Method Article

Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy elektroporację informacyjnego RNA (mRNA) jako metodę, która pozwala na szybką i efektywną ekspresję wielu białek w systemie modelowym zarodka przepiórki. Metoda ta może być stosowana do fluorescencyjnego znakowania komórek i rejestrowania ich ruchów in vivo za pomocą mikroskopii poklatkowej wkrótce po elektroporacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informujemy, że elektroporacja mRNA pozwala białkom fluorescencyjnym znakować komórki w żywych zarodkach przepiórczych szybciej i szerzej niż elektroporacja DNA. Wysoka wydajność transfekcji pozwala na kotransfekcję co najmniej 4 różnych mRNA z wydajnością ~87%. Większość wysterylizowanych elektroporacją mRNA ulega degradacji w ciągu pierwszych 2 godzin po elektroporacji, co pozwala na przeprowadzenie wrażliwych na czas eksperymentów w rozwijającym się zarodku. Na koniec opisujemy, jak dynamicznie obrazować żywe zarodki elektroporowane mRNA, które kodują różne subkomórkowe ukierunkowane białka fluorescencyjne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja to metoda fizycznej transfekcji, która wykorzystuje impuls elektryczny do tworzenia przejściowych porów w błonie plazmatycznej, umożliwiając substancjom takim jak kwasy nukleinowe lub chemikalia przejście do cytozolu. Elektroporacja jest szeroko stosowana do dostarczania DNA do komórek bakterii, drożdży, roślin i ssaków1,2,3. Jest rutynowo stosowany do wprowadzania ładunków genetycznych do docelowych komórek i tkanek w rozwijającym się zarodku ptaka w celu zbadania genetycznej kontroli rozwoju lub oznaczania migrujących populacji komórek4,5,6,7. Istnieje jednak kilka ograniczeń eksperymentalnych związanych z elektroporacją DNA8. Na przykład elektroporacja DNA często wprowadza bardzo zmienną liczbę wektorów ekspresyjnych na komórkę, a następnie kodowane przez nie mRNA i białka. Ta zmienność może prowadzić do znacznej heterogeniczności między komórkami, co komplikuje zarówno analizę obrazu, jak i interpretację danych9,10. Dodatkowo, białka z elektroporacji DNA zaczynają wyrażać się dopiero ~3 godziny po elektroporacji i nie osiągają maksymalnej wydajności w liczbie komórek i intensywności fluorescencji do 12 godzin, prawdopodobnie ze względu na czas potrzebny do przeniesienia do jądra i zakończenia zarówno transkrypcji, jak i translacji in vivo11.

Dla kontrastu, transfekcja mRNA została skutecznie wykorzystana w różnych systemach modelowych, w tym oocyty Xenopus laevis metodą mikroiniekcji12,13, przeprogramowanie ludzkich komórek macierzystych przez transfekcję lipofektaminy mRNA14, oraz elektroportowanie opornych nerwowych komórek macierzystych u dorosłych myszy15. Przetestowaliśmy zdolność elektroporacji mRNA do skutecznego znakowania komórek podczas wczesnego rozwoju embrionalnego ptaków przy użyciu syntetyzowanych in vitro mRNA, które kodują odrębne białka fluorescencyjne (FP). W naszych badaniach wykorzystaliśmy wektor pCS2+, uniwersalny wektor ekspresyjny, który jest powszechnie stosowany do ekspresji białek w zarodkach Xenopus i zebry pręgowanego. Promotory polimerazy RNA SP6 i T7 w pCS2 + umożliwiają syntezę mRNA i białka z dowolnego sklonowanego genu, gdy są stosowane w systemie transkrypcji/translacji in vitro.

Tutaj pokazujemy, że elektroporacja mRNA umożliwia szybką i efektywną ekspresję białek fluorescencyjnych (FPs) w zarodkach przepiórczych gastrulatujących. Zaprojektowaliśmy i wygenerowaliśmy wiele wektorów ekspresyjnych wykorzystywanych w tych badaniach. Na przykład sklonowaliśmy gen LifeAct-eGFP 16 do wektora pCS2+17 w celu ekspresji z promotora CMV i promotora SP6. Wstawiony gen znajduje się poniżej promotora SP6 i powyżej SV40 poly(A) tail18. W zarodkach poddanych jednoczesnej elektroporacji z mRNA i DNA FP kodowane z transkrybowanych in vitro mRNA zostały po raz pierwszy wykryte w ciągu 20 minut od elektroporacji, podczas gdy FP z wektorów ekspresji DNA wykryto dopiero po 3 godzinach. Wiele mRNA kodujących białka jądrowe, Golgiego i błonowe mogą być jednocześnie elektroporowane do zarodka, co skutkuje szybką i wydajną ekspresją wielu białek w poszczególnych komórkach. Wreszcie, stosując test odzyskiwania fluorescencji in vivo po fotowybielaniu (FRAP), pokazujemy, że większość elektroporowanych mRNA rozpada się w ciągu 2 godzin. Tak więc szybka początkowa produkcja białek w połączeniu z ograniczoną translacją nowych białek sprawia, że elektroporacja mRNA jest cenną techniką, gdy konieczna jest czasowa kontrola ekspresji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Szpitala Dziecięcego w Los Angeles oraz Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Kalifornii.

