ręcznie mrugnij powiekami 5-10 razy, aby równomiernie rozprowadzić warstwę łez na powierzchni oka.
- Delikatnie schuj dolną pokrywę.
- Próbka łez za pomocą osmometru TearLab na styku spojówki powiekowej i opuszkowej wzdłuż dolnego sklepienia, tuż za podstawą ściętej błony nazębnej.
- Zmierz osmolarność za pomocą testu osmolarności TearLab zgodnie z instrukcjami producenta.
- Czas rozpadu łez (TBUT)
- Przyciemnij pomieszczenie do tego testu.
- Umieść druciany wziernik powieki między powiekami.
- Nanieś kroplę 0,2% fluoresceiny o objętości 50 μl na powierzchnię rogówki za pomocą mikropipety. Jeśli pierwsza kropla nie zapewnia równomiernego rozprowadzenia fluoresceiny na rogówce, należy umieścić drugą kroplę.
- Natychmiast uruchom minutnik.
- Obserwuj film łzowy przed rogówką w niebieskim świetle. TBUT definiuje się jako czas potrzebny do powstania czarnych kropek, linii lub oczywistego przerwania filmu fluoresceinowego (Rysunek 4). W razie potrzeby użyj lup chirurgicznych, które zapewniają powiększenie +1,50, aby lepiej uwidocznić wczesne oznaki rozpadu. Monitorowanie do 1 minuty; jeśli zerwanie zgodnie z opisem nastąpi po 1 minucie, zapisuj TBUT tylko przez 60 sekund.
- Test łez Schirmera (STT)
- Nanieś 25 μl kropli lidokainy bez konserwantów na powierzchnię oka.
- Umieść włócznię chirurgiczną z komórek Wecka w dolnej dziurce, aby wchłonąć resztki lidokainy i płyn łzowy. W razie potrzeby użyj dolnej powieki, aby zakryć proksymalny koniec gąbki, aby pomóc utrzymać ją na miejscu (Rysunek 5A).
- Po około 30 s wyjmij gąbkę Weck.
- Natychmiast włóż pasek testowy na łzy Schirmera w przestrzeń między rogówką a spojówką powiekową w środkowym punkcie dolnej powieki.
- Natychmiast uruchom licznik czasu (Rysunek 5B).
- Po 5 minutach zmierz długość zwilżonej części paska; jest to wartość STT.
- Wykonaj pomiary w trzech egzemplarzach i podaj średnią z 3 odczytów jako wartość STT.
- Pobieranie próbek łez
- W celu pobrania próbek łez w celu oznaczenia poziomów różnych zawartych w nich analitów, takich jak laktoferyna, po zarejestrowaniu wartości STT po 5 minutach, należy pozostawić pasek na miejscu do uzyskania zwilżenia co najmniej 20 mm.
UWAGA: Jeśli po indukcji DED nie nastąpi odpowiednie zwilżenie, wsuń pasek głębiej w dolną szczelinę, aby pomóc osiągnąć ten punkt końcowy w rozsądnym czasie. - Pokrój zwilżony pasek i natychmiast umieść go w 490 μl schłodzonego buforu do zbierania łez (4% BSA, 1M NaCl, 0,1% Tween-20 w PBS z koktajlem inhibitorów proteinazy).
- Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie można je przechowywać w temperaturze -80 °C, gdzie powinny pozostać do czasu oznaczenia.
- W celu pobrania próbek łez w celu oznaczenia poziomów różnych zawartych w nich analitów, takich jak laktoferyna, po zarejestrowaniu wartości STT po 5 minutach, należy pozostawić pasek na miejscu do uzyskania zwilżenia co najmniej 20 mm.
- Barwienie różą bengalską (RBS)
- Nałóż 50 μl 1% lidokainy bez konserwantów na rogówkę za pomocą mikropipety.
- Po 30 s umieść 25 μl 1% róży bengalskiej na powierzchni oka i ręcznie mrugnij powieką, aby równomiernie ją rozprowadzić.
- Natychmiast uruchom minutnik.
- Po 3,5 minuty umieść wziernik z drucianą pokrywką między pokrywkami.
- Po 4,0 minutach sfotografuj górną powierzchnię spojówki i rogówki (Rysunek 6).
UWAGA: Dostosuj do typu używanej kamery. Typowe ustawienia: cyfrowa lustrzanka jednoobiektywowa, tryb preselekcji przysłony (przysłona 13 lub większa), ISO 6000, obiektyw makro 100 mm z dwoma rurkami przedłużającymi 12,5 mm, tryb ręcznego ustawiania ostrości, obiektyw przy maksymalnym powiększeniu i podświetlenie z makro/pierścieniowej lampy błyskowej ustawione na automatyczne w trybie przez obiektyw. Lampa ostrości pierścieniowej lampy błyskowej jest włączona, aby pomóc w ustawieniu ostrości na rogówce. - Wykonaj wszystkie zdjęcia dla obu oczu w ciągu 1 minuty.
