Artykuł metodologiczny

Solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59667

⸱

21 stycznia 2020

 , 
1Department of Dental Oncology and Maxillofacial Prosthetics, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Faculty of Dentistry, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia indukowanego przez ligaturę modelu mysiego zapalenia przyzębia obejmującego wiele zębów trzonowych szczęki, co skutkuje większymi obszarami zaangażowanej tkanki dziąsłowej i kości do późniejszej analizy, a także zmniejszeniem zużycia przez zwierzęta. Opisano również technikę oceny neutrofili w jamie ustnej w sposób analogiczny do osób badanych u ludzi.

Streszczenie

Główne zalety badania patofizjologii chorób przyzębia za pomocą modeli mysich to obniżony koszt zwierząt, szereg genetycznie modyfikowanych szczepów, ogromna liczba analiz, które można przeprowadzić na pobranych tkankach miękkich i twardych. Wiele z tych systemów jest jednak przedmiotem krytyki proceduralnej. Alternatywnie można zastosować model choroby przyzębia indukowany przez ligatury, napędzany przez miejscowy rozwój i utrzymanie dysbiotycznego mikrobiomu jamy ustnej, który jest szybko indukowany i stosunkowo niezawodny. Niestety, warianty protokołu mysiego zapalenia przyzębia wywołanego ligaturą są izolowane do ogniskowych obszarów przyzębia i podlegają przedwczesnemu zwichnięciu zainstalowanej ligatury. Minimalizuje to ilość tkanki dostępnej do kolejnych analiz i zwiększa liczbę zwierząt potrzebnych do badania. Protokół ten opisuje precyzyjne manipulacje wymagane do umieszczenia rozszerzonych ligatur trzonowych z lepszą retencją i zastosowaniem nowatorskiej techniki płukania w celu odzyskania doustnych neutrofili u myszy przy użyciu alternatywnego podejścia, które łagodzi wyżej wymienione wyzwania techniczne.

Wprowadzenie

Choroba przyzębia (PD) jest schorzeniem osteolitycznym związanym ze znaczną zachorowalnością gospodarza i obciążeniem ekonomicznym, które objawia się zapaleniem dziąseł i utratą zarówno przyczepu tkanek miękkich, jak i podparcia kostnego dla chorego uzębienia1,2,3,4. Proces ten jest regulowany przez interakcje między mikrobiotą jamy ustnej a wrodzonym układem odpornościowym gospodarza. Wiąże się to również z zaostrzeniem innych ogólnoustrojowych chorób zapalnych, w tym cukrzycy, chorób układu krążenia i raka5,6,7,8. Historycznie rzecz biorąc, postawiono hipotezę, że patogeneza choroby Parkinsona jest zależna od dużych ilości określonych bakterii, takich jak Porphyromonas gingivalis9. Jednak najnowsze dowody sugerują, że w mikrobiologicznym składniku PD pośredniczy biofilm zębowy. Biofilm jest zorganizowaną, złożoną społecznością licznych mikroorganizmów, które mogą istnieć w zdrowych, symbiotycznych i destrukcyjnych stanach dysbiotycznych10,11. Biofilm jamy ustnej zwykle zapewnia odporność gospodarza, zapobiegając tworzeniu się ognisk bakterii chorobotwórczych i promuje idealną strukturę i funkcję tkanki dziąseł poprzez regulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza12,13. Zaburzenia równowagi między organizmami komensalnymi w obrębie jamy ustnej a układem odpornościowym gospodarza mogą prowadzić do zmian w homeostazie tkanek, co skutkuje dysbakteriozą i rozwojem charakterystycznych objawów klinicznych i radiologicznych PD5,10,12,13,14.

Interesujące, wytworzenie dysbakteriozy w jamie ustnej, choć wymagane do zainicjowania PD, nie jest wystarczające do wywołania PD u wszystkich osób, wymykając się zdolności odpowiedzi immunologicznej gospodarza do zakłócenia przejścia mikrobioty między stanami symbiotycznymi i dysbiotycznymi15. Kładzie to szczególny nacisk na środki, za pomocą których PD wpływa na jedną z głównych cech wrodzonego układu odpornościowego, a mianowicie granulocyt wielojądrzasten (PMN) lub neutrofile, z perspektywy lokalnej i ogólnoustrojowej16,17.