1. Generowanie wektorów wyrażeń opartych na pCS2

  1. Aby sklonować pCS2.Lifeact-eGFP, należy przygotować szkielet wektora, trawiąc 2 μg pCS2.CycB1-GFP (konstrukt zawierający inną wstawkę) za pomocą BamHI (10 U) i BsrGI (10 U) w odpowiednim buforze do mineralizacji (patrz tabela materiałów) rozcieńczonym do 1x w całkowitej objętości reakcji 50 μL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (patrz Rysunek 1 dla schematu procedury klonowania).
    1. Defosforylacja wolnych końców 3'OH szkieletu wektora z reakcji enzymu restrykcyjnego przez dodanie fosfatazy alkalicznej krewetek (1 U). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Uruchom całą mieszaninę w 1% żelu agarozowym/1x buforze Tris Acetate EDTA (TAE) pod napięciem 90 V przez ~ 50 min, a następnie wybarwić żel w roztworze bromku etydyny o stężeniu 0,5 μg/ml w 1x buforze TAE przez 15 minut z delikatnym kołysaniem. Upewnij się również, że załadowałeś markery masy cząsteczkowej na wolnym pasie, aby pomóc określić rozmiary DNA.
    3. Używając bezpiecznego dla DNA transiluminatora UV, aby uniknąć nacinania DNA, szybko wytnij szkielet wektora (oczekiwany rozmiar pasma 4 kb) z żelu agarozowego i wyizoluj fragment DNA z kawałka żelu za pomocą zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Równocześnie z etapem 1.1 przygotować wkładkę, trawiąc 2 μg pEGFP-N1-Lifeact z BglII (10 U) i BsrGI (10 U) w odpowiednim buforze do wytrawiania rozcieńczonym 1x w całkowitej objętości reakcji 50 μL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Uruchomić całą mieszaninę w 1% żelu agarozowym, aby wyizolować pasmo 800 pz, jak wyjaśniono wcześniej w kroku 1.1.2-1.1.3.
  3. Po oczyszczeniu i ilościowym określeniu zarówno wektora, jak i wstawki na spektrofotometrze, połącz 50 ng wektora i 38 ng wstawki (stosunek molowy wektora do wstawki 1:3) w buforze ligazy DNA T4 przed dodaniem ligazy DNA T4 w celu katalizowania reakcji ligacji. Dodatkowo ustaw kontrolę bez DNA, kontrolę tylko wektora i kontrolę tylko z wstawką. Inkubować wszystkie reakcje w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    1. Przekształć 1 μl mieszaniny (mieszanin) ligacji w właściwy E. coli DH10. Przekształć również kontrolę ujemną tylko wodę i 20 pg kontroli pozytywnej pUC19. Rozprowadzić bakterie na płytkach agarowych Luria Broth (LB) zawierających 50 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego ranka policz kolonie na każdej tabliczce.
      nuta: Idealnie byłoby, gdyby na płytkach kontroli ujemnej nie było żadnych kolonii, >100 kolonii na płytkach ligacyjnych wektor + wstawka, a mniej kolonii na płytce tylko wektor.
    3. Pobrać co najmniej 8 kolonii bakteryjnych z płytki agarowej przekształconej mieszaniną ligacji wektor + insert i zaszczepić je za pomocą sterylnych wykałaczek lub końcówek pipet do 2 ml płynnego bulionu LB zawierającego 50 μg/ml ampicyliny.
    4. Wyekstrahuj DNA z każdego z klonów za pomocą komercyjnych zestawów do miniprzygotowania plazmidu.
    5. Przeprowadzić diagnostyczne trawienie restrykcyjne przy użyciu 500 ng DNA z każdego klonu przy użyciu NotI (10 U) i BamHI (10 U) w odpowiednim buforze do wytrawiania rozcieńczonym do 1x przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i uruchomić strawione DNA na 1% żelu agarozowym w 1 buforze TAE. Oczekiwane rozmiary pasm dla dodatnich klonów pCS2.Lifeact-eGFP wynoszą 3,9 kb i 978 pz.
    6. Przekształć 1 pg-100 ng DNA z dodatniego klonu w kompetentną E. coli DH10 i przygotować 3-4 reakcje miniprep, jak opisano w poprzednich krokach, aby uzyskać wystarczającą ilość DNA do reakcji transkrypcji in vitro (minimum 10 μg).