- Oceń barwienie powierzchni oka za pomocą metody NEI23 zmodyfikowane w następujący sposób. Nie oddzielaj stref spojówek stopnia 6. Oceń górną spojówkę każdego oka. Jest to część powierzchni spojówki, którą można łatwo sfotografować bez manipulowania kulą ziemską. Manipulacja może w sposób sztuczny zmienić zabarwienie powierzchni oka.
- Poziom laktoferyny łzowej jest zastępczą miarą produkcji łez przez gruczoły łzowe. Otrzymuj laktoferynę łzową we łzach zebranych jak powyżej, używając testu immunoenzymatycznego 24 zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Indukcja i leczenie zespołu suchego oka
UWAGA: Trzy części systemu gruczołu łzowego oczodołu są wstrzykiwane.
- Uspokoić króliki acepromazyną w dawce 0,2 mg/kg podskórnie.
- Odetnij sierść w okolicy okołooczodołowej i skóry głowy i całkowicie usuń wszelkie pozostałości futra za pomocą Naira. Pozostaw skórę całkowicie gładką, aby uzyskać lepszą wizualizację anatomicznych cech charakterystycznych i wstrzyknięcie konkanawaliny A pod kontrolą USG (Ryc. 7).
- Wywołaj umiarkowaną sedację, jak opisano powyżej.
- Iniekcja w część powiekową gruczołu łzowego górnego (PSLG)
UWAGA: Najpierw należy wykonać wstrzyknięcie PSLG.- Nałóż na odpowiednie oko 25 μl lidokainy 1% bez konserwantów za pomocą mikropipety.
- Odczep górną powiekę i delikatnie uciskaj przyśrodkowo tylną krawędź oczodołu, aż pojawi się wypukłość oznaczająca część powiekową gruczołu. PSLG pojawia się jako małe bulwiaste wzniesienie w tylnej (skroniowej) części górnej powieki.
UWAGA: Aby wyświetlić tkankę gruczołu podczas procesu uczenia się, nałóż 5% fluoresceiny na obszar (Rysunek 8A). Z bulwiastego PSLG spływają łzy. Stosowanie fluoresceiny nie jest konieczne do podawania Con A; Odbywa się to wyłącznie w celach ilustracyjnych, aby pokazać tkankę gruczołu. - Za pomocą kleszczyków o drobnych zębach i igły o rozmiarze 27 na strzykawce tuberkulinowej bezpośrednio penetruj gruczoł za pomocą dostępu przezspojówkowego. Wsuń igłę o 2 mm w tkankę i wstrzyknij 500 μg Con A w objętości 0,1 ml (Rysunek 8B).
UWAGA: To wstrzyknięcie może być czasami bolesne. Jeśli to konieczne, należy trzymać zwierzęta pod izofluranem do czasu zakończenia tego wstrzyknięcia.
- Iniekcja gruczołu łzowego górnego (OSLG)
UWAGA: OSLG następuje w szybkim tempie.- Zastosuj przyśrodkowy nacisk na kulę ziemską, powodując wysunięcie OSLG z tylnego wcięcia (zobacz ref25 dla anatomii, jeśli to konieczne). Zastosuj przyśrodkowy nacisk na kulę ziemską (Rysunek 9, czerwona strzałka) z wypukłością OSLG od tylnego wcięcia. Wypukłość służy jako lokalizacja brutto w celu znalezienia tylnego nacięcia.
- Użyj zakrzywionych kleszczy z zamkniętymi końcówkami, aby wciąć obszar, aż wyczujesz kostny otwór w czaszce. Będzie to podobne do szczeliny z kierunkiem przednim/tylnym pod wypukłością.
- Zastosuj niewielki nacisk kleszczami, aby pozostawić wgłębienie w skórze, które posłuży jako punkt orientacyjny do umieszczenia igły (Rysunek 10A).
- Włóż igłę (strzykawkę tuberkulinową z igłą o rozmiarze 27, 5/8 cala) prostopadle do skóry nad znakiem wgłębienia (Rysunek 10B) ~ 1/4 cala w nacięcie, a następnie przekieruj igłę do tyłu i na zewnątrz w kierunku bocznego kantu, dążąc do punktu środkowego między miejscem wstrzyknięcia a kostną krawędzią oczodołu.
UWAGA: Jeśli wcięcie nie jest precyzyjnie wymierzone igłą, czaszka blokuje jego postęp. - Po dotarciu do piasty igły powoli wstrzyknij 1000 μg Con A w objętości 0,2 ml (Rysunek 10C).
- Wstrzyknięcie zarówno PSLG, jak i OSLG należy wykonać w ciągu 2-3 minut.
- Usunąć zwierzę z sedacji izofluranem (jeśli jeszcze tego nie zrobiono). Wstrzyknięcie gruczołu łzowego dolnego (ILG) można zwykle wykonać bez dalszej sedacji.
