Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Podsumowanie

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Streszczenie

Przedkliniczne badania nad chorobami naczyniowymi wymagają modeli in vitro naczyń krwionośnych, które można dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Jednak obecne modele badań przesiewowych in vitro, które mają wystarczającą przepustowość, mają jedynie ograniczone znaczenie fizjologiczne, co utrudnia przełożenie wyników z in vitro na in vivo. Z drugiej strony, platformy mikroprzepływowych hodowli komórkowych wykazały niezrównane znaczenie fizjologiczne in vitro, ale często brakuje im wymaganej przepustowości, skalowalności i standaryzacji. Pokazujemy solidną platformę do badania angiogenezy komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-ECs) w fizjologicznie odpowiednim mikrośrodowisku komórkowym, w tym perfuzji i gradientach. iPSC-EC są hodowane jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D na wzorzystym rusztowaniu kolagenu-1. Po zastosowaniu gradientu czynników angiogennych można badać ważne cechy charakterystyczne angiogenezy, w tym różnicowanie się na komórki wierzchołkowe i łodygowe oraz tworzenie przepuszczalnego światła. Perfuzja fluorescencyjnymi barwnikami znacznikowymi umożliwia badanie przepuszczalności w trakcie i po zespoleniu kiełków angiogennych. Podsumowując, metoda ta pokazuje wykonalność EC pochodzących z iPSC w standaryzowanym i skalowalnym teście angiogennym 3D, który łączy fizjologicznie istotne warunki hodowli na platformie, która ma wymaganą solidność i skalowalność, aby można ją było zintegrować z infrastrukturą badań przesiewowych leków.

Wprowadzenie

Modele in vitro odgrywają fundamentalną rolę w odkrywaniu i walidacji nowych celów leków na choroby naczyniowe. Jednak obecne modele badań przesiewowych in vitro, które mają wystarczającą przepustowość, mają ograniczone znaczenie fizjologiczne¹, co utrudnia przełożenie wyników z in vitro na in vivo. W związku z tym, aby posunąć naprzód przedkliniczne badania nad lekami naczyniowymi, niezbędne są ulepszone modele naczyń krwionośnych in vitro, które łączą wysokoprzepustowe badania przesiewowe z fizjologicznie istotnym mikrośrodowiskiem komórkowym 3D.

W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w celu zwiększenia fizjologicznego znaczenia modeli in vitro naczyń krwionośnych. Zamiast hodować komórki śródbłonka na płaskich powierzchniach, takich jak tworzywa sztuczne z kultur tkankowych, komórki śródbłonka można osadzić w rusztowaniach 3D, takich jak fibryna i żele kolagenowe². W obrębie tych macierzy komórki śródbłonka wykazują bardziej fizjologicznie istotny fenotyp związany z degradacją macierzy i tworzeniem światła. Jednak modele te pokazują tylko podzbiór wielu procesów, które zachodzą podczas kiełkowania angiogennego, ponieważ nadal brakuje ważnych wskazówek z mikrośrodowiska komórkowego.

Platformy do hodowli komórek mikroprzepływowych są wyjątkowo przystosowane do dalszego zwiększania fizjologicznego znaczenia modeli in vitro naczyń. Na przykład komórki śródbłonka mogą być narażone na naprężenia ścinające, które są ważnym bodźcem biomechanicznym dla układu krwionośnego. Ponadto możliwość przestrzennego sterowania płynami w mikrofluidyce pozwala na tworzenie gradientów biomolekularnych^3,4,5,6. Takie gradienty odgrywają ważną rolę in vivo podczas tworzenia i modelowania podczas angiogenezy. Jednakże, podczas gdy platformy mikroprzepływowych hodowli komórkowych wykazały niezrównane znaczenie fizjologiczne w porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli komórkowych 2D i 3D, często brakuje im niezbędnej przepustowości, skalowalności i standaryzacji, które są wymagane do badań przesiewowych leków⁷. Ponadto wiele z tych platform nie jest dostępnych na rynku i wymaga od użytkowników końcowych mikrofabrykacji swoich urządzeń przed użyciem⁸. Wymaga to nie tylko aparatury produkcyjnej i wiedzy technicznej, ale także ogranicza poziom kontroli jakości i negatywnie wpływa na odtwarzalność⁹.

Do tej pory, pierwotne ludzkie komórki śródbłonka pozostają najczęściej używanym źródłem komórek do modelowania angiogenezy in vitro¹⁰. Jednak pierwotne komórki ludzkie mają szereg ograniczeń, które utrudniają ich rutynowe zastosowanie w badaniach przesiewowych. Po pierwsze, istnieje ograniczona możliwość zwiększania skali i rozszerzania pierwotnych kultur komórkowych. W związku z tym w przypadku eksperymentów na dużą skalę należy użyć partii od różnych dawców, co skutkuje różnicami genomowymi i różnicami między partiami. Po drugie, po kilku fragmentach, pierwotne komórki śródbłonka na ogół tracą odpowiednie właściwości, gdy są hodowane in vitro^11,12.

