Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC). Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przygotowanie wysokiej jakości mysich wycinków oczu do immunohistochemii (IHC) jest kluczowe dla oceny struktury i funkcji siatkówki oraz dla określenia mechanizmów leżących u podstaw chorób siatkówki. Utrzymanie integralności strukturalnej przez cały okres przygotowania tkanki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych danych IHC siatkówki, ale może być trudne ze względu na kruchość i złożoność cytoarchitektury siatkówki. Silne utrwalacze, takie jak 10% formalina lub roztwór Bouina, optymalnie zachowują strukturę siatkówki, często utrudniają analizę IHC poprzez wzmocnienie fluorescencji tła i/lub zmniejszenie interakcji przeciwciało-epitop, proces znany jako maskowanie epitopów. Z drugiej strony, łagodniejsze utrwalacze, takie jak 4% paraformaldehydu, zmniejszają fluorescencję tła i maskują epitopy, należy stosować skrupulatne techniki preparacji, aby zachować strukturę siatkówki. W tym artykule przedstawiamy kompleksową metodę przygotowania tylnych miseczek ocznych myszy do IHC, która jest wystarczająca do zachowania większości interakcji przeciwciało-epitop bez utraty integralności strukturalnej siatkówki. Dołączamy reprezentatywny IHC z przeciwciałami przeciwko różnym markerom typu komórek siatkówki, aby zilustrować zachowanie i orientację tkanek w optymalnych i nieoptymalnych warunkach. Naszym celem jest optymalizacja badań siatkówki IHC poprzez dostarczenie kompletnego protokołu od rozwarstwienia tylnej części oka do IHC.
Wprowadzenie
Immunohistochemia (IHC) to potężna technika lokalizacji określonych białek i struktur komórkowych w tkankach in situ1,2,3. Niewłaściwe metody utrwalania i nieoptymalne sekcjonowanie złożonych tkanek mogą zakłócić strukturę tkanki, generować wysokie barwienie tła lub zmniejszać interakcje przeciwciało-epitop, co skutkuje artefaktami barwienia i w konsekwencji błędną interpretacją danych IHC4. Ponieważ siatkówka kręgowców jest złożonym i wysoce zorganizowanym narządem nerwowym składającym się z warstw połączonych ze sobą fotoreceptorów, interneuronów i komórek zwojowych, jest bardzo delikatna i może zostać łatwo rozerwana podczas sekcji i sekcji. Szczegółowy, ustandaryzowany i zwalidowany protokół, od sekcji i orientacji oka myszy po barwienie immunologiczne, pomoże znacznie zmniejszyć artefakty IHC, zwiększając w ten sposób wiarygodność wyników i umożliwiając dokładniejszą analizę danych porównawczych.
Istnieje wiele protokołów przygotowania tkanek do IHC, jednak nie wszystkie są odpowiednie dla tkanki siatkówki. Silne utrwalacze, takie jak 10% formalina lub roztwór Bouina, zachowują strukturę siatkówki podczas preparowania i cięcia5. Niestety, silne utrwalacze często prowadzą do zwiększonej fluorescencji tła i maskowania epitopów z powodu chemicznej modyfikacji epitopów6. Z drugiej strony, łagodniejsze utrwalacze, takie jak 4% paraformaldehyd (PFA), mogą złagodzić niektóre z tych artefaktów, ale wymagają skrupulatnego rozwarstwienia i cięcia, aby zachować optymalną strukturę siatkówki. PFA szybko wnika w tkankę, ale bardzo wolno sieciuje białka, zmniejszając ryzyko maskowania epitopów. Ponieważ krótkotrwała inkubacja PFA jest stosunkowo łagodnym utrwalaniem, tkanki często wymagają szybkiego zamrożenia w celu zachowania antygenów. Ważne jest, aby unikać tworzenia się kryształków lodu podczas zamrażania tkanek, ponieważ zniekształcają one i uszkadzają integralność komórek i tkanek7.
Tutaj opisujemy szczegółowe i ustandaryzowane protokoły preparacji, utrwalania i krioochrony tylnych bańek oka myszy, które dostarczają spójnych i wiarygodnych danych IHC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych dostarczonym przez Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanii.
Wszystkie narzędzia i sprzęt do metod są pokazane w Rysunek 1 i wymienione w Tabeli Materiałów.
