Artykuł metodologiczny

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59682

⸱

28 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Tumor Immunology, Translational Research Center in Onco-Hematology, Department of Internal Medicine Specialties, Faculty of Medicine, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, University Medical Center, University of Geneva, 3Laboratory of Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring, Geneva University Hospitals, 4Tissue Engineering Laboratory, Hepia/HES-SO, University of Applied Sciences Western Switzerland, 5Laboratory of Experimental cell therapy, Department of Diagnostics, Geneva University Hospitals

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Streszczenie

Brak odpowiednich modeli neuronowych in vitro jest istotną przeszkodą dla postępu medycznego w neuropatologiach. Stworzenie odpowiednich modeli komórkowych ma kluczowe znaczenie zarówno dla lepszego zrozumienia patologicznych mechanizmów tych chorób, jak i dla określenia nowych celów i strategii terapeutycznych. Aby model in vitro był trafny, musi odtwarzać patologiczne cechy choroby człowieka. Jednak w kontekście chorób neurodegeneracyjnych odpowiedni model in vitro powinien zapewnić wymianę komórek nerwowych jako cenną szansę terapeutyczną.

Taki model nie tylko pozwoliłby na badania przesiewowe cząsteczek terapeutycznych, ale mógłby być również wykorzystany do optymalizacji różnicowania protokołów neuronowych [na przykład w kontekście transplantacji w chorobie Parkinsona (PD)]. W badaniu opisano dwa protokoły in vitro: 1) rozwoju ludzkiego glejaka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych (NO) oraz 2) różnicowania neuronów dopaminergicznych (DA) generujących trójwymiarowy (3D) organoid. W tym celu stworzono dobrze ustandaryzowany protokół, który umożliwia produkcję skalibrowanych pod względem wielkości neurosfer pochodzących z różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Pierwszy model może być wykorzystany do ujawnienia zdarzeń molekularnych i komórkowych zachodzących podczas rozwoju glejaka w organoidzie nerwowym, podczas gdy organoid DA nie tylko stanowi odpowiednie źródło neuronów DA do terapii komórkowej w chorobie Parkinsona, ale może być również wykorzystany do testowania leków.

Wprowadzenie

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) klasyfikuje gwiaździaki jako gwiaździaki niskiego stopnia (stopień I do II) lub wysokiego stopnia (stopień III i IV). Glejak wielopostaciowy (GBM) jest gwiaździakiem IV stopnia, najbardziej śmiertelnym z pierwotnych nowotworów mózgu, który jest odporny na wszystkie obecne formy leczenia1. Pomimo standardowej terapii, w tym neurochirurgii, chemioterapii i radioterapii, GBM pozostaje śmiertelny, a 15-miesięczny wskaźnik całkowitego przeżycia nie zmienił się dramatycznie w ciągu ostatnich 15 lat2. Aby osiągnąć znaczący postęp w zrozumieniu patogenezy GBM, kluczowe znaczenie ma zastosowanie odpowiednich modeli. Do tej pory badanie GBM opierało się na liniach komórkowych, wycinkach organotypowych gryzoni i ksenotransplantacji komórek pochodzących od pacjentów myszom lub myszom transgenicznym, u których rozwijają się spontaniczne nowotwory3,4. Chociaż modele te były przydatne do badania przerzutów do mózgu i agresywności guza, są one ograniczone przez różnice między gatunkami, a wynikające wnioski mogą być nieprawidłowo przełożone na tkanki ludzkie. Co więcej, istniejące modele z komórkami ludzkimi są również ograniczone przez brak interakcji tkanka/guz gospodarza3,4. Modele eksperymentalne mają kluczowe znaczenie dla przełożenia z nauk podstawowych na cele terapeutyczne. W związku z tym opisanie protokołu wytwarzania in vitro ludzkich organoidów nerwowych hodowanych wspólnie z komórkami inicjującymi GBM (GIC) może zapewnić odpowiedni system, który naśladuje morfologiczne i funkcjonalne cechy rozwoju GBM. System ten odtwarza niektóre cechy rozwoju GBM in vivo, takie jak rozlana migracja inwazyjnych komórek i obszarów martwicy, a także podkreśla ekspresję genów istotnych dla biologii nowotworu. Jak ujawniono wcześniej, niektóre krytyczne mikroRNA są indukowane podczas rozwoju GIC w tkance nerwowej 3D5,6.

