Artykuł metodologiczny

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

DOI:

10.3791/59690

⸱

11 lipca 2019

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest spowodowana degeneracją neuronów dopaminergicznych (DA) w istocie czarnej pars compacta (SNpc) w brzusznym śródmózgowiu (VM). Terapia zastępcza komórek jest bardzo obiecująca w leczeniu choroby Parkinsona. Ostatnio indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC) pojawiły się jako potencjalny kandydat do terapii zastępczej komórek ze względu na zmniejszone ryzyko powstania guza i plastyczność w celu powstania specyficznych dla regionu neuronów i gleju. iNSC można przeprogramować z autologicznych somatycznych źródeł komórkowych, takich jak fibroblasty, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC) i różne inne typy komórek. W porównaniu z innymi typami komórek somatycznych, PBMNC są atrakcyjnym typem komórek startowych ze względu na łatwość dostępu i ekspansji w hodowli. Wirus Sendai (SeV), nieintegrujący RNA, kodujący czynniki przeprogramowujące, w tym ludzkie OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC, ma jednoniciowy, niesegmentowany genom o ujemnym sensie, który nie integruje się z genomem gospodarza, a jedynie replikuje się w cytoplazmie zakażonych komórek, oferując wydajny i bezpieczny pojazd do przeprogramowania. W tym badaniu opisujemy protokół, w którym iNSC są uzyskiwane przez przeprogramowanie PBMNC i różnicowane w wyspecjalizowane neurony VM DA metodą dwuetapową. Następnie prekursory DA są przeszczepiane do jednostronnie zmienionych 6-hyroksydopaminą (6-OHDA) mysich modeli PD w celu oceny bezpieczeństwa i skuteczności w leczeniu PD. Metoda ta stanowi platformę do badania funkcji i efektów terapeutycznych specyficznych dla pacjenta komórek nerwowych DA in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest powszechnym zaburzeniem neurodegeneracyjnym, spowodowanym degeneracją neuronów dopaminergicznych (DA) w istocie czarnej pars compacta (SNpc) w brzusznym śródmózgowiu (VM), z częstością występowania ponad 1% w populacji powyżej 60 roku życia1,2. W ciągu ostatniej dekady terapia komórkowa, mająca na celu zastąpienie zwyrodnieniowych lub uszkodzonych komórek lub odżywienie mikrośrodowiska wokół degenerujących się neuronów, wykazała potencjał w leczeniu PD3. W międzyczasie technologia przeprogramowania poczyniła znaczne postępy4, co stanowi obiecujące źródło komórkowe dla terapii zastępczej. Udowodniono, że ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) i embrionalne komórki macierzyste (ESC) są w stanie różnicować się w komórki nerwowe DA, które mogą przetrwać, dojrzewać i poprawiać funkcje motoryczne po wszczepieniu do modeli PD szczurów i naczelnych innych niż ludzie5,6,7,8. Komórki iPS stanowią kamień milowy w technologiach przeprogramowania komórkowego i mają ogromny potencjał w transplantacji komórek; Jednak nadal istnieje obawa o ryzyko powstania guza z nie w pełni zróżnicowanych komórek. Alternatywnym źródłem komórkowym do przeszczepu komórek są dorosłe komórki macierzyste zaangażowane w linię uzyskane poprzez bezpośrednie przeprogramowanie, takie jak indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC), które mogą pochodzić z niestabilnych produktów pośrednich, z pominięciem etapu pluripotencji9,10,11.

