Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

Summary

Opisujemy elektroporację informacyjnego RNA (mRNA) jako metodę, która pozwala na szybką i efektywną ekspresję wielu białek w systemie modelowym zarodka przepiórki. Metoda ta może być stosowana do fluorescencyjnego znakowania komórek i rejestrowania ich ruchów in vivo za pomocą mikroskopii poklatkowej wkrótce po elektroporacji.

Abstract

Informujemy, że elektroporacja mRNA pozwala białkom fluorescencyjnym znakować komórki w żywych zarodkach przepiórczych szybciej i szerzej niż elektroporacja DNA. Wysoka wydajność transfekcji pozwala na kotransfekcję co najmniej 4 różnych mRNA z wydajnością ~87%. Większość wysterylizowanych elektroporacją mRNA ulega degradacji w ciągu pierwszych 2 godzin po elektroporacji, co pozwala na przeprowadzenie wrażliwych na czas eksperymentów w rozwijającym się zarodku. Na koniec opisujemy, jak dynamicznie obrazować żywe zarodki elektroporowane mRNA, które kodują różne subkomórkowe ukierunkowane białka fluorescencyjne.

Introduction

Elektroporacja to metoda fizycznej transfekcji, która wykorzystuje impuls elektryczny do tworzenia przejściowych porów w błonie plazmatycznej, umożliwiając substancjom takim jak kwasy nukleinowe lub chemikalia przejście do cytozolu. Elektroporacja jest szeroko stosowana do dostarczania DNA do komórek bakterii, drożdży, roślin i ssaków^1,2,3. Jest rutynowo stosowany do wprowadzania ładunków genetycznych do docelowych komórek i tkanek w rozwijającym się zarodku ptaka w celu zbadania genetycznej kontroli rozwoju lub oznaczania migrujących populacji komórek⁴

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Szpitala Dziecięcego w Los Angeles oraz Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Kalifornii.

1. Generowanie wektorów wyrażeń opartych na pCS2

1. Aby sklonować pCS2.Lifeact-eGFP, należy przygotować szkielet wektora, trawiąc 2 μg pCS2.CycB1-GFP (konstrukt zawierający inną wstawkę) za pomocą BamHI (10 U) i BsrGI (10 U) w odpowiednim buforze do mineralizacji (patrz tabela materiałów) rozcieńczonym do 1x w całkowitej objętości reakcji 50 μL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (patrz

Results

elektroporacja mRNA jest bardziej efektywna niż elektroporacja DNA

Użyliśmy pCS2+. H2B-Cytryn do przygotowania mRNA transkrybowanego in vitro. Ponieważ elektroporacja DNA jest zwykle wykonywana przy 1-2 μg/μL, do elektroporacji mRNA użyliśmy równomolowego stężenia mRNA (obliczonego na około 0,25-0,5 μg/μL dla H2B-cytrynu) do elektroporacji mRNA. W pierwszej kolejności przetestowaliśmy wydajność elektroporacji p.......

Discussion

W tym protokole przedstawiliśmy instrukcje krok po kroku, jak precyzyjnie mikrowstrzykiwać i elektrorazować mRNA do komórek zarodków przepiórek gastrulujących. Wykazaliśmy, że zsyntetyzowana in vitro elektroporacja mRNA umożliwia szybką i wydajną ekspresję białek fluorescencyjnych (FP) w gastrulujących zarodkach przepiórek (ryc. 2 i 3). Fluorescencja z białka H2B-cytrynu translowanego z elektroporowanych mRNA mogła być wykryta za pomocą mikroskopii konfokalnej w ciągu ~ 20 m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy	Thermo Fisher
SP6 mMessage Machine zestaw do transkrypcji in vitro	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	Glikol 4-(1,1,3,3-Tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy, t-Octylphenoxyethoxyethanol, Eter glikolu polietylenowego tert-oktylofenylowy
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	Dichlorowodorek 2-(4-amidinofenylo)-6-indolokarbidyny, dichlorowodorek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu, dichlorowodorek DAPI
Bibuła filtracyjna Whatman No.1	Sigma Aldrich	WHA1001125
glicerol	Sigma Aldrich	G9012
Mocznik	Sigma Aldrich Aldrich	51457
pmTurkus2-Golgi	Addgene	36205	pmTurkus2-Golgi był prezentem od Dorusa Gadelli (plazmid Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Methods 2008;5:605-7. Identyfikator PubMed: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		Ten artykuł
pCS.H2B-cytryn	Addgene	53752	pCS-H2B-cytryn był prezentem od Seana Megasona (plazmid Addgene # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry był prezentem od Seana Megasona (plazmid Addgene # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Mikroskop odwrócony Zeiss LSM-780	Carl Zeiss Microscopy GmbH		LSM-780 to mikroskop konfokalny i wielofotonowy, który oferuje czułość wymaganą do ważnych prac obrazowych. Wyposażony w zmotoryzowany stolik, urządzenie do automatycznego ustawiania ostrości i inkubator z pełnym zaciemnieniem, model 780 jest doskonałym mikroskopem do wysokiej jakości obrazowania żywych komórek/zarodków. 32-kanałowy detektor Quasar o wysokiej czułości pozwala na obrazowanie spektralne, liniowe rozmieszanie i akwizycję obrazu o dużej liczbie kolorów (>4). Wzbudzenie może być realizowane za pomocą 6-liniowych laserów jednofotonowych (405, 458, 488, 514, 564 i 633 nm), lasera 2-fotonowego Chameleon (Coherent) (zakres od 690nm do 1000nm) oraz pracy z oprogramowaniem systemowym ZEN 2011 SP7 (Black).
CUY-21 EDIT Elektroporator in vivo	Bex Co., Ltd.
Płaska elektroda kwadratowa platynowa, długość boku 5 mm	Bex Co., Ltd.
Mikroskop stereoskopowy Olympus MVX10 FL	Olympus LifeScience
XM10	Olympus LifeScience
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do HCR (10&krotnie, pH 7,4)			Aby przygotować 1 l 10-krotnego roztworu podstawowego, połącz 80 g NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g Na2HPO4 (bezwodny; Sigma-Aldrich S3264) i 2,7 g KH2PO4 (bezwodny; Sigma-Aldrich P9791). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i doprowadź końcową objętość do 1 l za pomocą ultraczystego H2O. Należy unikać stosowania CaCl2 i MgCl2 w PBS dla HCR. Ważne jest, aby PBS dla HCR był przygotowany jako roztwór wolny od RNaz (np. poprzez obróbkę ditylowęglanem [DEPC]).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			1 ml Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) i 100 ml 10&razy; PBS do 890 ml ultraczystego destylowanego H2O. Przefiltrować roztwór przez 0,2 μ m przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 ? C do momentu użycia.
1&krotnie; sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (poddawana działaniu DEPC; pH 7,4)
0,1% Triton X-100