PD jest poważnym zaburzeniem neurodegeneracyjnym związanym z degeneracją wielu podtypów neuronów7. Nawet jeśli choroba charakteryzuje się postępującym początkiem objawów (np. bradykinezja, asymetryczne drżenie spoczynkowe, sztywność i niestabilność postawy), jej dokładna etiologia nie jest jednoznacznie ustalona. Rzeczywiście, wiele badań wykazało, że główne czynniki ryzyka mogą wynikać z połączenia czynników genetycznych i środowiskowych. Objawy parkinsonowskie są związane z obustronnym zwyrodnieniem neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej (SN), co prowadzi do zaniku aksonów dopaminergicznych (DA) wystających do prążkowia8,9. Dlatego obniżenie poziomu dopaminy w prążkowiu jest skorelowane z progresją dysfunkcji motorycznej u pacjentów z chorobą Parkinsona. Neurony dopaminergiczne zawierają hydroksylazę tyrozyny (TH), kluczowy enzym w syntezie neuroprzekaźników katecholaminergicznych, który przekształca aminokwas L-tyrozynę w L-3,4-dihydroksyfenyloalaninę (L-DOPA, prekursor dopaminy) w dopaminę10. Wczesna utrata aktywności TH, a następnie spadek ekspresji białka TH jest cechą charakterystyczną PD.

To badanie opisuje dwa protokoły wykorzystujące ludzkie organoidy nerwowe, z których jeden jest specjalnie zorientowany na fenotyp podobny do śródmózgowia, wzbogacony o komórki TH-dodatnie.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań naukowych Uniwersytetu Genewskiego.

1. Utrzymanie i hodowla niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC)

  1. Przeprowadzaj konserwację i ekspansję hSEC w warunkach bezkarmowych poprzez wstępne powlekanie naczyń określoną macierzą zewnątrzkomórkową.
    1. Rozmrozić 300 μl macierzy zewnątrzkomórkowej w temperaturze 4 °C (typowe stężenie w zakresie 18-22 mg/ml, przechowywać na lodzie) i delikatnie wymieszać z 15 ml zimnego podłoża DMEM, aby uniknąć przedwczesnego żelowania macierzy zewnątrzkomórkowej. Dodać 7,5 ml matrycy zewnątrzkomórkowej do obu kolb T150.
    2. Inkubować szalki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę (maksymalnie przez noc).
    3. Usunąć pożywkę i zasiać hESC do gęstości 6,5 x 104 komórki/cm2.
  2. Utrzymanie H1 (linia komórkowa hESC) w pożywce hESC i 1% penicylina/streptomycyna.
  3. Przepuścić komórki za pomocą procedury enzymatycznej: dodać 7,5 ml roztworu enzymatycznego do kolby T75cm2 przez okres 1-2 minut w temperaturze 37 °C. Po całkowitym odłączeniu komórek dodaj 7,5 ml DMEM-F12, a następnie wiruj przez 5 minut przy 300 x g. Aby umożliwić lepsze przeżycie, ponownie umieść komórki w pożądanej gęstości na szalkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, w tym samym podłożu zawierającym inhibitor kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) (10 μM) przez 24 godziny.