2. Przygotowanie mRNA metodą transkrypcji in vitro

  1. Linearyzować 10 μg pCS2.LifeAct-eGFP na końcu 3' wkładki za pomocą NotI (10 U) w odpowiednim buforze do wytrawiania, rozcieńczonym do 1x w całkowitej objętości reakcyjnej 50 μL w temperaturze 37 °C przez noc.
    nuta: Aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą i zmniejszyć degradację mRNA, podczas pracy z próbkami mRNA należy nosić rękawice.
  2. Oczyść DNA za pomocą mieszaniny fenolu: chloroform: alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v).
    1. Dodać 150 μl wody wolnej od RNaz, aby całkowita objętość reakcji trawienia była równa 200 μl. Następnie dodaj 200 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego i mieszaj mieszaninę przez 20 s.
    2. Wirować w mikrofugach z maksymalną prędkością (18 400 x g) przez 2 min. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną, która zawiera zlinearyzowane DNA. Powtórz ten krok, aby usunąć dodatkowe zanieczyszczenia i uważaj, aby nie zakłócić białego osadu, który może tworzyć się między dolną i górną fazą cieczy.
  3. Wytrącić zlinearyzowane DNA, dodając 1/10 objętości octanu sodu 3M (bez RNaz) i 2,5 objętości 100% etanolu. Pozostawić mieszaninę w temperaturze -20 °C na >30 min, a następnie osadzać DNA przez odwirowanie z maksymalną prędkością (18 400 x g).
    1. Umyj osad DNA 70% etanolem, a następnie susz go na powietrzu przez >5 minuty.
    2. Rozpuść osad DNA w 5 μl wody wolnej od RNaz. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru.
      nuta: Oczekiwane stężenie DNA wynosi ~0,5-1 μg/μL przy stosunku A260/A280 między 1,7-2,0.
  4. Użyj 1 μg zlinearyzowanego DNA pCS2.LifeAct-eGFP do transkrypcji in vitro (IVT). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zawartymi w zestawie komercyjnym (patrz tabela materiałów), aby dołączyć 10 μl analogu czapeczki (stężenie końcowe 0,8 mM) i NTP (stężenie końcowe 1 mM dla ATP, CTP i TTP; 0,2 mM dla GTP), 2 μL 10x buforu reakcyjnego (stężenie końcowe 1x), 2 μL polimerazy RNA SP6, i woda wolna od RNaz do 20 μL.
    1. Mieszaninę IVT inkubować przez około 2 godziny lub dłużej, w zależności od wielkości transkryptu.
      UWAGA: Inkubacja trwająca 2 godziny działa dobrze w przypadku transkryptu o wielkości 3 kb, ale inkubacja przez noc działa lepiej w przypadku transkryptów większych niż 5 kb.
    2. Aby usunąć wolne nukleotydy z reakcji transkrypcji, dodaj 30 μl roztworu do wytrącania LiCl RNA (7,5 M chlorku litu, 50 mM EDTA) w celu wytrącenia mRNA. Mieszaninę należy krótko zmieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 30 minut. Wiruj mRNA przez 15 minut w mikrofudzie z maksymalną prędkością (18 400 x g) i spłucz 70% etanolem (bez RNaz).
  5. Zsyntetyzowane mRNA rozpuścić w 15 μl wody wolnej od RNaz. Dozować zsyntetyzowane mRNA w ilości 5 μl/probówkę (łącznie 3 probówki) i umieścić w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Określ ilościowo mRNA za pomocą spektrofotometru.
    nuta: Przewidywany plon to 15-20 μg mRNA (~1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) jest wystarczający do eksperymentu z ~10 zarodkami, przy założeniu, że mRNA jest rozcieńczone od 1 μg/μL do 500 ng/μL i że każdemu zarodkowi wstrzykuje się ~200 nL. Każda probówka powinna zatem zawierać wystarczającą ilość mRNA na ~5 eksperymentów.
  6. Uruchom ~ 300 ng mRNA na 1% żelu agarozowym w buforze 1x TAE po oczyszczeniu wszystkich urządzeń żelowych roztworem odkażającym RNaza (np. RNase Away) i upewnij się, że mRNA pojawia się jako jedno prążko (wiele prążków może być obecnych, jeśli tworzą się struktury drugorzędowe) i że na pasku żelu nie pojawia się rozmaz, który wskazuje na degradację RNA.

