Artykuł metodologiczny

Ocena reakcji na napięcie naczyniowe przy użyciu izolowanych tętnic krezkowych z naciskiem na modulację przez okołonaczyniowe tkanki tłuszczowe

DOI:

10.3791/59688

⸱

3 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology and the Department of Pharmacology and Pharmacy, University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje użycie miografii drucianej do oceny przezściennego napięcia izometrycznego tętnic krezkowych wyizolowanych od myszy, ze szczególnym uwzględnieniem modulacji przez czynniki uwalniane z komórek śródbłonka i okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmieniona reakcja tonu naczyniowego na bodźce patofizjologiczne przyczynia się do rozwoju szerokiego zakresu chorób sercowo-naczyniowych i metabolicznych. Dysfunkcja śródbłonka stanowi głównego winowajcę zmniejszonego rozszerzenia naczyń krwionośnych i zwiększonego zwężenia naczyń krwionośnych tętnic. Tkanki tłuszczowe (tłuszczowe) otaczające tętnice odgrywają ważną rolę w regulacji zależnego od śródbłonka rozluźnienia i/lub skurczu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Wzajemne oddziaływanie między śródbłonkiem a okołonaczyniową tkanką tłuszczową można ocenić ex vivo za pomocą zamontowanych naczyń krwionośnych za pomocą systemu miografii przewodowej. Należy jednak ustalić optymalne ustawienia dla tętnic pochodzących od zwierząt różnych gatunków, w różnym wieku, o różnym pochodzeniu genetycznym i/lub stanach patofizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozszerzenia i zwężenia tętnic są osiągane odpowiednio przez rozluźnienia i skurcze komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Zmiany w reakcjiach naczyniowych małych tętnic przyczyniają się do homeostatycznej regulacji ciśnienia tętniczego krwi przez autonomiczne nerwy i hormony obecne we krwi (np. Katecholaminy, angiotensyna II, serotonina, wazopresyna). Na poziomie lokalnym reakcje naczyniowe komórek mięśni gładkich są modulowane przez sygnały zarówno z komórek śródbłonka błony wewnętrznej, jak i tkanki tłuszczowej otaczającej tętnice (Ryc. 1).

Śródbłonek jest nie tylko pasywną barierą, ale służy również jako powierzchnia do wymiany sygnałów między krwią a leżącymi poniżej komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Uwalniając różne substancje wazoaktywne, śródbłonek odgrywa kluczową rolę w lokalnej kontroli reakcji tonu naczyniowego1. Na przykład, w odpowiedzi na acetylocholinę, śródbłonkowa syntaza tlenku azotu (eNOS) jest aktywowana w śródbłonku w celu wytworzenia tlenku azotu (NO), który indukuje rozluźnienie leżących poniżej mięśni gładkich naczyń krwionośnych poprzez aktywację rozpuszczalnej cyklazy guanylowej (sGC)2. Inne substancje wazoaktywne obejmują produkty cyklooksygenaz (np. prostacykliny i tromboksanuA2), lipooksygenazy (np. kwasów 12-hydroksyeikozatetraenowych, 12-HETE) i monooksygenaz cytochromu P450 (HETE i kwasy epoksyeikozatrienowe, EET), reaktywnych form tlenu (ROS) i peptydów wazoaktywnych (np. endoteliny-1 i angiotensyny II) oraz czynników hiperpolaryzacyjnych pochodzących ze śródbłonka (EDHF)3. Delikatna równowaga między środkami rozszerzającymi naczynia krwionośne pochodzącymi ze śródbłonka a zwężającymi naczynia krwionośne utrzymuje lokalne napięcie naczynioruchowe4,5.

Dysfunkcja śródbłonka charakteryzuje się upośledzeniem zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń krwionośnych6, cecha charakterystyczna starzenia się naczyń krwionośnych7. Wraz z wiekiem zdolność śródbłonka do promowania rozszerzenia naczyń krwionośnych jest stopniowo zmniejszana, głównie z powodu zmniejszonej biodostępności NO, a także nieprawidłowej ekspresji i funkcji eNOS w śródbłonku i sGC w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych8,9,10. Zmniejszona biodostępność NO nasila produkcję zależnych od śródbłonka czynników zwężających naczynia krwionośne11,12. W starzejących się tętnicach dysfunkcja śródbłonka powoduje przerost w podłożu, co znajduje odzwierciedlenie w wyraźnym wzroście grubości ścian, liczby jąder przyśrodkowych, które przypominają pogrubienie tętnic w nadciśnieniu tętniczym i miażdżycy obserwowane u ludzi13,14. Ponadto stany patofizjologiczne, takie jak otyłość, cukrzyca czy nadciśnienie, przyspieszają rozwój dysfunkcji śródbłonka15,16.

Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa (PVAT) uwalnia liczne adipokiny regulujące strukturę i funkcję naczyń krwionośnych17. W przeciwskurczowym działaniu PVAT pośredniczą czynniki relaksujące, takie jak adiponektyna, NO, nadtlenek wodoru i siarkowodór18,19,20. Jednak w zależności od lokalizacji i stanu patofizjologicznego, PVAT może również wzmacniać reakcje skurczowe w różnych tętnicach21. Substancje prokurczliwe wytwarzane przez PVAT obejmują angiotensynę II, leptynę, rezystynę i ROS22,23. W większości badań nad izolowanymi naczyniami krwionośnymi PVAT był uważany za proste wsparcie strukturalne dla układu krwionośnego, a tym samym usuwany podczas przygotowywania segmentów pierścienia naczyń krwionośnych. Ponieważ dysfunkcja tkanki tłuszczowej stanowi niezależny czynnik ryzyka nadciśnienia tętniczego i związanych z nim powikłań sercowo-naczyniowych24, PVAT otaczający naczynia krwionośne powinien być brany pod uwagę podczas badania reakcji naczyniowej różnych tętnic.

Wieloprzewodowe systemy miograficzne były szeroko stosowane do badania funkcji naczyniomotorycznych różnych naczyń krwionośnych, w tym aorty, tętnic krezkowych, nerkowych, udowych, mózgowych i wieńcowych25,26. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły będą wykorzystywać miografię przewodową do oceny reakcji naczyniowej w tętnicach krezkowych wyizolowanych z genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy, ze szczególnym naciskiem na modulację przez PVAT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta użyte do poniższego badania zostały dostarczone przez Laboratorium Zwierząt Wydziału Medycyny Uniwersytetu w Hongkongu. Aprobatę etyczną uzyskano od wydziałowego Komitetu ds. Wykorzystywania Zwierząt Laboratoryjnych do Nauczania i Badań (CULATR, nr: 4085-16).