2. Organoidy neuronalne pochodzące z hESC do badań GBM

  1. Na 24 godziny przed rozpoczęciem hodowli 3D należy zastąpić pożywkę hESC pożywką bez surowicy uzupełnioną 10 μM inhibitorem ROCK (oba składniki są niezbędne do wspomagania przeżycia komórek i spontanicznego tworzenia neurosfery podczas fazy agregacji w płytce mikrostudzienki). Komórki powinny znajdować się w 60% zbieżności. Następnego dnia (dzień 0) należy odłączyć kolonie hESC jako pojedyncze komórki: usunąć pożywkę, następnie przepłukać PBS bez Ca2+/Mg2+, dodać 5 ml roztworu do rozpuszczania enzymatycznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty.
  2. Zebrać komórki w pożywce wolnej od surowicy z 10 μM inhibitora ROCK i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i policzyć komórki w 10 ml pożywki bez surowicy uzupełnionej 10 μM inhibitora ROCK.
  3. Równolegle przepłukać płytkę mikrodołkową 2 ml pożywki bez surowicy na dołek i odwirować płytkę o sile 1200 x g przez 5 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki, co może zapobiec tworzeniu się neurosfery.
  4. Przygotować 28,2 x 106 komórek w 12,5 ml pożywki bez surowicy uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK. Dozować 1000 komórek/mikrostudzienkę. Odwirować komórki o sile 300 x g przez 5 minut i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc (maksymalnie 36 godzin). Na przykład: aby uzyskać 30 ludzkich organoidów neuronalnych, użyj jednej kolby T150 przy 70%-80% konfluencji (około 30 milionów komórek).
  5. Następnego dnia (dzień 1) zbierz kulki (za pomocą P1000) i umieść je na płytce 6-dołkowej. Do każdej studzienki dodaj 2 ml pożywki B27 i pożywki DMEM-F12 GlutaMAX i Neurobasel (wymieszać w stosunku 1:1), uzupełnionych 1% suplementami B27 i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA). Aby promować szybką indukcję neuronalną, uzupełnij pożywkę podwójnym koktajlem hamującym SMAD, składającym się z 10 μM TGFβ / Activin / inhibitora węzłowego i 0,5 μM inhibitora morfogennego białka kostnego (BMP). Od tego kroku naprzód kule są hodowane w ruchu obrotowym (60 obr./min, wytrząsarka orbitalna). Obrót ma kluczowe znaczenie, aby kule nie sklejały się ze sobą lub z płytą.
  6. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni: zegnij płytkę i pozwól kulkom opaść na 5 minut, usuń połowę pożywki (2 ml) i dodaj 2 ml świeżej pożywki B27 uzupełnionej czynnikami wzrostu i inhibitorami. Nie odwirowywać kulek.
  7. Wykonaj indukcję neuronalną zgodnie z następującym przebiegiem czasowym:
    1. Od 1 do 4 dni hodować kulki w pożywce B27 uzupełnionej podwójnym SMAD. Podwójny koktajl hamujący SMAD (10 μM TGFβ/Activina/inhibitor węzłowy i 0,5 μM inhibitor BMP) wspomaga indukcję neuronalną.
    2. Od 4 do 11 dni promuj proliferację rozet nerwowych pochodzących z hESC (do kulek), dodając 10 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 10 ng / ml podstawowego czynnika fibroblastów (bFGF) do pożywki B27 uzupełnionej podwójnym koktajlem SMAD.
      UWAGA: W dniu 11 większość komórek powinna być dodatnia dla Nestin.
    3. Od 11 do 13 dni hodować kulki w pożywce B27 uzupełnionej 0,5 μM inhibitorem BMP.
    4. Od 13 do 21 dni hoduj kulki w pożywce B27 uzupełnionej 10 ng / ml neurotroficznym czynnikiem glejowym (GDNF), 10 ng / ml neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego (BDNF) i 1 μM inhibitora γ-sekretazy. GDNF i BDNF promują różnicowanie neuronów i gleju. Inhibitor γ-sekretazy pozwala na większe dojrzewanie neuronów.
    5. W dniu 21 umieść kulki (około 1000 kulek) na hydrofilowej membranie z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica 6 mm, 0,4 μm) osadzonej na wkładce do płytki hodowlanej przeznaczonej dla płytki 6-dołkowej. Zatrzymaj obrót od tego kroku. Obecność rozet, obserwowanych za pomocą mikroskopu jasnego pola, wskazuje na inicjację różnicowania neuronalnego. Rozety nerwowe można zaobserwować 2-3 dni po poszyciu kulek na membranie PTFE.
    6. Dodawać 1 ml pożywki B27 uzupełnionej czynnikami wzrostu i inhibitorami (zgodnie z opisem) do każdej studzienki pod wkładką membranową, co 2-3 dni (zwykle w poniedziałek, środę i piątek), przez kolejne 3 tygodnie różnicowania.
    7. Od 21 do 25 dni hoduj ludzkie organoidy nerwowe w tym samym podłożu do dojrzewania nerwowego (por. krok 2.7.4).
    8. Od 25 do 28 dni tylko pożywkę B27 uzupełniać 1 μM inhibitorem γ-sekretazy.
    9. Od 28 do 39 dni należy zaprzestać dodawania inhibitora γ-sekretazy i kontynuować hodowlę ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie w pożywce B27.
      UWAGA: Po 3 tygodniach organoidy nerwowe są gotowe do użycia do implantacji GIC. Wraz z dojrzewaniem neuronalnym obserwowano zmniejszenie markera niedojrzałości nerwowej Nestin i wzrost dojrzałych markerów nerwowych β3-tubuliny i GFAP.

3. Izolacja i hodowla komórek inicjujących glejaka (GIC)

  1. Wyizoluj GIC poprzez fragmentację biopsji GBM u człowieka o wysokiej jakości. Przenieś kawałek guza do zlewki zawierającej 0,25% trypsyny w 0,1 mM EDTA (4:1) i powoli mieszaj w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut (w zależności od wielkości guza).
  2. Umieść zdysocjowane komórki w kolbach do hodowli tkankowych o długości 75 cm2 posianych z prędkością 2,500-5,000 komórek nacm2 w pożywce GIC: pożywka DMEM/F-12 (1:1) zawierająca 1% suplementów N2, 1% B27 i 1% G5 (w celu sprzyjania przeżyciu GIC), uzupełniona bFGF i EGF (obie w stężeniu 10 ng / ml, w celu promowania macierzystości) i 1% penicyliny / streptomycyny.
  3. Gdy GIC jest dobrze ugruntowany i rośnie, usuń suplementy N2 i G5 z pożywki GIC.
  4. Na dzień przed dodaniem komórek do organoidu oddziel GIC i policz je.
  5. Przepłukać płytkę mikrodołkową 2 ml pożywki GIC i odwirować płytkę z maksymalną prędkością, aby usunąć pęcherzyki (1000 x g). Umieść GIC w 1,000 komórkach, aby uzyskać jedną glejaka na mikrostudzienkę. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (Rysunek 1C). Ten krok jest kluczowy i pozwala na dobrze skalibrowane GIC (przykład nekrotycznych i zbyt dużych GIC jest pokazany w Rysunek 2A,C).
  6. Aby zainicjować inwazję GBM, dodaj jedną glejaka na wierzchu tkanki nerwowej za pomocą końcówki pipety o dużym otworze (Rysunek 1F). Ostrożnie umieść płytkę 6-dołkową z powrotem w inkubatorze.