3. Przygotowanie mieszanki do elektroporacji mRNA

  1. Rozmrozić i rozcieńczyć mRNA do pożądanego stężenia (250-500 ng/μL w wodzie wolnej od RNaz działa dobrze dla wszystkich mRNA badanych w tej pracy). Dodaj 1/10 objętości kolorowego barwnika (patrz tabela materiałów, bez RNAse, 0,1% stężenie końcowe), aby pomóc uwidocznić miejsce wstrzyknięcia mRNA i prawidłowo umieścić elektrody.
    UWAGA:     Jeśli DNA i RNA są łączone w celu przeprowadzenia koelektroporacji, upewnij się, że DNA jest wolne od zanieczyszczających RNaz, stosując ekstrakcję fenolowo-chloroformową i wytrącanie etanolu przed zmieszaniem mRNA i DNA.
    1. Należy pamiętać o przygotowaniu kontroli ujemnej przy użyciu imitacji (bez dodatku RNA) roztworu do elektroporacji. Jeśli to możliwe, przygotuj kontrolę pozytywną przy użyciu wstępnie zwalidowanego mRNA (mRNA, które, jak wykazano w poprzednich eksperymentach, z powodzeniem wytwarza FP).
      nuta: Kontrola ujemna jest niezbędna dla wszystkich eksperymentów obrazowych w celu ustalenia poziomów fluorescencji tła w celu normalizacji danych. Kontrola pozytywna jest szczególnie ważna podczas pracy z nowo transkrybowanym mRNA, ponieważ pomaga potwierdzić, że ustawienia elektroporacji zadziałały.
  2. Przechowuj roztwór do elektroporacji mRNA na zawiesinie lodu, aby zapobiec degradacji, dopóki nie będzie gotowy do rozpoczęcia elektroporacji.