1. Przygotowania

  1. Przygotowanie leków
    1. Leki należy przechowywać w odpowiedni sposób, zgodnie z Kartą Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS) natychmiast po ich otrzymaniu. Rozpuścić leki w postaci proszku w rozpuszczalnikach w postaci roztworów podstawowych o wysokim stężeniu, a następnie podwielokrotność do przechowywania w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Większość leków rozpuszcza się w wodzie destylowanej w celu przygotowania roztworów podstawowych; W przypadku niektórych leków może być wymagane ogrzewanie lub sonikacja. Jeśli leki nie rozpuszczą się całkowicie w wodzie, można dodać kroplę 1 M NaOH, natomiast w przypadku podstawowych leków można użyć kropli 1 M HCl. Leki hydrofobowe można rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO) lub absolutnym etanolu. W tych ostatnich przypadkach należy znać końcowe stężenie w kąpieli (w M) i przeprowadzić odpowiednie kontrole w celu wykluczenia wpływu rozpuszczalników.
    2. Przed eksperymentem rozpuścić podwielokrotności leku (tabela materiałów) w roztworze wodorowęglanu Krebsa-Ringera (Krebs) zawierającym 115 mM NaCl, 4,6 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,17 mMMgSO4, 1,17 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 11,1 mM D-glukozy i 0,01 mM EDTA, pH 7,4.
    3. Dla skumulowanych krzywych stężenie-odpowiedź, należy przygotować roztwory podstawowe i robocze różnych leków przez seryjne rozcieńczenia (Tabela 1).
  2. Konfiguracja instrumentu
    1. Kalibruj przetwornik siły dla wszystkich kanałów przed użyciem systemu myograph każdego dnia lub za każdym razem, gdy system został przeniesiony.
      UWAGA: Szczegółowa procedura kalibracji różni się w zależności od modelu. Ogólnie rzecz biorąc, na szczęki przykładany jest dwugramowy ciężarek, a odpowiednia siła powinna wynosić 9,81 ± 0,1 mN. Jeśli odczyt jest opóźniony o więcej niż 0,1 mN, przetwornik należy ponownie skalibrować. Dla systemu stosowanego w niniejszym protokole (patrz Tabela materiałów) wartości robocze dla przetwornika siły podczas kalibracji powinny wynosić od 3000 do 3500. Jeśli wartość przetwornika jest wyższa lub niższa, przetwornik siły należy wymienić.
    2. Wyreguluj i wyrównaj wsporniki montażowe w każdej komorze. Ciągłe i wielokrotne używanie komory miografu może powodować pewne niewspółosiowość wspornika montażowego, który wymaga sporadycznej regulacji przed eksperymentami, aby upewnić się, że szczęki są prawidłowo ustawione.
      UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na regulację wsporników montażowych, ponieważ przetworniki siły są bardzo czułe i delikatne.
    3. Włączyć grzejniki i gaz (95%O2 i 5% CO2) co najmniej 30 minut przed eksperymentem, aby umożliwić ogrzanie komór i do temperatury 37 ± 0,1 °C i zrównoważenie z mieszaniną gazów.
      1. Sprawdź temperaturę na termometrze, aby upewnić się, że grzałka jest dokładna. Temperaturę można modyfikować, aby przeprowadzić eksperymenty z chłodzeniem lub ociepleniem. Jeśli temperatura nie jest prawidłowa zgodnie z ustawieniem, zastosuj funkcję przesunięcia urządzenia, aby zwiększyć lub zmniejszyć ustawienia, aby osiągnąć wymaganą temperaturę.
    4. Pod koniec eksperymentu wyczyść wszystkie komory i wyłącz grzałkę, a także gaz płynący do zestawu.
      1. Nie wyłączaj gazu, dopóki cała ciecz w komorze nie zostanie odessana z układu, w przeciwnym razie kwas/woda destylowana może zwrócić i dotrzeć do komory narządowej podczas następnego użycia.
      2. Aby oczyścić komory miografu drucianego, najskuteczniejszym sposobem jest przepłukanie kwasem za pomocą rozcieńczonego roztworu kwasu octowego. Oczyść krawędź i wnętrze komór bawełnianym wacikiem.
      3. Po umyciu należy dokładnie wypłukać komory wodą destylowaną. Wytrzyj zewnętrzną część komór wilgotną szmatką, aby usunąć zaschniętą sól. Etanol może być również użyty, jeśli podczas eksperymentu zastosowano leki hydrofobowe.
      4. Przykładowa procedura prania jest następująca. Napełnij komory 8% roztworem kwasu octowego i inkubuj przez 2 minuty. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby mechanicznie wyczyścić powierzchnię stalowej komory. Unikaj kontaktu z aluminiową częścią miografu.
      5. Odessać kwas octowy i kilkakrotnie umyć komorę miografu oraz podpory wodą destylowaną, a następnie osuszyć powierzchnie za pomocą chłonnego papieru lub aplikatorów z bawełnianą końcówką.
  3. Rozwarstwienie pierścieni tętniczych krezki
    UWAGA: Zwierzęta wykorzystane w obecnym badaniu były karmione dietą wysokotłuszczową samcami myszy Adipo-SIRT1 i rodzeństwem z dzikiego miotu jako grupą kontrolną. Każde zwierzę ważyło około 45 g w czasie eksperymentów.
    1. Poddaj mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (50 mg/kg).