U ludzi PMN są rekrutowane z krążenia w tempie ~2 x 106 komórek/h w zdrowych tkankach łącznych przyzębia, gdzie są dominującą populacją leukocytów. Tutaj są one następnie wydalane z bruzdy dziąsłowej do jamy ustnej jako składnik płynu dziąsłowego. W obecności PD neutrofilia objawia się w krążeniu i jamie ustnej, gdzie te komórki efektorowe posiadają fenotyp hiperzapalny, który prowadzi do wspomnianego wcześniej zniszczenia przyzębia17,18,19,20,21,22. Dlatego zrozumienie roli PMN w chorobie Parkinsona i innych ogólnoustrojowych stanach zapalnych ma ogromne znaczenie.

Chociaż powszechnie przyjmuje się, że choroby przewlekłe są wzajemnie powiązane z chorobą Parkinsona, mechanizmy leżące u ich podstaw nie zostały jeszcze wyjaśnione, co przyczynia się do trudności w leczeniu tych chorobliwych i potencjalnie śmiertelnych chorób ogólnoustrojowych. Wiele eksperymentalnych modeli zwierzęcych, z których każdy ma unikalne zalety i wady, zostało wykorzystanych do badania patofizjologii PD23,24. Skupiając się w szczególności na modelach mysich, istnieje wiele protokołów, dzięki którym badanie PD jest ułatwione; Mają jednak kilka technicznych i fizjologicznych niedociągnięć25,26,27,28,29,30,31.

Po pierwsze, model myszy z zgłębnikiem jamy ustnej wymaga wielu doustnych szczepień ludzkimi patogenami przyzębia, aby wywołać zapalenie dziąseł i utratę kości. Dodatkowo, jest on zazwyczaj poprzedzony okresem antybiotykoterapii w celu obalenia mysiej komensalnej flory jamy ustnej25. Model ten często wymaga specjalistycznego szkolenia, aby bezpiecznie wykonać zgłębnik jamy ustnej, wykorzystuje tylko niewielką część patogenów przyzębia z bardziej złożonego ludzkiego mikrobiomu jamy ustnej i wymaga kilku miesięcy na ustalenie ubytku kości wyrostka zębodołowego.

Dla kontrastu, chemicznie indukowane modele mysie wykorzystują doustne dostarczanie kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) lub siarczanu dekstranu sodu (DSS), środków powszechnie stosowanych do tworzenia mysich modeli zapalenia jelita grubego przez okres kilku miesięcy w celu wywołania utraty kości przyzębia26. Dostępne są modele oparte na ropniu wewnątrzustnym i zewnątrzustnym, które obejmują odpowiednio mysie siekacze i tkanki grzbietu, a także kalwarii. W poprzednim modelu ropnia podaje się kilka zastrzyków z bakterii, co powoduje powstawanie wielu ropni dziąseł i niedostatek zaniku kości wyrostka zębodołowego, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach nad chorobą Parkinsona. Te ostatnie modele ropni są znacznie bardziej podatne na badanie zjadliwości bakteryjnej, stanu zapalnego i resorpcji kości w miejscach poza jamą ustną, co eliminuje ocenę mikrobiomu przyzębia i jamy ustnej27,28,29,30,31.

Korzystając z modelu zapalenia przyzębia wywołanego przez ligatury, zwykle zakłada się pleciony jedwabny szew wokół drugiego zęba trzonowego. Alternatywnie, pojedynczy liniowy segment materiału do szycia można umieścić między pierwszym a drugim zębem trzonowym32,33. Celem wszczepienia ligatury jest ułatwienie akumulacji bakterii i wytworzenie dysbiozy w obrębie bruzd dziąsłowych, skutkujących stanem zapalnym tkanek przyzębia i zniszczeniem tkanek tworzących przyzębie. Przede wszystkim model ten jest w stanie spowodować znacznie większy ubytek kości wyrostka zębodołowego w porównaniu z częściej stosowanym modelem gaźnika jamy ustnej34. Dodatkowym utrudnieniem stosowania modelu zgłębnika w jamie ustnej jest naturalna odporność kilku szczepów myszy (tj. C57BL/6) na rozwój utraty kości wyrostka zębodołowego. Jest to również problematyczne, ponieważ ten szczep jest najczęściej używany w badaniach na myszach na zwierzętach35.

Istniejące procedury opisane przez Marchesan et al. oraz Abe i Hajishengallis zostały opracowane w celu uproszczenia technicznego aktu umieszczania ligatury33,36. Niestety, poprzedni protokół wymaga specjalistycznego sprzętu drukowanego w 3D i stwarza ryzyko przedwczesnej utraty ligatur, co zwiększa wykorzystanie zwierząt i koszty związane z dodatkowym czasem spędzonym na sali operacyjnej. Co więcej, oba protokoły generują tylko małe obszary chorego przyzębia dostępne do badania.