- Iniekcja gruczołu łzowego dolnego
- Spójrz na zwierzę z boku. Protuberancja ILG może być widoczna wzdłuż dolnej przedniej części oczodołu (Rysunek 11A).
- Narysuj pionową linię za pomocą pisaka chirurgicznego lub odpowiedniego markera permanentnego na skórze, w miejscu, w którym powierzchowna część gruczołu ILG przechodzi z powierzchownego (bardziej zewnętrznego) miejsca spoczynku na kości jarzmowej do bardziej przyśrodkowego miejsca na oczodole. Jest to zazwyczaj gorsze od rąbka przedniego (Ryc. 11A).
- Zidentyfikuj koniec kości jarzmowej, przesuwając pionowo trzymaną sondę US w poprzek tej linii na skórze. Przejście ILG zachodzi, gdy obraz gruczołu zmienia się z wyraźnie opisanego (hiperechogeniczna linia kości jarzmowej jest widoczna wzdłuż dolnej krawędzi gruczołu na obrazie) do obrazu bez rozpoznawalnej granicy przyśrodkowej (echo kości jarzmowej nie jest już obecne, Ryc. 1).
- Obserwuj względne położenie rękojeści w stosunku do linii narysowanej na skórze, gdy ekran amerykański pokazuje tę zmianę. Jest to "miejsce wstrzyknięcia", w którym należy podać Con A.
- Kontroluj głębokość wstrzyknięcia tak, aby umieścić Con A w gruczole w punkcie przyśrodkowym do kości łuku jarzmowego.
- Określić głębokość wstrzyknięcia w następujący sposób: Ustawić żądaną głębokość wstrzyknięcia jako głębokość kości jarzmowej (sygnał hiperechogeniczny) plus 1 mm. Odejmić tę wartość od znanej długości igły (w tym przykładzie 15 mm).
- Wprowadzić igłę do gruczołu w "miejscu wstrzyknięcia" ~12 mm, a następnie powoli ją wyjąć, aż długość odsłoniętej igły na zewnątrz ciała (mierzona suwmiarką chirurgiczną) będzie równa różnicy obliczonej w 5.8.6 (Rysunek 12). Wstrzyknąć 1000 μg Con A w 0,2 ml.
UWAGA: Aby upewnić się, że torebka gruczołu jest przekłuta, a nie po prostu popychana przez igłę, igłę należy wprowadzić ~12 mm lub prawie do piasty przed rozpoczęciem jej wysuwania. - Powtórz operację w USA, aby potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia. ILG powinien pokazywać charakterystyczną przestrzeń hipoechogeniczną (Rysunek 1).
UWAGA: Wstrzyknięcie ILG jest najlepiej tolerowane przez animals26 i dlatego jest wykonywane na końcu.
- Wykonaj całą procedurę, aby w ciągu 10 minut wstrzyknąć wszystkie gruczoły obu oczu. Będzie to wymagało osiągnięcia kompetencji w zakresie procedury.
UWAGA: Pojedynczy zestaw wstrzyknięć do 2 oczodołowych gruczołów łzowych wywoła ostre DED trwające 1-2 tygodnie. - W przypadku DED o dłuższym czasie trwania, Con A należy wstrzykiwać dokładnie tak, jak powyżej, co 7 dni. Udało się wykonać do 6 takich iniekcji.
6. Opieka pozabiegowa
- Po wstrzyknięciu Con A należy obserwować zwierzęta w workach krępujących przez co najmniej 10-20 minut lub do momentu, gdy efekt znieczulający ustąpi.
- Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie należy umieszczać ich z powrotem w ich indywidualnych klatkach, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone.
- Ból pozabiegowy jest zwykle łagodny i trwa krócej niż 48 godzin. Oceń ból za pomocą skali grymasu królika. W razie potrzeby należy podać pojedynczą dawkę ketorolaku podawanego podskórnie (5 mg/kg mc.). W przypadku silniejszego bólu należy podawać podskórnie buprenorfinę w dawce 0,1 mg/kg mc. co 8 godzin.
Wyniki
Iniekcje Con A wywołały silną odpowiedź zapalną w gruczołach łzowych, charakteryzującą się gęstym naciekiem limfocytarnym (Rysunek 13), czemu towarzyszyło zmniejszenie produkcji łez. Wszystkie parametry łez uległy znacznemu przekształceniu (Tabela 1 i Tabela 2). Dodatkowo stężenia laktoferyny w łzach były obniżone (kontrola = 3,1±0,45 vs. po iniekcji Con A = 2,7±0,02 ng/mg białka (średnia ± SEM); p<0,03). Efektem końcowym było uszkodzenie nabłonka rogówki i spojówki, co potwierdzono zwiększonym barwieniem bengałą różową (Rysunek 6).
Iniekcja w trzy orbitalne tkanki LG wywołała spójny i jednolity stan DED, w przeciwieństwie do stanów osiąganych poprzednimi metodami18,27. Kluczowymi czynnikami wpływającymi na ten wynik były iniekcja ILG pod kontrolą US oraz iniekcja OSLG. Tabela 1 podsumowuje najważniejsze wyniki tej metody. Wszystkie zmiany są spójne z ciężkim DED.