    2. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy wykonaj laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić zawartość jamy brzusznej.
    3. Zbierz arkadę krezki na pokrytą silikonem szalkę Petriego.
    4. Rozprowadź i przypnij sieć krezkową na szalce Petriego, aby odsłonić rozgałęzienia krezki i siatki tkanki łącznej.
    5. Pod mikroskopem (10x) oraz za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy dokładnie wypreparuj otaczające tkanki łączne. Unikaj uszkodzenia warstwy przybyszowej. Alternatywnie, otaczająca tkanka tłuszczowa może zostać zatrzymana wokół naczynia krwionośnego do eksperymentu (jeśli jest to konieczne).
    6. Za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy wytnij wtórne gałęzie tętnic krezkowych w lodowatym buforze Krebsa.
      UWAGA: Każdy badacz powinien posiadać własny zestaw preparacyjny, sznurki i strzemiona. Narzędzia te powinny być odpowiednio przechowywane i czyszczone za każdym razem po eksperymencie, ponieważ niektóre leki są trudne do zmycia i mogą się do nich przyklejać pozostałości.
      1. Utrzymuj naczynia krwionośne w zimnym buforze Krebsa, jednocześnie oddzielając otaczające tkanki łączne, w tym PVAT. Podczas obchodzenia się z naczyniem krwionośnym należy zachować ostrożność, aby zapobiec niepotrzebnemu uszkodzeniu śródbłonka.
      2. Jeśli eksperyment obejmuje badanie PVAT, zachowaj kulę PVAT o średnicy od 1,5 do 2 mm wokół naczynia krwionośnego. Alternatywnie, te same ilości tkanki tłuszczowej można dodać do każdej komory w celach eksperymentalnych.
    7. (Opcjonalnie) Usuń śródbłonek z wypreparowanego naczynia krwionośnego jako kontrolę, aby ocenić zależność odpowiedzi od śródbłonka. W przypadku tętnic krezkowych usuń śródbłonek, delikatnie przetaczając go po drucianym strzemieniu lub włosie.
    8. Pokrój naczynie krwionośne przygotowane jak powyżej na małe pierścienie (~2 mm długości) i umieść je w plastikowym naczyniu pełnym napowietrzonego (95% O2 i 5% CO2) bufora Krebsa w celu późniejszego zamontowania w komorach drucianego miografu27.
    9. Przenieś pierścienie naczyń do komory miografu umieszczonej pod mikroskopem. Pierścienie powinny być rozmieszczone równomiernie, z górnym i dolnym strzemieniem równolegle. Drut mocujący (40 μm) powinien być przygotowany na nowo, ponieważ leki mogą wiązać się ze sznurkami.
    10. Nakręć pierścień naczynia krwionośnego na odpowiednią długość (2 cm) drutu i przymocuj do jednej szczęki komory montażowej, przykręcając, aby ustalić pozycję.
    11. Przełóż drugi drut przez pierścień i zakotwicz do przeciwległej szczęki.
    12. Z pierścieniami gwintowanymi i przymocowanymi do szczęk komory, zamontuj komorę na zestawie miografu i przekręć mikrometru zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć przewody blisko siebie, aż odczyt siły na interfejsie użytkownika odpowiadający zamontowanej komorze wyniesie zero lub nieco poniżej.
      UWAGA: Drut przymocowany do górnej szczęki powinien mieć minimalną długość, aby zapewnić pełne przeniesienie napięcia na detektor.
    13. Równoważyć preparaty w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut przed pierwszym przyłożeniem siły, używając regulowanego mikrometru.
    14. Oceń żywotność tkanek w 115 mM wysokim potasie (NaCl zastąpiony przez KCl w przeliczeniu na mola) Krebs zawierający 4,6 mM NaCl, 115 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,17 mM MgSO4, 1,17 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 i 11,1 mM D-glukozy przy pH 7,4,
      UWAGA: Izolowane naczynia uważa się za żywotne, jeśli siła skurczu przekształcona i zarejestrowana jako ugięcie powyżej linii podstawowej w oprogramowaniu do rejestracji danych systemu miografu wynosi więcej niż 40% ich tonu spoczynkowego w odpowiedzi na czynnik skurczowy. Jeśli tętnica nie kurczy się prawidłowo, oznacza to, że albo optymalne napięcie podstawowe/ciśnienie w ścianie nie zostało odpowiednio wyregulowane, albo tętnica mogła zostać uszkodzona podczas izolacji lub montażu naczynia.
    15. (Opcjonalnie) Oceń integralność komórek śródbłonka, stosując fenylefrynę w celu wywołania skurczu naczynia do 50% początkowej odpowiedzi na KCl (zarejestrowanej przez przetwornik siły w oprogramowaniu do rejestracji danych), a następnie dodając 1 μM acetylocholiny.
      UWAGA: Dobre przygotowanie naczyń krwionośnych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych i dokładnych wyników. W doświadczeniu nie należy stosować preparatu, jeśli badanie integralności śródbłonka jest niezadowalające lub nie reaguje na KCl, co wskazuje, że odpowiednio funkcja śródbłonka lub kurczliwość mięśni gładkich naczyń krwionośnych nie są zadowalające. W takim przypadku preparat należy zastąpić nowym pierścieniem z tego samego naczynia krwionośnego lub nowym naczyniem krwionośnym.