Zarówno iPSC, jak i iNSC mogą być przeprogramowane z autologicznych źródeł komórkowych, takich jak fibroblasty, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC) i różne inne typy komórek12,13,14, zmniejszając w ten sposób immunogenność przeszczepionych komórek w znacznym stopniu. Co więcej, w porównaniu z iPSC, iNSC są nieodłącznie związane ze zmniejszonym ryzykiem powstawania nowotworu i plastycznością zaangażowaną w linię, zdolnymi do różnicowania się tylko w neurony i glej11. We wstępnych badaniach ludzkie lub mysie iPSC i iNSC zostały wygenerowane z fibroblastów uzyskanych z biopsji skóry, co jest procedurą inwazyjną14,15. Pod tym względem, PBMNC są atrakcyjnym początkowym źródłem komórek ze względu na mniej inwazyjny proces próbkowania i łatwość uzyskania dużej liczby komórek w krótkim czasie ekspansji16. Początkowe badania nad przeprogramowaniem wykorzystywały integracyjne systemy dostarczania, takie jak wektory lentiwirusowe lub retrowirusowe, które są skuteczne i łatwe do wdrożenia w wielu typach komórek17; Jednak te systemy dostarczania mogą powodować mutacje i reaktywację resztkowych transgenów, co stanowi zagrożenie dla bezpieczeństwa dla klinicznych celów terapeutycznych12. Wirus Sendai (SeV) jest nieintegracyjnym wirusem RNA z jednoniciowym genomem o ujemnym znaczeniu, który nie integruje się z genomem gospodarza, a jedynie replikuje się w cytoplazmie zakażonych komórek, oferując wydajny i bezpieczny nośnik do przeprogramowania18,19. Dostępne są rekombinowane wektory SeV, które zawierają czynniki przeprogramowujące, w tym ludzkie OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC w swoich otwartych ramkach odczytu. Ponadto, wektory wirusowe SeV mogą być dalej ulepszane poprzez wprowadzanie mutacji wrażliwych na temperaturę, tak aby można je było szybko usunąć, gdy temperatura hodowli zostanie podniesiona do 39 °C20. W tym artykule opisujemy protokół do przeprogramowania PBMNC na iNSC za pomocą systemu SeV.

Wiele badań wykazało pochodzenie neuronów DA z ludzkich ESC lub iPSC przy użyciu różnych metod6,8,21. Brakuje jednak protokołów szczegółowo opisujących różnicowanie neuronów DA od iNSC. W tym protokole opiszemy efektywne generowanie neuronów DA z iNSC przy użyciu metody dwuetapowej. Prekursory neuronalne DA można przeszczepić do prążkowia mysich modeli PD w celu oceny bezpieczeństwa i skuteczności. W tym artykule zostanie przedstawiony szczegółowy protokół, który obejmuje różne etapy od wytworzenia indukowanych nerwowych komórek macierzystych przez wirusa Sendai, różnicowania iNSC w neurony DA, ustanowienia mysich modeli PD, aż do przeszczepienia prekursorów DA do prążkowia modeli PD. Korzystając z tego protokołu, można generować iNSC od pacjentów i zdrowych dawców oraz uzyskiwać neurony DA, które są bezpieczne, standaryzowalne, skalowalne i jednorodne do celów przeszczepu komórek lub do modelowania PD w naczyniu i badania mechanizmów leżących u podstaw początku i rozwoju choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury muszą być zgodne z wytycznymi instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań na ludziach. Przed pobraniem krwi należy uzyskać świadomą zgodę od pacjentów lub zdrowych ochotników. Protokół ten został zatwierdzony przez komisję etyczną ds. badań na ludziach i został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt.