Komórki śródbłonka pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są obiecującą alternatywą: przypominają komórki pierwotne, ale mają bardziej stabilny genotyp, który jest również podatny na precyzyjną edycję genomu. Co więcej, komórki iPSC są zdolne do samoodnawiania się, a tym samym mogą być namnażane w niemal nieograniczonych ilościach, co sprawia, że komórki pochodzące z iPSC są atrakcyjną alternatywą dla komórek pierwotnych do stosowania w modelach badań przesiewowych in vitro¹³.

Tutaj opisujemy metodę hodowli komórek śródbłonka jako perfuzyjnych mikronaczyń 3D w standaryzowanej, wysokoprzepustowej platformie mikroprzepływowej hodowli komórek. Perfuzja odbywa się poprzez umieszczenie urządzenia na platformie kołyskowej, co zapewnia solidną pracę i zwiększa skalowalność testu. Ponieważ mikronaczynia są stale perfundowane i wystawione na działanie gradientu czynników angiogennych, kiełkowanie angiogenne jest badane w bardziej fizjologicznym mikrośrodowisku komórkowym. Chociaż protokół jest kompatybilny z wieloma różnymi źródłami (pierwotnych) komórek śródbłonka^14,15, skupiliśmy się na wykorzystaniu ludzkich EC pochodzących z iPSC w celu zwiększenia standaryzacji tego testu i ułatwienia jego integracji z badaniami nad lekami naczyniowymi.

Protokół

1. Przygotowanie urządzenia

1. Przenieś 384-dołkową płytkę mikroprzepływową do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.
2. Zdejmij pokrywkę i dodaj 50 μl wody lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej z 40 studzienek obserwacyjnych (Rysunek 1b, studzienka B2) za pomocą pipety wielokanałowej lub powtarzalnej.
   nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Pozostaw płytkę z założoną pokrywką w sterylnym komorze hodowlanej w temperaturze pokojowej (RT).

2. Przygotuj żel i powłokę

1. Przygotować 2,5 ml roztworu powlekającego fibronektyny (FN) o stężeniu 10 μg/ml. Rozcieńczyć 25 μl 1 mg/ml roztworu podstawowego fibronektyny w 2,5 ml PBS firmy Dulbecco (dPBS, bez wapnia i magnezu). Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu użycia.
2. Przygotuj 100 μl roztworu kolagenu-1. Dodać 10 μl HEPES (1 M) do 10 μl NaHCO₃ (37 g/l) i wymieszać pipetując. Umieść probówkę na lodzie i dodaj 80 μl kolagenu-1 (5 mg/ml), aby uzyskać zneutralizowane stężenie kolagenu-1 wynoszące 4 mg/ml. Użyj pipety, aby dokładnie wymieszać i uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
3. Dodaj 1,5 μl roztworu kolagenu-1 (4 mg / ml) do wlotu żelu każdej jednostki mikroprzepływowej (Rysunek 1b, dołek B1). Upewnij się, że kropla żelu jest umieszczona na środku każdej studzienki, aby żel mógł dostać się do kanału (patrz Rysunek 2a).
   nuta: Phaseguides zapobiegają wypełnianiu sąsiednich kanałów i umożliwiają modelowanie żelu. Prawidłowe obciążenie żelem można potwierdzić pod mikroskopem jasnego pola, obserwując tworzenie się menisku przez "okienko obserwacyjne" (studzienka B2) lub odwracając płytkę do góry nogami. Jeśli żel nie wypełnił całkowicie kanału, można dodać dodatkową kroplę 1 μl.
4. Umieścić płytkę mikroprzepływową w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) na 10 minut w celu polimeryzacji kolagenu-1,
   nuta: Czas polimeryzacji ma kluczowe znaczenie; Ze względu na małe objętości stosowane w mikrofluidyce, parowanie można zaobserwować już po 15 minutach inkubacji, co skutkuje zapadnięciem się lub skurczem żelu.
5. Wyjąć płytkę z inkubatora i przenieść do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.
6. Dodać 50 μl roztworu powlekającego FN o stężeniu 10 μg/ml do studzienki wylotowej górnego kanału perfuzyjnego każdej jednostki mikroprzepływowej (ryc. 1b, dołek A3). Dociśnij końcówkę pipety do boku studzienki, aby prawidłowo napełnić studzienkę bez zatrzymywania pęcherzyków powietrza (patrz rysunek 2b). Kanał powinien się napełnić, a ciecz powinna przypiąć się do wlotu (studzienka A1) bez studzienki napełnienia wlotu.
7. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) na co najmniej 2 dni.
   nuta: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, ponieważ żel kolagenowy-1 wraz z mieszaniną powlekającą jest stabilny przez co najmniej 5 dni w inkubatorze. Jeśli mieszanina powłokowa zostanie odświeżona, możliwe mogą być dłuższe okresy, ale nie zostało to przetestowane. Kluczowy jest poziom powłoki FN, ponieważ zapobiega to odwodnieniu żelu kolagenowego-1.