2. Normalizacja w celu określenia optymalnego napięcia początkowego

UWAGA: Procedura normalizacji pozwala na określenie optymalnej średnicy wewnętrznej (IC) tętnic, przy której naczynie krwionośne doświadcza odpowiedniego spoczynkowego ciśnienia przezściennego (100 mmHg lub 13,3 kPa dla tętnic krezkowych) i wytwarza maksymalne siły aktywne w odpowiedzi na czynniki wazoaktywne.

  1. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do rejestracji danych (patrz tabela materiałów).
  2. Zapisz eksperyment jako "plik danych LabChart" o nowej nazwie, aby uniknąć zastąpienia oryginalnego pliku ustawień.
  3. Otwórz okno ustawień normalizacji i ustaw współczynnik k na 1. Zaakceptuj domyślne wartości kalibracji okularu (0.3, jeśli długość naczynia jest nieznana, lub 1, jeśli znana jest długość zbiornika), ciśnienia docelowego (13.3), czasu uśredniania online (2) i czasu opóźnienia (60). Kliknij przycisk OK, aby zapisać ustawienia.
  4. Wybierz interesujące Cię kanały i wprowadź średnicę drutu (40 μm), punkty końcowe tkanek (a1: 0; a2: zmierzona długość tkanki), początkowy odczyt mikrometru w oknie normalizacji.
  5. Procedurę normalizacji należy rozpocząć od przyłożenia pierwszego biernego rozciągania do naczynia krwionośnego (przekręć mikrometryczną w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara).
  6. Poczekaj, aż naczynie się ustabilizuje (3 min) i wprowadź nowy odczyt mikrometru w oknie normalizacji. Naprężenie ściany jest obliczane automatycznie i wyświetlane jako punkt na wykresie.
    UWAGA: "Kroki" mikrometryczne używane podczas rozciągania pasywnego nie muszą być takie same. Pierwsze kilka odcinków może mieć po 20 μm każdy. W miarę zbliżania się odcinków do linii izobarowej, kroki mogą być zmniejszane do 10 μm, 5 μm, 2 μm lub nawet mniejszych. Miej otwarte główne okno wykresu podczas dostosowywania ustawień mikrometru — jeśli pojawi się duży skok przekraczający linię izobarową na wykresie długości/naprężenia (który wskazuje punkty nacisku odpowiadające wcześniej określonej wartości), zmniejsz napięcie.
  7. Po każdym pasywnym rozciąganiu należy zastąpić kontrolny Krebs izoosmotycznym Krebsem o wysokiej zawartości potasu zawierającym 115 mM KCl. Gdy skurcz osiągnie plateau (około 3 minut), zapisz czynną siłę (F), odejmując siłę bierną przy każdym rozciągnięciu od siły aktywowanej potasem. Oblicz naprężenie ściany, a także wartości obwodu wewnętrznego (IC).
    1. Zmierz czynne naprężenie jako ugięcie powyżej linii bazowej. Naprężenie czynne (T) oblicza się na podstawie równania F (mN) = T (mN/mm) x 2 x długość naczynia (mm). Wartości obwodu wewnętrznego (IC) są obliczane na podstawie danych mikrometrycznych (IC = 205,6 μm + 2 x "przerwa").
  8. Usuń stan wysokiego poziomu potasu, zastępując go świeżymi Krebsami. Powtarzaj mycie trzy razy w ciągu 5 minut.
  9. Powtarzaj kroki od 2,5 do 2,8 (poprzez wywoływanie pasywnego rozciągania, po którym następuje aktywne kurczenie się na przemian), aż aktywne napięcie zacznie się zmniejszać (Rysunek 2).
  10. Po wielu rundach naprzemiennych rozciągań, pasywne krzywe długości/naprężenia dają wartość IC100, wewnętrzny obwód naczynia przy ciśnieniu poprzecznym 100 mmHg, jako punkt przecięcia z linią izobarową.
    UWAGA: Każda wartość mikrometryczna podczas rozciągania pasywnego jest wprowadzana ręcznie w module normalizacji oprogramowania. Program automatycznie rejestruje odpowiedni pomiar siły w celu wygenerowania pasywnej krzywej długości/naprężenia, która podaje wartość IC100 jako punkt przecięcia z linią izobarową (Rysunek 2, prawe panele). Im bliżej linii izobarowej znajduje się ostatni punkt, ale tuż powyżej, lepsza normalizacja przebiega bez uszkadzania naczyń. Punkt znajdujący się zbyt daleko ponad linią izobarową może fizycznie uszkodzić zamontowane naczynie, powodując niewiarygodne wyniki podczas eksperymentu.
  11. Utwórz aktywne krzywe długości/napięcia, aby określić wartości IC1 i obliczyć współczynnik normalizacji k jako stosunek IC1/IC100, który zostanie wykorzystany dla tego typu naczynia krwionośnego w kolejnych eksperymentach miograficznych.
    UWAGA: Aktywne krzywe długości/naprężenia są tworzone przez wykreślenie wartości IC obliczonych na podstawie danych mikrometrycznych na osi x i aktywnych naprężeń na osi y. IC1 to wartość leżąca w obszarze plateau piku (czerwone ślady w Rysunek 2, prawe panele). Po wykreśleniu aktywnych krzywych długości/naprężenia i wyznaczeniu IC1, współczynnik normalizacji k jest obliczany jako stosunek IC1/IC100. W oparciu o współczynnik normalizacji k, optymalna IC dla linii bazowej, oznaczona jako IC1, pojawi się na pasywnej krzywej długości/naprężenia. Ustawienie mikrometru dla tego układu scalonego znajduje się pod krzywą i powinno być używane do ustawiania mikropozycjonera dla kolejnych eksperymentów miograficznych. Napięcie początkowe (T) jest równe ciśnieniu docelowemu (Pi) x IC/2π, a optymalna siła (F) przyłożona do zbiornika jest równa T x 2 x długość naczynia.
  12. Dokładnie wypłukać Krebsa o wysokiej zawartości potasu i zrównoważyć preparaty przez kolejne 30 do 45 minut. Zresetuj podstawowe napięcia do "zera", tak aby podczas kolejnego eksperymentu rejestrowane były tylko aktywne reakcje skurczowe.