1. Zbieranie, izolacja i rozbudowa PBMNC

  1. Kolekcja PBMNC
    1. Pobrać 10-20 ml krwi z żył obwodowych dawcy przez nakłucie żyły za pomocą fiolki z konserwantem heparyny sodowej.
      UWAGA: Próbki krwi powinny być przechowywane lub wysyłane w temperaturze pokojowej (RT). Próbki krwi należy przetworzyć w ciągu 24 godzin.
  2. Przygotowanie pożywki hodowlanej
    1. Przygotować pożywkę wolną od surowicy (SFM), łącząc następujące składniki: 245 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 240 ml pożywki F-12 Ham's, 5 ml suplementu insuliny-transferyny-selenu-X (ITS-X), 5 ml 100x roztworu podstawowego glutaminy (tabela materiałów), 5 ml chemicznie zdefiniowanego koncentratu lipidowego, 2,5 g płodowej surowicy bydlęcej, 0,025 g kwasu askorbinowego i 9 μl 1-tioglicerolu. Przefiltrować pożywkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Kwas askorbinowy i 1-tioglicerol są toksyczne w kontakcie ze skórą i wdychaniu .
    2. Aby przygotować pożywkę dla komórek jednojądrzastych (MNC), należy uzupełnić pożywkę SFM o 10 ng/ml ludzkiej interleukiny 3 (IL-3), 2 U/ml erytropoetyny (EPO), 100 ng/ml ludzkiego czynnika komórek macierzystych (SCF), 40 ng/ml ludzkiego insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1), 100 μg/ml holotransferyny i 1 μM deksametazonu. Przefiltrować pożywkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Przygotuj podłoże bezpośrednio przed użyciem.
  3. Izolacja PBMNC
    1. Ultrafioletowo-sterylizuj czystą ławkę przed użyciem. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie i sprzęt 75% alkoholem. Wysterylizuj wszystkie końcówki za pomocą autoklawu.
    2. Przenieść krew obwodową (PB) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć PB równą objętością sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco.
    3. Przygotuj 15 ml wysterylizowanej pożywki o gradiencie gęstości (tabele materiałów) w innej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Utrzymuj medium gradientu gęstości i PB na poziomie RT, aby umożliwić lepszą izolację PBMNC.
    4. Przechylić stożkową rurkę zawierającą podłoże o gradiencie gęstości pod kątem 45°, a następnie powoli i ostrożnie położyć 30 ml rozcieńczonego PB na pożywce o gradiencie gęstości.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność i pozwól, aby PB powoli spływał po boku stożkowej rurki na warstwę medium o gradiencie gęstości. Czerwone krwinki osadzają się na dnie probówki. Ostrożnie przechyl rurkę, aby zminimalizować zakłócenia interfejsu warstw.
    5. Odwirować probówki o masie 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej z hamulcem wirówki ustawionym w pozycji "wyłączonej". Odessać żółtą, górną warstwę plazmy i wyrzucić ją. Następnie przenieś białą, mętną, cienką warstwę zawierającą MNC za pomocą pipety 10 ml do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Wyłączenie hamulca wirówki jest ważne dla izolacji MNC.
    6. Dodać 30 ml D-PBS do probówki z MNC i odwirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a następnie dodać 45 ml D-PBS w celu ponownego zawieszenia komórek. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Hamulec wirówki powinien być włączony dla tego i następnych etapów wirowania. Ponieważ granulki komórkowe są gęste, dodaj 1-2 ml D-PBS, aby delikatnie ponownie zawiesić granulki, a następnie dodaj D-PBS do 45 ml.
    7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml D-PBS i policzyć żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanowego.
    8. Po odłożeniu na bok korporacji wieloletnich potrzebnych do ekspansji, zamroź pozostałe komórki do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: Co najmniej 5 x 106 MNC można zamrozić w jednej fiolce z 1 ml pożywki do zamrażania (Tabela materiałów). W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Ekspansja korporacji wielonarodowych
    1. W dniu -14 wysiewaj MNC o gęstości 2-3 x 106 komórek na mililitr w jednym dołku sześciodołkowych płytek z 1,5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża MNC. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 dni.
    2. W dniu -11 zebrać komórki i pożywkę za pomocą wysterylizowanej pipety i przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża MNC.
    3. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego. Wysiewaj MNC o gęstości 1 x 106 komórek na mililitr we wstępnie podgrzanym podłożu MNC i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni.
      UWAGA: Oczekuje się, że całkowita liczba komórek może się zmniejszyć w dniu -11.
    4. W dniu -8 powtórz kroki 1.4.2-1.4.3 i hoduj komórki przez 3 dni.
    5. W dniu -4 powtórz kroki 1.4.2-1.4.3 i hoduj komórki przez 3 dni.
      UWAGA: Po 14 dniach hodowli w kulturze powinna pozostać taka sama lub większa liczba MNC.