Korzyści płynące z tej techniki wynikają z jednoczesnego badania dysbiozy jamy ustnej i immunologii, które rządzą przyzębiem, wykorzystania tanich zwierząt o różnym pochodzeniu genetycznym oraz prostych praktykach hodowlanych i hodowlanych. W związku z tym celem powinno być maksymalizowanie objętości chorej tkanki i, w próbach praktykowania zasad redukcji w badaniach na zwierzętach, ograniczenie spożycia zwierząt do jak najniższego poziomu. Wymaga to upewnienia się, że wszystkie zwierzęta mogą zostać włączone do analiz eksperymentalnych37. Należy jednak zauważyć, że bez względu na to, jaki zwierzęcy model choroby przyzębia zostanie wykorzystany, nie ma jednego modelu, który obejmowałby każdy element patofizjologii choroby Parkinsona u człowieka.

Ten nowy protokół wykorzystuje umieszczanie ligatury wokół wielu zębów trzonowych szczęki przy użyciu narzędzi i materiałów, które można znaleźć w większości laboratoriów. Daje to wystarczającą ilość czasu na łatwe i pewne zainstalowanie ligatury, która prawdopodobnie nie ulegnie przedwczesnemu złudzeniu. Wreszcie, ponieważ PMN koordynują niszczenie przyzębia w PD, przedstawiono również nową metodologię odzyskiwania doustnych neutrofili w sposób analogiczny do ludzkiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na myszach były zgodne z odpowiednimi przepisami etycznymi i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Toronto oraz Radę ds. Etyki Badań (Protokół 20011930).

1. Instalacja ligatury

UWAGA: To jest niesterylny zabieg chirurgiczny, który można przeprowadzić na standardowej sali operacyjnej. Wykorzystanie zwierząt wolnych od zarazków (nieomówione tutaj) wymaga obchodzenia się z nimi w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używania sterylnych narzędzi i zaszczepiania jamy ustnej patogenami przyzębia w celu wywołania objawów klinicznych zapalenia przyzębia.

  1. Podać znieczulenie dootrzewnowe 8-12-tygodniowym samcom myszy C57BL/6, które powinny zostać zaaklimatyzowane w swoim obiekcie inwentarskim, za pomocą sterylnej igły podskórnej 0,5" 26 G i strzykawki 1 ml zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania (IACUC).
    UWAGA: Połączenie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) środków znieczulających szybko i niezawodnie indukuje odpowiedni poziom znieczulenia na czas zabiegu.
  2. Oceń głębokość znieczulenia przed zabiegiem i co 15 minut w jego trakcie, o czym świadczy utrata odruchu pedałowania.
  3. Umieść mysz na podgrzewanej platformie chirurgicznej (Rysunek 1A). Ustabilizuj szczękę i żuchwę w pozycji otwartej za pomocą elastycznych taśm i podeprzyj szyję bawełnianą rolką, aby pomóc utrzymać szczękę w bardziej poziomej orientacji (Rysunek 1B). Przykryj ciało i ogon zwierzęcia, aby złagodzić utratę ciepła podczas zabiegu.
  4. Ustaw mikroskop chirurgiczny pod żądanym powiększeniem i oświetleniem (jeśli nie jest zamontowany bezpośrednio na mikroskopie) nad jamą ustną w celu wizualizacji uzębienia. Podczas gdy pożądane powiększenie zależy od operatora, optymalną wizualizację jamy ustnej uzyskuje się przy 16x.
  5. Załóż sterylny jedwabny szew pleciony 5-0 wokół pierwszych (M1) i drugich (M2) zębów trzonowych szczęki w obrębie bruzdy dziąsłowej za pomocą kleszczy odłamkowych.
    UWAGA: W tym celu można zastosować plecione szwy jedwabne o mniejszej grubości, aby ułatwić szybszy montaż i zmniejszyć możliwość jatrogennego uszkodzenia tkanek miękkich.
    1. Umieść dystalny ogon szwu po stronie podniebiennej uzębienia i włóż bliższy segment między kontaktem M2 i M3 (Rysunek 2A).
    2. Owiń szew wokół powierzchni policzkowej M2 i włóż go między kontakt M1 i M2. Upewnij się, że oba końce szwu są mocno naciągnięte, aby wbić szew w bruzdę dziąsłową i usunąć cały luz (Rysunek 2B).
    3. Owiń proksymalny segment szwu wokół M1, poniżej jego wysokości konturu, i włóż go między styk M1 i M2. Pociągnij mocno proksymalny ogon szwu, aby wbić szew w bruzdę dziąsłową i usunąć cały luz (Rysunek 2C).
      UWAGA: Jeśli podczas zakładania szwu między M1 a M2 lub M2 i M3 obserwuje się opór, kontakt może być lekko otwarty za pomocą standardowego eksploratora dentystycznego.
    4. Zawiąż końce szwu węzłem chirurgicznym i przytnij ogony tak krótko, jak to możliwe. Umieść węzeł w otworze strzelniczym między M1 i M2 po stronie podniebiennej uzębienia szczęki (Rysunek 2D).
      UWAGA: Kroki 1.4.1–1.4.4 można powtórzyć po stronie przeciwnej, jeśli jest to wymagane.
    5. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze z gorącymi szklanymi kulkami między każdym zwierzęciem.
      UWAGA: Końcówki kleszczy są niezwykle ostre i mogą łatwo spowodować uraz jamy ustnej i znaczne krwawienie. Przygotuj małe segmenty gazy, aby usunąć krew z jamy ustnej i uciskać aktywnie krwawiące rany.
  6. Po założeniu ligatury wyjmij mysz z aparatu chirurgicznego, umieść ją w czystej klatce pod lampą grzewczą i monitoruj, aż w pełni wyzdrowieje.
  7. Indywidualnie umieść każdą mysz z odpowiednim wzbogaceniem środowiska i zapewnij ad libitum dostęp do przefiltrowanej wody i puree standardowego pokarmu w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (12-godzinny cykl światła/12-godzinny cykl ciemny) przez 7–11 dni.
    UWAGA: Puree chow zmniejsza siły potrzebne do żucia, zmniejszając w ten sposób ból związany z karmieniem i pomaga w zapobieganiu przedwczesnej utracie zainstalowanej ligatury.