3. Skurcze wywołane fenylefryną

UWAGA: Leki, które mogą być wybrane do wywoływania reakcji zwężających naczynia krwionośne, obejmują niespecyficznego agonistę receptorów adrenergicznych noradrenalinę, selektywnego agonistę adrenergicznego α-1 fenylefrynę, hormon peptydowy angiotensynę II i neuroprzekaźnik monoaminowy 5-hydroksytryptaminę. Fenylefryna jest stosowana w niniejszym protokole do badania (tabela materiałów).

  1. Przygotować i zamontować sparowane pierścienie tętnicze zgodnie z opisem w sekcji 1.3, jeden z nienaruszonym PVAT, a drugi z usuniętym PVAT, z sąsiednich odcinków każdej tętnicy na potrzeby eksperymentu.
  2. Po normalizacji (opisanej w sekcji 2) należy wstępnie skurczyć odcinki tętnic buforem Krebsa o wysokiej zawartości potasu, dodając 115 mM roztwór KCl do komory zawierającej Krebsa.
  3. Poczekaj, aż skurcz się ustabilizuje (3 min), wypłucz wysoki poziom potasu i zastąp go świeżym, napowietrzonym buforem Krebsa. Powtórz mycie trzy razy w ciągu 5 minut.
  4. Powtórz stymulację KCl i mycie trzy razy i zapisz maksymalną reakcję/napięcie skurczu na KCl, odejmując napięcie podstawowe od napięcia spowodowanego stymulacją KCl.
  5. Po ostatnim skurczu i przemyciu należy ponownie napełnić komorę ciepłym, napowietrzonym buforem Krebsa i pozostawić tętnicę na około 30 minut do regeneracji przed wykonaniem kolejnego zadania.
  6. Do każdej komory dodać skumulowane ilości fenylefryny (przyrosty o pół logarytmu od 10-10 do 10-4 M) w celu wywołania zależnego od stężenia wzrostu napięcia izometrycznego preparatów w stanie spoczynku.
  7. Zacznij od dodania niskiego stężenia agonisty do komory. Po odczekaniu wystarczającej ilości czasu na ustabilizowanie się skurczu (3-5 minut), dodaj kolejne stężenie. Powtórz kroki ze wzrostem stężenia fenylefryny.
  8. Po dodaniu ostatniej dawki agonisty (fenylefryny) należy dokładnie wypłukać lek i ponownie napełnić komorę świeżym buforem Krebsa. Wykreśl odpowiedzi zależne od stężenia jako rosnący procent maksymalnych skurczów wywołanych przez KCl (Rysunek 3).
  9. (Opcjonalnie) Aby ocenić udział NO, należy inkubować preparaty z inhibitorem syntazy NO, L-NAME (10-4 M), przez 30 minut przed dodaniem fenylefryny. L-NAME wzmacnia skurcze wywołane fenylefryną w spoczynkowych preparatach tętnic krezkowych (Ryc. 4).
    UWAGA: Inhibitory lub antagoniści muszą mieć wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie równowagi, zwykle 30-45 minut (należy zachować spójność dla każdego zestawu eksperymentów).
  10. W celu sekwencyjnego wykonania drugiej krzywej stężenie-odpowiedź, należy całkowicie i wielokrotnie umyć komorę w celu usunięcia wszystkich poprzednich agonistów, aż do momentu, gdy nie zaobserwuje się dalszych zmian tonu.
    UWAGA: Równoległe eksperymenty wystawiają co najmniej dwa pierścienie uzyskane z tego samego naczynia krwionośnego na działanie agonisty, jeden w warunkach kontrolnych, a drugi w obecności inhibitora (inhibitorów); W każdym pierścieniu krzywa stężenie-odpowiedź zostanie wykonana tylko raz. Zaleca się przeprowadzanie równoległych eksperymentów, ponieważ zapewnia to lepszą kontrolę działania leku i wrażliwości naczyń krwionośnych. W eksperymentach seryjnych uzyskuje się krzywą stężenie-odpowiedź do agonisty w pojedynczym pierścieniu; wypłukanie, zmiana warunków doświadczalnych (np. dodanie inhibitora), a następnie powtórzenie krzywej stężenie-odpowiedź na tym samym pierścieniu. W takim przypadku konieczne są kontrole czasu, aby wykazać, że