2. Przeprogramowanie PBMNC na iNSC przez infekcję SeV

  1. Przygotowanie roztworu i pożywki hodowlanej
    1. Przygotować roztwór podstawowy poli-D-lizyny (PDL), rozpuszczając 100 mg PDL w 100 mlH2Odo stężenia 1 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
    2. Przygotować podstawowy roztwór insuliny, rozpuszczając 100 mg insuliny w 20 ml 0,01 N HCl do stężenia 5 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
    3. Aby przygotować 200 ml podłoża podstawowego iNSC, połącz 96 ml DMEM-F12 i 96 ml pożywki zasadowej (tabela materiałów) z 2 ml 100x roztworu podstawowego glutaminy, 2 ml aminokwasu endogennego (NEAA), 2 ml suplementu N2 i 2 ml suplementu B27. Przed użyciem dodać 10 ng/ml rekombinowanego czynnika hamującego białaczkę ludzką, 3 μM CHIR99021 i 2 μM SB431542. Przefiltrować pożywkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Pożywkę należy zużyć w ciągu 2 tygodni. Dodać rekombinowany czynnik hamujący białaczkę ludzką, CHIR99021 i SB431542 bezpośrednio przed użyciem.
  2. Przeprogramowanie PBMNC na iNSC przez infekcję SeV
    1. Ultrafioletowo-sterylizuj czystą ławkę przed użyciem. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie i sprzęt 75% alkoholem. Wysterylizuj wszystkie końcówki za pomocą autoklawu.
    2. W dniu 0 zebrać komórki w pożywce MNC i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża MNC.
    3. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego. Ponownie zawiesić komórki za pomocą wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża MNC do stężenia 2 x 105 komórek na studzienkę na płytkach 24-dołkowych.
    4. Po wyjęciu probówek SeV z magazynu w temperaturze -80 °C, rozmrozić probówki zawierające SeV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5-10 s, a następnie pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu natychmiast umieść je na lodzie.
    5. Dodać do studzienek kodujący SeV ludzkie Klf4, Oct3/4, SOX2 i c-MyC, przy wielokrotności infekcji (MOI) 10. Odwirować komórki z płytkami o wymiarach 1 000 x g przez 30 minut, aby ułatwić łączenie komórek. Pozostawić komórki i supernatant na płytkach. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Wszystkie procedury związane z SeV muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa, a wszystkie końcówki i rurki powinny być traktowane etanolem lub wybielaczem przed utylizacją.
    6. W dniu 1 przenieś pożywkę i komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłucz studzienkę 1 ml pożywki MNC. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MNC na płytkach 24-dołkowych.
      UWAGA: Użyj 24-dołkowej płytki o niskim nasadce, aby zapobiec przyczepianiu się jakichkolwiek komórek przed posiewem na PDL/lamininie.
    7. W dniu 2 rozcieńczyć 1 ml 1 mg/ml PDL z 19 ml D-PBS do stężenia 50 μg/ml. Pokryć płytki 6-dołkowe 50 μg/ml PDL przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    8. Rozcieńczyć 200 μl 0,5 mg/ml lamininy w 20 ml D-PBS do stężenia 5 μg/ml. Odessać PDL do płytek 6-dołkowych i wysuszyć na pionowej czystej ławce.
    9. Pokryć płytki 6-dołkowe 5 μg/ml lamininy i inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C. Przed użyciem przemyć D-PBS.
    10. W dniu 3 poszczepić transdukowane komórki otrzymane w kroku 2.2.6 w pożywce iNSC na 6-dołkowych płytkach pokrytych PDL/lamininą.
      UWAGA: W razie potrzeby delikatnie przesuwaj płytki po umieszczeniu komórek na płytkach pokrytych PDL/lamininą, starając się nie zakłócać mocowania komórek.
    11. W dniu 5 delikatnie dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki iNSC do każdego dołka na płytkach 6-dołkowych.
      UWAGA: Oczekuje się, że komórki ulegną drastycznej śmierci (>60%).
    12. W dniu 7 delikatnie dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki iNSC do każdego dołka na 6-dołkowych płytkach.
    13. Od 9 do 28 dnia należy codziennie wymieniać zużytą pożywkę na świeżą, wstępnie ogrzaną (37 °C) pożywkę iNSC. Monitorowanie pojawiania się kolonii iNSC. Wybierz i przenieś klony iNSC do ekspansji w ciągu około 2-3 tygodni. Zebrać kolonie o odpowiedniej morfologii za pomocą przypalonych szklanych pipet, wykluczając wszelkie potencjalnie zanieczyszczające komórki, i odessać kolonie za pomocą końcówek o pojemności 200 μl.
      UWAGA: Scharakteryzowane iNSC można zamrozić do wykorzystania w przyszłości z 2-5 koloniami w jednej fiolce. Pożywka do zamrażania składa się z pożywki podstawowej wolnej od surowicy (tabela materiałów) i sulfotlenku dimetylu zmieszanego w stosunku 9:1, który należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Różnicowanie iNSC do neuronów dopaminergicznych