Pojedyncza seria iniekcji Con A wywołuje DED trwający około 1 tygodnia; wszystkie parametry kliniczne normalizują się do 10. dnia (Tabela 2). Sekwencyjne iniekcje Con A w odstępach około 1 tygodnia odpowiednio wydłużają czas trwania DED. Na przykład druga seria iniekcji Con A w 7. dniu utrzymuje DED przez 2 tygodnie i tak dalej. Po około 5 seriach iniekcji stan DED często staje się trwały bez konieczności przeprowadzania dalszych iniekcji.
Podanie nowego związku, fosfosulindaku, królikom z indukowanym Con A DED znacząco zahamowało rozwój choroby. Na przykład po tygodniu leczenia tym związkiem TBUT wyraźnie wzrósł w porównaniu z zwierzętami traktowanymi nośnikiem (43,6±4,0 vs 12,2±2,8 s; p<0,001; odpowiednio średnia ± SEM dla tej i kolejnych wartości), natomiast osmolarność łez uległa normalizacji (294±4,6 vs 311±2,0 mOsm/L, p<0,002). Pod względem mechanistycznym fosfosulindak obniżył poziomy dwóch kluczowych interleukin: IL-1β (8,4±1,2 vs 21,2±6,6 pg/mg białka; p<0,03) oraz IL-8 (4,9±1,7 vs 13,5±5,0 pg/mg białka; p<0,05)19.
Rysunek 1: Obraz ultrasonograficzny dolnego gruczołu łzowego. Panel górny: Dolny gruczoł łzowy (ILG) w miarę przesuwania się głębiej w oczodole, aby znajdować się pod łukiem jarzmowym. Linia przerywana reprezentuje linię na skórze, wzdłuż której przesuwana jest sonda US. Panele środkowe: Podczas przesuwania głowicy wzdłuż tej linii badacz szuka zaniku echa kości jarzmowej, które jest widoczne na obrazie po lewej (strzałka) i znika na obrazie po prawej. Panele dolne: Obrazy ILG wykonane przed (lewo) i po (prawo) wstrzyknięciu Con A. Powstanie dużej przestrzeni torbielowatej w obrębie gruczołu potwierdza prawidłowe podanie preparatu. Przedrukowano za zgodą19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Sedacja maską gazową. Na zdjęciu przedstawiono maskę gazową służącą do krótkotrwałej, umiarkowanej sedacji izofluranem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Usunięcie błony migotliwej. (A) Iniekcja lidokainy/epinefryny. (B) Odcięcie błony migotliwej u jej podstawy za pomocą nożyczek Westcotta. (C) Powierzchnia oka widoczna wyraźniej po usunięciu błony migotliwej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Pomiar czasu przerwania filmu łzowego. (A) Jednolity zielony wygląd filmu łzowego na powierzchni rogówki w świetle niebieskim bezpośrednio po zastosowaniu kropli z fluoresceiną. (B) Powierzchnia rogówki, która uległa już wyraźnemu przerwaniu, co objawia się licznymi ciemnymi kręgami i liniami w fluoresceinie. Czas przerwania rejestruje się w momencie pojawienia się pierwszej ciemnej plamki lub linii. Dwa jasnoniebieskie kręgi to odbicia źródła światła od rogówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Test Schirmera. (A) Prawidłowe umieszczenie gąbki Weck-Cel w forniksie dolnym w celu usunięcia resztek miejscowego roztworu lidokainy oraz łez bazowych. Poprzez umieszczenie tylnej krawędzi trójkątnej gąbki pod brzegiem dolnej powieki można zachować bardzo jednolity sposób osuszania powierzchni gałki ocznej przed umieszczeniem pasków testowych. (B) Pasek testowy odpowiednio umieszczony w środkowej części dolnej powieki między gałką oczną a dolną powieką (spojówka powieczna). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Barwienie błękitem różowym (Rose bengal). Góra: Fotografie powierzchni rogówki. Po lewej: Brak barwienia błękitem różowym przed leczeniem Con A. Po prawej: Widoczne rozproszone barwienie rogówki i spojówki w górnym kwadrancie nosowym po wstrzyknięciu (prawy górny róg). Dół: Cytologia z odcisku spojówki z górnej części spojówki gałkowej. Po lewej: Liczne komórki kubkowe obecne przed leczeniem. Po prawej: Komórki nabłonkowe są obecne, ale komórki kubkowe nie występują po leczeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Przygotowanie królika do iniekcji konkanawaliny A. (A) Małe nożyczki są używane do usunięcia futra, co umożliwia łatwiejszą wizualizację punktów orientacyjnych w celu zidentyfikowania górnego gruczołu łzowego oczodołu. (B) Do usunięcia włosów pozostałych po strzyżeniu używa się preparatu Nair. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 8: Iniekcja do gruczołu łzowego powiekowego. (A) Gruczoł łzowy powiekowy widoczny jako pękate uwypuklenie w tylnej skroniowej części górnej powieki. Po podaniu kropli 2% fluoresceiny widoczne są łzy wypływające z powierzchni tego gruczołu. (B) Wykonywana jest iniekcja do gruczołu łzowego powiekowego podczas umiarkowanej sedacji królika. Jeden badacz odciąga powiekę, optymalizuje ekspozycję gruczołu i stabilizuje maskę, podczas gdy drugi badacz wykonuje iniekcję do gruczołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 9: Lokalizacja górnego orbitalnego gruczołu łzowego. Zmiany w konturach skóry wskazują lokalizację OSLG, który wystaje przez wcięcie tylne. Naprzemienny ucisk przyśrodkowy na gałkę oczną (duża strzałka) powoduje wypadnięcie górnego gruczołu orbitalnego, co objawia się jako niewielkie uwypuklenie skóry. Uwypuklenie to będzie zwiększać się przy każdym wywarciu nacisku (małe strzałki). Lokalizacja tego gruczołu znajduje się zazwyczaj w linii z tylną krawędzią oczodołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 10: Iniekcja do oczodołowego górnego gruczołu łzowego. (A) Wywieranie lekkiego nacisku na czaszkę za pomocą pęsety o drobnych ząbkach w obszarze, który wypadł, jak pokazano na Rycynie 9. Można wyczuć palcem wąski otwór szczelinowy w czaszce. Pozostawienie niewielkiego wgłębienia pęsetą znacznie ułatwia umieszczenie igły podczas iniekcji. (B) Igła jest wprowadzana prostopadle przez wcięcie. W przypadku nieprawidłowego umieszczenia, jej przejście zostaje zatrzymane przez kostną strukturę czaszki. (C) Igła znajduje się w pozycji końcowej, skierowana pod kątem w stronę kącika bocznego oka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 11: Lokalizacja dolnego gruczołu łzowego (ILG). (A) Wypukłość powierzchownej części ILG widoczna przez dolną powiekę. Zakrzywiona linia zaznaczona pisakiem wskazuje dolne położenie gruczołu. Linia pionowa, pod nosowym limbusie, wyznacza przybliżoną pozycję, w której ILG przechodzi w głębsze położenie w obrębie oczodołu i służy jako punkt odniesienia wizualnego dla US. (B) Głowica US przesuwana wzdłuż linii pionowej; monitor US wskaże miejsce zakończenia kości jarzmowej, punkt przejścia ILG oraz miejsce, w którym należy wykonać wtrysk Con A („miejsce wstrzyknięcia”). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 12: Iniekcja do dolnego gruczołu łzowego. Iniekcję do ILG wykonuje się w miejscu zidentyfikowanym za pomocą US. Głębokość iniekcji oblicza się zgodnie z opisem w tekście (krok 5.8.6). Suwmiarka (widoczna za igłą) zapewnia umieszczenie igły na właściwej głębokości przed wykonaniem wstrzyknięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 13: Histologia gruczołów łzowych. Przekroje tkanki prawidłowego dolnego gruczołu łzowego z typową strukturą cewkowo-pęcherzykową (A) oraz po wstrzyknięciu Con A (B), wykazujące wyraźny naciek limfocytarny ze zatarciem struktury. Podobne nacieki zapalne widoczne są w górnych gruczołach łzowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| Metoda iniekcji | TBUT, s | Osmolalność łez, Osm/L | STT, mm | |||
| Wartość odniesienia | Po wstrzyknięciu | Poziom wyjściowy | Po wstrzyknięciu | Wartość odniesienia | Po wstrzyknięciu | |
| średnia ± SEM, % zmiany | ||||||
| ILG bez prowadzenia USG | 58.5 ± 1.5 | 44.5 ± 7.7 | 297 ± 4.9 | 300 ± 3.8 | 15.2 ± 0.9 | 12.9 ± 2.2 |
| %zmiana | -23% | 1% | -15% | |||
| p=0,05 | p=0,36 | p=0,21 | ||||
| ILG i PSLG pod kontrolą US | 59.4 ± 0.6 | 11.4 ± 4.2 | 296 ± 4.7 | 326 ± 3.7 | 15.1 ± 1.3 | 10.7 ± 1.8 |
| zmiana % | -81% | 10% | -29% | |||
| p<0.0001 | p<0.0001 | p<0.03 | ||||
| ILG + PSLG + OSLG pod kontrolą US | 60 ± 0.0 | 6.2 ± 1.3 | 299 ± 2.9 | 309 ± 2.8 | 14.6 ± 0.9 | 9.9 ± 1.3 |
| zmiana % | -90% | 3% | -32% | |||
| p<0.0001 | p<0.008 | p<0.002 | ||||
| Wszystkie wartości zmierzono w 6. dniu po jednorazowym wstrzyknięciu Con A do wymienionych gruczołów. Wszystkie porównania wykonano w odniesieniu do wartości bazowych. *ILG – dolny gruczoł łzowy; PSLG – część powiekowa górnego gruczołu łzowego; OSLG – część oczodołowa górnego gruczołu łzowego; US – ultradźwięki. | ||||||
Tabela 1: Wpływ techniki iniekcji i liczby miejsc wstrzyknięcia na stopień nasilenia zespołu suchego oka.
