Oferujemy prostą i skuteczną metodę przeszczepiania grasicy leczonej 2'-deoksyguanozyną E18.5 do torebki nerkowej nagiej myszy. Metoda ta powinna pomóc w badaniu zarówno funkcji komórek nabłonka grasicy, jak i dojrzewania limfocytów T.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podtorebkowe przeszczepienie nerki mysiej grasicy embrionalnej leczonej 2'-deoksyguanozyną u nagich myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Grasica jest ważnym centralnym organem odpornościowym, który odgrywa istotną rolę w rozwoju i różnicowaniu limfocytów T. Przeszczep grasicy jest ważną metodą badania funkcji komórek nabłonka grasicy i dojrzewania limfocytów T in vivo. W tym miejscu opiszemy metody eksperymentalne stosowane w naszym laboratorium do przeszczepiania grasicy embrionalnej leczonej 2'-deoksyguanozyną (w celu wyczerpania limfocytów dawcy) do torebki nerkowej atymimicznej nagiej myszy. Ta metoda jest zarówno prosta, jak i wydajna i nie wymaga specjalnych umiejętności ani urządzeń. Wyniki uzyskane tą prostą metodą wykazały, że przeszczepiona grasica może skutecznie wspierać produkcję limfocytów T biorcy. Ponadto zostanie doprecyzowanych kilka kluczowych kwestii związanych z protokołem.
Wprowadzenie
Grasica jest centralnym organem odpornościowym, w grasicy thymocyty przechodzą selekcję pozytywną i negatywną, a następnie stają się dojrzałymi limfocytami T1,2. Nieprawidłowa selekcja pozytywna lub negatywna powoduje odpowiednio niedobór odporności lub patologie autoimmunologiczne3,4. Dlatego przeszczepienie narządu grasicy jest ważnym podejściem do badania procesu selekcji limfocytów T w grasicy dawcy. Metoda ta jest szczególnie istotna przy analizie funkcji nabłonka grasicy, w której pośredniczą mutacje genów, które powodują embrionalny fenotyp letalny po mutacji5.
Aby zbadać dojrzewanie limfocytów T biorcy w przeszczepionej grasicy, konieczne jest zmniejszenie liczby limfocytów dawcy w grasicy. W tym celu zwykle wybiera się embrionalną 14-, 15- lub 16-dniową (E14, E15, E16) grasicę6,7. Grasica z bardziej dojrzałych stadiów może być również z powodzeniem pozbawiona limfocytów dawcy poprzez leczenie 2'-deoksyguanozyną. Jednak szczegółowy protokół dotyczący zubożenia limfocytów i wykorzystania starszych kultur grasicy nie został wcześniej opisany8,9. Chociaż protokoły transplantacji zostały wprowadzone w kilku badaniach10,11, konieczna jest dalsza modyfikacja i ulepszenie tych protokołów.
Nasz protokół jest podzielony na dwie części: (i) Wyczerpanie limfocytów T z późnego stadium rozwoju grasicy E18.5 przez hodowlę w pożywce zawierającej 2'-deoksyguanozynę. (ii) Przeszczepienie wyhodowanej grasicy biorcom. W tej procedurze opracowaliśmy prosty sposób dostarczania dużej tkanki (grasicy E18,5) do torebki nerkowej ze zmniejszonym ryzykiem uszkodzenia nerek. Koncentrując się na grasicy w późniejszym stadium, nasz protokół może być również stosowany bezpośrednio lub z modyfikacjami do przeszczepiania grasicy na różnych etapach rozwoju lub innych tkanek o podobnej wielkości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Prezentowany protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki Uniwersytetu Jinan dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
UWAGA: Użyte materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja grasicy embrionalnej
- Przed eksperymentem należy autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne i wysterylizować ławkę/kaptur 70% etanolem.
- Za pomocą dwutlenku węgla znieczulij i poddaj eutanazji ciężarną samicę myszy (18,5 dnia po udanym kryciu). Następnie przetrzyj okolice brzucha 70% etanolem.
UWAGA: Tutaj skrzyżowaliśmy samice Insm1+/lacZ i samce Insm1+/lacZ. Wstrzyknięcie pentobarbitalu do łożyska wykonano przed izolacją zarodków z macicy i dekapitacją dla każdego zarodka. - Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w kształcie litery "V" na brzuchu, zaczynając od pęcherza i biegnąc do każdego rogu macicy.
- Za pomocą nożyczek przetnij mezometrium i szyjkę macicy/pochwę i zbierz macicę. Umieścić macicę na szalce Petriego zawierającej zimny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) na lodzie. Następnie odsłoń zarodki, które znajdują się w otoczce decidua, przecinając przednią ścianę macicy od jednego rogu macicy do drugiego. Za pomocą cienkiej pęsety odklej otoczkowe tkanki decidua i przetnij pępowinę, aby uwolnić zarodki. Umieść wszystkie zarodki na nowej szalce Petriego na lodzie aż do wyizolowania grasicy.