4. Organoidy dopaminergiczne pochodzące z hESC do badań PD

  1. Dzień 0: Amplifikacja hESC w hodowli 2D do 60% konfluencji (dzień 0), a następnie zastąpienie pożywki z komórek macierzystych stosowanych do utrzymania cech pluripotencji hESC pożywką wolną od surowicy. Rozpocznij indukcję neuronalną od uzupełnienia pożywki hodowlanej 0,5 μM inhibitorem BMP i 10 μM TGFβ/Activin/inhibitorem węzłowym (koktajl inhibicyjny dual-SMAD), a następnie dodaj 10 μM inhibitora ROCK przez 24 godziny, aby zwiększyć przeżywalność komórek podczas pasażu.
  2. Dzień 1: Przygotuj płytkę mikrodołkową z 2,5 ml na dołek pożywki bez surowicy uzupełnionej 0,5 μM inhibitorem BMP, 10 μM TGFβ/aktywiną/inhibitorem węzłowym i 10 μM inhibitorem ROCK. Aby określić komórki w kierunku brzusznego wzorca cewy nerwowej, dodaj 100 ng / ml Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów 8 (FGF8) i 2 μM wygładzonego agonisty. Odwirować płytkę (tylko z pożywką i bez komórek) przy 1200 x g przez 5 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mikrostudzienek.
    1. Po 1 dniu indukcji neuronalnej w 2D usuń pożywkę i szybko przemyj PBS bez Ca2+ / MgCl2 +. Oddzielić kolonie w zawiesinie pojedynczych komórek, dodając 7,5 ml rekombinowanego roztworu enzymatycznego do kolby T75 cm2. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, a następnie uzupełnić 7,5 ml DMEM-F12.
    2. Zebrać zawiesinę komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i policzyć komórki w tym samym podłożu, które użyto do przygotowania płytki mikrodołkowej.
    3. Dostosuj objętość pożywki, aby uzyskać zawiesinę komórek pozwalającą na tworzenie neurosfer zawierających 1000 komórek na mikrodołek (na przykład zastosowana tutaj płytka mikrodołka zawiera 4,700 mikrodołków na studzienkę). Przygotuj więc 4,7 miliona komórek w 2,5 ml pożywki i dodaj ją do poprzednich 2,5 ml pożywki już umieszczonej na płytce.
    4. W celu prawidłowego rozprowadzenia komórek w każdej mikrostudzience należy delikatnie wstrząsnąć płytką i odwirować płytkę mikrodołkową 300 x g przez 5 minut. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu wytworzenia kulek.
  3. Dzień 2: Delikatnie przepłucz mikrodołki pożywką i zbierz, a następnie przenieś kulki na płytkę sześciodołkową poddaną działaniu tkanki. Zastąp pożywkę pożywką Neurobasal uzupełnioną 1% witaminy B27, 1x NEAA, 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny. Dodatkowo dodaj czynniki regionalizacji SHH, FGF8, wygładzonego agonistę i małe cząsteczki hamujące podwójny SMAD.
    1. Umieścić kule w ruchu obrotowym w temperaturze 37 °C (60 obr./min, wytrząsarka orbitalna) i zmieniać pół pożywki świeżo uzupełnionej co 2-3 dni.
  4. Dzień 3: Aby zwiększyć indukcję neuronalną i przekształcić się w neuronalne komórki progenitorowe z tożsamością śródmózgowia, uzupełnij pożywkę inhibitorem 3 μM GSK-3β, który aktywuje szlak Wnt / β-kateniny. Utrzymuj inhibitor GSK-3β w pożywce do 13 dnia. Podziel na dwie nowe 6-dołkowe płytki poddane działaniu tkanki, aby zmniejszyć gęstość kulek na studzienkę i uniknąć agregacji kul.
    UWAGA: W dniu 8 większość komórek powinna być dodatnia dla Nestin.
  5. Dzień 8: Rozpocznij dojrzewanie neuronalne: zastąp czynniki regionalizacji SHH, FGF8, wygładzonego agonistę i koktajl hamujący podwójny SMAD 0,5 mM dibutyrylu cAMP (w celu ułatwienia dojrzewania), 20 nM inhibitorem deacetylazy histonowej (do wyjścia z cyklu komórkowego), 1 μM inhibitorem γ-sekretazy i czynnikami wzrostu, 10 ng/ml GDNF, 10 ng/ml BDNF, 1 ng/ml transformującym czynnikiem wzrostu β3 (TGFβ3), i 5 ng / ml FGF20 (oba sprzyjają przeżyciu progenitora DA). Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
  6. Dzień 21: Wygeneruj organoid nerwowy: zasiej około 100 neurosfer w warunkach granicy faz powietrze-ciecz na membranie PTFE (średnica 6 mm). Przenieś błonę do wkładki płytki hodowlanej (0,4 mm) i dodaj 1,2 ml pożywki do dojrzewania neuronów używanej do różnicowania neurosfery, jak opisano wcześniej.
    1. Zatrzymaj obrót od tego kroku. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni, aż do osiągnięcia wymaganego punktu czasowego różnicowania.
      UWAGA: Jeśli chodzi o dojrzewanie neuronalne, zaobserwowano zmniejszenie markera niedojrzałości neuronalnej Nestin i wzrost dojrzałych markerów nerwowych β3-tubuliny i GFAP. Zaobserwowano wysokie ekspresje TH i NURR1 (Ryc. 3C) i potwierdziły dojrzałość organoidów nerwowych11.