1 . Wyłuszczenie oka myszy, rozwarstwienie muszli ocznej i osadzanie
- Eutanazja myszy za pomocą dwutlenku węgla (CO2 ), a następnie dekapitacja (myszy po urodzeniu P0 - P11) lub zwichnięcie szyjki macicy (dorosłe myszy >P11). W przypadku myszy P0-P14 oczy są pokryte skórą. Upewnij się, że usunąłeś skórę przed kolejnymi krokami.
- Zaznacz skroniową część oka (Rysunek 2A) poprzez lekkie spalenie rogówki za pomocą kauteryzatora ogonowego. Unikaj wypalania w rogówce, dotykając rogówki bardzo lekko i nie dłużej niż przez ułamek sekundy kauteryzatorem.
- Natychmiast wyłuszczej oczy myszy za pomocą zakrzywionych kleszczy Dumont #5/45. Inkubować przez 15 minut w probówce krioprobówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie.
- Po 15 minutach w 4% PFA, przenieś nieruchome oko za pomocą zakrzywionych kleszczy Dumont #5/45 do zmodyfikowanej 35 mm płytki preparacyjnej (patrz Tabela Materiałów i Rysunek 1C) wypełnionej PBS i umieść pod mikroskopem preparacyjnym.
- Wykonaj małe nacięcie w miejscu oparzenia, prostopadle do rąbka (granicy rogówki) i tuż nad nim, używając mikronoża.
- Włóż zakrzywione nożyczki do nacięcia i wykonaj obwodowe cięcie rogówki wzdłuż rąbka (Rysunek 2B).
- Usuń rogówkę i wyjmij soczewkę za pomocą cienkich kleszczyków Dumont #5 (Ryc. 2B) i delikatnie unieś ją z tylnej części oka. Ciało szkliste, przezroczysty żel, który wypełnia przestrzeń między soczewką a siatkówką, wyjdzie wraz z soczewką (Rysunek 2B), a siatkówka będzie widoczna jako biała powierzchnia pokrywająca wnętrze tylnej muszli ocznej. Upewnij się, że nie ma widocznych uszkodzeń siatkówki, takich jak lub rozdarcia (Rysunek 2C).
- Umyj muszle oczne dwukrotnie w 1 ml PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Kriochronić muszle oczne, równoważąc je w roztworze 15% sacharozy w PBS przez noc w temperaturze 4 °C, aż muszla oczna opadnie
- Przenieś muszle oczne do 30% sacharozy w PBS na 2-3 godziny, aż muszla oczna opadnie.
- Osadź muszle oczne w OCT w krioformach 10 x 10 mm (Rysunek 3A). Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ustaw oko w kriomoldie wzdłuż jego osi grzbietowo-brzusznej (Ryc. 2D, Ryc. 3A), obracając oko, aż ślad oparzenia znajdzie się na górze, nerw wzrokowy znajdzie się po lewej stronie, a wycięta część formy będzie skierowana w prawo (Rysunek 2D). Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków w pobliżu tkanki.
UWAGA: Aby manipulować muszlą oczną, użyj tytanowej sondy wykonanej z tytanowego drutu przymocowanego do końcówki pipety. - Aby błyskawicznie zamrozić tkankę siatkówki, zanurz kriomold na co najmniej 5 minut w metalowej zlewce zawierającej izopentan i umieść zlewkę w kąpieli z ciekłym azotem lub suchym lodem/100% etanolem (do 1/3 wysokości metalowej zlewki).
UWAGA: Kriomold powinien być zanurzony w izopentanie na więcej niż połowę swojej wysokości, ale nie musi być całkowicie zanurzony. - Wyjmij zamrożony blok i zawiń go w folię aluminiową.
- Przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Zaznacz zamrożony blok za pomocą długopisu lub sharpie, aby zapisać orientację bloku (Rysunek 3B).
2 . Cięcie za pomocą kriostatu
- Po wyregulowaniu temperatury kriostatu (między -20 a -25 °C) należy odczekać, aby formy zawierające osadzone muszle oczne zrównoważyły się z temperaturą kriostatu przez 1 godzinę.
- Zamontuj blok o orientacji grzbietowo-brzusznej (Rysunek 3C) i wytnij odcinki szeregowe o grubości 10 μm. Ostrożnie umieść skrawki siatkówki na szkiełkach mikroskopowych z adnotacjami i numerami.
