Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59641

⸱

11 maja 2020

 , 
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Streszczenie

Rosnąca globalna troska o dobrostan zwierząt zachęca producentów i Krajowe Laboratoria Kontrolne (OMCL) do przestrzegania strategii 3R dotyczącej zastąpienia, redukcji i udoskonalenia laboratoryjnych testów na zwierzętach. Opracowanie metod in vitro jest zalecane przez WHO i na poziomie europejskim jako alternatywa dla testu NIH do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie. Na powierzchni cząsteczki wirusa wścieklizny (RABV) trimery glikoproteiny stanowią główny immunogen indukujący przeciwciała neutralizujące wirusa (VNAb). Test ELISA, w którym neutralizujące przeciwciała monoklonalne (mAb-D1) rozpoznają trimeryczną formę glikoproteiny, został opracowany w celu określenia zawartości natywnej sfałdowanej glikoproteiny trimerycznej wraz z produkcją partii szczepionek. Ten test siły działania in vitro wykazał dobrą zgodność z testem NIH i został uznany za odpowiedni w badaniach zespołowych przeprowadzonych przez producentów szczepionek RABV i OMCL. Unikanie wykorzystywania zwierząt jest osiągalnym celem w najbliższej przyszłości.

Przedstawiona metoda opiera się na pośrednim wychwytywaniu immunologii kanapkowej ELISA za pomocą mAb-D1, który rozpoznaje miejsca antygenowe III (aa 330 do 338) trimerycznej glikoproteiny RABB, tj. immunogennego antygenu RABB. mAb-D1 jest używany zarówno do powlekania, jak i wykrywania trimerów glikoprotein obecnych w partii szczepionki. Ponieważ epitop jest rozpoznawany ze względu na jego właściwości konformacyjne, potencjalnie zdenaturowana glikoproteina (mniej immunogenna) nie może zostać wychwycona i wykryta przez mAb-D1. Szczepionka, która ma być poddana badaniu, inkubuje się w płytce uczulonej na mAb-D1. Związane trimeryczne glikoproteiny RABV identyfikuje się przez ponowne dodanie mAb-D1, znakuje się peroksydazą, a następnie ujawnia w obecności substratu i chromogenu. Porównanie absorbancji zmierzonej dla badanej szczepionki i szczepionki referencyjnej pozwala na określenie zawartości glikoproteiny immunogennej.

Wprowadzenie

Od ponad 50 lat, test 1 jest używany jako złoty standard metody oceny skuteczności szczepionki przeciwko wściekliźnie przed wydaniem partii. Test ten polega na dootrzewnowym uodparnieniu grup myszy szczepionką, która ma być testowana, a następnie prowokacji wewnątrzmózgowej (IC) 14 dni później szczepem wirusa wścieklizny (RABV) Challenge Virus Standard. Siła działania jest oceniana na podstawie odsetka myszy, które przeżyły prowokację IC. Chociaż WHO2 i European Pharmacopeia3 nadal wymagają testu NIH do oceny siły działania szczepionki, test ten napotyka kilka przeszkód: wyniki są bardzo zmienne4; zakaźny RABV jest używany podczas wyzwania, co wymaga zarówno umiejętności technicznych, jak i ścisłych środków bezpieczeństwa biologicznego; Wykorzystuje się dużą liczbę zwierząt, a powaga wyzwania budzi poważne obawy etyczne5. Opracowano mniej dotkliwą odmianę tego testu: dwa tygodnie po szczepieniu dootrzewnowym myszy nie są prowokowane IC, ale wykrwawiane i badane na obecność specyficznych przeciwciał neutralizujących RABV (VNAb) w ich surowicy za pomocą testu neutralizacji in vitro. Jednak ten test nadal wymaga poświęcenia dużej liczby myszy laboratoryjnych, chociaż jest już używany w szczepionkach weterynaryjnych6,7 i był brany pod uwagę w przypadku szczepionek dla ludzi8.

Na dzień dzisiejszy, zarówno International9, jak i European10 rekomendacje zachęcają producentów i Krajowe Laboratoria Kontrolne (Oficjalne Laboratoria Kontroli Leków - OMCLs) do wdrożenia Zastępstwa, Redukcji i Udoskonalenia laboratoryjnych testów na zwierzętach, określanych jako strategia 3R. Dyrektywa europejska 2010/63/UE (obowiązująca od 2013/01/01) dotycząca ochrony i dobrostanu zwierząt również zaostrzyła ograniczenia dla producentów szczepionek i laboratoriów zajmujących się kontrolą jakości szczepionek przeciwko wściekliźnie, a także badaniami nad wścieklizną11. W związku z tym opracowanie, walidacja i stosowanie alternatywnych podejść in vitro stało się obecnie priorytetem. Są one nie tylko etycznie uzasadnione, ale mogą również obniżyć koszty testowania wsadowego i skrócić czas oczekiwania na wyniki do godzin zamiast tygodni3.