- Przetrzyj zarodek 70% alkoholem i umieść go na nowej szalce Petriego. Od tego kroku upewnij się, że zachowane są sterylne warunki.
- Nacinając nożyczkami blisko dolnej szczęki, usuń głowę zarodka i odcedź krew ręcznikiem papierowym. Następnie unieruchom zarodek na tej samej szalce Petriego w pozycji leżącej.
UWAGA: Wycinamy kawałek ogona każdego zarodka do genotypowania Insm1 i lacZ. - Za pomocą nożyczek przetnij boczną ścianę klatki piersiowej poziomo wzdłuż przodu pachy, a następnie przetnij przeponę, aby otworzyć klatkę piersiową. Grasica powinna być teraz widoczna jako dwa białe płaty znajdujące się przed tchawicą i przylegające do serca.
- Umieść kleszcze ze zgiętą końcówką za grasicą, a następnie delikatnie ściągnij grasicę. Pamiętaj, aby sprawdzić integralność grasicy, aby upewnić się, że zawiera ona dwa przegubowe płaty.
- Umyj grasicę 1x PBS i odetnij tkanki łączne i naczynia krwionośne pod mikroskopem stereoskopowym.
2. Hodowla izolowanej grasicy embrionalnej
- Dodać 500 μl pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 100 j/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Przenieś czystą teję do studzienek z jedną grasicą na studzienkę. Rysunek 1 przedstawia wyizolowaną grasicę w pożywce hodowlanej.
- Do każdej studzienki zawierającej grasicę dodać 2'-deoksygranozynę do końcowego stężenia 1,25 mM.
- Hoduj izolowaną grasicę przez osiem dni, odświeżając zarówno pożywkę hodowlaną, jak i 2'-deoksygranozynę co dwa dni.
3. Ustal przestrzeń podtorebkową w torebce nerkowej
- Aby przygotować igłę i przyciętą rurkę infuzyjną (Rysunek 2), naciąć igłę do żyły skóry głowy na części rurki pod kątem 45° za pomocą nożyczek.
- Zważ nagą mysz, a następnie znieczul ją zastrzykiem pentobarbitalowym (1,5%) (75 μg/g masy ciała).
- Gdy nie zaobserwuje się odruchu po uszczypnięciu palca, umieść mysz na stole operacyjnym w prawej pozycji bocznej.
- Za pomocą wacika z 0,5% jodonu należy dwukrotnie zdezynfekować skórę w obszarze operacyjnym od wewnątrz na zewnątrz ciała.
- Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie skóry o grubości 5–9 mm równolegle do kręgosłupa w lewej okolicy nerki (między ostatnim żebrem a grzebieniem biodrowym). Następnie otwórz jamę brzuszną, przecinając tkankę podskórną i mięsień oraz odsłaniając nerkę.
- Gdy nerka jest odsłonięta, użyj pęsety w jednej ręce, aby podnieść tkankę mięśniową i tłuszczową z krawędzi nacięcia po stronie kręgosłupa. Drugą ręką delikatnie wyciśnij nerkę (alternatywnie nerkę można wycisnąć palcami obu rąk).
- Aby upewnić się, że torebka nerkowa jest wilgotna podczas zabiegu, należy zwilżyć powierzchnię nerki solą fizjologiczną (0,9% NaCl).
- Zrób nacięcie w torebce nerkowej i delikatnie podrapaj torebkę nerkową w prawym dolnym rogu za pomocą końcówki igły przygotowanej w kroku 3.1. Rozmiar nacięcia powinien wynosić 1/2–2/3 szerokości nerki; Nie drapać nerki.
- Wsunąć rurkę infuzyjną przygotowaną w kroku 3.1 do nacięcia na torebce nerkowej. Delikatnie oddzielić torebkę nerkową od nerki wzdłuż dłuższego boku nerki, aż do osiągnięcia 3–4 mm wewnątrz torebki nerkowej. Wyciągnąć rurkę infuzyjną; Ustala się przestrzeń podtorebkowa nerki.
4. Przeszczep embrionalną grasicę mysią
- Umyć grasicę wyhodowaną w kroku 2.3 dwukrotnie w roztworze soli fizjologicznej, aby zubożyć pożywkę hodowlaną.
- Podłączyć zaciśniętą rurkę infuzyjną przygotowaną w kroku 3.1 do strzykawki na jej interfejsie do podłączenia strzykawki. Przygotowane grasice należy powoli odsysać do rurki infuzyjnej.