3. Sadzenie komórek/hodowla mikronaczyń

1. Dodaj 5 ml płodowej surowicy cielęcej i 2,5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 500 ml pożywki do hodowli komórek śródbłonka i przefiltruj sterylizację za pomocą filtra butelkowego o wielkości porów 0,22 μm. To podłoże jest obecnie określane jako podłoże podstawowe.
2. Przygotować naczyniową pożywkę wzrostową: Dodać 3 μl 50 μg/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i 2 μl 20 μg/ml podstawowych czynników wzrostu fibroblastów (bFGF) do 5 ml podłoża podstawowego.
3. Zamrożone iPSC-EC rozmrozić szybko (<1 min) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, przenieść do probówki o pojemności 15 ml i rozcieńczyć w 10 ml podłoża podstawowego.
4. Policz komórki.
   nuta: Pojedyncza fiolka zawiera 1 milion komórek w 0,5 ml z >90% żywotnością.
5. Odwirować probówkę przy 100 x g przez 5 minut. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić w podłożu podstawowym, aby uzyskać stężenie 2 x 10⁷ komórek/ml.
6. Przenieść 384-dołkową płytkę mikroprzepływową z inkubatora do sterylnego kaptura z przepływem laminarnym.
7. Odessać roztwór powlekający FN ze studzienki wylotowej perfuzji (A3) i zastąpić 25 μl podłoża podstawowego w studzience wylotowej (studzienka A3).
8. Dodać 1 μl kropli zawiesiny komórkowej do każdego górnego dołka perfuzyjnego (Rysunek 1b, studzienka A1). Kropla powinna spłaszczyć się w ciągu kilku sekund (patrz rysunek 3a,b w celu zilustrowania tej metody "pasywnego pompowania").
   UWAGA: Sprawdź pod mikroskopem, czy wysiew jest jednorodny. Jeśli nie, dodaj kolejny 1 μl do wylotu i poczekaj, aż kropla się spłaszczy.
9. Inkubować płytkę studzienki mikroprzepływowej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Następnie komórki powinny były przylegać. Jeśli nie, odczekaj kolejne 30 minut.
10. Usuń podłoże podstawowe z górnych studzienek wylotowych perfuzji (Rysunek 1b, studzienka A3). Dodaj pożywkę do hodowli w ciepłych naczyniach w górnym wlocie i wylocie perfuzji (Rysunek 1b, studzienki A1 i A3). Umieść płytkę na platformie kołyskowej (ustawionej pod kątem 7°, 8 min interwał kołysania) w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ).
11. Zobrazuj płytkę za pomocą mikroskopu jasnego pola z automatycznym etapem w 1 i 2 dniu po wysiewie, aby potwierdzić żywotność komórek. Po 2 dniach powinna powstać zlewająca się monowarstwa na rusztowaniu kolagenu-1.
    nuta: Jeśli kanały nie wydają się być jednakowo zlewające się, mikronaczynia można hodować przez dodatkowe 24 godziny.

4. Badanie kiełkowania angiogennego, w tym tworzenia komórek wierzchołkowych i łodygowych

1. Przygotować 4,5 ml angiogennej pożywki do kiełkowania, uzupełniając podłoże podstawowe 4,5 μl VEGF (50 μg/ml bulionu), 4,5 μl octanu 12-mirystynianu-13 forbolu (PMA) (2 μg/ml bulionu) i 2,25 μl sfingozyno-1-fosforanu (S1P) (1 mM zapasu).
2. Przygotuj 8,5 ml pożywki do wzrostu naczyń (podłoże podstawowe uzupełnione 30 ng/ml VEGF i 20 ng/ml bFGF).
3. Odessać pożywkę ze studzienek i dodać 50 μl pożywki do hodowli w naczyniu świeżym do studzienek wlotowych i wylotowych z górną perfuzją oraz studzienek wlotowych i wylotowych żelu (Rysunek 1b, studzienki A1, A3, B1 i B3).
4. Dodaj 50 μl mieszaniny kiełków angiogennych do każdej ze studzienek wlotowych i wylotowych dolnego kanału perfuzyjnego (Rysunek 1b, dołki C1 i C3).
5. Umieścić urządzenie z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5% CO_{2 )} na platformie kołyskowej, aby utworzyć gradient angiogennych czynników wzrostu.
6. Obraz 1 dzień i 2 dni po dodaniu angiogennych czynników wzrostu przy użyciu mikroskopu jasnego pola z automatycznym stolikiem.
   nuta: Kontynuuj hodowlę mikronaczyń w celu zbadania zespolenia (przejdź do sekcji 5) lub utrwal i wybarwij mikronaczynia w celu ilościowego określenia długości kiełkowania i morfologii w dniu 2 i 6 (przejdź do sekcji 6).