4. Elektroportowanie mRNA do żywych zarodków przepiórczych

  1. Zbieraj świeżo złożone zapłodnione jaja przepiórcze codziennie i przechowuj w temperaturze 13 °C w wilgotnej lodówce nie dłużej niż 1 tydzień. Jaja przepiórcze wysiadywać w temperaturze 38 °C aż do osiągnięcia pożądanych etapów rozwoju embrionalnego19,20,21.
    nuta: HH3 do HH5 zastosowano w tym badaniu zarówno do obrazowania statycznego, jak i dynamicznego. W przypadku zarodków HH3 pozostawienie jaj w temperaturze pokojowej na 2 godziny przed pobraniem znacznie ułatwia proces izolacji, ponieważ zarodki są na ogół bardziej odporne na manipulacje fizyczne po schłodzeniu.
  2. Wyizoluj i przygotuj zarodki zgodnie z systemem hodowli EC22. Zbierz co najmniej 5 zarodków na każdy warunek, w tym co najmniej jeden, który posłuży jako kontrola negatywna (nie poddana elektroporacji).
    1. Delikatnie rozbij i wlej jajko do 10 cm szalki Petriego. Usuń większość grubej albuminy za pomocą pipety transferowej i usuń pozostałą gęstą albuminę wokół zarodka, delikatnie przecierając powierzchnię żółtka chusteczką, aby upewnić się, że zarodek ściśle przylega do papierowego pierścienia.
    2. Połóż wstępnie przyciętą bibułę filtracyjną (patrz Tabela materiałów) na zarodku i użyj nożyczek, aby płynnie przeciąć na obwodzie zarodka.
    3. Użyj pipety Pasteura, aby podbudować zarodek PBS, używając delikatnych strumieni, aby usunąć żółtko przyklejające się do zarodka.
      nuta: Ten etap ma kluczowe znaczenie podczas pracy z młodszymi zarodkami (
    4. Powoli pociągnij zarodek/papierowy pierścień pod kątem do góry i zdejmij z żółtka na szalkę Petriego wypełnioną PBS w celu dalszego czyszczenia. Po usunięciu większości żółtka umieścić zarodek brzuszną stroną do góry na szalce Petriego o średnicy 35 mm pokrytej półstałą mieszaniną agaru i białka.
  3. Przygotuj od sześciu do ośmiu szklanych mikrokapilar o długości 10 cm (średnica zewnętrzna = 1,2 mm) za pomocą szklanego ściągacza do mikropipet.
  4. Umieść zarodek brzuszną stroną do góry w komorze do elektroporacji wypełnionej PBS. Za pomocą szklanej mikrokapilary wstrzyknąć bolus 200 nL mieszaniny mRNA lub mieszanki elektroporacyjnej DNA/mRNA do wnęki między epiblastem a błoną witelinową pokrywającą żądany obszar.
    nuta: Cały przedni obszar dla przeźroczystości i pewien obszar dla opaki był elektroporowany w większości eksperymentów pokazanych w tym manuskrypcie.
  5. Umieścić elektrody dodatnią i ujemną (płaska elektroda kwadratowa platynowa, bok o długości 5 mm) odpowiednio na górze i na dole zarodka i elektroporować za pomocą następującej sekwencji impulsów: pięć kwadratowych impulsów elektrycznych o napięciu 5 V, czasie trwania 50 ms w odstępach 100 ms za pomocą elektroporatora in vivo. Upewnij się, że odległość między elektrodami wynosi ~5 mm.
    nuta: Optymalizacja parametrów elektroporacji ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia warunków, które mogą zabić delikatne komórki embrionalne. Parametry napięcia, długości impulsu, interwałów impulsów oraz liczby impulsów dla DNA i mRNA powinny być brane pod uwagę dla różnych urządzeń do elektroporacji.
  6. Inkubować elektropostowane zarodki w temperaturze 38 °C do pożądanego stadium rozwojowego.
    nuta: Fluorescencyjny stereoskop preparacyjny (patrz tabela materiałów) pomaga w badaniach przesiewowych zarodków transfekowanych i nietransfekowanych.
  7. Jeśli zarodki mają być obrazowane statycznie, należy je utrwalić w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. Usuń zarodki z błony witelinowej, płynnie przecinając nożyczkami po obwodzie bibuły filtracyjnej i delikatnie odklejając błyszczącą błonę na powierzchni grzbietowej ostrymi kleszczami.
    2. Umyj utrwalone zarodki w PBS/Triton (0,1%) 2x przez 5 minut i kontynuuj hybrydyzację in situ lub barwienie immunologiczne, jeśli jest to pożądane.
    3. Na koniec wybarwić zarodek w 0,5 μg/μL DAPI w PBS/Triton (0,1%) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Myj zarodki w PBS/Triton 2x przez 5 minut i oczyść zarodek w roztworze SCALE-U223 przez noc.
  8. Aby przeanalizować wydajność elektroporacji (patrz Rysunek 2), użyj narzędzia do analizy binarnej i cząsteczkowej oraz kanału DAPI na ImageJ, aby uzyskać kontury jądrowe ze wszystkich komórek na obrazie.
    1. Aby użyć narzędzia binarnego w ImageJ, użyj pojedynczego wycinka z w kanale DAPI zawierającym większość komórek i kliknij Process > Binary > Make Binary. Aby oddzielić pobliskie komórki, kliknij pozycję Przetwarzaj > binarny > zlewni. Aby uzyskać kontury komórek, kliknij opcję Analizuj > Analizuj cząstki, rozmiar ustawiony na 100–500 (μm2).
    2. Upewnij się, że większość komórek jest obrysowana w kanale DAPI i zapisz kontury komórek, klikając Więcej > Zapisz w wyskakującym oknie menedżera ROI.
    3. Użyj tych konturów, aby uzyskać wartości intensywności fluorescencji dla kanału mRNA i DNA, otwierając wcześniej zapisany plik na pojedynczym wycinku z w kanale mRNA lub DNA, a następnie kliknij przycisk Zmierz w menedżerze ROI.
    4. Na koniec przefiltruj te wartości intensywności, licząc komórki o intensywności fluorescencji <6,000 jako nietransfekowane i komórki o intensywności fluorescencji >6,000 jako transfekowane.