reakcje leku nie są spowodowane zmianami w tkance w czasie. Nigdy nie można być pewnym, że tkanka jest w dokładnie takim samym stanie po ekspozycji na eksperyment stężenie-odpowiedź. Należy zapewnić odpowiedni czas (co najmniej 30–60 minut), aby umożliwić segmentom naczynia powrót do napięcia spoczynkowego (podstawowego), chociaż w niektórych przypadkach może to nie nastąpić natychmiast po dysocjacji agonisty o wysokim powinowactwie od receptorów. Ponadto Krebs o wysokiej zawartości potasu może być stosowany między krzywymi skumulowanego stężenia-odpowiedzi w celu zmniejszenia odczulania28. Pamiętaj, że większości antagonistów nie da się całkowicie wypłukać, więc dodawaj go do końca eksperymentu.

4. Relaksy/skurcze zależne od śródbłonka

  1. Wstępnie zakontraktuj świeżo zamontowany odcinek tętnicy (zgodnie z opisem w krokach od 3.2 do 3.5). Ponownie zapisz maksymalną reakcję/napięcie skurczowe na KCl, odejmując napięcie podstawowe od napięcia spowodowanego stymulacją KCl.
  2. (Opcjonalnie) Inkubować preparaty z inhibitorem syntazy N, L-NAME (10-4 M), przez 30 minut przed dodaniem U46619.
  3. Dodaj wstępnie obliczone stężenia U46619 do komory i pozwól na stabilny, trwały skurcz segmentów tętnicy.
    UWAGA: Reakcje rozszerzające naczynia krwionośne są indukowane w tętnicach krezkowych wstępnie skurczonych do około 80% maksymalnych odpowiedzi na 115 mM KCl. Różni agoniści mogą być stosowani do wywoływania skurczu poprzez aktywację ich specyficznych receptorów. W tym przypadku segmenty naczyń krwionośnych z PVAT lub bez niego są wstępnie zakontraktowane z U46619 (1–3 x 10-8 M; Tabela materiałów), agonista receptora tromboksanu A2, w celu wywołania stabilnych i utrzymujących się skurczów mięśni gładkich.
  4. Dodać skumulowane stężenia acetylocholiny (10-10 do 10-4 M) do komory narządowej. Zależne od stężenia reakcje rozszerzające naczynia krwionośne segmentów tętnic są przedstawione jako procent reakcji kurczliwych wywołanych przez U46619 (Rysunek 5).
    UWAGA: Przez większą część eksperymentu następne stężenie relaksującego agonisty powinno być dodawane natychmiast po zaobserwowaniu plateau, aby zapobiec nawrotowi napięcia. Zależne od stężenia odpowiedzi rozszerzające naczynia krwionośne segmentów tętnic są znormalizowane jako procent reakcji skurczowych indukowanych przez U46619 w celu dostosowania się do niewielkich różnic w unerwieniu i średnicy między segmentami tętnicy (Rysunek 5). Niewielkie różnice w reakcji, między poszczególnymi pierścieniami uzyskanymi z tego samego naczynia krwionośnego, stają się minimalne, gdy grupa sześciu lub więcej eksperymentów jest analizowana statystycznie. Wyrażając odpowiedzi jako procent własnych maksymalnych skurczów, właściwe jest zastosowanie analizy sparowanej (np. sparowanego testu t-Studenta) w celu porównania odpowiedzi tego samego rodzaju tkanek pochodzących od różnych zwierząt, jak i w celu porównania odpowiedzi pojedynczej tkanki przed i po interwencji. Podczas analizy efektów PVAT stosuje się dwukierunkową ANOVA, po której następuje test wielokrotnych porównań.
  5. Po dodaniu ostatniej dawki relaksującego agonisty należy wyjąć lek z każdej komory i ponownie napełnić świeżym buforem Krebsa. Dokładnie umyj komorę buforem Krebsa i pozwól tętnicy ustabilizować się przez co najmniej 45 minut przed wykonaniem jakichkolwiek dodatkowych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zależności długość/napięcie w celu uzyskania współczynnika normalizacji k