5. Badanie zespolenia i stabilizacji kiełków

1. Obraz za pomocą mikroskopu jasnego pola ze zautomatyzowanym stolikiem.
2. Dodać 1 μl znakowanej fluorescencyjnie albuminy (0,5 mg/ml) do górnego wlotu perfuzji (Rycina 1b, dołek A1) i wymieszać za pomocą pipety o pojemności 50 μl.
3. Przenieść płytkę do mikroskopu fluorescencyjnego z automatycznym stolikiem i inkubatorem ustawionym na 37 °C. Ustawić mikroskop na obiektyw 10x i prawidłowe ustawienia ekspozycji (np. kanał tetrametylodaminy [TRITC], ekspozycja 20 ms). Rób zdjęcia poklatkowe co minutę przez 10 minut.
4. Wyjąć płytkę z mikroskopu i przenieść ją do sterylnego kaptura z przepływem laminarnym.
5. Usunąć całą pożywkę z dołków i umieścić zarówno pożywkę do hodowli naczyń, jak i pożywkę do kiełkowania angiogennego w odpowiednich studzienkach (patrz kroki 4.3 i 4.4).
6. Umieścić urządzenie z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5% CO_{2 ),} aby kontynuować kiełkowanie angiogenne.
7. Powtórz kroki 5.1−5.6, aby zbadać przepuszczalność w 6. dniu.

6. Utrwalenie, barwienie i obrazowanie

1. Odessać wszystkie pożywki hodowlane ze wszystkich studzienek.
   nuta: Resztkowe medium lub ciecze w kanałach mikroprzepływowych nie wpływają na utrwalanie ze względu na małą objętość 1−2 μL.
2. Dodaj 25 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS do wszystkich studzienek wlotowych perfuzyjnych (Rysunek 1b, A1 i C1) i wylotowych (Rysunek 1b, A3 i C3). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umieścić urządzenie pod niewielkim kątem (±5°) w celu wywołania przepływu (np. poprzez umieszczenie jednej strony płytki na pokrywce).
3. Odessać PFA ze studzienek. Umyj wszystkie wloty i wyloty perfuzyjne dwukrotnie 50 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS). Odsysać HBSS ze studni.
4. Przepuszczalność w temperaturze pokojowej przez 10 minut, dodając 50 μl 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego do wszystkich wlotów i wylotów perfuzji.
5. Odessać niejonowy środek powierzchniowo czynny ze studzienek. Przemyć kanały perfuzyjne dwukrotnie, dodając 50 μl HBSS do wszystkich studzienek wlotowych i wylotowych perfuzji. Odsysać HBSS ze studni.
6. Wybarwić jądra za pomocą Hoechst (1:2,000) i F-aktyny za pomocą falloidyny (1:200) w HBSS. Przygotuj 2,2 ml na 40 jednostek i dodaj 25 μl do każdego dołka wlotowego i wylotowego perfuzji. Umieścić płytkę pod niewielkim kątem i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
7. Przemyć dwukrotnie 50 μl HBSS we wszystkich wlotach i wylotach perfuzyjnych.
8. Bezpośrednie obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z automatycznym stolikiem lub przechowywanie płytki zabezpieczonej przed światłem w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.

Wyniki

Platforma mikroprzepływowej hodowli komórkowej 3D składa się z 40 perfundowanych jednostek mikroprzepływowych (Rysunek 1a,b), która jest używana do badania angiogennego kiełkowania perfundowanych mikronaczyń na tle wzorzystego żelu kolagenu-1 (Rysunek 1c). Te mikronaczynia są stale perfundowane i wystawione na działanie gradientu angiogennych czynników wzrostu (ryc. 3a-d). Kiełki angiogenne mogą być badane 2 dni po ekspozycji gradientowej lub hodowane przez ponad 5 dni po ekspozycji gradientowej w celu zbadania zespolenia i stabilizacji kiełków (patrz oś czasu, Rysunek 1d).

Sadzenie iPSC-EC za pomocą metody pasywnego pompowania powinno skutkować jednorodnymi gęstościami wysiewu (Rysunek 4a,b). Hodowla pod ciągłą perfuzją doprowadziła do zlewających się mikronaczyń w ciągu 2 dni, z komórkami całkowicie wyściełającymi obwód kanału mikroprzepływowego i tworzącymi zlewającą się monowarstwę na wzorzystym żelu kolagenowym-1.

Ekspozycja na gradient czynników angiogennych spowodowała kierunkowe angiogenne kiełkowanie mikronaczyń w żelu kolagenowym-1 (Rysunek 5a-g). Tworzenie się komórek z wyraźną końcówką i inwazja w żelu kolagenowym-1 była widoczna 24 godziny po dodaniu gradientu angiogennego, podczas gdy komórki łodygi, w tym tworzenie światła, były widoczne po 48 godzinach (Ryc. 5a).

Po utrwaleniu i barwieniu, sieć kapilar może być zwizualizowana za pomocą falloidyny do barwienia F-aktyny i za pomocą Hoechst 33342 do barwienia jądra (Rysunek 5b,c). Kiełki te można określić ilościowo (np. kształt i długość¹⁴). Bez dodatku czynników wzrostu nie należy zaobserwować inwazji do żelu kolagenowego-1 (Rysunek 5d). Obrazowanie konfokalne wykorzystano do określenia średnicy kiełka i potwierdzenia tworzenia światła (ryc. 5e-g).