Na powierzchni cząstki RABV glikoproteina przyjmuje formę trimeryczną12,13,14,15,16. W szczepionce przeciwko wściekliźnie ta natywna forma trimeryczna stanowi główną indukującą immunogen VNAbs17, podczas gdy monomeryczne, rozpuszczalne lub zdenaturowane glikoproteiny są słabo immunogenne18,19. Tak więc zachowanie trimerów glikoproteiny w całym procesie produkcji szczepionki jest dobrym wskaźnikiem dla zachowania optymalnego potencjału immunogennego. Kilka metod immunochemicznych, takich jak test wiązania przeciwciał20,21, test pojedynczej radialnej immunodyfuzji (SRD)22 i test ELISA23,24,25,26,27 są zalecane przez WHO Technical Report Series2 oraz europejska monografia3 w celu ilościowego określenia zawartości antygenu w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Są one wykorzystywane przez producentów do monitorowania spójności produkcji szczepionek oraz przez OMCL do oceny spójnego składu partii szczepionek dla ludzi28, nawet jeśli test NIH jest nadal brany pod uwagę przy ustalaniu siły działania.

Jednak wszystkie te metody immunochemiczne nie są równoważne. Test SRD wymaga wstępnej obróbki, która może zmienić trimery zakotwiczone w błonie i doprowadzić do powstania rozpuszczalnej lub zdenaturowanej formy glikoproteiny22,29. W związku z tym SRD nie jest zbyt skuteczny w rozróżnianiu między immunogennymi i nieimmunogennymi glikoproteinami, co skutkuje niedoskonałą oceną immunogenności partii szczepionki. Natomiast test ELISA jest bardziej czuły22, zachowuje natywną strukturę glikoproteiny i jest bardziej odpowiedni do określenia zawartości natywnie pofałdowanych trimerów glikoproteiny. W teście ELISA można wykorzystać poliklonalne lub mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko glikoproteinie królików, oczyszczone lub skoncentrowane siarczanem amonu. Badania wykazały dobrą zgodność między testem NIH a zawartością antygenu ocenianą za pomocą testu ELISA w szczepionkach i wykazały, że metody ELISA są odpowiednie do testu siły działania in vitro. To przemawia za tym, że testy ELISA mogą przynajmniej uzupełniać lub nawet zastępować test NIH4,26,27,30,31,32,33. Obecnie Farmakopea Europejska zaleca stosowanie zwalidowanych testów serologicznych lub immunochemicznych jako alternatywy dla testu NIH3. Całkowite unikanie wykorzystywania zwierząt do celów szczepionki stało się realistyczną perspektywą.

Metoda przedstawiona poniżej opiera się na pośrednim testowaniu immunologicznym metodą ELISA przy użyciu mysiego klonu przeciwciała monoklonalnego (mAb-D1), które rozpoznaje miejsca antygenowe III (aa 330 do 338) trimerycznej glikoproteiny RABB15,34. Metoda ta została początkowo opracowana w Instytucie Pasteura26,30, a następnie zoptymalizowana i zwalidowana przez laboratorium Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), tj. francuskie OMCL4,33. mAb-D1 służy zarówno do uwrażliwiania płytki, jak i następnie do wykrywania wychwyconego antygenu. Pozwala to na specyficzną kwantyfikację trimerów glikoproteiny, tj. immunogennego antygenu RABV. MAb-D1 używany do wykrywania jest znakowany peroksydazą, która ujawnia się w obecności substratu i chromogenu. Porównanie absorbancji zmierzonej dla badanej szczepionki i szczepionki referencyjnej pozwala na określenie zawartości glikoproteiny immunogennej. Warto zauważyć, że ten sam rodzaj testu może być stosowany do różnych mAb rozpoznających różne miejsca antygenowe glikoproteiny RABB35. Metoda otrzymywania i oczyszczania lub zagęszczania poliklonalnymi immunoglobulinami króliczymi G (IgG) lub monoklonalnymi globulinami króliczymi z siarczanem amonu lub monoklonalnymi globulinami myszy została obszernie opisana wcześniej36 wraz z metodą koniugacji przeciwciał z peroksydazą37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Środki ostrożności

UWAGA: Ta metoda ma zastosowanie zarówno do żywej szczepionki RABB, jak i inaktywowanej.

  1. Stosuj dobrą praktykę laboratoryjną i procedury bezpieczeństwa.
  2. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym jednorazowy płaszcz, rękawice, maskę, okulary itp.
  3. Podczas miareczkowania żywego wirusa należy użyć komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
    1. Każdy materiał mający kontakt z próbkami (odczynniki, roztwory myjące itp.) należy traktować jako materiał zakaźny.
    2. Zanieczyszczony materiał należy poddać obróbce, zanurzając go w roztworze wybielacza (2,5% podchlorynu sodu) na 30 minut w celu odkażenia.
  4. Z chemikaliami należy obchodzić się zgodnie z Dobrą Praktyką Laboratoryjną.