Ilość rozciągnięcia zastosowanego do segmentu naczynia wpływa na zakres interakcji aktyna-miozyna, a tym samym na maksymalną siłę czynną. Tak więc, dla każdego rodzaju naczynia krwionośnego, określenie ilości rozciągliwości potrzebnej do uzyskania maksymalnej siły czynnej jest wymagane do prawidłowych badań miograficznych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz komórek śródbłonka, sygnały pochodzące z PVAT odgrywają ważną rolę w regulacji reaktywności napięcia mięśni gładkich30. Zdrowy PVAT uwalnia NO i przeciwzapalną adiponektynę, aby wywierać działanie przeciwskurczowe na tętnice, które jest tracone w stanach patologicznych, takich jak otyłość i zespół metaboliczny31,32. W stanach chorobowych PVAT przyczynia się do rozwoju dysfunkcji śródbłonka i innych nieprawidłowości sercowo-naczyniow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana finansowo przez granty z Research Grant Council of Hong Kong [17124718 i 17121714], Hong Kong Health and Medical Research Fund [13142651 i 13142641], Collaborative Research Fund of Hong Kong [C7055-14G] oraz National Basic Research Program of China [973 Program 2015CB553603].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetylocholinaSigma-AldrichA6625Stężenie magazynowe: 10-1 M
Stężenie robocze: 10-10 do 10-5 M
L-NAME (ester metylowy Nω-nitro-L-argininy)Sigma-AldrichN5751Stężenie zapasowe: 3 x 10-2 M
Stężenie robocze: 10-4 M
PhenylephrineSigma-AldrichP6126Stężenie zapasowe: 10-2 M
Stężenie robocze: 10-10 do 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11α prostaglandyna metaanoepoksydowa F2&alfa;)EnzoBML-PG023-0001Stężenie zapasów: 10-5 M
Stężenie robocze: 1-3 x 10-8 M
Miograf wieloprzewodowyDuńska technologia MyoTechnology (DMT)620M
Instrumenty PowerLab 4/26ADInstrumentsML848
Labchart7ADInstruments-
Myszy typu dzikiego Adipo-SIRT1Jednostka Zwierząt Laboratoryjnych, Uniwersytet w HongkonguNR KATALOGOWY: 4085-16
Pokryte silikonem szalki PetriegoDuńska MyoTechnology (DMT)
Druty wolframoweDuńska MyoTechnology (DMT)300331
Narzędzia
chirurgiczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  2. Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
  3. Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
  4. Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
  5. Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
  6. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153(1997).
  7. Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
  8. Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
  9. Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
  10. Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
  11. Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
  12. Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
  13. Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
  14. Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
  15. Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
  16. Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3(2018).
  17. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  18. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  19. Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415(2008).
  20. Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
  21. Gao, Y. -J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
  22. Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
  23. Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
  24. Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
  25. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
  26. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  27. del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
  28. Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
  29. Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
  30. Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
  31. Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
  32. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  33. Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
  34. Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
  35. Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
  36. Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
  37. Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
  38. Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
  39. Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
  40. Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
  41. Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200(2015).
  42. Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System mikromiografii drutowejwarunki izometrycznerozci ganie pasywneroztw r Krebsa z wysokim st eniem potasust enie fenylefrynyinhibicja L NAMEzale no d ugo napi cie

Powiązane artykuły