5. Kwantyfikacja ekspresji genów TH i Nurr1 w celu walidacji różnicowania dopaminergicznego

  1. Ekstrakcja RNA: We wskazanym dniu różnicowania należy poddać lizie 40 neurosfer za pomocą 350 μL buforu RLT (znajdującego się w zestawie do ekstrakcji RNA) uzupełnionego 3,5 μl 2-merkaptoetanolu. Wyodrębnij RNA z lizowanych neurosfer za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Określ ilościowo całkowite stężenia RNA.
  3. Wykonaj odwrotną transkrypcję 300 ng całkowitej ekstrakcji RNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przeprowadzanie analizy qPCR w systemach wykrywania PCR w czasie rzeczywistym, w oparciu o asymetryczne wykrywanie barwnika cyjaninowego. Znormalizuj dane za pomocą genów porządkowania: dehydrogenazy glicerynoaldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) i czynnika elongacji 1-alfa (EF1). Sekwencje starterów opisano w tabeli 1.

6. Detekcja metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)

  1. Użyj wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją elektrochemiczną, aby wykryć obecność dopaminy. Dopaminę ekstrahowano przez lizę organoidów nerwowych w 100 ml 0,1 N kwasu nadchlorowego (HClO4) przez 15 minut w temperaturze 4 °C z energicznym wirowaniem co 5 minut. Po odwirowaniu zebrać i przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C w celu dozowania dopaminy.
  2. Użyć kolumny C-18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm) do oddzielenia analitów za pomocą HPLC z odwróconymi fazami w trybie izokratycznym przy natężeniu przepływu 1 ml/minutę. Wykrywanie dopaminy powinno odbywać się za pomocą detektora kulometrycznego z ogniwem kondycjonującym ustawionym na potencjał +200 mV.

7. Zapis surowych danych za pomocą platformy mikroelectode array (MEA)

  1. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby przenieść neurosfery do środka porowatego urządzenia MEA.
  2. Do zapisów elektrofizjologicznych należy używać wzmacniacza i systemu akwizycji danych. Zmierz stosunek sygnału do szumu (SNR) jako odchylenie standardowe napięcia podczas 5-minutowego nagrania, używając sygnału jako średniego napięcia międzyszczytowego skoków zarejestrowanych w tych samych 5-minutowych okresach.

Wyniki

Kluczowe etapy niniejszego protokołu muszą zostać dokładnie zidentyfikowane i odpowiednio przeprowadzone. W związku z tym, na Rysunku 1A oraz Rysunku 3A przedstawiono schematy warunków hodowli z zaznaczeniem ram czasowych dla każdego etapu, a także związków wykorzystanych w protokole różnicowania dla organoidów NO plus GBM oraz DA, odpowiednio. Rysunek 1B, C, D, E, F przedstawia komórki, sfery i NO oraz ukazuje typową morfologię dla każdego etapu. Rysunek 1G, H, I przedstawia barwienie immunofluorescencyjne z zastosowaniem wybranych markerów neuronalnych.