Kiełki nadal rosną w kierunku gradientu i docierają do przeciwległego kanału perfuzyjnego w ciągu 3−4 dni po dodaniu angiogennych czynników wzrostu. Powoduje to przebudowę sieci naczyniowej, z wyraźnym zmniejszeniem liczby kiełków angiogennych (Ryc. 6a). Tworzenie światła oceniano za pomocą perfuzji sieci naczyniowej z fluorescencyjnie znakowanymi makrocząsteczkami (np. albuminą lub dekstransem). Perfuzja mikronaczyń albuminą znakowaną 0,5 mg/ml przed i po zespoleniu ujawniła wyraźną różnicę w przepuszczalności kiełków po 10 minutach (ryc. 6b-e), co sugeruje, że naczynia włosowate stabilizują się i dojrzewają po zespoleniu.

Rycina 1: Protokół mikroprzepływowej hodowli komórkowej mikronaczyń pochodzących z iPSC. (a) Na spodzie urządzenia do mikroprzepływowej hodowli komórkowej pokazano 40 jednostek mikroprzepływowych, które są zintegrowane pod płytką 384-dołkową. Większy widok wyświetla jedną z 40 jednostek mikroprzepływowych. (b) Każda jednostka mikroprzepływowa jest umieszczona pod 9 studzienkami z 3 studzienkami wlotowymi i 3 studzienkami wylotowymi. Kanały mikroprzepływowe są oddzielone grzbietami ("phaseguides"), które umożliwiają tworzenie wzorów hydrożeli w kanale centralnym ("kanał żelowy"), podczas gdy nadal występuje kontakt z sąsiednimi kanałami ("kanały perfuzyjne"). (c) Metoda hodowli perfundowanego mikronaczynia w urządzeniu mikroprzepływowym, które służy do badania napędzanego gradientem kiełkowania angiogennego przez wzorzystą matrycę kolagenu-1. (d) Harmonogram badania kiełkowania angiogennego i/lub zespolenia. Ten rysunek został zmodyfikowany z van Duinen et al.¹⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Procedury ładowania żelu i podłoża. a) Przykłady prawidłowego i nieprawidłowego osadzania żelu. Prawidłowe wypełnienie skutkuje powstaniem wzorzystego żelu kolagenu-1 w środkowym kanale, który jest następnie polimeryzowany. b) Przykłady prawidłowego i nieprawidłowego napełniania studni. Studzienki są napełniane w kolejności 1−4, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w kanałach mikroprzepływowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ciągły przepływ napędzany ciśnieniem hydrostatycznym i stabilizacja gradientu. a) Różnice ciśnienia hydrostatycznego między studniami powodują pasywne poziomowanie i przepływ w kanałach mikroprzepływowych. (b) Umieszczenie urządzenia na platformie kołyskowej ustawionej na 7° i czasie cyklu 8 minut powoduje ciągłą, dwukierunkową perfuzję w kanałach mikroprzepływowych. c) Gradienty są tworzone przez wprowadzenie dwóch różnych stężeń w obrębie studzienek, które są stale odświeżane przez pasywne wyrównywanie. (d) Wizualizacja gradientu przy użyciu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu. Przepływ dwukierunkowy stabilizuje nachylenie do 3 dni. Podziałka = 200 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z van Duinen et al.¹⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Pasywna metoda pompowania do wysiewu komórek. (a) Pompowanie pasywne jest napędzane przez różnice ciśnień, które są spowodowane różnicami w napięciu powierzchniowym. Powoduje to przepływ od kropli (wysokie ciśnienie wewnętrzne) w kierunku zbiornika (niskie ciśnienie wewnętrzne). (b) Upływ czasu kropli (szary kontur) umieszczonej na górze wlotu (biały kontur) kanału mikroprzepływowego (niebieski kontur). Zaraz po dodaniu (Rysunek 4b, i) kropla na górze wlotu kurczy się (Rysunek 4b, ii: 1 s po dodaniu; iv: 2 s po dodaniu), co powoduje przepływ w kierunku wylotu. Trwa to do momentu, gdy menisk kropelki zostanie przygwożdżony przez wlot (ryc. 4b, iv). Podziałka = 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Solidne kiełkowanie 3D mikronaczyń iPSC-EC. a) Kiełkowanie iPSC-EC w czasie. Mikronaczynia hodowano przez 48 godzin (po prawej), a następnie stymulowano koktajlem angiogennym zawierającym 50 ng/ml VEGF, 500 nM S1P i 2 ng/ml PMA. Pierwsze komórki wierzchołkowe, które atakują rusztowanie kolagenu-1 (w środku), są widoczne 24 godziny po ekspozycji. Pierwsze lumeny są widoczne (strzałki) 48 godzin po ekspozycji (po prawej), podczas gdy komórki końcówki migrowały dalej w kierunku gradientu. (b) Układ 15 mikronaczyń, które były stymulowane VEGF, S1P i PMA przez 2 dni i barwione na obecność F-aktyny (żółte) i jąder (niebieskie). Podziałka = 200 μm. (c) Stymulowane mikronaczynie (kontrola pozytywna). d) Niestymulowane mikronaczynia (kontrola ujemna). e) Maksymalny rzut pojedynczej kapilary w żelu. (f) To samo co (g), ale skupione na środku. Linia przerywana wskazuje położenie rzutu ortogonalnego w panelu g. Podziałka liniowa (a-d: 200 μm; np: 20 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Wizualizacja przepuszczalności kiełków angiogennych przed i po zespoleniu. (a) Zespolenie z kanałem podstawnym powoduje przycinanie i dojrzewanie kiełków angiogennych. Zbliżenie łożyska kapilarnego po 2, 4, 6 i 7 dniach od stymulacji angiogennymi czynnikami wzrostu. b) Kiełki angiogenne po 2 dniach od dodania angiogennych czynników wzrostu. Kiełki angiogenne powstają w żelu, ale nie są jeszcze połączone z dolnym kanałem perfuzyjnym. (c) Perfuzja mikronaczynia roztworem albuminy Alexa 555 o stężeniu 0,5 mg/mL. Obrazy fluorescencyjne uzyskane po 0 i 10 minutach (d,e) Takie same jak w panelach b i c, ale po 7 dniach stymulacji. Kiełki są połączone z drugą stroną i tworzą zlewające się mikronaczynie w podstawowym kanale perfuzyjnym. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