2. Pobieranie próbek

  1. Eutanazja myszy zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC.
    UWAGA: Indywidualna eutanazja przy użyciu komory CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy jest preferowaną metodą w tym protokole. Może to ulec zmianie w zależności od eksperymentów, które wymagają pobrania dodatkowych tkanek.
  2. Za pomocą pipety natychmiast przepłukać jamę ustną 100 μL wysterylizowanego soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o temperaturze 4 °C 1x PBS bez wapnia i magnezu przez 10 sekund.
  3. Powtórz krok 2.2 2x i umieść każde płukanie w pojedynczej stożkowej sterylnej probówce z polipropylenu o pojemności 15 ml.
  4. Przenieś zawartość do stożkowej sterylnej probówki z polipropylenu o pojemności 50 ml, przepuszczając ją przez nylonowy filtr siatkowy o średnicy 40 μm.
  5. Przenieś tę zawartość do nowej sterylnej probówki ze stożka polipropylenowego o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Ostateczne przeniesienie próbki do mniejszej probówki pozwala na lepszą wizualizację osadu komórkowego w kolejnych krokach.
    1. W razie potrzeby usunąć ligaturę (ligatury) molową i umieścić w 300 μl wysterylizowanego 1x PBS (4 °C, bez wapnia i magnezu) w oddzielnej sterylnej probówce ze stożka polipropylenowego o pojemności 15 ml. Delikatnie zamieszaj i usuń szew z tubki. Od tego momentu próbka ta jest traktowana identycznie jak próbka do płukania jamy ustnej.
  6. Dodać 33,3 μl 16% paraformaldehydu (PFA), aby ułatwić utrwalenie próbki.
  7. Próbki należy natychmiast zwirować i inkubować na lodzie przez 15 minut.
  8. Napełnij probówkę do 15 ml 1x PBS w celu rozcieńczenia PFA, a następnie odwiruj przy 1000 x g i 4 °C przez 5 minut.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w temperaturze 4 °C. Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  10. Ponownie odwirować próbkę w temperaturze 1000 RCF i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu FACS do uzyskania końcowego stężenia 0,5–1,0 x 106 komórek/50 μl buforu FACS.

3. Barwienie przeciwciał do analizy metodą cytometrii przepływowej

UWAGA: Oznacz i schładzaj wszystkie wymagane probówki FACS przed użyciem.