  1. Przygotowanie roztworu i pożywki hodowlanej
    1. Przygotuj 200 ml podłoża bazowego do różnicowania iNSC, łącząc 192 ml DMEM-F12 z 2 ml 100x roztworu podstawowego glutaminy, 2 ml NEAA, 2 ml suplementu N2 i 2 ml suplementu B27.
      UWAGA: Pożywkę należy zużyć w ciągu 2 tygodni.
    2. Przygotować pożywkę do różnicowania iNSC etapu I, uzupełniając podłoże podstawowe do różnicowania iNSC 1 μM SAG1 i 100 ng /mL FGF8b.
      UWAGA: Pożywkę należy zużyć w ciągu 2 tygodni.
    3. Przygotować pożywkę do różnicowania iNSC w stadium II, uzupełniając podstawową pożywkę różnicowania iNSC 0,5 mM cyklicznym monofosforanem adenozyny (cAMP), 0,2 mM kwasem askorbinowym, 10 μM DAPT, 10 ng/ml czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego (BDNF), 10 ng/ml neutroficznym czynnikiem glejowym (GDNF) i 1 ng/ml transformującym czynnikiem wzrostu βIII (TGF-βIII).
      UWAGA: Pożywkę należy zużyć w ciągu 2 tygodni.
  2. Powlekanie naczyń hodowlanych
    1. Ultrafioletowo-sterylizuj czystą ławkę przed użyciem. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie i sprzęt 75% alkoholem. Wysterylizuj wszystkie końcówki za pomocą autoklawu.
    2. W przypadku powlekania PDL, co najmniej jeden dzień przed ponownym posiewem komórek, rozcieńczyć 1 ml 1 mg/ml PDL z 19 ml D-PBS do stężenia 50 μg/ml. Szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm, które zostały wysterylizowane 75% alkoholem, należy pokryć na płytkach 24-dołkowych 50 μg/ml PDL w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.
    3. W przypadku powlekania lamininą rozcieńczyć 200 μl lamininy 0,5 mg/ml z 20 ml D-PBS do stężenia 5 μg/ml. Odessać PDL i wysuszyć studzienki w czystej ławce. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm pokryć 5 μg/ml lamininy i inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C. Przed użyciem przemyć preparatem D-PBS.
  3. Komórki pasażowe do różnicowania.
    1. Gdy zbieg hodowanych iNSC osiągnie 70-90%, odessać pożywkę z płytki hodowlanej i dodać 1 ml D-PBS w celu przemycia komórek. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) odczynnika do dysocjacji komórek (tabela materiałów) do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty w celu dysocjacji komórek.
    2. Po inkubacji przez 3 minuty komórki stają się półpływające; dodać 3 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża DMEM-F12 do dołka i pipetować komórki w górę iw dół, aby zdysocjować granulki komórek na pojedyncze komórki.
    3. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 250 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki odpowiednią objętością wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża iNSC w zależności od liczby komórek.
    4. Policz komórki, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego. Płytka 5 x 103 komórki na 12 mm szklane szkiełko nakrywkowe w 24-dołkowych płytkach i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne.
    1. Rozpocznij różnicowanie 24 godziny po ponownym posiewie komórek na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL/lamininą. Odessać pożywkę hodowlaną, przemyć komórki raz D-PBS, a następnie dodać 600 μl wstępnie podgrzanej pożywki z etapu różnicowania I do dołka na płytkach 24-dołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Zmieniaj podłoże codziennie od 1 do 10 dnia podczas pierwszego etapu różnicowania.
    3. W dniu 10 odessać pożywkę hodowlaną i raz przemyć komórki D-PBS. Dodać 600 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki do różnicowania etapu II do dołka na płytkach 24-dołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    4. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień od 11 do 25 dnia podczas drugiego etapu różnicowania. Zróżnicowane komórki można utrwalić za pomocą paraformaldehydu w różnych punktach czasowych w celu analizy.
    5. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego należy delikatnie przemyć komórki D-PBS trzy razy w wybranych punktach czasowych w ciągu 11 do 25 dnia różnicowania.
    6. Odpipetować 300 μl niejonowego środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów) do 100 ml PBS, aby uzyskać 0,3% niejonowy środek powierzchniowo czynny w PBS.
      UWAGA: Niejonowy środek powierzchniowo czynny jest toksyczny w kontakcie ze skórą i wdychaniu .
    7. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie umyć 0,3% w PBS.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny w kontakcie ze skórą i wdychaniu .
    8. Zablokuj komórki za pomocą 3% surowicy osła przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 1% surowicy osła o odpowiednim stężeniu i delikatnie rozcierać do wymieszania. Dodać 300 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego dołka na płytce 24-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj komórki trzykrotnie 0,3% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS.
    10. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w 1% surowicy osła o odpowiednim stężeniu i delikatnie rozcierać do wymieszania. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, chroniąc je przed światłem.
    11. Umyj komórki trzykrotnie 0,3% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS. Rozcieńczyć 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) PBS w rozcieńczeniu 1:500. Inkubować komórki w każdym dołku 24-dołkowej płytki z 300 μl rozcieńczonego DAPI przez 15 minut w temperaturze suchej temperatury, chroniąc przed światłem. Umyj komórki trzykrotnie 0,3% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS.
    12. Delikatnie wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków talerzy za pomocą kleszczy. Suszyć w ciemności przez noc w RT. Zamontować pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Ustanowienie jednostronnych modeli myszy PD z uszkodzeniami 6-hyroxydopamine (6-OHDA)