figure-results-1
Rycina 1: Protokół różnicowania ludzkich organoidów neuronalnych (NO) . (A) Standaryzowany protokół generowania NO pochodnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). (B) hESC są hodowane na macierzy zewnątrzkomórkowej w medium dla hESC. (C) Do generowania skalibrowanych neurosfer wykorzystano płytki z mikrootworami. W 2. tygodniu neurosfery naniesiono na insert zawierający membranę z PTFE (pasek skali = 50 µm). (D) Widok makroskopowy NO w insercie w jednej studzience płytki 6-dołkowej. W pierwszych dniach zaobserwowano rozetki (czarna strzałka) (E). (F) Widok makroskopowy NO z sferą GIC na górze. (G-I) Analiza immunofluorescencyjna NO z sferą GIC (EGFR-dodatnia; pasek skali = 50 µm) (G) oraz samego NO, który wykazał reaktywność immunologiczną dla markera neuronalnego βIII-tubuliny i był lekko dodatni dla nestyny; jednak synapsyna 1 wykazała słaby sygnał (H,I) (paski skali odpowiednio 100 µm i 50 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Ilustracja sfer nekrotycznych i niedojrzałych NO. Neurosfery (A) oraz NO (B) mogą ulegać nekrozie, gdy ich liczba w studzience jest zbyt duża lub gdy osiągną zbyt duże rozmiary (C) (pasek skali = 10 µm). (D) Pojedyncza komórka GIC z reporterem pomidorowym ułatwia śledzenie inwazji komórek nowotworowych w NO, pasek skali, 10 µm. Przykład niedojrzałego NO z cewami neuronalnymi (E) oraz bez cew neuronalnych (F) (pasek skali = 50 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Ustandaryzowany protokół generowania organoidów neuronalnych DA oraz analizy elektrofizjologicznej i morfologicznej. (A) Ustandaryzowany protokół generowania organoidów neuronalnych DA. (B) Analiza immunofluorescencyjna organoidu neuronalnego DA; komórki immunoreaktywne na TH koekspresujące Nurr1, marker specyficzny dla śródmózgowia (pasek skali = 50 µm). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM (n = 3). (C) Wykresy przedstawiają kinetykę ekspresji genów TH i Nurr1 ocenianą za pomocą qRT-PCR. (D) Reprezentatywny chromatogram HPLC: pik dopaminy (strzałka) wykryty metodą HPLC w lizacie organoidu neuronalnego DA. (E) Przykład surowych danych zarejestrowanych za pomocą platformy MEA. Każdy potencjał czynnościowy (spike) jest przedstawiony jako linia pionowa (znacznik czasu), natomiast pozostały ślad to szum. (F) Zdjęcie przedstawiające neurosferę naniesioną na MEA. (G) Superpozycja typowych potencjałów czynnościowych (krzywe niebieska i czerwona) wykrytych w surowych danych. Pogrubiona czarna krzywa oznacza średnią z odpowiadających jej czerwonych krzywych. (H) Wykres rastrowy pokazujący znaczniki czasu powiązane z każdym wykrytym potencjałem czynnościowym. Różne kolory wyróżniają poszczególne elektrody. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

GenW przódOdwrócenie
Nurr1GGCTGAAGCCATGCCTTGTGTGAGGTCCATGCTAAACTTGACA
THGCACCTTCGCGCAGTTCTCCCGAACTCCACCGTGAA
EEF1AGCAAAAATGACCCACCAATGGCCTGGATGGTTCAGGATA
GAPDHGCACAAGAGGAAAGAGAGAGAACCAGGGGAGATTCAGTGTGGGT

Tabela 1: Primery użyte w tym protokole.

Dyskusja

Jednym z najbardziej krytycznych aspektów tego protokołu jest utrzymanie pluripotencji hESC podczas hodowli komórek oraz ścisłe monitorowanie sfer i morfologii organoidów nerwowych. Komórki macierzystych są bardzo wrażliwe, a każda manipulacja może prowadzić do wczesnego niekontrolowanego różnicowania, a także do śmierci komórki. W celu zwiększenia odtwarzalności doświadczalnej i uniknięcia wystąpienia nieprawidłowych zdarzeń kariotypu, zaleca się krioprezerwację kilku partii hESC przy najniższym pasażu po walidacji ich stabilności chromosomowej. Ponadto zaleca się rozmrażanie nowej fiolki do każdego eksperymentu i codzienne sprawdzanie zachowania komórek. Jeśli kule są mniej załamane i mają nienormalnie większy rozmiar, prawdopodobnie zaczną się agregować i umierać.

Jednym z ulepszeń tego systemu jest albo perfuzja, albo implementacja systemu unaczynionego (poprzez dodanie komórek śródbłonka lub w mikrochipie płynnym 3D)12,13. Jednak kontrolowanie grubości organoidu nerwowego (≤300 μm) umożliwia wydajną bierną perfuzję tlenu i składników odżywczych oraz zapobiega martwicy. Kolejnym ulepszeniem jest wprowadzenie komórek odpornościowych (mikrogleju). Mając na uwadze te ograniczenia, organoidy neuronalne plus system GIC mogą być istotnym narzędziem z kilku powodów. Po pierwsze, system ten umożliwia badania przesiewowe leków w celu monitorowania, w jaki sposób związek terapeutyczny może wpływać na organoid lub komórkę nowotworową. Po drugie, można badać interakcje międzykomórkowe, a także wizualizować i badać mikrośrodowiskowe determinanty leżące u podstaw inwazji indywidualnych i zbiorowych 5,6,13.