5. Obrazy FP kodowane przez elektroporowane mRNA

  1. Wybierz najzdrowsze i najlepiej naelektryzowane zarodki do eksperymentów z obrazowaniem dynamicznym po obejrzeniu wszystkich elektroporowanych zarodków pod fluorescencyjnym stereoskopem preparacyjnym.
    1. Kontynuować inkubację pozostałych zarodków poddanych elektropostacji oraz zarodka niepoddanego elektropostacji (kontrola ujemna) w oddzielnym inkubatorze, jednocześnie obrazując wybrany zarodek na wypadek, gdyby zarodek ten umrze podczas eksperymentu.
  2. Do obrazowania dynamicznego należy użyć hodowli zarodków ptaków ex ovo z całym mocowaniem, jak opisano wcześniej24,25,26 z odwróconym mikroskopem konfokalnym.
    UWAGA:     Mikroskop jest wyposażony w inkubator sceniczny (patrz tabela materiałów), który utrzymuje temperaturę na poziomie 36 °C podczas obrazowania. Podczas ustawiania mikroskopu zaobserwowano, że zarodki inkubowane w temperaturze 36 °C przeżywają dłużej niż w wyższych temperaturach, prawdopodobnie dlatego, że laser może powodować miejscowe nagrzewanie się zarodka. Czytelnicy powinni określić optymalną temperaturę inkubacji na etapie dla własnej konfiguracji mikroskopu.
    1. Aby dynamicznie zobrazować i uwidocznić embriogenezę, należy krótko oczyścić zarodek podany elektroporacją za pomocą PBS, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogą tworzyć się na grzbietowej stronie zarodka podczas procesu elektroporacji, przesuwając zarodek za pomocą kleszczy w czystym roztworze PBS.
    2. Umieść czysty zarodek bezpośrednio na naczyniu do obrazowania zawierającym cienką warstwę agaru białkowego (~150 μL), uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków na grzbietowej powierzchni zarodka22.
    3. Aby zapewnić przeżycie przy długotrwałym obrazowaniu, dodaj mały, wilgotny, zwinięty kawałek bibuły na wewnętrznych krawędziach naczynia do obrazowania i uszczelnij naczynie folią parafinową, aby zminimalizować parowanie podczas obrazowania i inkubacji.
    4. Przenieś szybko tę naczynie do wstępnie podgrzanego etapu mikroskopu konfokalnego i zlokalizuj kolorowy barwnik w zarodku za pomocą kanału jasnego pola (laser PMT 20%), który identyfikuje wstrzyknięty i elektroporowany obszar.
  3. Ustaw oprogramowanie do obrazowania na żądany obiektyw (10 lub 20x), zwierciadło dichroiczne (488 nm dla GFP nm, 561 dla RFP), widma emisyjne (499-562 nm dla GFP, 570-695 nm dla RFP) i włącz odpowiedni laser (488 nm dla GFP, 561 nm dla RFP).
    UWAGA:     Elektroporowane mRNA uległo translacji na białka, które były widoczne w ciągu 20 minut (patrz Rysunek 3). Metadane obrazowania użyte dla większości obrazów w tym artykule to: odwrócony mikroskop konfokalny z obiektywem 20x (patrz tabela materiałów); czas przebywania pikseli, ~1,5 μs; średnia ze skanów 4-liniowych.
    1. Kliknij opcję Live w oprogramowaniu do obrazowania i dostosuj moc lasera do ustawienia odpowiedniego dla intensywności fluorescencji w zależności od mocy lasera każdego mikroskopu. Zacznij od zobrazowania zarodka przy użyciu 1% mocy lasera, wzmocnienia 800 i powoli zwiększaj moc lasera o 1%, aż zobaczysz nasycone piksele.
    2. Następnie nieznacznie zmniejsz moc lasera, aż nie będzie widać nasyconych pikseli.
      nuta: Moc lasera wybrana na początek sesji obrazowania zarodka może być dobra dla wcześniejszych punktów czasowych, ale nie idealna w późniejszych punktach czasowych, jeśli fluorescencja komórek staje się z czasem znacznie jaśniejsza lub ciemniejsza. Aby temu zaradzić, należy początkowo zobrazować zarodek przy nieco niższych ustawieniach mocy, ponieważ elektroporowane komórki na ogół stają się jaśniejsze w ciągu pierwszych 6 godzin po elektroporacji (patrz rysunek 3A-E w celu ilościowego określenia wzrostu sygnału). Jeśli późniejsze obrazy są nasycone, kontynuuj obrazowanie z oryginalnymi ustawieniami obrazowania, ale natychmiast po tym wykonaj dodatkowe zdjęcie ze słabszymi ustawieniami obrazowania (mniejszy otwór lub słabsza moc lasera).
    3. Obrazuj zarodek co 3-5 minut, aby śledzić migrację poszczególnych komórek w różnych punktach czasowych. W tej pracy obrazy były stosami z (o grubości ~50 μm) całego obszaru elektroporowanego, plus trochę dodatkowego miejsca w kierunku dolnej części stosu z użyciem na wypadek, gdyby zarodek zapadł się w łożu agarozy podczas sesji obrazowania.
    4. Obserwuj, jak szybko poruszają się komórki, sprawdzając kilka pierwszych punktów czasowych pierwszego filmu. Jeśli komórki poruszają się w szybkim tempie (co oznacza, że opuszczą obszar obrazowanego obszaru w ciągu kilku dodatkowych punktów czasowych), rozważ zwiększenie powiększenia obrazowanego obszaru (1x à 0,8x) lub zobrazowanie innego obszaru.
      nuta: Regiony embrionalne w obszarze pellucida przemieszczają się znacznie szybciej niż te w obszarze opaca. Ponadto młodsze zarodki (HH3, HH5) często zawierają komórki, które podlegają szybszemu ruchowi w porównaniu ze starszymi zarodkami (>HH7).
    5. Po zobrazowaniu elektroporowanego obszaru zarodka, zobrazuj nieelektroporowany obszar tego samego zarodka, aby określić poziomy autofluorescencji (powinny być minimalne, jeśli do obrazowania zarodka używa się niskiej mocy lasera <10%).

6. Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) w celu oceny integralności mRNA

UWAGA: Test odzyskiwania fluorescencji in vivo po fotowybielaniu (FRAP) może być użyty do określenia, jak długo transfekowane mRNA może być transfekowane na FP. Poniższy protokół przedstawia eksperyment FRAP w celu wykrycia okresu półtrwania H2B. MRNA cytrynu w elektroporowanym zarodku.

  1. Wykonuj eksperymenty FRAP na odwróconym mikroskopie konfokalnym przy użyciu obiektywu 20x 0,8 NA i całkowicie otwartego otworka.
    1. Po potwierdzeniu elektroporacji H2B-cytrynu na stereomikroskopie i ustawieniu zarodka na wstępnie podgrzanym etapie w odwróconym mikroskopie konfokalnym (patrz krok 5.2.4), fotowybielaj większość fluorescencji komórkowej z H2B-cytrynu w różnych punktach czasowych (45 min, 2 godziny i 5 godzin po elektroporacji) za pomocą lasera 405 nm o 70% mocy lasera, 100 iteracji, prędkość skanowania 4, co pozostawia tylko 5% fluorescencji.
      nuta: Ten proces powinien zająć kilka minut.
    2. Kontynuować inkubację zarodków na etapie w temperaturze 36 °C po fotowybielaniu.
  2. Należy zwrócić uwagę na aktywnie dzielące się komórki w obszarze fotowybielania, które wskazują, że fotowybielone komórki nie umarły całkowicie po leczeniu.
  3. Rejestruj obrazy po wybielaniu (stosy z obszaru elektroporowanego) przez maksymalnie 30 minut w regularnych odstępach czasu (3 lub 5 minut) za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    nuta: Jeśli to możliwe, użyj transgenicznej linii H2B-XFP jako kontroli pozytywnej w celu zapewnienia przeżycia komórek w regionie fotowybielanym. Szybkość odzyskiwania fluorescencji dla FP kodowanego przez elektroporowane mRNA powinna się zmniejszyć, ale dla FP kodowanego przez transgen powinna pozostać spójna przez cały film.
  4. Aby upewnić się, że warunki obrazowania nie wpływają szkodliwie na przeżywalność zarodków, należy jednocześnie inkubować elektropostowane zarodki, które nie są wybielane fotoblaszem, co może służyć jako kontrola obrazowania.
  5. Aby określić ilościowo wyniki fotowybielania dla rozpadu mRNA po elektroporacji, śledź fluorescencję komórki w czasie (3 lub 5 minut), mierząc intensywność fluorescencji środka (okrąg 7,5 μm) każdej komórki za pomocą ImageJ. Zmierz to dla wszystkich komórek w obszarze fotowybielania, które nie przechodzą mitozy i zostały całkowicie wybielone.
    nuta: Rozważ pominięcie komórek mitotycznych w kwantyfikacji, ponieważ jądra mitotyczne mają silniejszą fluorescencję niż jądra międzyfazowe z powodu kondensacji chromatyny.
  6. Wykreśl intensywność fluorescencji w czasie po wybielaniu w różnych punktach czasowych (45 minut, 2 godziny i 5 godzin).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