| Poziom bazowy | Dzień 6 | Dzień 13 | Dzień 21 | |
| 1 wstrzyknięcie | 2 iniekcje | 3 iniekcje | ||
| TBUT, s | 58.5 ± 1.5 | 44.5 ± 7.7 | 29.2 ± 7.8 | 12.8 ± 3.9 |
| % zmiana | -24% | -50% | -78% | |
| p=0,17 | p=0,001 | p<0.0001 | ||
| Osm całkowita, Osm/L | 297 ± 4.9 | 300 ± 3.9 | 308 ± 4.9 | 313 ± 2.7 |
| zmiana % | 1% | 4% | 5% | |
| p=0,36 | p=0,04 | p=0,003 | ||
| STT, mm | 15.2 ± 0.9 | 9.3 ± 1.6 | 12.9 ± 1.6 | 7.4 ± 1.1 |
| zmiana % | -39% | -15% | -51% | |
| p=0,17 | p=0,13 | p=0,008 | ||
| Dokonano porównań z wartościami wyjściowymi. | ||||
Tabela 2: Wpływ powtarzanych iniekcji Con A do ILG na czas trwania DED.
Dyskusja
Króliki są bardzo atrakcyjne do badania DED. Ich rogówka i spojówka mają powierzchnię bliższą powierzchni ludzi w porównaniu z myszami i szczurami; Ich zestaw enzymów metabolizujących leki, takich jak esterazy, i histologia gruczołów łzowych są podobne do ludzkich, a ich oczy są wystarczająco duże, aby można było przeprowadzić pouczające badania farmakokinetyczne. W porównaniu ze świniami i małpami, z którymi mają podobne cechy, kosztują mniej, a ich eksperymentalna manipulacja jest łatwiejsza. Jeśli rozważane są badania mechanistyczne, względną wadą królika, w porównaniu z myszami, jest to, że dostępnych jest mniej odczynników (np. przeciwciał monoklonalnych). Z drugiej strony, królik jest znacznie lepszy od myszy w badaniach farmakokinetycznych i biodystrybucji, ponieważ poszczególne tkanki są łatwe do wypreparowania i mają wystarczającą wielkość do pracy analitycznej, unikając "łączenia próbek".
Krytycznym parametrem ogólnym jest okres aklimatyzacji królików. Zwierzęta są wysyłane od dostawcy w warunkach, które często nie zapewniają środowiska transportu o odpowiedniej temperaturze lub wilgotności. U niektórych zwierząt może już rozwinąć się zespół suchego oka po przyjeździe. Zalecany jest dwutygodniowy okres aklimatyzacji. Równie ważna jest skrupulatna dbałość o wilgotność i temperaturę w pomieszczeniu, w którym badane króliki są trzymane w wiwarium. Odchylenia w którymkolwiek z tych warunków mogą powodować ogromne różnice w stanie ich oczu. Miej pod ręką zapasowe nawilżacze i osuszacze. Jeśli system centralny ulegnie awarii, działaj szybko, aby przywrócić wilgotność otoczenia za pomocą sprzętu zapasowego. Należy pamiętać, że takie niefortunne wydarzenia są częstsze w miesiącach letnich. Trzy najważniejsze etapy skutecznego wywołania DED u królików to: 1) umiejętne wykorzystanie obrazowania US w celu identyfikacji ILG oraz skierowania i potwierdzenia wstrzyknięcia Con A; 2) zapewnienie iniekcji zarówno ILG, jak i dwóch części SLG; oraz 3) wiarygodne i powtarzalne oznaczanie parametrów DED.
Rozwinięcie wymaganych umiejętności eksperymentalnych nie jest trywialne, ale nie powinno odstraszyć żadnego poważnego badacza. Spodziewaj się, że krzywa uczenia się zostanie ukończona w ciągu pięciu iteracji. Niezbędny jest amerykański system obrazowania o rozsądnej jakości. Rozpoznanie anatomicznych cech rozpoznawczych przez USG jest ważne, dlatego badacz powinien dokonać przeglądu anatomii królika. Doskonały opis anatomii królika autorstwa Davisa25, klasyka, może być niezwykle pomocny. Należy również pamiętać o różnicach w wielkości ILG. Konsekwencją tego jest to, że sukces Con A musi być zawsze potwierdzony za pomocą dalszego obrazowania. Różnice w odpowiedzi na Con A w grupie królików są najczęściej spowodowane techniką iniekcji (nieudane lub częściowo udane wstrzyknięcie) lub ignorowaniem zdolności resztkowych tkanek gruczołów łzowych do kompensacji nadprodukcji łez. Dla tych, którzy chcą opanować technikę wstrzykiwania, pomocne może być wstrzyknięcie błękitu metylenowego, a następnie szybka sekcja anatomiczna; Wizualizację uzyskuje się, jeśli dotrze do gruczołu łzowego lub rozleje się na sąsiednie tkanki. Do tej pory ta metoda iniekcji została wykonana przez autorów ponad 270 razy bez ani jednego powikłania.