  1. Dodać 1 μl surowicy szczura i 2 μl przeciwciała anty-mysiego IgG do 50 μl próbki, natychmiast przemieszać i blokować na lodzie przez 20 minut.
  2. Dodać odpowiednie przeciwciała do każdej próbki, natychmiast wirować i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności.
    UWAGA: Dobór i ilość przeciwciał zależą od wcześniejszych eksperymentów pilotażowych optymalizacyjnych dostosowanych do tej konkretnej techniki.
  3. Przemyć próbki 1 ml buforu FACS, krótko wirować i odwirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i 4 °C. Powtórzyć ten krok 2 razy.
  4. Zawiesić próbki w 250 μl buforu FACS, przykryć probówki folią parafinową, zawinąć w folię aluminiową i utrzymać w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
    UWAGA: Idealnie nadaje się do analizy próbek w ciągu kilku godzin od ukończenia protokołu ze względu na utratę sygnału fluorescencyjnego podczas długich okresów przechowywania. Jednak próbki mogą być analizowane 2-3 dni później, jeśli jest to absolutnie wymagane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej próbek z płukania jamy ustnej myszy naiwnej (Rysunek 3A) oraz z jamy ustnej z zapaleniem (Rysunek 3B) wywołanym przez ligaturę w modelu periodontitis. Zaprezentowano również odzysk PMN z zamocowanej ligatury (Rysunek 3C). Napięcia kanałów cytometru przepływowego skalibrowano ręcznie, a kompensację przeprowadzono przy użyci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najbardziej krytycznym elementem związanym ze stosowaniem mysiego modelu zapalenia przyzębia indukowanego przez więzadło jest zachowanie ligatury do czasu poświęcenia lub celowego usunięcia. Zainstalowana ligatura zatrzymująca biofilm jest w stanie wywołać znaczną utratę wysokości kości wyrostka zębodołowego w ciągu zaledwie 6 dni, utrzymując się na stałym poziomie między 11-16 dniami39. Decyzja o uśmierceniu zwierząt przed maksymalnym okresem utraty masy kostnej, co czyni ten model znacznie króts...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

J. W. C. jest wspierany przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR). Autorzy chcieliby podziękować dr Chunxiang Sun za pomoc w przeprowadzeniu barwienia błękitem trypanowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało przeciw myszom F4/80BioLegend123131 BV421, klon BM8
Przeciwciało przeciw myszom Ly6GBD560602PerCP-Cy5.5, klon 1A8
C57BL/6 samce myszyCharles Riverwieku od 8 do 12 tygodni
Stożkowa probówka wirówkowaFroggaBioTB15-50015 ml
stożkowa probówka wirówkowaFroggaBioTB50-50050 ml
Bufor FACSwielokrotny1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDivaBDv8.0.1
Fibre-LiteDolan-JennerModel 180
FlowJoTree Starv10.0.8r1
Pompa do terapii cieplnejHallowellHTP-1500
Sterylizator gorących szklanych kulekMikroskopia elektronowa Sciences66118-10Germinator 500
Nożyczki do tęczówkiAlmedic7602-A8-684Prosta
ketaminaVetoquinol100mg/mL
LSRFortessaBDX-20
Mysie serumSigmaM5905-5ML
Nylonowy filtr siatkowyFisher Scientific22-363-54740 i Mikro; m
ParaformaldehydFisher Scientific2890816% (w/v), Sól fizjologiczna buforowana fosforanem bez metanolu
SigmaD1408-500MLBez CaCl2 i MgCl2, 10x
plastikowe jednorazowe strzykawkiBD3096591 ml
Rat SerumSigmaR9759-5ML
Jedwabny szewCovidienSS652C13 USP 5-0
Kleszcze przeciwodłamkoweAlmedic7726-A10-700#1
Kleszcze odłamkoweAlmedic7727-A10-704#5
Stereoskopowy mikroskop preparacyjnyCarl Zeiss28865Photo-Zusatz
Sterylna igła hipodemicznaBD30511126G X 1/2"
StrzykawkaBD3096591 ml
KsylazynaRompun20mg/ml
w

Bibliografia

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35(2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Periodontitis indukowane wi zaniemregeneracja neutrofili w jamie ustnejmysi model paradontozyanaliza tkanki dzi s owejcytometria przep ywowainstrumenty mikrochirurgicznemikroskop chirurgicznyfiksacja paraformaldehydemubytek ko ci jamki z bowejp ukanie jamy ustnej

Powiązane artykuły