Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rosnąca globalna troska o dobrostan zwierząt zachęca producentów i Krajowe Laboratoria Kontrolne (OMCL) do przestrzegania strategii 3R dotyczącej zastąpienia, redukcji i udoskonalenia laboratoryjnych testów na zwierzętach. Opracowanie metod in vitro jest zalecane przez WHO i na poziomie europejskim jako alternatywa dla testu NIH do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie. Na powierzchni cząsteczki wirusa wścieklizny (RABV) trimery glikoproteiny stanowią główny immunogen indukujący przeciwciała neutralizujące wirusa (VNAb). Test ELISA, w którym neutralizujące przeciwciała monoklonalne (mAb-D1) rozpoznają trimeryczną formę glikoproteiny, został opracowany w celu określenia zawartości natywnej sfałdowanej glikoproteiny trimerycznej wraz z produkcją partii szczepionek. Ten test siły działania in vitro wykazał dobrą zgodność z testem NIH i został uznany za odpowiedni w badaniach zespołowych przeprowadzonych przez producentów szczepionek RABV i OMCL. Unikanie wykorzystywania zwierząt jest osiągalnym celem w najbliższej przyszłości.
Przedstawiona metoda opiera się na pośrednim wychwytywaniu immunologii kanapkowej ELISA za pomocą mAb-D1, który rozpoznaje miejsca antygenowe III (aa 330 do 338) trimerycznej glikoproteiny RABB, tj. immunogennego antygenu RABB. mAb-D1 jest używany zarówno do powlekania, jak i wykrywania trimerów glikoprotein obecnych w partii szczepionki. Ponieważ epitop jest rozpoznawany ze względu na jego właściwości konformacyjne, potencjalnie zdenaturowana glikoproteina (mniej immunogenna) nie może zostać wychwycona i wykryta przez mAb-D1. Szczepionka, która ma być poddana badaniu, inkubuje się w płytce uczulonej na mAb-D1. Związane trimeryczne glikoproteiny RABV identyfikuje się przez ponowne dodanie mAb-D1, znakuje się peroksydazą, a następnie ujawnia w obecności substratu i chromogenu. Porównanie absorbancji zmierzonej dla badanej szczepionki i szczepionki referencyjnej pozwala na określenie zawartości glikoproteiny immunogennej.
Wprowadzenie
Od ponad 50 lat, test 1 jest używany jako złoty standard metody oceny skuteczności szczepionki przeciwko wściekliźnie przed wydaniem partii. Test ten polega na dootrzewnowym uodparnieniu grup myszy szczepionką, która ma być testowana, a następnie prowokacji wewnątrzmózgowej (IC) 14 dni później szczepem wirusa wścieklizny (RABV) Challenge Virus Standard. Siła działania jest oceniana na podstawie odsetka myszy, które przeżyły prowokację IC. Chociaż WHO2 i European Pharmacopeia3 nadal wymagają testu NIH do oceny siły działania szczepionki, test ten napotyka kilka przeszkód: wyniki są bardzo zmienne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Środki ostrożności
UWAGA: Ta metoda ma zastosowanie zarówno do żywej szczepionki RABB, jak i inaktywowanej.
- Stosuj dobrą praktykę laboratoryjną i procedury bezpieczeństwa.
- Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym jednorazowy płaszcz, rękawice, maskę, okulary itp.
- Podczas miareczkowania żywego wirusa należy użyć komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
- Każdy materiał mający kontakt z próbkami (odczynniki, roztwory myjące itp.) należy traktować jako materiał zakaźny.
- Zanieczyszczony materiał należy poddać obróbce, zanurzając go w roztworze wybielacza (2,5% podchlory....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W poniższym przykładzie zastosowano referencyjną partię szczepionki Lot 09, składającą się z oczyszczonych, inaktywowanych cząstek wirusa wścieklizny (szczep PV). Zawartość trimerów glikoproteiny (10 µg/mL) została ustalona po oznaczeniu całkowitej ilości białek wirusowych (test BCA) oraz ocenie procentowego udziału glikoproteiny za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS. Alternatywnie można zastosować skalibrowaną szczepionkę referencyjną, np. 6th International Sta.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Epitop rozpoznawany przez mAb-D1 znajduje się w miejscu antygenowym III glikoproteiny RABB, która jest nie tylko immunodominująca w indukcji VNAb, ale także bierze udział w neurowirulencji, patogenności40,41 i rozpoznawaniu receptorów42. Istnieje inne ważne miejsce antygenowe wzdłuż glikoproteiny, miejsce II43, przeciwko któremu wyizolowano kilka MAb, takich jak mAb-WI-111235. Można je równie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dr. Sylvie Morgeaux i Dr. Jean-Michel Chapsal muszą być docenieni za ich kluczowy udział w ustanowieniu testu ELISA na partiach szczepionek oraz w organizowaniu międzynarodowych warsztatów i wspólnych badań. Dziękujemy Sabrinie Kali za krytyczną lekturę manuskryptu. Dr Pierre Perrin był odpowiedzialny za izolację i charakterystykę mAb-D1. Prace te były głównie wspierane przez fundusze Instytutu Pasteura.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II | ThermoFisher Scientific | 10445753 | do miareczkowania żywego wirusa |
| Przezroczyste płaskodenne immunoniesterylne płytki 96-dołkowe, 400 i mikro; L, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | dobry do wiązania z załadowanym przeciwciałem |
| Wyposaż Labo Polipropylenowy laboratoryjny dygestorium | ThermoFisher Scientific | 12576606 | do przygotowania kwasu siarkowego |
| Płytka immunologiczna Strong Adsorpcja MAXISORP Flat Bottom Well, F96 | Dutscher | 55303 | dobry do wiązania z załadowanym przeciwciałem |
| Mikropłytki uszczelniające Taśma (100 arkuszy) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Czytnik mikropłytek czytnik jednomodowy Sunrise | TECAN | ||
| Wytrząsarka-inkubator do mikropłytek | Dutscher | 441504 | |
| Myjka do mikropłytek Wellwash ThermoFisher | Scientific | 5165000 | |
| Pipeta wielokanałowa (30-300 &mikro; L) 12-kanałowe | jednokanałowe ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| (Zestaw 2: Pipety Finnpipettes F2 0,2-2 i mu; L mikro, 2-20 μ L, 20-200 μ L & 100-1000 μ L) | 4700880 | Naukowy ThermoFisher |
Bibliografia
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