  1. Aby wygenerować mysie modele PD do przeszczepu komórek, użyj dorosłego samca myszy SCID-beżowych o wadze 20-25 g do wstrzyknięcia 6-OHDA.
  2. Przygotowanie leków do zabiegu chirurgicznego
    1. Przygotować 0,2% roztwór kwasu askorbinowego, rozpuszczając 0,2 g kwasu askorbinowego w 100 ml sterylizowanego roztworu soli fizjologicznej (0,9%) i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. W dniu zabiegu należy 10-krotnie rozcieńczyć 0,2% roztwór kwasu askorbinowego, aby uzyskać 0,02% roztwór kwasu askorbinowego.
      UWAGA: Kwas askorbinowy dodaje się, aby zapobiec utlenianiu 6-OHDA do postaci nieaktywnej.
    2. Aby przygotować roztwór 6-OHDA, należy zważyć odpowiednią ilość 6-OHDA do wysterylizowanej probówki o pojemności 1 ml, a następnie dodać pewną objętość 0,02% kwasu askorbinowego, aby uzyskać roztwór 6-OHDA o stężeniu 5 μg/μl. Mieszaj mieszaninę, aż się rozpuści. Umieść 6-OHDA na lodzie do czasu użycia.
      UWAGA: 6-OHDA jest wrażliwy na temperaturę i światło. Należy uważać, aby chronić roztwór przed światłem i przechowywać go na lodzie przed użyciem.
  3. Przygotuj wysterylizowany sprzęt chirurgiczny przez autoklawowanie przed operacją. Wyczyść cały sprzęt i powierzchnie etanolem podczas ustawiania ramy stereotaktycznej. Ustaw klatkę do odzyskiwania myszy pod lampą grzewczą.
  4. Przeprowadź operację w celu ustalenia jednostronnych modeli myszy z uszkodzeniem 6-OHDA.
    1. Zważ każdą mysz, zapisz wagę i oblicz ilość leku, którą należy podać. Każda mysz otrzymuje 0,5 mg/kg atropiny na 20 minut przed operacją. Znieczulić mysz 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.
    2. Podawać 0,5 mg/kg atropiny we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
    3. Znieczulić mysz ketaminą w dawce 80 mg/kg i ksylazyną w dawce 10 mg/kg ksylazyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym 20 minut po podaniu atropiny.
    4. Umieść mysz w zamkniętej komorze. Po 3-5 minutach mysz zostanie głęboko znieczulona bez reakcji na szczypanie tylnej nogi.
      UWAGA: Oczekuje się, że mysz, która otrzymała znieczulenie, doświadczy okresu pobudzenia.
    5. Ogol głowę myszy i nałóż maść do oczu z erytromycyną na oczy myszy w celu ochrony przed rozwojem owrzodzeń rogówki.
    6. Umieść mysz na aparacie stereotaktycznym. Najpierw napraw mysz za pomocą siekaczy. Włóż nauszniki prawidłowo, aby główka myszy znalazła się w płaskiej i bezpiecznej pozycji.
    7. Wysterylizuj głowę myszy jodem powidonu i alkoholem izopropylowym. Wytnij strzałkowe nacięcie (~1,5 cm) na skórze głowy za pomocą ostrza skalpela i odsłoń czaszkę. Wyreguluj siekacze i nauszniki, aby zmniejszyć różnicę wysokości między bregmą a lambdą do mniej niż 0.1 mm.
      UWAGA: Bregma myszy znajduje się na przecięciu szwów koronalnych i strzałkowych, a lambda znajduje się na przecięciu szwów lambdoidowych i strzałkowych.
    8. Powoli przesuwaj i opuść końcówkę igły w kierunku bregmy i traktuj bregmę jako punkt zerowy. Przesuń końcówkę do pozycji o współrzędnych A/P +0,5 mm, M/L -2,1 mm względem bregmy. Schowaj końcówkę i zaznacz punkt. Wykop małą dziurę w czaszce.
    9. Ekstrahować 2 μl z 5 μg/μl roztworu 6-OHDA do mikrostrzykawki (tabela materiałów). Ustawić igłę z powrotem w zaznaczonym miejscu i włożyć igłę do D/V -3,2 mm.
    10. Wstrzyknąć 2 μl 5 μg/μL roztworu 6-OHDA (łącznie 10 μg) z szybkością 1 μl/min. Po zakończeniu wstrzykiwania 6-OHDA należy pozostawić igłę na miejscu przez kolejne 5 minut. Następnie powoli wycofać igłę do wstrzykiwań.
    11. Zamknij nacięcie szwami i nałóż maść do oczu z erytromycyną na oczy myszy. Podaj podskórnie 0,5 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu, i nałóż maść z antybiotykiem bezpośrednio na zszytą skórę.
    12. Wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego i umieść ją w klatce odzyskiwania. Umieść mysz z powrotem i pozwól jej na dostęp do jedzenia i wody, aż odzyska przytomność. Leczyć mysz środkiem przeciwbólowym w wodzie pitnej codziennie po operacji przez 2-3 dni, a zalecana dawka ibuprofenu wynosi 0,03 mg/g masy ciała dziennie.
    13. Sprawdzaj mysz codziennie po operacji.