- Szkiełka należy przechowywać w pudełkach na prowadnice w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu zabiegów IHC.
3 . Barwienie immunologiczne fluorescencyjne za pomocą stojaka na slajdy
UWAGA: System Slide Rack (np. Sequenza) utrzymuje szklane szkiełka mikroskopowe z pokrywą, tworząc ~100 μL szczelinę kapilarną między szkiełkiem a płytą.
- Rozmrażaj kriosekcje w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 do 4 godzin, aby mogły wyschnąć i przymocuj do szkiełek mikroskopowych.
UWAGA: Możliwe jest również suszenie ich w temperaturze 30-37 °C przez 30 min do 1 h. - Umieść szkiełka w stojaku na szkiełka i umyj sekcje siatkówki dwukrotnie w 100-200 μl PBS przez 2 minuty.
- Przepuszczalność skrawków siatkówki poprzez inkubację w 0,25% Triton-X / 0,05% NaN3w PBS przez 5 minut w RT.
- Dodać 100 μl roztworu blokującego do szkiełek.
- Dodać do szkiełek 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym.
- Inkubować skrawki siatkówki przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: W tym czasie przykryj stojak na prowadnice, aby uniknąć wysuszenia sekcji. - Przemyj odcinki siatkówki 3 razy, każdy przez 15 minut, używając 200 μl PBS.
UWAGA: Dodatek 0,001-0,002% Triton-X100 do PBS (PBS-T) pozwala na bardziej rygorystyczne mycie, ale może zakłócić działanie niektórych błon i struktur komórkowych. - Inkubować skrawki siatkówki w znakowanych fluorescencyjnie przeciwciałach drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Od teraz chroń się przed światłem.
- Umyj sekcje siatkówki 3 razy, każdy przez 15 minut.
- Inkubować skrawki siatkówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut za pomocą markera jądrowego, takiego jak Hoechst 33342 lub roztwór DAPI.
- Myć sekcje siatkówki 1 raz przez 15 min.
- Umieść szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym na stole laboratoryjnym.
- Dodaj 2 krople środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na środek szkiełka nakrywkowego.
- Odwróć szkiełko, aby kriosekcja siatkówki była skierowana w dół.
- Ostrożnie zamontuj szkiełko nakrywkowe powoli, pod kątem ~45°, przechyl suwak na nośnik montażowy.
UWAGA: Unikanie tworzenia się pęcherzyków podczas opuszczania zjeżdżalni na miejscu. - Zastosuj równomierny nacisk, używając ciężkiej książki lub katalogu (patrz poniżej), do kombinacji szkiełka nakrywkowego, aby wyeliminować nadmiar nośników montażowych.
UWAGA: Aby zapewnić spójność w przygotowaniu próbki, zawsze używaj tego samego przedmiotu (tj. tej samej książki lub katalogu), aby wywrzeć równomierny nacisk na szkiełko nakrywkowe podczas montażu szkiełka. - Trzymaj płasko i pozostaw na noc do stwardnienia w temperaturze RT w ciemności. Szkiełka należy przechowywać płasko w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
- Obraz za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnej lub konfokalnej (Rysunek 4).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zilustrować, w jaki sposób protokoły te zapewniają optymalną konserwację siatkówki do IHC, przebadaliśmy przekroje siatkówki myszy WT w 28. dniu po urodzeniu (P28, szczep C57BL/6N) przy użyciu przeciwciał przeciwko rodopsynie (markerowi fotoreceptorów)8,ydekarboksylazie kwasu glutaminowego 65 (Gad65, markerowi komórek amakrynowych)9, syntetazie glutaminowej (GS, markerowi komórek Müllera)10 oraz kalbindynie (marke...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rozwarstwienie siatkówki myszy jest delikatnym procesem ze względu na mały rozmiar i kształt oczu myszy oraz kruchość tkanki siatkówki. Mimo że wykonanie wysokiej jakości sekcji jest kwestią praktyki, posiadanie szczegółowego protokołu, zapewnienie skutecznych metod i wskazówek jest koniecznością do uzyskania wycinków siatkówki i IHC. Oprócz opisanych tutaj protokołów istnieje kilka wskazówek, które pozwalają na uzyskanie spójnych, wysokiej jakości odcinków siatkówki, które są odpowiednie dla powtarzalnego IHC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak ujawniania informacji.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez fundusze z NIH (RO1-GMO97327) i University Research Foundation (UPenn). Szczególnie dziękujemy Svetlanie Savinie za pomoc w opracowaniu protokołu immunohistochemicznego, Gordonowi Ruthelowi (University of Pennsylvania) i Penn Vet Imaging Core za pomoc w mikroskopii oraz dr Leslie King za krytyczną lekturę tego manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zlewka ze stali nierdzewnej (185 x 218 mm) Gilson | #MA-48 | Do ciekłego azotu (rysunek 1E) | |