W kontekście choroby Parkinsona organoid nerwowy wzbogacony w neurony DA może stanowić istotny i dokładny model 3D do badania rozwoju choroby. W poprzednich badaniach indukowane przez pacjenta pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta, zróżnicowane w kierunku neuronów DA, zostały wykorzystane do zbadania dotkniętych podtypów neuronów. Warto zauważyć, że zaobserwowano niektóre fenotypy związane z chorobą, takie jak akumulacja α-synukleiny i wrażliwość na stres oksydacyjny14,15. Co więcej, organoid nerwowy może być wykorzystywany jako narzędzie do badań przesiewowych cząsteczek terapeutycznych. Należy jednak ustanowić szczegółowe i odpowiednie odczyty w celu oceny przeżycia i funkcjonalności neuronów DA, takich jak produkcja dopaminy i aktywność elektrofizjologiczna. W sumie protokół ten zapewnia dwa ustandaryzowane i dokładne podejścia oparte na komórkach macierzystych do generowania organoidów nerwowych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują la Ligue Genevoise Contre le Cancer (Genewa, Szwajcaria), Fundacji ISREC (Lozanna, Szwajcaria) oraz Fundacji Claytona na rzecz Badań (Houston, TX, USA) za wsparcie finansowe. Ponadto autorzy dziękują HES-HO i Centrum Wyss za wsparcie finansowe. Dziękujemy laboratorium Krausego za pomocne dyskusje i wsparcie oraz dr Halah Kutaish za korektę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 6-dołkowa (płytka 6-dołkowa)Falcon / Corning07-201-588
System detekcji ABI Prism 7900 HT  (Systemy wykrywania PCR w czasie rzeczywistym)Applied BiosystemsWycofane
Aggrewell 400 (płytki do hodowli mikrostudzienek)Wzmacniacz StemCell Technologies34421
(W2100-HS32)  (Wzmacniacz)wielokanałowe
Przeciwciało anty-EGFR (fosfo Y1101)Abcamab76195Rozcieńczenie 1/100
Przeciwciało anty-GFAPDako Z334 Rozcieńczenie 1:1000
Anty-Nestin, Ludzkie przeciwciałoMillipore ABD69 Rozcieńczenie 1:400
Chemia przeciwciał anty-synapsyny I AB1543P Rozcieńczenie 1:500
Suplementy B27 (B27)Life Technologies / Invitrogen1238Dla obu protokołów, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego  (BDNF)Prowadzenie komórkiGFH1-2Dla obu protokołów,  roztwór podstawowy 100 i mikro; g / ml w czystym H2O, roztwór końcowy 20 ng / ml
CHIR-99021 (inhibitor GSK-3 i beta)Axon Medchemct99021Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 7,5 mM w DMSO, roztwór końcowy 3 i mikro; M
Związek E a γ – inhibitor sekretazy (γ – inhibitor sekretazy)CalbiochemCAS 209986-17-4Dla obu protokołów (inhibitor gamma-sekretazy XXI),  roztwór podstawowy 5 mM w DMSO, roztwór końcowy 1 i mikro; M
Coulochem III  (Parametry detektora kulometrycznego)Thermo scientific
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP)SigmaD0627Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 0,5 M w DMSO, roztwór końcowy 0,5 mM
DMSO)Sigma-AldrichC6164Związki rozpuszczalnikowe, gotowy do użycia
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies12491-015Do hodowli komórkowych, gotowy do stosowania
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12)Gibco11320033Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
EDTA 0,1 mM (EDTA)Life TechnologiesAM9912Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)GibcoPHG0313Do hodowli GIC,  roztwór podstawowy 100 &mikro; g / ml w czystym H2O, roztwór końcowy 10 ng / ml
Czynnik wzrostu fibroblastów 20 (FGF20)Peprotech100-41Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 100 i mikro; g/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 5 ng/ml
czynnik wzrostu fibroblastów 8  (FGF8)PeprotechGFH176-5Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 100 &mikro; g / ml w czystym H2O, roztwór końcowy 100 ng / ml
Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)GibcoPHG0024Do hodowli GIC,  roztwór podstawowy 100 &mikro; g / ml w czystym H2O, roztwór końcowy 10 ng / ml
Suplementy G5 (G5)Invitrogen17503012Do hodowli GIC, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF)Prowadzenie komórekGFH2-2Dla obu protokołów,  roztwór podstawowy 100 i mikro; g / ml w czystym H2O, roztwór końcowy 20 ng / ml
Hydrofilowa membrana politetrafluoroetylenowa   (membrana PTFE)BioCell-InterfaceWycofano
LDN-193189 (inhibitor BMP) AxonMedchem / Stemgen04-0072-02 / 1509Dual/Smad,  roztwór podstawowy 5 mM w DMSO, roztwór końcowy 0,5 &mikro; M
L-glutamina (L-glutamina)Gibco25030081L-glutamina (200 mM), roztwór podstawowy 200 mM, roztwór końcowy 2 mM
Matrigel (macierz zewnątrzkomórkowa)BD Biosciences354277Matryca kwalifikowana do hESC, roztwór podstawowy 18-22 mg/ml, roztwór końcowy 180-220 i mikro; g/mL
Millicell-CM Wkładka do płytki hodowlanej  (0,4 &mikro; m) (Wkładka do płytki hodowlanej)MilliporePICM03050
Monoklonalne przeciwciało anty-β-tubuliny IIISigma T8660 Rozcieńczenie 1:1000
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital Shaker)Major ScienceMS-NRC-30
N2 suplementy (N2)Invitrogen17502-048Do hodowli GIC, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Nanodrop (Nanodrop)Thermo Fisher ScientificWycofany
Neurobasal (Neurobasal)Life Technologies / Gibco21103049Utrzymanie i dojrzewanie embrionalnych populacji komórek neuronalnych , gotowe do użycia
aminokwasy endogenne  Panie przewodniczący, panie i panowie!Gibco11140Aminokwasy endogenne 100X, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Przeciwciało Nurr1 (M-196)Santa CruzSc-55681/100 rozcieńczenie
Nutristem  (pożywka z hESC)Przemysł biologiczny05-100-1APożywka z komórkami macierzystymi, gotowa do użycia
Penicilin / Streptomycyna  (Penicilina / Streptomycyna )Life Technologies / Gibco15140122Do hodowli komórkowych, roztwór podstawowy 5 mg/ml, roztwór końcowy 50 &mikro; g/mL 
Kwas nadchlorowy 0,1N (HCLO4)Merck100519Do HPLC, gotowy do użycia
sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+/Mg2+  (PBS bez Ca2+/Mg2+ )Life Technologies14190250Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
zestaw PrimeScript RT-PCR (zestaw do odwrotnej transkrypcji)TakaraRR014A
Purmorphamina (wygładzony agonista)CalbiochemSML0868Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 10 mM w DMSO, roztwór końcowy 2 i mikro; Kinaza
związana z M Rho Y-27632 (ROCK)Abcam Biochemicalsab120129-1Inhibitor skał,  roztwór podstawowy 50 mM w DMSO, roztwór końcowy 10 &mikro; M
RNeasy mini kit (zestaw do ekstrakcji RNA)Qiagen74104
SB-431542 (TGF i beta; / Activin/inhibitor węzłowy)AscentAsc-163Dual-Smad,  roztwór podstawowy 50 mM w DMSO, roztwór końcowy 10 &mikro; M
Sonic Hedgehog (SHH)Prowadzenie komórekGFH168-5Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 100 &mikro; g/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 100 ng/ml
StemPro Accutase (roztwór enzymatyczny hESC)GibcoA11105-01roztwór enzymatyczny hESC, gotowy do użycia
Symetria C-18,5 mm (4,6 150mm2)  (Kolumna z odwróconą fazą)Kolba Waters Corporation
T150 (kolba T150)Przeciwciało Falcon08-772-1F
TH (F-11)Santa CruzSc-252691/200 rozcieńczenie
Transformujące czynniki wzrostu beta 3 (TGF i beta; 3)Prowadzenie komórekGFH109-2Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 100 i mikro; g / ml w czystym etanolu, roztwór końcowy 1 ng / ml
Trichostatyna A (inhibitor deacetylazy histonowej)SigmaT8552Do protokołu dopaminergicznego,  roztwór podstawowy 100 &mikro; M w DMSO, roztwór końcowy 20 nM
TrypLE (rekombinowany roztwór enzymatyczny)Invitrogen12604021rekombinowany roztwór enzymatyczny, gotowy do użycia
Trypsyna 0,25% (roztwór enzymatyczny)Life Technologies15050065roztwór enzymatyczny, gotowy do użycia
W2100, Multi Channel Systems (System akwizycji danych)WAT045905
X-vivo (pożywka wolna od surowicy)LonzaBE04-743Qpożywka bez surowicy, gotowa do użycia
Systemy Czysty dimetylosulfotlenek (