problem	przyczyna	rozwiązanie
Collagen-1 nie wchodzi do kanału ani nie wypełnia go całkowicie	Kropla kolagenu-1 nie jest umieszczana na górze wlotu	Ostrożnie umieść kroplę na wlocie z kanału żelowego
	Objętość kolagenu-1 jest zbyt mała	Użyj 1,5 μl żelu, aby całkowicie wypełnić kanał
	Kolagen-1 jest zbyt lepki	Użyj innej partii kolagenu-1
Kolagen-1 przepływa do kanałów perfuzyjnych	Kolagen-1 jest pipetowany bezpośrednio do wlotu kanału żelowego	Ostrożnie umieść kroplę na wlocie z kanału żelowego
Kolagen-1 nie jest przezroczysty/tworzenie włókien	Kolagen-1 nie jest prawidłowo przechowywany	Przechowuj kolagen-1 w temperaturze 4 °C, nie zamrażaj
	NaHCO3 i HEPES nie są dobrze mieszane przed dodaniem kolagenu-1	Ostrożnie wymieszać NaHCO3 i HEPES przez pipetowanie przed dodaniem kolagenu-1
Kropla nie kurczy się przy użyciu pasywnej metody pompowania	Kropla przylega do boku studni	Odessać kroplę i dodać nową kroplę na górze wlotu
		Upewnij się, że studzienka wylotowa jest wypełniona co najmniej 20 μl podłoża
Nie obserwuje się kiełkowania	Czynniki wzrostu nie są dodawane lub podwielokrotności nie są prawidłowo przechowywane	Przygotować świeżą pożywkę do kiełkowania angiogennego
	Pęcherzyki powietrza blokują perfuzję/tworzenie gradientu	Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą pipety P20 lub P200
	Różnice objętości między studzienkami	Objętości we wszystkich studzienkach muszą być równe, aby utworzyć gradient liniowy
Komórki niezdolne do życia	Tabliczka nie umieszczona na platformie wahacza/platforma wahacza wyłączona	Upewnij się, że platforma kołyskowa jest włączona i ma odpowiedni czas/kąt cyklu (8 min/7°)
	Brak możliwości perfuzji ze względu na obecność pęcherzyków powietrza	Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą pipety P20 lub P200
Nie powstają żadne światła, komórki migrują jako pojedyncze komórki	Angiogenna mieszanina kiełkowa została dodana przed utworzeniem monowarstwy	Odczekaj dodatkowe 24 godziny przed dodaniem angiogennych czynników wzrostu
Duże różnice w gęstości kiełkowania	Różnice w gęstości komórek po wysiewie	Sprawdź, czy gęstość komórek jest jednorodna i porównywalna między jednostkami mikroprzepływowymi. W razie potrzeby dodać kolejną kroplę zawiesiny komórkowej

Tabela 1: Rozwiązywanie typowych problemów.

Dyskusja

Metoda ta opisuje hodowlę 40 perfuzyjnych mikronaczyń śródbłonka w solidnej i skalowalnej platformie do hodowli komórek mikroprzepływowych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli komórkowych 2D i 3D, metoda ta pokazuje, w jaki sposób fizjologicznie istotne mikrośrodowisko komórkowe, które obejmuje gradienty i ciągłą perfuzję, można połączyć z hodowlą komórkową 3D o odpowiedniej przepustowości do celów przesiewowych.