5. Ocena zachowania po jednostronnym zmianie 6-OHDA

  1. Dwa do trzech tygodni po operacji przeprowadź ocenę behawioralną, aby oszacować objawy PD. Zważyć każdą mysz, zapisać jej wagę i obliczyć ilość leku, którą należy podać (0,5 mg/kg apomorfiny przed oceną).
  2. Przed oceną należy podać 0,5 mg/kg apomorfiny we wstrzyknięciu podskórnym i umieścić mysz w szklanym cylindrze.
  3. Po 5-minutowym okresie przyzwyczajenia policz liczbę obrotów kontralateralnych i ipsilateralnych względem strony zmiany na minutę i zarejestruj ich aktywność za pomocą kamery wideo.
  4. Myszy z kontralateralnymi minus ipsilateralnymi rotacjami >7 obr./min są uważane za pomyślnie uszkodzone i wybierane jako kandydaci do eksperymentów przeszczepu komórek. Po 30-minutowym odpoczynku należy umieścić myszy z powrotem w klatkach mieszkaniowych.
    UWAGA: Jeśli mysz została pomyślnie uszkodzona, mysz, której wstrzyknięto 6-OHDA, będzie wykazywać większe odchylenie w kierunku strony przeciwnej, ponieważ agonista DA aktywuje głównie nadwrażliwe odnerwione prążkowie strony zmienionej chorobowo.
  5. Przeprowadź ocenę behawioralną tydzień przed i 2, 4, 6, 8, 12, 16 tygodni po przeszczepie komórek.

6. Przeszczepianie komórek prekursorów DA

  1. Przygotować zawiesinę komórek do przeszczepu. W przypadku wszczepienia komórek zawiesić 2 x 105 prekursorów DA zmieszanych z prekursorami D10 i D13 DA w stosunku 1:7 do 4 μl 5 g L-1 glukozy w zrównoważonym roztworze soli (tabela materiałów) buforu do przeszczepów.
  2. Zabieg chirurgiczny należy przeprowadzić po przeszczepieniu komórek zgodnie z procedurami opisanymi w punkcie 4.4, z wyjątkiem zastąpienia 6-OHDA zawiesiną lub buforem komórek prekursorowych DA.
  3. Przeprowadzić ocenę behawioralną 2, 4, 6, 8, 12, 16 tygodni po przeszczepieniu komórek prekursorów DA zgodnie z procedurami opisanymi w punkcie 5. Policz liczbę wywołanych przez apomorfinę rotacji kontralateralnych względem strony zmiany na minutę i zarejestruj ich aktywność za pomocą kamery wideo.
    UWAGA: Po przeszczepie zmniejszona częstość rotacji przeciwstawnych sugeruje poprawę funkcji motorycznych.
  4. Po 4, 8, 12 i 16 tygodniach po przeszczepie komórek należy perfuzjować mysz w głębokim znieczuleniu z 4% paraformaldehydem, aż ciało myszy stanie się sztywne, a wątroba myszy stanie się blada.
  5. Delikatnie oddziel mózg myszy i umieść mózg w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C na noc.
  6. Drugiego dnia umieść mózg w 30% sacharozie w celu odwodnienia, aż mózg opadnie na dno.
  7. Pokrój mózgi na grubość 40 μm za pomocą mikrotomu do zamrażania.
  8. Wykonaj barwienie immunologiczne zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 3.4.5-3.4.12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj raportujemy protokół, który obejmuje różne etapy terapii komórkowej iNSC-DA w leczeniu modeli PD. Po pierwsze, PBMNC zostały wyizolowane i namnażone, a następnie przeprogramowane do iNSC przez infekcję SeV. Schematyczne przedstawienie procedur z ekspansją PBMNC i indukcją iNSC pokazano na rysunku Rysunek 1. W dniu -14 PBMNC wyizolowano przy użyciu pożywki o gradiencie gęstości (Tabela materiałów). Przed odwirowaniem krew rozcieńczoną PBS i pożywką o gradiencie gęstości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiliśmy protokół, który obejmował różne etapy terapii komórkowej iNSC-DA dla modeli PD. Krytyczne aspekty tego protokołu obejmują: (1) izolację i ekspansję PBMNC oraz przeprogramowanie PBMNC do iNSC przez infekcję SeV, (2) różnicowanie iNSC do neuronów DA, (3) ustanowienie jednostronnych mysich modeli PD z uszkodzeniem 6-OHDA i ocenę behawioralną oraz (4) przeszczep komórek prekursorów DA i ocena behawioralna.