| Folia aluminiowa | |||
| Kauteryzator | Bovie | #AA01 | Do oznaczania orientacji oczu (Rysunek 1A) |
| Kleszcze zakrzywione, pęseta Dumont #5/45, zgięta pod kątem 45 stopni | Nauki o mikroskopii elektronowej | #72703-D | Do enukleacji i konserwacji oka myszy (Rysunek 1A) |
| Nożyczki zakrzywione, Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 2,5 mm | Narzędzia naukowe | #15002-08 | Aby przeciąć rogówkę na obwodzie (Rysunek 1B) |
| Pokryta woskiem dentystycznym naczynie | Do wypreparowania muszli ocznej (Rysunek 1C) | ||
| Mikroskop preparacyjny | Leica, Houston, Stany Zjednoczone | MZ12.5 Wysokowydajny mikroskop stereoskopowy | |
| Mikro noże - Plastikowa rękojeść | Narzędzia naukowe | #10315-12 | Aby wykonać małe nacięcie w miejscu oparzenia (Rysunek 1A) |
| Różowy wosk dentystyczny | Nauki o mikroskopii elektronowej | #72660 | Do powlekania naczynia preparacyjnego |
| Stojak na prowadnice i pokrywę | Ted Pella | #36107 | Do siatkówki IHC (Rysunek 1G) |
| Zlewka ze stali nierdzewnej (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | Do kąpieli izopentanowej (Rysunek 1E) |
| Skrzynka | Do izolowanej chłodnicy | ||
| Cienkie kleszcze Dumont #5 | Narzędzia naukowe | #11254-20 | Aby usunąć rogówkę i wyjąć soczewkę (Rysunek 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Nauki o błędnej analizie elektronów | #62534-10 | Forma do zatapiania OCT |
| Buffers and Reagents | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| Roztwór | 2% Normalna surowica końska, 1,5% Zimna skóra rybia Żelatyna (w 40-50% w H2O, kat. #G7765), 5% albumina surowicy bydlęcej (kat. #AK1391-0100) w buforze permeabilizacyjnym. | ||
| Gelvatol (środek montażowy zapobiegający blaknięciu) | Pod wyciągiem rozpuść 0,337 g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) w 10 ml Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Dostosuj do pH 8-8,5 za pomocą 12N HCl (~ 5 kropli). Przechowywać w bursztynowej butelce z kroplami w temperaturze 4° C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml w PBS (1000x). Aliquot i przechowywać w ciemności, w temperaturze 4° C do 1 roku lub przy -20° C do długotrwałego przechowywania. Przygotuj świeże przy 1 μg/ml (1x) |
| Izopentan, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| ciekłego azotu | |||
| (PFA) w | naukach o mikroskopii elektronowej PBS | #15710 | Przygotowane świeże 4% PFA z 16% PFA. Pozostałe 16% PFA należy przechowywać w temperaturze 4° C w ciemności. |
| Roztwór | przepuszczalny PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO kat. #0694-1L) + 0,05% NaN3. Przygotuj świeże. | ||
| Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Przygotowane z 10x stock |
| Roztwory sacharozy | Fisher Scientific | #S-5-500 | Rozpuść odpowiednią ilość sacharozy w 37° C PBS (rozpuszczenie trwa ~15 minut). Może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze 4 |
| Związek Tissue-Tek OCT | Sakura | #4583 | |
| Przeciwciała | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | Do oznaczania komórek horinzotalnych |
| anty-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Do oznaczania GABA-ergicznych komórek amakrynowych |
| Anty-GS | BD Transdukcja | 610517 | Do oznaczania Mü komórki ller |
| anty-rodopsyna | Millipore | MAB5316 | Do etykietowania prętów |
Bibliografia
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