elektroporacja mRNA jest bardziej efektywna niż elektroporacja DNA

Użyliśmy pCS2+. H2B-Cytryn do przygotowania mRNA transkrybowanego in vitro. Ponieważ elektroporacja DNA jest zwykle wykonywana przy 1-2 μg/μL, do elektroporacji mRNA użyliśmy równomolowego stężenia mRNA (obliczonego na około 0,25-0,5 μg/μL dla H2B-cytrynu) do elektroporacji mRNA. W pierwszej kolejności przetestowaliśmy wydajność elektroporacji p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole przedstawiliśmy instrukcje krok po kroku, jak precyzyjnie mikrowstrzykiwać i elektrorazować mRNA do komórek zarodków przepiórek gastrulujących. Wykazaliśmy, że zsyntetyzowana in vitro elektroporacja mRNA umożliwia szybką i wydajną ekspresję białek fluorescencyjnych (FP) w gastrulujących zarodkach przepiórek (ryc. 2 i 3). Fluorescencja z białka H2B-cytrynu translowanego z elektroporowanych mRNA mogła być wykryta za pomocą mikroskopii konfokalnej w ciągu ~ 20 m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Davidowi Hussowi za pomocne spostrzeżenia na temat tej pracy. Praca ta była częściowo wspierana przez Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) oraz stypendium USC Provost's Undergrad Research Fellowship dla MT, Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award dla MD oraz nagrodę University of Southern California Undergraduate Research Associates Program dla R.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowyThermo Fisher
SP6 mMessage Machine zestaw do transkrypcji in vitroThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich93443Glikol 4-(1,1,3,3-Tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy, t-Octylphenoxyethoxyethanol, Eter glikolu polietylenowego tert-oktylofenylowy
DAPISigma AldrichD9542Dichlorowodorek 2-(4-amidinofenylo)-6-indolokarbidyny, dichlorowodorek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu, dichlorowodorek DAPI
Bibuła filtracyjna Whatman No.1Sigma AldrichWHA1001125
glicerolSigma AldrichG9012
MocznikSigma Aldrich Aldrich51457
pmTurkus2-GolgiAddgene36205pmTurkus2-Golgi był prezentem od Dorusa Gadelli (plazmid Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5:605-7. Identyfikator PubMed: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneTen artykuł
pCS.H2B-cytrynAddgene53752pCS-H2B-cytryn był prezentem od Seana Megasona (plazmid Addgene # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry był prezentem od Seana Megasona (plazmid Addgene # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Mikroskop odwrócony Zeiss LSM-780Carl Zeiss Microscopy GmbHLSM-780 to mikroskop konfokalny i wielofotonowy, który oferuje czułość wymaganą do ważnych prac obrazowych. Wyposażony w zmotoryzowany stolik, urządzenie do automatycznego ustawiania ostrości i inkubator z pełnym zaciemnieniem, model 780 jest doskonałym mikroskopem do wysokiej jakości obrazowania żywych komórek/zarodków. 32-kanałowy detektor Quasar o wysokiej czułości pozwala na obrazowanie spektralne, liniowe rozmieszanie i akwizycję obrazu o dużej liczbie kolorów (>4). Wzbudzenie może być realizowane za pomocą 6-liniowych laserów jednofotonowych (405, 458, 488, 514, 564 i 633 nm), lasera 2-fotonowego Chameleon (Coherent) (zakres od 690nm do 1000nm) oraz pracy z oprogramowaniem systemowym ZEN 2011 SP7 (Black).
CUY-21 EDIT Elektroporator in vivoBex Co., Ltd.
Płaska elektroda kwadratowa platynowa, długość boku 5 mmBex Co., Ltd.
Mikroskop stereoskopowy Olympus MVX10 FLOlympus LifeScience
XM10Olympus LifeScience
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do HCR (10&krotnie, pH 7,4) Aby przygotować 1 l 10-krotnego roztworu podstawowego, połącz 80 g NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g Na2HPO4 (bezwodny; Sigma-Aldrich S3264) i 2,7 g KH2PO4 (bezwodny; Sigma-Aldrich P9791). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i doprowadź końcową objętość do 1 l za pomocą ultraczystego H2O. Należy unikać stosowania CaCl2 i MgCl2 w PBS dla HCR. Ważne jest, aby PBS dla HCR był przygotowany jako roztwór wolny od RNaz (np. poprzez obróbkę ditylowęglanem [DEPC]).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton1 ml Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) i 100 ml 10&razy; PBS do 890 ml ultraczystego destylowanego H2O. Przefiltrować roztwór przez 0,2 μ m przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 ? C do momentu użycia.
1&krotnie; sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (poddawana działaniu DEPC; pH 7,4)
0,1% Triton X-100
15593031LF701P5E Aparat monochromatyczny Dodaj

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894(2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674(2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918(2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

mRNA ElectroporationAvian EmbryosFluorescent ProteinsProtein ExpressionConfocal MicroscopyPhotobleaching AssayTransfection EfficiencyEmbryo ImagingQuail EmbryosDynamic Imaging

Related Articles