W tym protokole pierwsza część polega na zbieraniu i namnażani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została wsparta przez następujące granty: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Projekt Wsparcia Nauczycieli Wysokiego Szczebla na Uniwersytetach Miejskich w Pekinie w okresie 13. planu pięcioletniego (CIT & TCD20180333), Nagroda Talentów Wysokiego Szczebla Pekińskiego Systemu Medycznego (2015-3-063), Fundusz Miejskiej Komisji Zdrowia w Pekinie (PXM 2018_026283_000002), Fundusz Stu Tysięcy i Dziesięciu Tysięcy Talentów w Pekinie (2018A03), Rozwój Medycyny Klinicznej Specjalnej Wsparcia Finansowego Administracji Szpitali Miejskich w Pekinie (ZYLX201706) oraz Stypendium Królewskie Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15-ml probówka stożkowaCorning430052
1-tioglicerolSigma-AldrichM6145Działa toksycznie na wdychanie i kontakt ze skórą
Płytka 24-dołkowaCorning3337
Probówka stożkowa 50 ml Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
Płytka 6-dołkowaCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01Odczynnik do dysocjacji komórek
ApomorfinaSigma-AldrichA4393
Kwas askorbinowySigma-AldrichA92902Działa toksycznie w kontakcie ze skórą 
B27 suplement Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego
Probówki do pobierania krwi zawierające heparynę sodowąBD367871
BSAyisheng36106es60Surowica bydlęca płodu
cAMPSigma-AldrichD0627Cykliczny monofosforan dibutyryloadenozyny
CellBanker 2ZENOAQ100mlStosowany jako pożywka do zamrażania PBMNC
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyInvitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
Szkiełko nakrywkoweFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
DeksametazonSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
Surowica osłaJackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGErytropoetyna ludzka
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P = 1,077, średni gradient gęstości
GDNFPeprotech450-10Glejowy czynnik neurotroficzny
GlutaMAXInvitrogen21051024100 i razy; Roztwór podstawowy glutaminy
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Zrównoważony roztwór soli
Czynnik hamujący białaczkę ludzkąMillporeLIF1010
Ludzki rekombinowany SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGLudzki wzrost insulinopodobny czynnik 
IL-3Peprotech200-03-10UGInterleukina ludzka 3
IMDMGibco215056-023Zmodyfikowana pożywka Dulbecco
Isco, Insulina Roche 
ITS-XInvitrogen51500-056Suplement insuliny-transferyny-selenu-X
Wymiana surowicy nokautującejGibco10828028Surowica wolna podłoże bazowe
LamininRoche 
MikrostrzykawkaHamilton7653-01
N2 suplement Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Aminokwas endogenny
NeurobasalGibco10888Podłoże podstawowe
PDLSigma-AldrichP7280Poli-D-lizyna
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Gene Operation04-0010-10mgPrzechowywać ze światła przy -20?
Wirus SendaiLife TechnologiesMAN0009378
Sacharozabaiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36ETransformujący czynnik wzrostu  β?
TransferynaR& D Systems2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeNiejonowy środek powierzchniowo czynny
Trypan niebieskiGibcoT10282
KsylazynaSigma-AldrichX1126
firmy 1258501411243217001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mononuklearne kom rki krwi obwodowejr nicowanie neuron w dopaminergicznychreprogramowanie wirusem Sendaimodel uszkodzenia 6 hydroksydopaminprotok transplantacji kom rekmarker hydroksylazy tyrozynowejekspresja FOXA2ekspansja neuralnych kom rek macierzystychterapia choroby Parkinsona

Powiązane artykuły