Oznaczanie pięciu parametrów DED przedstawionych powyżej może być równie trudne, jak ich określenie w praktyce klinicznej. Chociaż zmiany okołodobowe nie zostały jeszcze formalnie udokumentowane w żadnym z nich, istnieje wystarczająco dużo dowodów na takie zjawiska w oku28 , że powinny one być badane o tej samej porze dnia (± 1 godzinie), zwłaszcza gdy mają być wykonane powtórzone testy i porównane ze sobą. Niezbędna jest konsekwencja w wykonywaniu tych testów. Wymagany jest dwuosobowy zespół. Czterech lub więcej badaczy w tym samym pomieszczeniu biorących udział w testach może być uciążliwych, biorąc pod uwagę, że niektóre kroki wymagają ścisłego czasu. Ważna jest odpowiednia i wysokiej jakości dokumentacja fotograficzna, jeśli jest to wskazane.
Model ten idealnie nadaje się do badań nad rozwojem leków. Opanowanie modelu zwierzęcego i technik oznaczania zapewniło doskonałą odtwarzalność19 badań skuteczności i bezpieczeństwa.
Jest to potężne podejście eksperymentalne, ponieważ eliminuje mylącą zmienność poprzednich modeli, usprawniło model zwierzęcy i zasadniczo ustandaryzowało oznaczanie pięciu parametrów DED. Udane zastosowanie tego modelu do badań nad potencjalnym środkiem terapeutycznym potwierdziło jego praktyczną użyteczność jako informacyjnego modelu zwierzęcego dla choroby, która desperacko potrzebuje nowych środków i głębszego zrozumienia jej patogenezy.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów, z wyjątkiem BR, który posiada udziały w Medicon Pharmaceuticals, Inc. i Apis Therapeutics, LLC; oraz LH, pracownik Medicon Pharmaceuticals, Inc. posiadający udziały w Apis Therapeutics, LLC.
Podziękowania
Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi. Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Stony Brook i przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
Te badania były częściowo wspierane przez grant Targeted Research Opportunities od Stony Brook University School of Medicine (numer grantu 1149271-1-82502) oraz grant badawczy od Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Autorzy dziękują Michele McTernan za wsparcie redakcyjne.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Obiektyw makro 100 mm | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
| Igły o rozmiarze 26 (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Igły do wstrzykiwania ConA do gruczołów łzowych |
| Igły o rozmiarze 27 (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Igły do wstrzykiwania ConA do gruczołów łzowych |
| Aceproinj (acepromazyna) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0,1 ml / kg wstrzyknięcie podskórne do uspokojenia królika |
| Waporyzator anestezjologiczny | VetEquip, Pleasanton, CA | Pozycja #911103 | |
| Kleszcze Bishop Harmon | Bausch i Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Kleszczyki do tkanek |
| Suwmiarka | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Suwmiarka używana do pomiaru długości igły podczas wstrzykiwania ConA |
| Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Wytwarzać 5 mg / ml w PBS do wstrzykiwań do gruczołów łzowych królika |
| Lustrzanka cyfrowa | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Cyfrowa lustrzanka jednoobiektywowa |
| fluoresceina | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Rozcieńczyć do 0,2% PBS do pomiaru TBUT |
| Isofluran | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
| Zestaw ELISA z laktoferyną | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Zmierz poziom laktoferyny w łzach |
| lidokaina | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% w PBS dla środka znieczulającego |
| makro/pierścień błyskowy | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
| Końcówki osmolarne | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Pomiar osmolarności łzowej |
| PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Królik, Nowa Zelandia Biały lub holenderski Opasany (zgodnie z opisem w tekście) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Zwierzęta badawcze |
| Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% w PBS, plami powierzchnię oka |
| Schirmer paski | Produkty Eaglevision, Katena. Denville, NJ | AX13613 | Zmierz produkcję łez |
| Lupy chirurgiczne + 1,50 | Projekty dla wzroku, Bohemia, NY | Przedmiot specjalistyczny | Zapewnij powiększenie powierzchni oka podczas obserwacji rozpadu łez i wykonywania zastrzyków z konkanawaliny A. |
| Osmometr TearLab | TearLab Corp., San Diego, Kalifornia | Model #200000W REV A | Zmierz osmolarność łez |
| Sonda ultradźwiękowa | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Przewodnik untrasonograficzny Con A iniekcja do dolnego gruczołu łzowego |
Bibliografia
- Paulsen, A. J., et al. Dry eye in the Beaver Dam Offspring Study: prevalence, risk factors, and health-related quality of life. American Journal of Ophthalmology. 157 (4), 799-806 (2014).