Jedną z głównych zalet w porównaniu z porównywalnymi testami mikroprzepływowymi jest to, że metoda ta nie opiera się na pompach do perfuzji, ale wykorzystuje platformę kołyskową do indukowania ciągłej perfuzji we wszystkich jednostkach mikroprzepływowych jednocześnie. Gwarantuje to, że test jest solidny i skalowalny: płytki można układać w stosy na platformie kołyskowej. Co ważne, wszystkie jednostki mikroprzepływowe pozostają indywidualnie adresowalne, co pozwala na wdrożenie tej metody w badaniach przesiewowych leków, w tym wygenerowanie krzywej dawka-odpowiedź. Co więcej, bez pompy obrazowanie i wymiana pożywki jest znacznie prostsza i wiąże się z mniejszym ryzykiem zanieczyszczenia (krzyżowego).

Kolejną zaletą tej metody jest wykorzystanie ustandaryzowanej, wstępnie wyprodukowanej platformy, podczas gdy porównywalne platformy do mikroprzepływowych hodowli komórkowych muszą być wytwarzane przez użytkowników końcowych. Ta dostępność ułatwia przyjęcie tego testu przez inne akademickie i farmaceutyczne grupy badawcze, prowadząc do standaryzacji. Ponadto, w przeciwieństwie do prototypów mikroprzepływowych, 384-dołkowy interfejs płytki zapewnia kompatybilność z obecnym sprzętem laboratoryjnym (np. aspiratorami, manipulatorami płytek i pipetami wielokanałowymi), ułatwiając integrację z obecną infrastrukturą przesiewową.

Istnieje kilka krytycznych kroków w wykonywaniu tego testu. Żel collagen-1 powinien całkowicie wypełnić kanał żelowy. Podczas ładowania żelem wypełnienie to można zaobserwować, sprawdzając kanały mikroprzepływowe przez okienko obserwacyjne (rysunek 2a) lub odwracając płytkę do góry nogami (jak pokazano na rysunku 1a). Podczas napełniania żel kolagenowy powinien pozostać w kanale środkowym, nie wpływając do sąsiednich kanałów perfuzyjnych. Zauważyliśmy, że jakość żelu Collagen-1 ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego wykonania testu. Partie kolagenu-1 o zbyt dużej lepkości doprowadzą do niepełnego wypełnienia kanału żelowego. Po 10 minutach polimeryzacji w temperaturze 37 °C żel powinien być jednorodny i klarowny. Jeśli kolagen-1 nie jest odpowiednio przechowywany (np. z powodu wahań temperatury w lodówce), kolagen będzie polimeryzował w kanałach z wyraźnie widocznym tworzeniem włókien. Może to spowodować inwazję EC do żelu bez dodatku czynników angiogennych, ale bez prawidłowego rozwoju światła.

Po wysianiu komórek roztwór powlekający fibronektynę jest usuwany ze studzienek, pozostawiając tylko kanały mikroprzepływowe wypełnione roztworem powlekającym. Zasysanie roztworu powlekającego z kanałów mikroprzepływowych może spowodować rozerwanie żelu lub aspirację żelu. Zawiesina komórek musi zastąpić/przemieścić ten roztwór powłokowy. Działa to najlepiej, gdy zawiesina komórkowa jest wysiewana przy użyciu metody pompowania pasywnego, ponieważ bezpośrednie pipetowanie zawiesiny komórkowej do kanałów wykazuje mniej powtarzalne gęstości wysiewu.

Ponieważ mikronaczynia tworzą stabilną monowarstwę na żelu, te niewielkie różnice skutkują jedynie różnymi czasami potrzebnymi do osiągnięcia zbieżności. W związku z tym punkt początkowy testu jest określany przez zbieg, a nie czas hodowli. W razie potrzeby czas hodowli można przedłużyć do momentu, gdy na żelu utworzy się przezroczysta monowarstwa.

Wewnątrz studzienek pęcherzyki powietrza mogą zostać uwięzione przez nieprawidłowe napełnienie studzienek (patrz rysunek 2b). Te pęcherzyki powietrza będą ograniczać przepływ medium, nawet gdy urządzenie zostanie umieszczone na platformie kołyskowej, i spowodują zapadnięcie się mikronaczynia i niewłaściwe tworzenie gradientu. Dociśnięcie końcówki pipety do bocznej ścianki studzienek zwiększy powodzenie całkowitego napełnienia studzienki. Jeśli pęcherzyk powietrza zostanie uwięziony w studzienkach, można go usunąć, delikatnie wkładając sterylną końcówkę pipety do szklanego dna. Pęcherzyki powietrza mogą również występować w kanałach mikroprzepływowych. Po usunięciu pożywki ze studzienek, po 30 minutach zauważalne jest odparowanie pożywki z kanałów mikroprzepływowych (ze względu na objętości mikrolitrów w kanałach). Dlatego zmiany podłoża najlepiej wykonywać tak szybko, jak to możliwe. Gdy pożywka zostanie dodana do kanału z odparowanym medium, pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione w kanałach mikroprzepływowych. Te pęcherzyki powietrza w kanałach mikroprzepływowych można usunąć ręcznie, umieszczając pipetę P20 bezpośrednio na wlocie lub wylocie i przetłaczając medium przez mikrofluidyki z przeciwległej studzienki. Pomyślne usunięcie pęcherzyków powietrza powoduje niewielki, ale zauważalny spadek objętości w drugiej studzience. W tabeli 1 wymieniono typowe błędy i sposoby ich rozwiązywania.