2. Przygotowanie

  1. Tam, gdzie to możliwe, należy używać odczynników klasy analitycznej.
  2. Przygotować świeże roztwory buforu powlekającego/buforu węglanowego, buforu pasywacyjnego, rozcieńczalnika i buforu cytrynianowego (tabela 1), przefiltrować przez filtry 0,45 lub 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden dzień przed użyciem w celu zachowania ich czystości analitycznej.
  3. Pozwól, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową (+18 °C do +25 °C) 30 minut przed użyciem i homogenizuj przez delikatne mieszanie przed użyciem.

3. Uczulenie na mikropłytkę

UWAGA: Użyj 96-dołkowych płytek do testów immunologicznych z adsorpcją, które są zoptymalizowane do wiązania dużych ilości immunoglobulin (np. zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Do każdej studzienki dodać 200 μl przeciwciała monoklonalnego (mAb-D1) rozcieńczonego w buforze węglanowym.
    UWAGA: Eksperymentalnie określono optymalne stężenie około 1 μg/ml, które odpowiada w przybliżeniu rozcieńczeniu 1/2000 oczyszczonego mAb-D1. To zalecane stężenie jest wskazane dla każdej partii mAb-D1 i musi być okresowo weryfikowane z kontrolą dodatnią.
  2. Przykryć płytkę folią przylepną i inkubować mikropłytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.
  3. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
  4. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

4. Pasywacja mikropłytek

  1. Do każdej studzienki dodać 300 μl buforu pasywacyjnego.
  2. Przykryć płytkę folią klejącą i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
  4. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbcyjnej w temperaturze pokojowej przez 1 min.
    UWAGA: Mikropłytka może być natychmiast użyta lub przechowywana szczelnie zamknięta w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.

5. Test ELISA

UWAGA: Do ustalenia krzywej kontrolnej szczepionki referencyjnej, Krok 5.3 nie jest wymagany; do miareczkowania testowanej szczepionki konieczne są wszystkie kroki od 5.1 do 5.6.