Bibliografia

  1. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Daphu, I., et al. In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations. Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).
  4. Huszthy, P. C., et al. In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives. Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).
  5. Nayernia, Z., et al. The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma. Biomaterials. 34 (33), 8279-8290 (2013).
  6. Cosset, E., et al. Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials. 107, 74-87 (2016).
  7. Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. The prevalence of Parkinson's's disease: a systematic review and meta-analysis. Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).
  8. Rajput, A. H., et al. Globus pallidus dopamine and Parkinson's motor subtypes: clinical and brain biochemical correlation. Neurology. 70 (16 Pt 2), 1403-1410 (2008).
  9. Jellinger, K. A. Pathology of Parkinson's's disease. Changes other than the nigrostriatal pathway. Molecular and Chemical Neuropathology. 14 (3), 153-197 (1991).
  10. Bernheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., Seitelberger, F. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson’s and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations. Journal of Neurological Science. 20 (4), 415-455 (1973).
  11. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells and Development. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  12. Chen, C. S. 3D Biomimetic Cultures: The Next Platform for Cell Biology. Trends in Cell Biology. 26 (11), 798-800 (2016).
  13. Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 743-747 (2012).
  14. Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS ONE. 6 (11), e26159(2011).
  15. Flierl, A., et al. Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication. PLoS ONE. 9 (11), e112413(2014).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Rozwój glejaka wielopostaciowegoróżnicowanie dopaminergiczneindukcja neuronalnaneurosfery o kalibrowanym rozmiarzepodwójne hamowanie SMADinhibitor ROCKinhibitor gamma-sekretazyilościowa RT-PCRplatforma MEA
Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.