Brak pompy jest ograniczeniem, gdy wymagane jest ciągłe obrazowanie, ponieważ platforma kołyskowa ogranicza użytkownika do obrazowania w sekwencyjnych odstępach czasu. Ponadto perfuzja ośrodka na tej platformie składa się z przepływu dwukierunkowego o niskich poziomach naprężeń ścinających, podczas gdy naczynia krwionośne in vivo są narażone na przepływ jednokierunkowy z wyższymi poziomami naprężeń ścinających. Chociaż nie obserwujemy negatywnych skutków przepływu dwukierunkowego w odniesieniu do kiełkowania angiogennego, przepływ jest ważnym bodźcem biomechanicznym i najlepiej kontrolowanym. Jednakże, chociaż istnieją komercyjnie dostępne konfiguracje pomp, połączenie z płytką 384-dołkową pozostaje wyzwaniem, a konfiguracje pomp poważnie utrudniają skalowalność tego testu.

Możliwość wykorzystania iPSC-EC do badania kiełkowania angiogennego otwiera nowe możliwości w modelowaniu chorób i badaniach nad lekami. W przeciwieństwie do pierwotnych EC, komórki te mogą być generowane w niemal nieograniczonych ilościach o stabilnym genotypie, a dzięki zastosowaniu technik edycji genomu można generować komórki, które obejmują nokautowanie genów i knock-iny. Ponieważ jednak protokoły odróżniające EC od iPSC są stosunkowo nowe, nadal nie jest jasne, co prowadzi do powstania iPSC-EC, które najlepiej odzwierciedlają pierwotne EC i które podtypy EC są lub mogą być generowane. Wciąż pozostają też pytania dotyczące ich trafności. Na przykład, czy iPSC-EC nadal wykazują plastyczność typową dla komórek śródbłonka? I w jakim stopniu komórki pochodzące z iPSC reagują na swoje mikrośrodowisko komórkowe i wchodzą z nim w interakcje? Przedstawiona tutaj ustandaryzowana platforma może zostać wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na niektóre z tych pytań w celu dalszej walidacji stosowania EC pochodzących z iPSC in vitro.

Najprostszym kierunkiem dla tego testu będzie integracja innych typów komórek, które odgrywają ważną rolę podczas angiogenezy, takich jak perycyty i makrofagi. Ułatwi to badanie roli makrofagów podczas zespolenia między kiełkami lub przylegania perycytów po utworzeniu naczyń włosowatych. Możliwe jest również hodowanie różnych innych typów komórek w obrębie lub przeciwko macierzy zewnątrzkomórkowej (np. Pokazaliśmy hodowlę neuronów i różnych struktur nabłonkowych, takich jak kanaliki proksymalne i jelito cienkie), które można łączyć z łożyskami naczyniowymi wytworzonymi tą metodą. Wreszcie, interesujące będzie badanie angiogennego kiełkowania w syntetycznych hydrożelach, ponieważ ich zdefiniowany skład dodatkowo zwiększa standaryzację testu i umożliwia dostrojenie sztywności i motywów wiązania, które wpływają na interakcje komórka-macierz.

Podsumowując, metoda ta pokazuje wykonalność EC pochodzących z iPSC w standaryzowanym i skalowalnym teście angiogennym 3D, który łączy fizjologicznie istotne warunki hodowli na platformie, która ma wymaganą solidność i skalowalność, aby można ją było zintegrować z infrastrukturą badań przesiewowych leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2-10 &m; L Elektroniczna pipeta powtarzalna	Sigma	Z654566-1EA
1 M HEPES	Gibco	15630-056
3-torowa OrganoPlate	Mimetas	4003-400B
4% PFA w PBS	Alfa Aesar	J61899
Pożywka do hodowli podstawowej	NCardia
Collagen-1	Cultrex	3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2,5 ml	VWR	613-2071
dPBS	Gibco	14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte	VWR	613-2890
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F4759-1MG	1 mg/ml w wodzie miliQ
HBSS	Gibco	14025-050
Sondy molekularne	Hoechst	H3569	10 mg/ml roztwór w wodzie
Komórki śródbłonka pochodzące z iPSC	NCardia
NaHCO3	Sigma	S5761	37 g/L w miliQ woda
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini	Mimetas		Platforma Rocker używana do zapewnienia przepływu
Pen/Strep	Sigma	P4333
Phalloidin	Sigma	P1951	1 mg / ml w DMSO
PMA	Focus-Biomolekuły	10-2165	2 μ g/ml w PBS zawierającym 0,1%
DMSO S1P	Ecehelon Biosciences	S-2000	1 mM w metanolu zawierającym 1% kwasu octowego
TRITC-albumina	Invitrogen	A34786
VEGF	Peprotech	450-32-10	50 μ g/ml w wodzie zawierającej 0,1% BSA