  1. Mycie mikropłytki uczulonej
    1. Do każdej studzienki dodać 300 μl buforu do mycia.
    2. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
    3. Powtórz kroki 5.1.1 i 5.1.2 jeszcze pięć razy, aby dokładnie umyć uczuloną płytkę.
    4. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  2. Rozcieńczenia szczepionki referencyjnej dla krzywej kontrolnej
    1. Odtworzyć szczepionkę wzorcową (antygen walidacyjny partia 09) w 1 ml wody destylowanej odpowiadającej stężeniu 10 μg/ml glikoproteiny wirusa wścieklizny.
    2. Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie odtworzonej szczepionki wzorcowej w rozcieńczalniku, aby osiągnąć 1 μg/ml glikoproteiny wirusa wścieklizny.
    3. Przygotować 6 seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń tej szczepionki wzorcowej w rozcieńczalniku, jak wskazano w Tabeli 1.
    4. Rozprowadzić 200 μl rozcieńczalnika w dwóch egzemplarzach (studzienki 1H/2H), aby służyły jako ślepa próba.
    5. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę każdego rozcieńczenia szczepionki referencyjnej w dwóch egzemplarzach (studzienki G1/G2 do A1/A2).
  3. Rozcieńczenia badanej szczepionki w celu jej miareczkowania
    1. Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie badanej szczepionki w rozcieńczalniku.
    2. Przygotować 7 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń badanej szczepionki w rozcieńczalniku, jak wskazano w Tabeli 2.
    3. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę każdego badanego rozcieńczenia szczepionki w dwóch egzemplarzach (studzienki H3/H4 do A3/A4).
  4. Inkubacja/Mycie płytki ELISA
    1. Przykryć mikropłytkę folią klejącą i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Usunąć folię, ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biornika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
    3. Do każdej studzienki dodaj 300 μl buforu do mycia.
    4. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
    5. Powtórzyć kroki 5.4.3 i 5.4.4 pięć razy w celu usunięcia niezwiązanego antygenu i zachowania trimerów białka G związanych z powlekanym przeciwciałem (mAb D1).
    6. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  5. Wiązanie mAb-D1 sprzężonego z peroksydazą
    1. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę zalecanego rozcieńczenia (1/2000) mAb-D1 znakowanego peroksydazą w rozcieńczalniku (przybliżone stężenie 1 μg/ml). Zalecane stężenie jest wskazane dla każdej partii mAb-D1 i musi być okresowo weryfikowane z kontrolą dodatnią.
    2. Przykryć mikropłytkę folią klejącą i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    3. Usunąć folię, ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biornika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
    4. Dodać do każdej studzienki 300 μl buforu do płukania.
    5. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
    6. Powtórzyć kroki 5.5.4 i 5.5.5 pięć razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciało znakowane peroksydazą (mAb D1).
    7. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  6. Rewelacja przy użyciu substratu-chromogenu
    1. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę roztworu substratu chromogenu.
    2. Uszczelnić mikropłytkę folią i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozwija się żółto-pomarańczowy kolor, którego intensywność jest proporcjonalna do ilości związanego przeciwciała znakowanego peroksydazą (mAb D1).
    3. Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl roztworu zatrzymującego na studzienkę.
    4. Ostrożnie wytrzeć spód mikropłytki i umieścić ją w spektrofotometrze w celu określenia gęstości optycznej (OD) przy 492 nm wszystkich użytych studzienek: kontroli ujemnej (ślepa), szczepionki referencyjnej i badanej szczepionki.
    5. Zbieraj dane OD w formacie pliku .xls lub .xlsx do analizy.
  7. Narysować krzywą odniesienia szczepionki, zawartość glikoproteiny trimerycznej, w funkcji gęstości optycznej (492 nm)
    1. Obliczyć średni OD przy długości fali 492 nm dla każdego duplikatu w różnych rozcieńczeniach szczepionki wzorcowej (baseniki G1/G2 do A1/A2 w tabeli 2)
    2. Odjąć średnią OD ślepej próby (studzienek, H1/H2 w tabeli 2) od każdej obliczonej średniej OD.
    3. Wykreślić wynikowe wartości OD na osi pionowej (skala liniowa) i odpowiadające im stężenie w trimerach glikoproteiny (ng / ml) na osi poziomej (skala logarytmiczna).
    4. Narysuj krzywą odniesienia, łącząc punkty (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W poniższym przykładzie zastosowano referencyjną partię szczepionki Lot 09, składającą się z oczyszczonych, inaktywowanych cząstek wirusa wścieklizny (szczep PV). Zawartość trimerów glikoproteiny (10 µg/mL) została ustalona po oznaczeniu całkowitej ilości białek wirusowych (test BCA) oraz ocenie procentowego udziału glikoproteiny za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS. Alternatywnie można zastosować skalibrowaną szczepionkę referencyjną, np. 6th International Sta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Epitop rozpoznawany przez mAb-D1 znajduje się w miejscu antygenowym III glikoproteiny RABB, która jest nie tylko immunodominująca w indukcji VNAb, ale także bierze udział w neurowirulencji, patogenności40,41 i rozpoznawaniu receptorów42. Istnieje inne ważne miejsce antygenowe wzdłuż glikoproteiny, miejsce II43, przeciwko któremu wyizolowano kilka MAb, takich jak mAb-WI-111235. Można je równie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dr. Sylvie Morgeaux i Dr. Jean-Michel Chapsal muszą być docenieni za ich kluczowy udział w ustanowieniu testu ELISA na partiach szczepionek oraz w organizowaniu międzynarodowych warsztatów i wspólnych badań. Dziękujemy Sabrinie Kali za krytyczną lekturę manuskryptu. Dr Pierre Perrin był odpowiedzialny za izolację i charakterystykę mAb-D1. Prace te były głównie wspierane przez fundusze Instytutu Pasteura.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy IIThermoFisher Scientific10445753do miareczkowania żywego wirusa
Przezroczyste płaskodenne immunoniesterylne płytki 96-dołkowe, 400 i mikro; L, MAXISORPThermoFisher Scientific439454dobry do wiązania z załadowanym przeciwciałem
Wyposaż Labo Polipropylenowy laboratoryjny dygestoriumThermoFisher Scientific12576606do przygotowania kwasu siarkowego
Płytka immunologiczna Strong
Adsorpcja MAXISORP Flat Bottom
Well, F96		Dutscher55303dobry do wiązania z załadowanym przeciwciałem
Mikropłytki uszczelniające Taśma (100 arkuszy)ThermoFisher Scientific15036
Czytnik mikropłytek  czytnik jednomodowy SunriseTECAN
Wytrząsarka-inkubator do mikropłytekDutscher441504
Myjka do mikropłytek Wellwash ThermoFisherScientific5165000
Pipeta wielokanałowa (30-300 &mikro; L) 12-kanałowejednokanałowe ThermoFisher Scientific4661180N
(Zestaw 2: Pipety Finnpipettes F2 0,2-2 i mu; L mikro, 2-20 μ L, 20-200 μ L & 100-1000 μ L)4700880Naukowy ThermoFisher
pipety

Bibliografia

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

test in vitroprzeciwcia a neutralizuj cetrimer glikoproteinyprzeciwcia o monoklonalnerozcie czenie seryjneg sto optycznaszczepionka referencyjnapartia szczepionki
Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.