- Vehof, J., Kozareva, D., Hysi, P. G., Hammond, C. J. Prevalence and risk factors of dry eye disease in a British female cohort. British Journal of Ophthalmology. 98 (12), 1712-1717 (2014).
- Tan, L. L., Morgan, P., Cai, Z. Q., Straughan, R. A. Prevalence of and risk factors for symptomatic dry eye disease in Singapore. Clinical and Experimental Optometry. 98 (1), 45-53 (2015).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II Report Executive Summary. The Ocular Surface. 15 (4), 802-812 (2017).
- Baudouin, C., et al. Clinical impact of inflammation in dry eye disease: proceedings of the ODISSEY group meeting. Acta Ophthalmologica (Copenhagen). 96 (2), 111-119 (2018).
- Calonge, M., et al. Dry eye disease as an inflammatory disorder. Ocular Immunology and Inflammation. 18 (4), 244-253 (2010).
- Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. The Pathophysiology of Dry Eye Disease: What We Know and Future Directions for Research. Ophthalmology. 124 (11S), S4-S13 (2017).
- Buckley, R. J. Assessment and management of dry eye disease. Eye (London, England). 32 (2), 200-203 (2018).
- Clayton, J. A. Dry Eye. New England Journal of Medicine. 378 (23), 2212-2223 (2018).
- Barabino, S. Animal models of dry eye. Archivos de la Sociedad Española de Oftalmología. 80 (12), 695-696 (2005).
- Stern, M. E., Pflugfelder, S. C. What We Have Learned From Animal Models of Dry Eye. International Ophthalmology Clinics. 57 (2), 109-118 (2017).
- Chen, Z. Y., Liang, Q. F., Yu, G. Y. Establishment of a rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Cornea. 30 (9), 1024-1029 (2011).
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Gray, K. L. A new rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (2), 225-228 (1987).
- Guo, Z., et al. Autologous lacrimal-lymphoid mixed-cell reactions induce dacryoadenitis in rabbits. Experimenal Eye Research. 71 (1), 23-31 (2000).
- Burgalassi, S., Panichi, L., Chetoni, P., Saettone, M. F., Boldrini, E. Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes. Ophthalmic Research. 31 (3), 229-235 (1999).
- Xiong, C., et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (5), 1850-1856 (2008).
- Heymann, F., Hamesch, K., Weiskirchen, R., Tacke, F. The concanavalin A model of acute hepatitis in mice. Lab Animal. 49 (1 Suppl), 12-20 (2015).
- Nagelhout, T. J., Gamache, D. A., Roberts, L., Brady, M. T., Yanni, J. M. Preservation of tear film integrity and inhibition of corneal injury by dexamethasone in a rabbit model of lacrimal gland inflammation-induced dry eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 21 (2), 139-148 (2005).
- Honkanen, R. A., Huang, L., Xie, G., Rigas, B. Phosphosulindac is efficacious in an improved concanavalin A-based rabbit model of chronic dry eye disease. Translational Research. 198, 58-72 (2018).
- Huang, L., et al. The novel phospho-non-steroidal anti-inflammatory drugs, OXT-328, MDC-22 and MDC-917, inhibit adjuvant-induced arthritis in rats. British Journal of Pharmacology. 162 (7), 1521-1533 (2011).
- Mattheolabakis, G., et al. Topically applied phospho-sulindac hydrogel is efficacious and safe in the treatment of experimental arthritis in rats. Pharmaceutical Research. 30 (6), 1471-1482 (2013).
- Osmalek, T., Froelich, A., Tasarek, S. Application of gellan gum in pharmacy and medicine. International Journal of Pharmaceutics. 466 (1-2), 328-340 (2014).
- Lemp, M. A. Report of the National Eye Institute/Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes. Contact Lens Association of Ophthalmologists Journal. 21 (4), 221-232 (1995).
- Dal Piaz, F., Braca, A., Belisario, M. A., De Tommasi, N. Thioredoxin system modulation by plant and fungal secondary metabolites. Current Medicinal Chemistry. 17 (5), 479-494 (2010).
- Davis, F. A. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit. Transactions of the American Ophthalmological Society. 27, 402-441 (1929).
- Lima, L., Lange, R. R., Turner-Giannico, A., Montiani-Ferreira, F. Evaluation of standardized endodontic paper point tear test in New Zealand white rabbits and comparison between corneal sensitivity followed tear tests. Veterinary Ophthalmology. 18 (Suppl 1), 119-124 (2015).
- Zheng, W., et al. Therapeutic efficacy of fibroblast growth factor 10 in a rabbit model of dry eye. Mol Med Report. 12 (5), 7344-7350 (2015).
- Wiechmann, A. F., Summers, J. A. Circadian rhythms in the eye: the physiological significance of melatonin receptors in ocular tissues. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (2), 137-160 (2008).
Przedruki i uprawnienia