- Delikatnie włożyć zaciśniętą rurkę infuzyjną do kapsułki nerkowej i dotrzeć do bieguna górnego. Dostarczyć grasicę do torebki nerkowej; Powoli wsunąć rurkę, jednocześnie delikatnie naciskając tłok strzykawki.
- Używając lampy alkoholowej, lekko podgrzej igłę przygotowaną w kroku 3.1. Po upewnieniu się, że cała grasica znajduje się w przestrzeni podtorebkowej, użyj podgrzanej igły do kauteryzacji nacięcia.
- Po kauteryzacji przywróć nerkę w jamie brzusznej. Zszyj otrzewną i mięsień.
- Za pomocą zmodyfikowanego przerywanego pionowego szwu materaca zamknij nacięcie skóry (zawiąż co najmniej trzy węzły i odetnij nadmiar nici).
- Za pomocą wacika jodowego powidonu zdezynfekuj nacięcie. W celu złagodzenia bólu w trakcie zabiegu wykonano podskórne wstrzyknięcie fluniksyny (2 μg/g masy ciała), a następnie przez 3 dni po zabiegu.
- Dopóki w pełni nie wyzdrowiejesz ze znieczulenia, trzymaj mysz w cieple pod lampą na podczerwień.
- Trzymaj grasicę w torebce nerkowej biorcy przez 8 tygodni przed sekcją przeszczepionej grasicy i przeprowadzeniem analizy fenotypowej zgodnie z wcześniejszym opisem5,8,9.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prezentujemy tutaj wyizolowany grasiczkę w dniu E18.5, zawierającą dwa pełne płaty (Rycina 1). Dodatkowo pokazujemy igłę do żył skóry głowy, która została przycięta w celu utworzenia ścięcia na przewodzie infuzyjnym (Rysunek 2). Następnie przedstawiamy reprezentatywny obraz położenia grasicy przeszczepionej do torebki nerki (Rycina 3A) oraz grasicę po 8 tygodniach wzrostu w myszach biorcach (Rysunek 3BA...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podtorebkowe przeszczepienie nerki grasicy zarodkowej jest ważną metodą badania funkcji komórek nabłonka grasicy i procesu dojrzewania limfocytów T in vivo. Chociaż istnieje kilka badań eksperymentalnych dotyczących hodowli i przeszczepiania narządów grasicyembrionalnej 6,7, nasz protokół zapewnia prostą alternatywną procedurę hodowli grasicy embrionalnej myszy i przeszczepu podtorebkowego nerki w przypadku starszej tkanki grasicy.
Nas...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Pakiet Start Uniwersytetu Jinan dla S.J. oraz przez Program Nauki i Technologii Guangzhou w Chinach (Grant nr 201704020209 dla S.J.). Dziękujemy Amy Botta (Wydział Biologii, York University, Toronto, ON M3J 1P3, Kanada) za korektę i redakcję manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% jodu powidonu | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 ml Sterylna strzykawka | Solarbio | YA1090 | |
| 2'-Deoksyguanozyna | MEC | HY-17563 | 1M w DMSO, 1:800 przy użyciu (końcowej 1,25 mM) |
| 24-dołkowej płytki | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Igły do szwów chirurgicznych z gwintem | NingBo Cheng-He Fabryka instrumentów mikrochirurgicznych Chiny | YY0166-2002 | |
| 60mm Naczynie do hodowli komórkowych | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC przeciwciała anty-mysie CD8a | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Kleszczyki z wygiętą końcówką, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | JD1060 | Do sterylizacji przed użyciem |
| Cefmetazol sodowy do wstrzykiwań | Sichuan Hexin Pharmaceutical co, Ltd | 17062111 079 | 6 mg w 0,5 ml 0,9% roztworu NaCl, 7,5 ul/g masy ciała |
| Nożyczki preparacyjne, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | JC2303 | Do sterylizacji przed użyciem |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Kleszcze precyzyjne, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | JD1050 | Do sterylizacji przed użyciem |
| Cytometria przepływowa | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1 mg w 1 ml 0,9% roztworu NaCl, 2ul / g masy ciała |
| Kleszcze, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | Do sterylizacji przed użyciem |
| Lampa na podczerwień | OTLAN | MT-810 | |
| Uchwyt na igłę, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | J32010 | Do sterylizacji przed użyciem |
| PE anty-mysie CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Mieszanina penicyliny-streptomycyny | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Sól sodowa pentobarbitalu | Sigma | P3761 | 1,5% roztwór w PBS, 75ug/g masy ciała |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Igła | do żył skóry głowyShanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Nożyczki sprężynowe | VANNAS | S11014-12 | Do sterylizacji przed użyciem |
| stereoskopowy | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterylny wacik bawełniany 15 cm | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterylna gaza 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterylny PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Kleszcze do tkanek, JZ 12,5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | J41010 | Do sterylizacji przed użyciem |
Bibliografia
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709(2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
